芭菲爾鞋蘭及蝴蝶蘭之試管內形態發生
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(2) 致謝. 感謝指導教授陳彥澄博士的耐心指導，在碩士班兩年的過程中，提供 舒適的學習及研究環境，並且給我一個能夠自由發揮的舞台。陳老師在 試驗進行的過程中給予我重要且關鍵的意見，不斷地鼓勵我，支持我的 人生方向。此外，也謝謝老師在論文撰寫期間的細心指導及不辭勞苦的 修改。稿成後，蒙徐麗芬老師與王恆隆老師批閱斧正，謹置卷首，以表 衷心謝忱。 謝謝高雄大學生命科學系和生物科技研究所的老師們，感謝你們所教 導的一切。謝謝劉承桓同學在試驗以及儀器應用方面的幫助。 謝謝我的家人，父親馮源裕先生、母親林保平女士，大姐馮愛玲小姐 及二姐馮愛華小姐！感謝你們給我百分之百的信任、支持及鼓勵。尤其 大姐和姐夫王星友先生，在我來到遠離家鄉的台灣求學期間給予我父母 般的照顧及關心。謝謝你們提供我生活費，讓我專心求學以便順利完成 學業。謝謝大家！. 馮家華 於高雄大學生物科技研究所 2009/8/3. i.
(3) 縮寫表 2,4-D. 2,4-dichlorophenoxyacetic acid. BA. N6-benzyladenine. MS. Murashige and Skoog medium (1962). NAA. 1-naphthaleneacetic acid. PGRs. plant growth regulators. PLB. protocorm like body. TDZ. N-phenyl-N’-123-thiadiazol-5-yl urea. TTC. 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride. ii.
(4) 目錄 頁次 致謝 .............................................................................................................. i 縮寫表 .......................................................................................................... ii 目錄 .............................................................................................................. iii 表目錄 .......................................................................................................... vi 圖目錄 .......................................................................................................... ix. 中文摘要........................................................................................................ 1 英文摘要........................................................................................................ 3. 第一章 緒論 ................................................................................................ 5 1.1 蘭花之植物學特性 ............................................................................ 5 1.2 蘭花之試管內形態發生 .................................................................... 6 1.3 形態發生之意義 ................................................................................ 7 1.4 影響蘭科植物形態發生之因子 ........................................................ 8 1.5 蘭科植物之市場 ................................................................................ 9. 第二章 芭菲爾鞋蘭之試管內形態發生 .................................................... 10 2.1 前人研究及試驗目的 ........................................................................ 10 2.2 材料與方法 ....................................................................................... 12 2.2.1 試驗材料 ........................................................................................ 12. iii.
(5) 2.2.2 基礎培養基 .................................................................................... 12 2.2.3 植物生長調節劑 ........................................................................... 12 2.2.4 芭菲爾鞋蘭癒傷組織之長期繼代 ............................................... 12 2.2.5 芭菲爾鞋蘭癒傷組織之試管內形態發生 ................................... 12 2.2.6 統計方法 ....................................................................................... 13 2.3 結果 ................................................................................................... 13 2.3.1 芭菲爾鞋蘭癒傷組織之長期繼代 ................................................ 13 2.3.2 芭菲爾鞋蘭癒傷組織之試管內形態發生 .................................... 13 2.4 討論 ................................................................................................... 15. 第三章 蝴蝶蘭之試管內形態發生 ............................................................ 26 3.1 前人研究及試驗目的 ....................................................................... 26 3.2 材料與方法 ....................................................................................... 27 3.2.1 試驗材料 ........................................................................................ 27 3.2.2 無菌播種 ........................................................................................ 27 3.2.3 播種培養基 .................................................................................... 27 3.2.4 以TTC溶液測試種子活力.............................................................. 28 3.2.5 培植體對蝴蝶蘭試管內形態發生之影響 .................................... 28 3.2.6 培養環境對蝴蝶蘭試管內形態發生之影響 ................................ 28 3.2.7 植物生長調節劑對蝴蝶蘭試管內形態發生之影響 .................... 29 3.2.8 形態發生所產生之類原球體的植株再生 .................................... 29 3.2.9 試驗條件 ........................................................................................ 29. iv.
(6) 3.2.10 統計方法 ...................................................................................... 30 3.3 結果 ................................................................................................... 30 3.3.1 種子活力測試 ................................................................................ 30 3.3.2 無菌播種 ........................................................................................ 30 3.3.3 蝴蝶蘭之試管內形態發生 ............................................................ 30 3.3.4 類原球體的植株再生 .................................................................... 32 3.4 討論 ................................................................................................... 33. 第四章 參考文獻 ........................................................................................ 51. v.
(7) 表目錄 頁次 表 2-1. 芭菲爾鞋蘭實生苗之根部與葉片組織來源癒傷組織在每兩個月繼 代過程中的增殖率 ........................................................................ 17. 表 2-2. 芭菲爾鞋蘭實生苗之根部與葉片組織來源癒傷組織在每兩個月繼 代過程中的褐化率 ........................................................................ 18. 表 2-3. 形態發生試驗中植物生長調節劑對根部癒傷組織的褐化之影響 .. .......................................................................................................... 19. 表 2-4. 形態發生試驗中植物生長調節劑對根部癒傷組織的增殖之影響 .. .......................................................................................................... 20. 表 2-5. 植物細胞生長素及植物細胞分裂素對芭菲爾鞋蘭實生苗之根部癒 傷組織形態發生的影響 ................................................................ 21. 表 2-6. NAA 組合 TDZ 對芭菲爾鞋蘭實生苗之根部癒傷組織形態發生的 影響 .................................................................................................. 22. 表 2-7. TDZ 組合 2,4-D 對芭菲爾鞋蘭實生苗之根部癒傷組織形態發生的 影響 .................................................................................................. 23. vi.
(8) 表 3-1. 兩個月大與四個月大蝴蝶蘭實生苗在含有不同植物生長調節劑之 固態培養基中培養兩個月後的存活率 ........................................ 35. 表 3-2. 兩個月大與四個月大蝴蝶蘭實生苗在含有不同植物生長調節劑之 液態培養基中培養兩個月後的存活率 ........................................ 36. 表 3-3. 兩個月大與四個月大蝴蝶蘭實生苗在含有不同植物生長調節劑之 雙層培養基中培養兩個月後的存活率 ........................................ 37. 表 3-4. 兩個月大蝴蝶蘭實生苗在含有不同植物生長調節劑之固態培養基 中培養四個月後基底部與葉片部位的類原球體形成率 ............ 38. 表 3-5. 兩個月大蝴蝶蘭實生苗在含有不同植物生長調節劑之液態培養基 中培養 2 個月後換到雙層培養基培養 2 個月，共培養四個月後基 底部與葉片部位的類原球體形成率 ............................................ 39. 表 3-6. 兩個月大蝴蝶蘭實生苗在含有不同植物生長調節劑之雙層培養基 中培養四個月後基底部與葉片部位的類原球體形成率 ............ 40. 表 3-7. 四個月大蝴蝶蘭實生苗在含有不同植物生長調節劑之固態培養基 中培養四個月後基底部與葉片部位的類原球體形成率 ............ 41. vii.
(9) 表 3-8. 四個月大蝴蝶蘭實生苗在含有不同植物生長調節劑之液態培養基 中培養 2 個月後換到雙層培養基培養 2 個月，共培養四個月後基 底部與葉片部位的類原球體形成率 ............................................ 42. 表 3-9. 四個月大蝴蝶蘭實生苗在含有不同植物生長調節劑之雙層培養基 中培養四個月後基底部與葉片部位的類原球體形成率 ............ 43. viii.
(10) 圖目錄 頁次 圖 2-1. 芭菲爾鞋蘭癒傷組織形態發生之研究 ......................................... 24. 圖 2-2. 芭菲爾鞋蘭癒傷組織在試管內的形態發生 ................................. 25. 圖 3-1. 蝴蝶蘭之播種 ................................................................................. 44. 圖 3-2. 蝴蝶蘭之試管內形態發生 ............................................................. 45. 圖 3-3. 蝴蝶蘭之試管內形態發生之類原球體於葉片部位形成圖.a ....... 46. 圖 3-4. 蝴蝶蘭之試管內形態發生之類原球體於葉片部位形成圖.b ....... 47. 圖 3-5. 蝴蝶蘭葉片部位形成之類原球體的抽芽情形 ............................. 48. 圖 3-6. 蝴蝶蘭之試管內形態發生試驗中植物生長調節劑對培植體的 影響 ................................................................................................ 49. 圖 3-7. 類原球體之植株再生 ..................................................................... 50. ix.
(11) 芭菲爾鞋蘭及蝴蝶蘭之試管內形態發生 指導教授：陳彥澄 博士 國立高雄大學生物科技研究所 學生：馮家華 國立高雄大學生物科技研究所 摘要 本論文的第一部分試驗為芭菲爾鞋蘭之試管內形態發生，其材料來源為長期繼代之 芭菲爾鞋蘭根部癒傷組織，試驗方法為測試癒傷組織在含有不同植物生長調節劑的培 養基所導致之形態發生的反應，以便了解長期繼代癒傷組織的再生能力。試驗所用之 基礎培養基為 1/2MS 添加 20 g/l 蔗糖（sucrose）、1 g/l 蛋白腖（peptone）及 3 g/l 水 晶洋菜（Gelrite）。試驗所用之植物生長調節劑為 0.1、0.5、1 mg/l NAA、2,4-D 和 TDZ 以及 0.1、0.5、1 mg/l NAA 或 2,4-D 組合 0.1、0.5、1 mg/l TDZ，未添加植物生 長調節劑之基礎培養基為控制組。培養 150 天後，癒傷組織呈現褐化死亡的狀態。癒 傷組織之褐化情形在未添加植物生長調節劑的控制組最顯著，平均褐化率為 75％， 其次為含有 TDZ 之培養基，平均褐化率為 60％。培養基中含有植物生長素 NAA 及 2,4-D 能降低癒傷組織之褐化率。在 NAA 或 2,4-D 組合 TDZ 培養基中，癒傷組織之 平均褐化率分別為 35.33％和 39.67%。在僅含有植物生長素 NAA 或 2,4-D 之培養基 中，癒傷組織之平均褐化率分別只有 20%和 10%。此外，癒傷組織亦有增殖的情形， 增殖情形在僅含有植物生長素 NAA 或 2,4-D 的培養基以及含有 NAA 或 2,4-D 組合 TDZ 培養基較明顯。培養 5 個月後，癒傷組織從鮮黃色轉為綠色，部分的癒傷組織 外圍形成光滑白色團粒及吸收毛等結構，但無類原球體或體胚的形成。經由結果推測 長期繼代之癒傷組織，其再生能力明顯下降。. . 1.
(12) 第二部分的試驗為蝴蝶蘭之試管內形態發生，其材料為兩個月大與四個月大之蝴 蝶蘭實生苗。培養於含有 0.5 mg/l TDZ 之液態基礎培養基，每隔兩個禮拜繼代一次， 繼代三次即液態培養兩個月後更換至雙層培養基，並繼續培養兩個月。經培養四個 月後，實生苗之基底部與葉片部位皆有類原球體的形成。在葉片部位形成之平均類 原球體數目分別為 22.6 個與 19.2 個。將這些類原球體培養於再生培養基，結果顯示 有百分之百的再生率。一般而言，植物組織培養是取植物的根、莖、葉或植株其他 部分切割後作為培植體培養。本試驗中，培養材料為完全的實生植株，結果其葉片 及基底部位仍可形成類原球體。生長在自然界的蘭花，唯有澤蘭在葉片部位偶而長 出體胚，然後會落地生根。根據本試驗結果，未來可進一步研究其生理意義或應用 於蘭科植物之種苗繁殖。此外，仍需進行形態解剖的研究以確認植株再生的途徑。. 關鍵字：形態發生, 芭菲爾鞋蘭, 蝴蝶蘭, 植物生長調節劑, 癒傷組織, 類原球體. . 2.
(13) In vitro morphogenesis of Paphiopedilum & Phalaenopsis Advisor：Dr.Jen-Tsung Chen Institute of Biotechnology National University of Kaohsiung Student：Kyaw Minn Hsan Institute of Biotechnology National University of Kaohsiung ABSTRACT To study in vitro morphogenesis of Paphiopedilum, root-derived long-term callus of Paphiopedilum ‘Alma Gevaert’ was used to study the effects of plant growth regulators (PGRs) on in vitro morphogenesis and subsequent plant regeneration. Callus was cultured on basal medium supplemented with PGRs. Basal medium contains 1/2 MS medium, 20 g/l sucrose, 1 g/l peptone and 3g/l Gelrite. PGRs used in this study were 0.1, 0.5, 1 mg/l NAA, 2,4-D, TDZ and 0.1, 0.5, 1 mg/l NAA or 2,4-D combined with 0.1, 0.5, 1 mg/l TDZ; basal medium was used as the control. After 150 days of incubation, callus has been necrosis. Necrosis rate was highest in control, about 75%, and the next is medium contains TDZ, about 60％. Callus cultured in medium contains NAA or 2,4-D not only shows lower necrosis rate but also shows proliferation of callus. Though some callus turns green from yellowish in color, and there is whitish smooth granules formed at the peripheral regions of some callus, there is neither protocorm-like-bodies (PLBs) nor somatic embryos forming. Suggesting that long time subculture callus might have a low regeneration ability. To study in vitro morphogenesis of Phalaenopsis, two months and four months old. . 3.
(14) seedlings of Phalaenopsis aphrodite subsp. formosana were cultured in liquid basal medium containing 0.5mg/l TDZ, and subculture every two weeks. After two months of incubation in liquid medium, seedlings were transferred to two layer medium. Forming of PLBs at posterior region and leaf part of seedlings were observed. Average number of PLBs formed in two months and four months old seedlings is 22.6 and 19.2, respectively. Newly formed PLBs were then cultured in regenerate medium, and a 100％ regeneration rate was obtained. In general, plant tissue culture is taking a part of tissue i.e; leaf, root or stem segment as explants and culture in medium. In this experiment, we cultured the whole seedlings and then obtained PLBs at posterior region and leaf part. In natural, just Malaxis Paludosa, one of orchidaceae sometimes forms embryos at leaf. We will study its significance and for the use in orchid’s mass propagation in future.. Keywords：morphogenesis, PLBs, callus, PGRs, Phalaenopsis, Paphiopedilum. . 4.
(15) 第一章、緒論 1.1 蘭花之植物學特性 蘭科（Orchidaceae）是開花植物中最大的科之一，除了嚴寒的南北兩 極地或乾燥的沙漠外，幾乎在每個生態環境都可以見到蘭花的蹤跡，目 前約有 800 屬，30000 至 35000 個原生種；由人類育成的品種有 100000 多種，並且每年增加。蘭科屬於單子葉植物綱，雌雄合蕊植物目 （Gynandrae），為多年生草本。蘭科植物依生活型態可以區分成附生蘭 （epiphyte）、地生蘭（terrestrial）、岩生蘭（lithophyte）以及腐生蘭 （saprophytic）（Rittershausen and Rittershausen, 2002）。 蘭科植物具有五個植物學特徵（Sheehan and Sheehan, 1994）。第一特 徵為具完全花器，共有六片花枚，分為內外兩輪，外輪三片為萼片 （sepal），內輪為花瓣（petal），兩側的花瓣通常較大且成對，底部一 片花瓣特化為唇辦（labellum or lip），型態多變，主要功能為引誘昆蟲， 達到授粉目的。花朵中央的蕊柱（column）是由雌雄蕊結合而成，是蘭 科的第二特徵。蕊柱先端內含有的花粉塊（pollinia）為蘭科第三特徵， 花粉塊是由花粉黏結而成，依種類不同會有 2~8 塊不等。容納花粉塊的 地方稱為藥床（clinandrium），其外側有藥帽（anther cap）蓋住以保護 花粉塊。喙（rostellum）位於花粉塊的後面，為蘭科的第四特徵。蘭科之 第五特徵為其果實是蒴果（capsule），具多量缺乏胚乳之微細種子，種 子之發育只停留在原球胚（globular embryo）的階段，在自然環境中須與 蘭菌（orchid mycorrhizal fungus）共生才能發芽。. . 5.
(16) 1.2 蘭花之試管內形態發生 蘭花的繁殖有分株、無菌發芽及組織培養等方式（陳及張, 2002）。許 多蘭花每年會在植株的基部形成側芽，分株就是將這些側芽切離母體， 並使這些側芽能夠單獨存活。但利用分株來繁殖蘭花的數量極為有限。 除了分株以外，無菌發芽是另一個繁殖蘭花的方法。無菌發芽的方式是 將蘭花種子播於含有糖類及營養元素等成分的培養基中。此方法雖然可 以得到大量的種苗，但是，種子本身是經由有性繁殖而來，無法保留優 良性狀。目前，蘭花多以組織培養的方式進行繁殖。組織培養是以取植 物的細胞、組織或器官進行體外培養，進而獲取性狀及遺傳物質一致的 植株，這種方法已經被廣泛地應用在植物的繁殖及育種等領域上。 早期蘭花組織培養歷史上，法國人莫瑞爾，用莖頂組織進行培養，經 由類原球體而獲得再生植株(Morel, 1960)，蘭花的營養繁殖研究也隨之增 加。蘭科植物以組織培養方法進行繁殖的途徑包括：素心蘭 （Cymbidium）、石斛蘭（Dendrobuim）、蝴蝶蘭（Phalaenopsis）、香 蘭（Vanilla planifolia）及芭菲爾鞋蘭（Paphiopedilum）等可以芽體再生 及增殖（Arditt and Ernst, 1993；Chen et al., 2002）；素心蘭能夠經由根莖 形成進行增殖（Hasegawa and Goi, 1987；Shimasaki and Uemoto, 1991； Chang and Chang, 1998） ；素心蘭（Chang and Chang, 1998） 、石斛蘭（Jonojit et al., 2007）、蝴蝶蘭（Ishii et al., 1998）、芭菲爾鞋蘭（Hong et al., 2008） 及文心蘭（Oncidium）（Chen and Chang, 2000）也可經由癒傷組織形成 體 胚 或 原 球 體 後 進 行 繁 殖 ； 瓢 唇 蘭 （ Catasetum ） 、 朵 麗 蝶 蘭 （Doritaenopsis）、萬代蘭（Vanda）、蝴蝶蘭及紫蘭（Spathoglottis plicata）. . 6.
(17) 等可經類原球體發生的過程進行繁殖（Kraus and Monterio, 1989；Rosmah et al., 2006；Tokuhara and Masahiro, 1993；Teng et al., 1997；Tanaka et al., 1975）；文心蘭，石斛蘭及蝴蝶蘭的葉片則可直接形成體胚，而發育成 正常的植株（Chen et al., 1999；Chen and Chang, 2006；Chung et al., 2007； Gow et al., 2008；Kuo et al., 2005）；蝴蝶蘭可經原生質體進行繁殖 （Tokuhara and Mii, 2001；Shrestha et al., 2007 ）。. 1.3 形態發生之意義 形態發生（morphogenesis）指植物個體發育或再生過程中，由於細胞 和組織的分化，而使其器官或個體形態結構形成的過程（張, 1996）。在 蘭科植物，培植體在植物生長調節劑的誘導下會直接或間接的經由癒傷 組織路徑最終會形成體胚或類原球體，進一步可獲得再生植株。體胚最 基本的特徵是具有形態雙極性，即在發育的早期階段從方向相反的兩端 分化出莖端與根端（Haccius, 1978），而不定芽及不定根都是單向極性。 體胚發生的形態變化過程與結合子胚發生（zygotic embryogenesis） 的過 程非常相似（Zimmerman, 1993）。結合子胚發生之過程是卵細胞授精後， 開始進行有絲分裂，產生的二個子細胞形成具分化極性之二分體，再繼 續分裂成四分體、八分體，再進入球形胚期（globular stage），心臟形胚 期（heart stage），魚雷形胚期（torpedo stage），最後發育為成熟的結合 子胚。而體胚發生形成的過程，是由單一游離細胞發生類似結合胚的極 化作用，再依循球形胚、心臟形胚、魚雷形胚的變化，發育為成熟的體 胚，而二者最大的不同點是體胚發生可不經受精作用，直接由單一的體. . 7.
(18) 細胞進行發育，結合子胚發生則需經受精作用，形成結合子，再發育成 胚（Dodeman et al., 1997）。體胚發生的發育途徑，主要是經由直接體胚 發生（direct somatic embryogenesis）及間接體胚發生（indirect somatic embryogenesis）二個發育途徑， 但部分植物則可進行中間型體胚發生 （intermediate somatic embryogenesis）或重複體胚發生（repetitive somatic embryogenesis）二種發育途徑。. 1.4 影響蘭科植物形態發生之因子 一般而言，影響形態發生的因子中，最重要的可說是植物生長調節劑 （Zimmerman, 1993）。在文心蘭的形態發生研究方面，植物生長素會抑 制培植體體胚發生的效果，而植物細胞分裂素則會促進培植體的體胚發 生率（Chen and Chang, 2001）。此外、培養基中添加GA3、cycocel、AgNO3 與 CoCl2 會 抑 制 文 心 蘭 的 形 態 發 生 ， 而 培 養 基 中 含 有 ancymidol 、 paclobutrazol及ACC則會促進體胚發生（Chen and Chang, 2003；Chen and Chang, 2003）。在蝴蝶蘭的形態發生研究方面，葉片培養於不添加植物 生長調節劑的培養基，則沒有體胚或不定芽的形成。而葉片培植體培養 於含有BA或TDZ之培養基，則30天後就有體胚產生（Chen and Chang, 2006）。 此外，培養基成分、培植體以及光照與否等因子也會影響蘭科植物的 形態發生。培養基中不添加蔗糖會使文心蘭葉片培植體褐化，形態發生 率為零。蔗糖添加 10 g/l 即可滿足形態發生之需求。培植體的部位以及 擺放方向會影響形態發生比率，即文心蘭葉片尖端的部位體胚形成率. . 8.
(19) 高，且以向軸面朝上擺放的體胚形成率遠高於向軸面朝下擺放者。培植 體也受到光照與否的影響，文心蘭葉片在黑暗培養下會形成體胚，但照 光卻不利體胚的形成（Chen and Chang, 2002）。. 1.5 蘭科植物之市場 在亞洲，歐洲以及美國等地，由於蘭花之普及化及流行度的增加，世 界各地的蘭花生產量也隨著增加。例如，在 Winkelmann 等人（2006） 的統計結果可看到，在德國，1985 年只生產約 100 萬株蘭花到 2004 年 生產量達 3300 多萬株，可見蘭花之普及化的增加。台灣的蘭花產業也 在每年增長，台灣蝴蝶蘭的總進出口量在民國 87 年的 1284 萬公噸到 97 年時以成長到 5536 萬公噸，產值達 30 億台幣。為了與所需求之蘭 花量齊步並進，蘭花快速增殖之體外組織培養研究隨之被重視。 芭菲爾鞋蘭以及蝴蝶蘭均為台灣重要之經濟花卉，本論文針對芭菲爾 鞋蘭癒傷組織以及蝴蝶蘭進行試管內培養並觀察其形態發生。一部份研 究植物生長調節劑對不同組織來源並長期繼代之芭菲爾鞋蘭癒傷組織形 態發生的影響。另一部份研究培植體大小，培養環境及植物生長調節劑 對蝴蝶蘭培植體的直接體胚或直接類原球體發生的影響，找出其增殖的 最佳條件。. . 9.
(20) 第二章、芭菲爾鞋蘭之試管內形態發生 2.1 前人研究及試驗目的 拖鞋蘭（slipper orchids）是蘭科植物中的一種，泛指拖鞋蘭亞科 （Cypripedioideae），其中包含四個屬，即喜普鞋蘭屬（Cypripedium）、 芭菲爾鞋蘭屬（Paphiopedilum）、鬍拉蜜鞋蘭屬（Phragmipedium）及西 麗妮鞋蘭屬（Selenipdeium）。一般市場上最常見的是芭菲爾鞋蘭屬。 “Paphiopedilum” 源 自 羅 馬 女 神 居 住 的 島 嶼 “Paphos” 及 她 的 拖 鞋 “pedilum”，而芭菲爾鞋蘭目前又俗稱為仙履蘭。芭菲爾鞋蘭屬約有 65 個原生種，分布於印度、中國、菲律賓、印尼及新幾內亞等地（Sheehan and Sheehan, 1994） 。 芭 菲 爾鞋蘭多為複莖軸（ sympodial） 地 生 蘭 （terrestrial），莖短縮，葉片互生。背側萼片（dorsal sepal）艷麗且明顯， 兩側萼片（lateral sepal）合而為一形成 synsepal，位於囊袋正後方。 傳統上，芭菲爾鞋蘭以種子繁殖為主，但發芽不易，因此繁殖率低， 另一缺點為有性生殖無法保留優良性狀。除了以種子繁殖外，芭菲爾鞋 蘭亦以組織培養方法進行繁殖。Huang（1998）以BA處裡芭菲爾鞋蘭之 莖頂組織後得到叢生芽體。Huang 等人（2001）將植物生長調節劑改為 BA組合NAA，培養12個禮拜後，所誘導出叢生芽體為之前其研究的兩 倍。Chen 等人（2002）將Paphiopedilum philippiense hybrids的莖節組織 培養於含有2,4-D組合TDZ的1/2 MS培養基上，成功誘導芽體，平均芽體 數為1.8個。。此外，Chen 等人（2004）將Paphiopedilum philippiense hybrids 的葉片組織當培植體，培養於不添加植物生長調節劑的1/2 MS培養基及 黑暗處裡下，一個月後獲得不定芽，培養五個月後所得平均芽體數為5.6. . 10.
(21) 個。 芭菲爾鞋蘭亦有經由癒傷組織成功得到再生植株的研究。Stewart及 Button（1975）將莖頂組織培養於含有2,4-D組合BA的Heller培養基上， 成功誘導癒傷組織後，進一步得到再生植株。Lin等人（2000）將原球體 誘導所得之癒傷組織培養於含有NAA組合TDZ之1/2 MS培養基，三個月 後形成類原球體，五個月後得到7個再生芽體。Hong等人（2008）從 Paphiopedilum‘Alma Gevaert’之種子成功誘導癒傷組織後，進一步將癒傷 組織培養於含有2.69 uM NAA及0.45 uM TDZ之1/2 MS培養基，四個月後 有30％的癒傷組織形成類原球體，且類原球體平均帶有3個再生芽體。此 外 ， Lee 及 Lee （ 2003 ） 將 芭 菲 爾 鞋 蘭 之 近 緣 屬 ， 即 台 灣 喜 普 鞋 蘭 （Cypripedium formosanum）之原球體培養於含有2,4-D組合TDZ的1/4 MS 培養基，成功誘導癒傷組織後，進一步將癒傷組織培養於含有2,4-D組合 TDZ或2,4-D組合BA的1/4 MS培養基；八週後，培植體平均形成13個類原 球體，其中，以BA處理之培植體在統計結果上最有顯著性。 芭菲爾鞋蘭癒傷組織之再生雖然有成功的例子，但其再生芽體數少、 再生比率低，且蘭花之癒傷組織在繼代過程中容易褐化死亡（Chang and Chang, 1998；Lin et al., 2000；Lu, 2004；Wu et al., 2004）。故芭菲爾鞋 蘭癒傷組織之再生尚有進一步研究空間。本實驗之癒傷組織為芭菲爾鞋 蘭－Paphiopedilum ‘Alma Gevaert’實生苗之根部與葉片組織誘導而來，所 得結果可作為未來芭菲爾鞋蘭體細胞誘導之癒傷組織的長期繼代以及其 再生實驗之參考數據。. . 11.
(22) 2.2 材料與方法 2.2.1 試驗材料 Paphiopedilum ‘Alma Gevaert’ 實生苗之根部與葉片組織所誘導之鮮黃 色團狀癒傷組織（圖 2-1-a）。. 2.2.2 基礎培養基 試驗所用之基礎培養基成分為 1/2 MS（Murashige and Skoog, 1962）的 鹽類添加20 g/l蔗糖、1 g/l蛋白腖及水晶洋菜3 g/l。在加入Gelrite 之前將 培養基之pH調整為 5.2 ± 0.01。. 2.2.3 植物生長調節劑 試驗所用之植物生長調節劑為 TDZ、2,4-D 以及 NAA。. 2.2.4 芭菲爾鞋蘭癒傷組織之長期繼代 Paphiopedilum ‘Alma Gevaert’ 實生苗之根部與葉片來源的癒傷組織培 養於含有 3 mg/l TDZ 組合 1 mg/l 2,4-D（簡稱 T3D1）、3 mg/l TDZ 組合 3 mg/l 2,4-D（簡稱 T3D3）以及 1 mg/l TDZ 組合 3 mg/l 2,4-D（簡稱 T1D3） 的基礎培養基，每種處理做 6 盤，每兩個月在黑暗處理下繼代一次。. 2.2.5 芭菲爾鞋蘭癒傷組織之試管內形態發生 長期繼代（約兩年半）於含有T3D1之基礎培養基的根部癒傷組織當材 料。將繼代後一個禮拜之鮮黃色根部癒傷組織作為培植體來進行其形態. . 12.
(23) 發生實驗。取鮮重約0.1 克癒傷組織培養於含有不同植物生長調節劑的基 礎培養基，培養容器為150 x 20 mm 的試管（圖2-1-b,c）。試驗所用之植 物生長調節劑為0.1，0.5，1 mg/l NAA、2,4-D和TDZ以及0.1，0.5，1 mg/l NAA或2,4-D組合0.1，0.5，1 mg/l TDZ，沒有添加任何植物生長調節劑之 基礎培養基做為控制組。每一種處理做20個試管，每4小管為一組，溫度 為25℃±1℃，光週期16/8小時下培養。. 2.2.6 統計方法 試驗結果以鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Mutiple Range Test）進行 平均值的差異比較。. 2.3 結果 2.3.1 芭菲爾鞋蘭癒傷組織之長期繼代 每兩個月繼代一次之葉片來源癒傷組織的平均增殖率在含有 T3D1、 T3D3 及 T1D3 之基礎培養基為 68.95％、90.16％和 109.06％（表 2-1）， 其平均褐化率分別為 0.34％、1.47％和 0.25％（表 2-2）。根部來源癒傷 組織的平均增殖率在含有 T3D1、T3D3 及 T1D3 之基礎培養基為 67.36 ％、81.96％和 51.33％（表 2-1），其平均褐化率分別為 0.84％、1.55％ 和 0.56％（表 2-2）。試驗結果顯示，芭菲爾鞋蘭之癒傷組織在繼代過程 中幾乎沒有褐化的問題。繼代後所增殖的癒傷組織可供後續試驗之用。. 2.3.2 芭菲爾鞋蘭癒傷組織之試管內形態發生. . 13.
(24) 癒傷組織之試管內形態發生研究方面，試驗中將根部來源之癒傷組織 培養於含有不同植物生長調節劑的培養基培養一個月後就有的褐化的現 象（圖2-1-d）。初步發現，癒傷組織之平均褐化率在沒有添加任何植物 生長調節劑的控制組為最顯著，約70％，其次為僅含有植物細胞分裂素 TDZ之培養基，約43.33％。培養基中含有植物生長素NAA及2,4-D能降低 癒傷組織之褐化率。在NAA或2,4-D組合TDZ培養基中，癒傷組織之平均 褐化率分別為29.33％和33％。僅含有植物生長素-NAA或2,4-D之培養基 中，癒傷組織之平均褐化率分別只有8.33％和6.67％（表2-3）。 形態發生實驗中，癒傷組織在含有不同植物生長調節劑的培養基培養 五個月後，其褐化率都有上升的結果：控制組仍為最顯著，從70%上升 為75％，其次為含有TDZ之培養基，從43.3％上升為60%。在NAA或2,4-D 組合TDZ培養基中，平均褐化率分別從29.33％和33％上升為35.33％和 39.67%。在含有NAA及2,4-D之培養基中，平均褐化率則分別從8.33％上 升為20%和6.67％上升為10%（表2-3）。 培養過程中，癒傷組織亦有增殖的情形（圖 2-1-f）。增殖情形在僅含 有植物生長素 NAA 或 2,4-D 的培養基以及含有 NAA 或 2,4-D 組合 TDZ 培養基中較明顯。在控制組和僅含有植物細胞分裂素 TDZ 的培養基中， 癒傷組織增殖的情形則較不明顯（表 2-4）。 芭菲爾鞋蘭癒傷組織在試管內培養五個月後，到目前為止雖然沒有任 何的類原球體產生，但在含有 1 mg/l NAA 培養基中的癒傷組織從鮮黃色 轉為綠色的現象（圖 2-2-a）（表 2-5）。此外、在僅含有 0.5 mg/l 2,4-D 或 NAA 以及含有 0.5 mg/l 2,4-D 或 NAA 組合 0.5 mg/l TDZ 培養基中的. . 14.
(25) 癒傷組織則有偏綠色的現象（圖 2-2-b,c）（表 2-5）（表 2-6）（表 2-7）。 芭菲爾鞋蘭癒傷組織在僅含有植物細胞分裂素 TDZ 及控制組培養基中， 形態上則沒有變化（圖 2-1-e）（表 2-5）。在含有植物生長素 NAA 或 2,4-D 的培養基以及含有 NAA 或 2,4-D 組合 TDZ 培養基中，癒傷組織從 鮮黃色逐漸轉綠色外，有些癒傷組織會形成白色水漬狀癒傷組織（圖 2-2-i）。此外，癒傷組織外圍有白色光滑團粒（圖 2-2-d,e,f）或吸收毛（圖 2-2-g,h）等結構產生（表 2-5）（表 2-6）（表 2-7）。推測這些癒傷組織 具有形態發生之潛力。. 2.4 討論 植物生長素為誘導和維持癒傷組織所必須的植物生長調節劑（Kerbauy, 1984）。培養基中同時添加植物細胞分裂素和植物細胞生長素有利於文 心蘭癒傷組織之誘導和維持（Chen and Chang, 2000）。此外、也有報導 指出石斛蘭蘭癒傷組織在沒有添加任何植物生長調節劑的培養基中可維 持（Mitra et al., 1976；Roy and Banerjee, 2003；Roy et al., 2007）。但大 部分蘭科植物之癒傷組織則需要植物細胞分裂素和植物細胞生長素方可 維持（Chen and Chang, 2000；Lin et al., 2000；Lee and Lee, 2003；Huan and Tanaka, 2004；Huan et al., 2004）。另外，蘭科植物之癒傷組織在繼代過 程普遍的容易褐化，這是因為缺乏適當的植物生長調節劑（Chang and Chang, 1998；Lin et al., 2000；Lu, 2004；Wu et al., 2004）。 本試驗結果顯示，芭菲爾鞋蘭之癒傷組織適合培養於含有植物細胞分 裂素 TDZ 組合植物生長素 2,4-D 的 1/2 MS 培養基。芭菲爾鞋蘭實生苗. . 15.
(26) 之根部與葉片來源的癒傷組織在每隔兩個月繼代培養下，葉片來源癒傷 組織的平均增殖率在含有 T3D1、T3D3 及 T1D3 之基礎培養基為 68.95 ％、90.16％和 109.06％，根部來源癒傷組織的平均增殖率在含有 T3D1、 T3D3 及 T1D3 之基礎培養基為 67.36％、81.96％和 51.33％，癒傷組織幾 乎沒有褐化的情形。因此，本實驗所用配方可提供未來拖鞋蘭癒傷組織 繼代培養的參考數據。 在癒傷組織在試管內形態發生研究中，培養5個月後在含有1 mg/l NAA培養基中的癒傷組織從鮮黃色轉為綠色的現象。另外、在僅含有0.5 mg/l 2,4-D或NAA以及含有0.5 mg/l 2,4-D或NAA組合0.5 mg/l TDZ 培養 基中的癒傷組織則有偏綠色的現象。癒傷組織的外圍也有白色光滑團 粒，吸收毛等結構的產生。雖然推測這些產生變化的癒傷組織具有形態 發生之潛力，但仍然沒有類原球體的形成。前人研究（Hong et al., 2008） 在90天時已有類原球體的產生。因此，由結果可以推測長期繼代癒傷組 織的再生能力會降低。未來將進行如何將已長期繼代之癒傷組織具有再 生能力等研究。. . 16.
(27) 表 2-1. 芭菲爾鞋蘭實生苗之根部與葉片組織來源癒傷組織在每兩個月繼 代過程中的增殖率. Treatment (mg/l). Percentage of callus proliferation. TDZ. 2,4-D. Root. Leaf. 1. 3. 51.33 b. 109.06 a. 3. 3. 81.96 a. 90.16 ab. 3. 1. 67.36 ab. 68.95 b. 芭菲爾鞋蘭實生苗之根部與葉片組織來源癒傷組織培養於 T1D3、T3D3 及 T3D1 培養基，每種處理做 6 盤，培養兩個月後比較繼代過程中的增 殖率（callus proliferation）。 final fresh weight –initial fresh weight callus proliferation =. x 100％ initial fresh weight. 試驗結果以鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Mutiple Range Test）進行平 均值的差異比較（P < 0.05）。. . 17.
(28) 表 2-2. 芭菲爾鞋蘭實生苗之根部與葉片組織來源癒傷組織在每兩個月繼 代過程中的褐化率. Treatment (mg/l). Percentage of necrosis callus. TDZ. 2,4-D. Root. Leaf. 1. 3. 0.56 a. 0.25 a. 3. 3. 1.55 a. 1.47 a. 3. 1. 0.84 a. 0.34 a. 芭菲爾鞋蘭實生苗之根部與葉片組織來源癒傷組織培養於 T1D3、T3D3 及 T3D1 培養基，每種處理做 6 盤，培養兩個月後比較繼代過程中的褐 化率（necrosis of callus）。 weight of necrosis callus necrosis of callus =. x 100％ final callus weight. 試驗結果以鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Mutiple Range Test）進行平 均值的差異比較（P < 0.05）。. . 18.
(29) 表 2-3. 形態發生試驗中植物生長調節劑對根部癒傷組織的褐化之影響 Percentage of necrosis callus Treatment 30 days PGR-free. 150 days. 70.00 a. 75.00 a. NAA. 8.33. b. 20.00. bc. 2,4-D. 6.67. b. 10.00. c. TDZ. 43.33 ab. 60.00 ab. NAA + TDZ. 29.33 b. 35.33 abc. 2,4-D + TDZ. 33.00 b. 39.67 abc. 在試管內形態發生研究中，芭菲爾鞋蘭根部癒傷組織培養於含有不同植 物生長劑的培養基中，每種處理做 20 個試管，每 4 小管為一組，培養 1 個月以及 5 個月後之平均褐化率。 weight of necrosis callus necrosis of callus =. x 100％ final callus weight. 試驗結果以鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Mutiple Range Test）進行平 均值的差異比較（P < 0.05）。. . 19.
(30) 表 2-4. 形態發生試驗中植物生長調節劑對根部癒傷組織的增殖之影響 Treatment. Proliferation. PGR-free. +. NAA. +++. 2,4-D. +++. TDZ. +. NAA + TDZ. +++. 2,4-D + TDZ. ++. 在試管內形態發生研究中，芭菲爾鞋蘭根部癒傷組織培養於含有不同植 物生長劑的培養基中，每種處理做 20 個試管，培養 5 個月後觀察其增值 情況。. +. ： low proliferation rate of callus. ++ ： medium proliferation rate of callus +++ ： high proliferation rate of callus. . 20.
(31) 表 2-5. 植物細胞生長素及植物細胞分裂素對芭菲爾鞋蘭實生苗之根部癒 傷組織形態發生的影響 Treatment （mg/l） B. YC. GC. WG. WC. AH. 75 ab. 25 de. 0b. 0b. 0b. 0b. 0.1. 60 c. 20 de. 0b. 10 a. 10 a. 0b. 0.5. 0f. 80 b. 5 ab. 10 a. 1.0. 0f. 75 bc. 0.1. 20 de. 65 c. 0.5. 10 ef. 80 b. 1.0. 0f. 0.1. PGR-free NAA. 2,4-D. TDZ. Different forms of calli（％）. 5 ab. 0b. 5 ab. 5 ab. 5a. 5 ab. 5 ab. 0b. 10 a. 0b. 0b. 0b. 100 a. 0b. 0b. 0b. 0b. 85 a. 15 e. 0b. 0b. 0b. 0b. 0.5. 70 bc. 30 d. 0b. 0b. 0b. 0b. 1.0. 25 d. 65 c. 0b. 5 ab. 5 ab. 0b. 10 a 5 ab. B: browning；YC: yellow callus；GC: green callus；WG: white granules WC: watery callus；AH: absorbing hairs weight of different forms of callus forms of calli（％）=. x. 100. entire callus weight. 試驗結果以鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Mutiple Range Test）進行平 均值的差異比較（P < 0.05）。. . 21.
(32) 表 2-6. NAA 組合 TDZ 對芭菲爾鞋蘭實生苗之根部癒傷組織形態發生的 影響 Treatment（mg/l） NAA. TDZ. Different forms of calli（％） B. YC. GC. WG. WC. AH. 0.1. 0.1. 80 a. 20 b. 0b. 0b. 0b. 0b. 0.1. 0.5. 90 a. 10 b. 0b. 0b. 0b. 0b. 0.1. 1.0. 60 b. 15 b. 5b. 5 ab. 5a. 0b. 0.5. 0.1. 20 cd. 70 a. 0b. 5 ab. 5a. 0b. 0.5. 0.5. 10 cd. 75 a. 5b. 0b. 0b. 0.5. 1.0. 15 cd. 75 a. 0b. 5 ab. 5a. 0b. 1.0. 0.1. 25 c. 60 a. 5b. 5 ab. 0b. 5 ab. 1.0. 0.5. 15 cd. 65 a. 5b. 10 a. 5a. 0b. 1.0. 1.0. 5d. 60 a. 15 a. 10 a. 0b. 10 a. 10 a. B: browning；YC: yellow callus；GC: green callus；WG: white granules WC: watery callus；AH: absorbing hairs weight of different forms of callus forms of calli（％）=. x. 100. entire callus weight. 試驗結果以鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Mutiple Range Test）進行平 均值的差異比較（P < 0.05）。. . 22.
(33) 表 2-7. TDZ 組合 2,4-D 對芭菲爾鞋蘭實生苗之根部癒傷組織形態發生的 影響 Treatment（mg/l）. Different forms of calli（％）. 2,4-D. TDZ. B. YC. GC. WG. WC. AH. 0.1. 0.1. 45 b. 55 cd. 0b. 0b. 0b. 0b. 0.1. 0.5. 10 c. 90 a. 0b. 0b. 0b. 0b. 0.1. 1.0. 40 b. 45 d. 5 ab. 0b. 0b. 0b. 0.5. 0.1. 40 b. 60 c. 0b. 5a. 5a. 0b. 0.5. 0.5. 10 c. 75 b. 10 a. 0b. 0b. 5a. 0.5. 1.0. 40 b. 60 c. 0b. 0b. 0b. 0b. 1.0. 0.1. 50 b. 50 cd. 0b. 0b. 0b. 0b. 1.0. 0.5. 40 b. 55 cd. 5 ab. 0b. 0b. 0b. 1.0. 1.0. 75 a. 10 e. 5 ab. 5a. 0b. 0b. B: browning；YC: yellow callus；GC: green callus；WG: white granules WC: watery callus；AH: absorbing hairs weight of different forms of callus forms of calli（％）=. x. 100. entire callus weight. 試驗結果以鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Mutiple Range Test）進行平 均值的差異比較（P < 0.05）。. . 23.
(34) a . b. c. d . e. f. 圖 2-1. 芭菲爾鞋蘭癒傷組織形態發生之研究（bar） a.. Paphiopedilum ‘Alma Gevaert’ 實生苗之根部與葉片組織所誘導之 鮮黃色團狀癒傷組織（1.6 mm）. b, c. 培養於 150 x 20 mm 的試管內的癒傷組織（4.5, 90.9 mm） d.. 形態發生實驗中，在僅含 TDZ 培養基中培養 1 個月後所褐化之癒傷 組織（4.0 mm）. e.. 癒傷組織培養於控制組和僅含 TDZ 培養基後無增殖的情形（4.5 mm）. f.. 癒傷組織培養於僅含有植物生長素-NAA 或 2,4-D 的培養基以及含有 NAA 或 2,4-D 組合 TDZ 培養基中有明顯的增殖的情形（3.6 mm）. . 24.
(35) a . b. c . d . e. f . g . h. i. 圖 2-2. 芭菲爾鞋蘭癒傷組織在試管內的形態發生（bar） a, b, c. 從鮮黃色逐漸轉綠色之癒傷組織（箭頭處）（2.6, 1.0, 1.5 mm） d, e, f. 癒傷組織外圍所形成之白色光滑團粒（箭頭處） （0.3, 0.5, 0.8 mm） g, h.. 癒傷組織外圍所形成之吸收毛（箭頭處）（0.4, 0.4 mm）. i.. 白色水漬狀癒傷組織（箭頭處）（0.3 mm）. . 25.
(36) 第三章、蝴蝶蘭之試管內形態發生 3.1 前人研究及試驗目的 蝴蝶蘭在分類學上的地位是屬於被子植物門（Angiospermae）、單子葉 植物綱（Monocotyledoneae）、雌雄合蕊植物目（Gynandrae）、蘭科 （Orchidaceae） 、樹蘭亞科（Epidendroideae） 、萬代蘭族（Tribe Vandeae） 、 萬代蘭亞族（Subtribe Vandeae） 、蝴蝶蘭屬（Phalaenopsis）的植物（Dressler, 1981）。蝴蝶蘭的屬名Phalaenopsis 中，phalaen 是指蝶蛾（moths）， 而opsis 為形象，所以蝴蝶蘭的原意是指花似蝶蛾之意。目前全世界約有 45個原生種，大多位於東南亞，從本省恆春半島，經菲律賓、新幾內亞、 澳洲北部、印尼、馬來西亞、中南半島到喜馬拉亞山麓。台灣亦為蝴蝶 蘭原產地之一，主要是分佈於恆春半島、台東及蘭嶼。主要有台灣阿媽 （Phal. Aphrodite subsp. formosana）和姬蝴蝶蘭（Phal. equestris）。台灣 阿媽是大白花的重要親本，而姬蝴蝶蘭顏色變化較大，常作為小型紅花 之親本（Chen and Wang, 1996）。 蝴蝶蘭的花型美，花期長，可出售盆花與切花，是具有國際市場潛力 的花卉。因此，利用植物組織培養學將蝴蝶蘭大量繁殖之方法已被研究， 如；花苞當培植體（Arditti, 1977；Tanaka and Sakanishi, 1978）、芽體或 莖部當培植體（Griesbach, 1983）、根尖當培植體（Tanaka et al., 1976； Park et al., 2003），培養後經由癒傷組織、芽體形成或類原球體形成等路 徑得到大量的再生植株。近期也有文章報導，利用葉片當培植體，培養 於含有植物生長調節劑的培養基，由直接體胚形成的路徑可得到再生植 株的方法（Kuo et al., 2005；Chen and Chang, 2006；Gow et al., 2008）。. . 26.
(37) 然而，為了得到最理想之繁殖效率，培植體之培養方法、培養環境及培 養基條件等需要進一步的研究。本實驗將研究培植體大小，培養環境及 植物生長調節劑對蝴蝶蘭培植體直接體胚或直接類原球體發生的影響， 找出其繁殖的最佳條件。. 3.2 材料與方法 3.2.1 試驗材料 從 博 意 蘭 園 購 入 已 長 花 苞 之 二 倍 體 台 灣 阿 媽 蝴 蝶 蘭 （ 圖 3-1-a ） （Phalaenopsis aphrodite subsp. formosana）後，在溫度21-23℃、光週期 16/8小時條件下培養。開花後將花朵自交授粉，以便得到果莢。. 3.2.2 無菌播種 授粉約120天後，將果莢採收（圖3-1-b）。以75％酒精擦拭果莢表面後， 將其放入含有10％漂白水clorox（含6％次氯酸鈉）、1~2滴 Tween 20 延 展劑的消毒水中，以超音波震盪15分鐘來完成表面消毒。表面消毒完後， 用去離子水清洗三次，再以解剖刀和鑷子將種子（圖3-1-c）取出後培養 於播種培養基上。. 3.2.3 播種培養基 用兩種培養基播種，以期得到最高發芽率。第一種為1/2 MS（Murashige and Skoog, 1962）的鹽類添加20 g/l蔗糖、1 g/l蛋白腖及3 g/l水晶洋菜。第 二種為1/4 MS的鹽類添加20 g/l蔗糖、1 g/l胰蛋白腖（tryptone）、5 g/l椰. . 27.
(38) 子粉（coconut powder）及8.5 g/l洋菜（Agar）。在加入Gelrite及Agar之前 將培養基之pH調整為 5.2 ± 0.01。播種實驗中，發芽率較好之培養基做為 後續實驗的基礎培養基。. 3.2.4 以2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) 溶液測試種子 活力 將蘭花種子浸入 TTC 溶液，置於黑暗下 24 小時後，利用解剖型顯微 境觀察種子活力。2、3、5-氯化三苯基四氮唑(TTC)的氧化狀態是無色的， 被氫還原時成紅色的 2,3,5-Triphenyltetrazolium formanzane (TTF)。具 有生命力的種子，由於呼吸作用產生的氫氣能使 TTC 還原成 TTF，因此， 胚的部份便染成紅色；而無生命的種子沒有呼吸代謝活力，TTC 不被還 原，因此，胚的部份不著色。所以，可根據種子胚部染不染成紅色來判 斷種子有無生命力，從而測定種子發芽率。. 3.2.5 培植體對蝴蝶蘭試管內形態發生之影響 將播種後兩個月大之實生苗以及四個月大實生苗做為培植體，培養於 不同培養環境和含有不同植物生長調節劑的培養基中，以便觀察培植體 大小對蝴蝶蘭試管內形態發生之影響。. 3.2.6 培養環境對蝴蝶蘭試管內形態發生之影響 將播種後兩個月大之實生苗以及四個月大實生苗做為培植體，培養於 液態，固態和雙層培養基中。固態培養基為有添加洋菜之基礎培養基，. . 28.
(39) 液態培養基則沒有添加洋菜之基礎培養基，雙層培養基為固態培養基上 放一層液態培養基。以三種不同之培養環境來觀察其對蝴蝶蘭試管內形 態發生之影響。. 3.2.7 植物生長調節劑對蝴蝶蘭試管內形態發生之影響 將播種後兩個月大之實生苗以及四個月大實生苗做為培植體，培養於 液態，固態和雙層培養基中，各培養基中添加不同濃度之BA（1、2.5及 5ppm）和TDZ（0.1、0.5及1ppm），沒有添加植物生長調節劑為控制組， 以便觀察植物生長調節劑對蝴蝶蘭試管內形態發生之影響。. 3.2.8 形態發生所產生之類原球體的植株再生 播種後兩個月大之實生苗以及四個月大實生苗做為培植體，培養於液 態，固態和雙層培養基中，各培養基中添加不同濃度之BA和TDZ，來觀 察蝴蝶蘭之試管內形態發生。將形態發生實驗所產生之體胚或類原球體 培養於1/4 MS的鹽類濃度，添加20 g/l蔗糖、1 g/l胰蛋白腖、1 g/l活性炭 以及8.5 g/l洋菜的培養基中。在加入agar之前將培養基之pH調整為 5.2 ± 0.01。. 3.2.9 試驗條件 將播種後兩個月大之實生苗以及四個月大實生苗做為培植體，培養於 125ml錐形瓶中，每一種處理做5瓶，且每一瓶中培養5顆小苗。液態培養 瓶以每分鐘120轉shaker中振盪培養，且每隔兩個禮拜繼代一次，繼代三. . 29.
(40) 次後移將小苗到雙層培養基內。溫度為25℃±1℃，光週期16/8小時下培 養。. 3.2.10 統計方法 試驗結果以鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Mutiple Range Test）進行 平均值的差異比較。. 3.3 結果 3.3.1 種子活力測試 將蘭花種子浸入TTC溶液，置於黑暗下24小時後，利用解剖型顯微境 觀察種子活力，結果顯示果莢內所帶有之種子都呈現紅色（圖3-1-d）， 表示其有百分之百的活力，即受粉後約120天之果莢已完全成熟。. 3.3.2 無菌播種 利用1/2 MS（Murashige and Skoog, 1962）的鹽類添加20 g/l蔗糖、1 g/l 蛋白腖及3 g/l水晶洋菜以及1/4 MS的鹽類添加20 g/l蔗糖、1 g/l胰蛋白 腖、5 g/l椰子粉及8.5 g/l洋菜兩種培養基播種，結果顯示播種於1/4 MS濃 度培養基的種子發芽率為百分之百（圖3-1-f）。播種於1/2 MS濃度培養 基的種子雖有發芽，但大部分種子有白化及褐化的情形（圖3-1-e）。因 此，採用1/4 MS濃度培養基的配方做為形態發生實驗的基礎培養基。. 3.3.3 蝴蝶蘭之試管內形態發生. . 30.
(41) 將播種後得到之兩個月大與四個月大蝴蝶蘭實生苗培養於含有不同植 物生長調節劑之固態、液態及雙層培養基，以便觀察培植體大小、培養 環境以及植物生長調節劑對蝴蝶蘭試管內形態發生的影響。培養兩個月 後，在固態培養基的實生苗皆有百分之百的存活率（表3-1）。培養於液 態培養基的兩個月大實生苗之存活率最顯著者為控制組的84％，含有1 mg/l TDZ的培養基中，僅有20％實生苗存活（表3-2）。培養於液態培養 基的四個月大實生苗在控制組有百分之百存活率，與兩個月大實生苗一 樣，在含有1 mg/l TDZ的培養基中存活率不佳，只有64％（表3-2）。培 養於雙層培養基的兩個月大與四個月大實生苗之存活率最顯著者亦為控 制組，存活率分別為88％和100％。培養於雙層培養基中，兩個月大實生 苗在含有1 mg/l TDZ的培養基中存活率不佳，僅有56％，四個月大實生苗 則在含有5 mg/l BA的培養基中存活率不佳，存活率為64％（表3-3）。 兩個月大蝴蝶蘭實生苗在含有不同植物生長調節劑之固態培養基中培 養四個月後，其基底部有類原球體形成（圖 3-2）。平均類原球體形成數 在含有 0.5 mg/l TDZ 之培養基為最顯著，平均有 15.4 個類原球體形成。 在葉片部位則沒有類原球體形成（表 3-4）。在液態培養基中培養 2 個月 後換到雙層培養基培養 2 個月，共培養四個月的情況下，其基底部與葉 片部位都有類原球體的形成（圖 3-2；圖 3-3；圖 3-4；圖 3-5）。基底部 形成之類原球體在含有 1 mg/l TDZ 的培養基為最顯著，每顆實生苗平均 有 28.8 個類原球體的形成。在葉片部位形成之平均類原球體數目在控制 組以及含有不同濃度之 BA 和 TDZ 的培養基中，沒有顯著性的差異，平 均類原球體數目在 15.2 個與 22.6 個中間（表 3-5）。培養於雙層培養基. . 31.
(42) 中的實生苗，其基底部與葉片部位亦有類原球體的形成。雙層培養基中， 基底部與的平均類原球體數目在含有 0.5 mg/l TDZ 的培養基為最顯著， 平均有 15 個類原球體形成。葉片部位形成之平均類原球體數目則沒有顯 著性的差異，平均類原球體數目在 2.6 個與 7 個中間（表 3-5）。 培養於含有不同植物生長調節劑之固態培養基的四個月大實生苗跟兩 個月大實生苗一樣，在基底部有類原球體的形成，葉片部位則沒有。平 均類原球體數在含有 0.5 mg/l TDZ 為最顯著，平均有 6.6 個類原球體形成 （表 3-7）。培養於控制組之實生苗葉片形狀正常，根部也發達。但培養 於含有植物生長調節劑之培養基的實生苗葉片周圍形成波浪狀，且其根 部生長有受到抑制的情形（圖 3-6-a）。 培養於液態培養基 2 個月後換到雙層培養基培養 2 個月之四個月大實 生苗以及培養於雙層培養基之四個月大實生苗在基底部與葉片部位皆有 類原球體的形成。基底部之平均類原球體數分別在含有 1 mg/l BA 以及 0.1 mg/l TDZ 或 1 mg/l BA 之培養基為最顯著，分別有 5.2 個和 11.8 個平 均類原球體形成。葉片部位之平均類原球體數則都在含有 0.5 mg/l TDZ 之培養基為最顯著，分別有 19.2 個和 7 個平均類原球體形成（表 3-8; 表 3-9）。此外，培養於含有植物生長調節劑之液態培養基的實生苗之根尖 部位有腫大的情形（圖 3-6-b）。. 3.3.4 類原球體的植株再生 將形態發生實驗中所獲得之類原球體培養於1/4 MS的鹽類濃度，添加 20 g/l蔗糖、1 g/l胰蛋白腖、1 g/l活性炭以及8.5 g/l洋菜的培養基中（圖. . 32.
(43) 3-7-a），兩個月後即可獲得含有三到四個葉片以及兩到三個根部之再生 植株（圖3-7-b），且類原球體有百分之百的再生率。. 3.4 討論 蝴蝶蘭培養過程中，類原球體會從基底細胞形成（Chen and Chang, 2004），本實驗也有類似的結果，兩個月大與四個月大之蝴蝶蘭實生苗 培養於含有不同植物生長調節劑的固態、液態和雙層培養基，都有類原 球體從其基底部位形成。平均類原球體形成數大部分在含有TDZ之培養 基為最顯著。TDZ為尿素（urea）的衍生物，最早做為棉花（Gossympium hirsutum）之落葉劑（Arndt et al., 1976）。Mok等（1982）指出TDZ具有 細胞分裂素（cytokinin）活性，且其活性高於一般腺嘌呤（adenine）類 的細胞分裂素。細胞分裂素具有促進細胞分裂、擴大細胞、促使細胞分 化等生理作用（高, 1989），是蝴蝶蘭組織培養上廣泛使用的生長調節劑。 其中，BA已普遍使用於類原球體的誘導及增生（Tanaka et al., 1978； Tokuharu and Mii, 1993；Park et al., 2002）。 蝴蝶蘭形態發生之研究已報導很多。例如；類原球體當培植體，利用 生物反應器研究蝴蝶蘭形態發生以及其大量增值（Park et al., 2000），利 用細胞漩浮培養法，從原生質體得到體胚（Tokuhara and Mii, 2001； Shrestha et al., 2007），類原球體當培植體，經由癒傷組織形成路徑獲得 再生植株（Ishii et al., 1998），葉片當培植體，培養於含有 TDZ 之培養 基後由直接體胚形成路徑獲得再生植株（Chen and Chang, 2006；Kuo et al., 2005）等。一般而言，植物組織培養是取植物的根，莖，葉或植株其他. . 33.
(44) 部分切割後培養。本試驗中，培養完全體植株的情況下，類原球體在植 株的基底部與葉片部位形成。在不同植物生長調節劑的誘導下，所長出 的平均類原球體數目不一樣。這些類原球體培養於再生培養基，結果顯 示有百分之百的再生率。到目前為止，還沒有報導指出，培養完全體植 株的情況下，類原球體會從葉片部分形成。在自然界的蘭花中，唯有澤 蘭在葉片部位偶而長出體胚，然後會落地生根（Taylor, 1967）。因此、 本試驗成功建立了新的蝴蝶蘭試管內形態發生之系統。未來將研究其生 理意義以及應用於蘭科植物之種苗繁殖。此外，仍需進行形態解剖的研 究以確認植株再生的途徑。. . 34.
(45) 表 3-1. 兩個月大與四個月大蝴蝶蘭實生苗在含有不同植物生長調節劑之 固態培養基中培養兩個月後的存活率. Treatment (mg/l) PGR-free BA. TDZ. 1.0 2.5 5.0 0.1 0.5 1.0. Seedlings survival rate Two months old Four months old seedlings seedlings 25 (25) 25 (25) 25 (25) 25 (25) 25 (25) 25 (25) 25 (25) 25 (25) 25 (25) 25 (25) 25 (25) 25 (25) 25 (25) 25 (25). 兩個月大與四個月大實生苗培養於含有不同濃度之 BA 和 TDZ，沒添加 植物生長調節劑為控制組，每一種處理做 5 瓶，且每一瓶中培養 5 顆小 苗，培養於固態培養基兩個月後計算其存活率。. 括號中之數字為存活下來的實生苗數目。. . 35.
(46) 表 3-2. 兩個月大與四個月大蝴蝶蘭實生苗在含有不同植物生長調節劑之 液態培養基中培養兩個月後的存活率. Treatment (mg/l) PGR-free BA. TDZ. 1.0 2.5 5.0 0.1 0.5 1.0. Seedlings survival rate Two months old Four months old seedlings seedlings 25 (21) 25 (25) 25 (12) 25 (24) 25 ( 8) 25 (22) 25 ( 5) 25 (18) 25 (16) 25 (25) 25 (14) 25 (21) 25 ( 5) 25 (16). 兩個月大與四個月大實生苗培養於含有不同濃度之 BA 和 TDZ，沒添加 植物生長調節劑為控制組，每一種處理做 5 瓶，且每一瓶中培養 5 顆小 苗，培養於液態培養基，每隔兩個禮拜繼代，繼代三次即培養兩個月後 計算其存活率。. 括號中之數字為存活下來的實生苗數目。. . 36.
(47) 表 3-3. 兩個月大與四個月大蝴蝶蘭實生苗在含有不同植物生長調節劑之 雙層培養基中培養兩個月後的存活率. Treatment (mg/l) PGR-free BA. TDZ. 1.0 2.5 5.0 0.1 0.5 1.0. Seedlings survival rate Two months old Four months old seedlings seedlings 25 (22) 25 (25) 25 (18) 25 (23) 25 (18) 25 (20) 25 (15) 25 (16) 25 (20) 25 (24) 25 (17) 25 (21) 25 (14) 25 (17). 兩個月大與四個月大實生苗培養於含有不同濃度之 BA 和 TDZ，沒添加 植物生長調節劑為控制組，每一種處理做 5 瓶，且每一瓶中培養 5 顆小 苗，培養於雙層培養基兩個月後計算其存活率。. 括號中之數字為存活下來的實生苗數目。. . 37.
(48) 表 3-4. 兩個月大蝴蝶蘭實生苗在含有不同植物生長調節劑之固態培養基 中培養四個月後基底部與葉片部位的類原球體形成率 Average number of PLBs Treatment (mg/l) PGR-free BA. TDZ. Posterior region. Leaf. 0 d 5.8 c 7.4 bc 5.6 c 8.2 bc 15.4 a 9.2 b. 0 0 0 0 0 0 0. 1.0 2.5 5.0 0.1 0.5 1.0. 兩個月大蝴蝶蘭實生苗培養於含有不同濃度之 BA 和 TDZ，沒添加植物 生長調節劑為控制組，每一種處理做 5 瓶，且每一瓶中培養 5 顆小苗， 培養於固態培養基四個月後計算平均類原球體形成率。. 試驗結果以鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Mutiple Range Test）進行平 均值的差異比較（P < 0.05）。. . 38.
(49) 表 3-5. 兩個月大蝴蝶蘭實生苗在含有不同植物生長調節劑之液態培養基 中培養 2 個月後換到雙層培養基培養 2 個月，共培養四個月後基 底部與葉片部位的類原球體形成率 Average number of PLBs Treatment (mg/l) PGR-free BA. TDZ. Posterior region. Leaf. 5 b 7 b 10.4 b 7.8 b 19 ab 16.6 ab 28.8 a. 19 a 20.6 a 10.2 a 19.4 a 16.2 a 22.6 a 15.2 a. 1.0 2.5 5.0 0.1 0.5 1.0. 兩個月大蝴蝶蘭實生苗培養於含有不同濃度之 BA 和 TDZ，沒添加植物 生長調節劑為控制組，每一種處理做 5 瓶，且每一瓶中培養 5 顆小苗， 培養於液態培養基 2 個月後換到雙層培養基培養 2 個月，共培養四個月 後計算平均類原球體形成率。. 試驗結果以鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Mutiple Range Test）進行平 均值的差異比較（P < 0.05）。. . 39.
(50) 表 3-6. 兩個月大蝴蝶蘭實生苗在含有不同植物生長調節劑之雙層培養基 中培養四個月後基底部與葉片部位的類原球體形成率 Average number of PLBs Treatment (mg/l) PGR-free BA. TDZ. Posterior region. 1.0 2.5 5.0 0.1 0.5 1.0. 3.6 b 4.0 b 7.6 ab 5.6 b 6.8 ab 15.0 a 12.4 ab. Leaf 2.6 a 3.6 a 4.6 a 5.0 a 6.0 a 7.0 a 5.6 a. 兩個月大蝴蝶蘭實生苗培養於含有不同濃度之 BA 和 TDZ，沒添加植物 生長調節劑為控制組，每一種處理做 5 瓶，且每一瓶中培養 5 顆小苗， 培養於雙層培養基四個月後計算平均類原球體形成率. 試驗結果以鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Mutiple Range Test）進行平 均值的差異比較（P < 0.05）。. . 40.
(51) 表 3-7. 四個月大蝴蝶蘭實生苗在含有不同植物生長調節劑之固態培養基 中培養四個月後基底部與葉片部位的類原球體形成率 Average number of PLBs Treatment (mg/l) PGR-free BA. TDZ. Posterior region. Leaf. 0 c 2.4 abc 2.2 abc 1.6 bc 3.2 abc 6.6 a 6.2 ab. 0 0 0 0 0 0 0. 1.0 2.5 5.0 0.1 0.5 1.0. 四個月大蝴蝶蘭實生苗培養於含有不同濃度之 BA 和 TDZ，沒添加植物 生長調節劑為控制組，每一種處理做 5 瓶，且每一瓶中培養 5 顆小苗， 培養於固態培養基四個月後計算平均類原球體形成率. 試驗結果以鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Mutiple Range Test）進行平 均值的差異比較（P < 0.05）。. . 41.
(52) 表 3-8. 四個月大蝴蝶蘭實生苗在含有不同植物生長調節劑之液態培養基 中培養 2 個月後換到雙層培養基培養 2 個月，共培養四個月後基 底部與葉片部位的類原球體形成率 Average number of PLBs Treatment (mg/l) PGR-free BA. TDZ. Posterior region. Leaf. 0 c 5.2 a 1.6 bc 1.6 bc 2.4 bc 3.0 ab 2.2 bc. 5.0 b 10.2 ab 12.8 ab 8.0 b 15.2 ab 19.2 a 12.6 ab. 1.0 2.5 5.0 0.1 0.5 1.0. 四個月大蝴蝶蘭實生苗培養於含有不同濃度之 BA 和 TDZ，沒添加植物 生長調節劑為控制組，每一種處理做 5 瓶，且每一瓶中培養 5 顆小苗， 培養於液態培養基 2 個月後換到雙層培養基培養 2 個月，共培養四個月 後計算平均類原球體形成率。. 試驗結果以鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Mutiple Range Test）進行平 均值的差異比較（P < 0.05）。. . 42.
(53) 表 3-9. 四個月大蝴蝶蘭實生苗在含有不同植物生長調節劑之雙層培養基 中培養四個月後基底部與葉片部位的類原球體形成率 Average number of PLBs Treatment (mg/l) PGR-free BA. TDZ. Posterior region. 1.0 2.5 5.0 0.1 0.5 1.0. 5.6 b 11.8 a 10.0 ab 8.8 ab 11.8 a 10.2 ab 10.8 ab. Leaf 0 c 2.6 bc 3.6 b 3.0 bc 5.0 ab 7.0 a 4.4 ab. 四個月大蝴蝶蘭實生苗培養於含有不同濃度之 BA 和 TDZ，沒添加植物 生長調節劑為控制組，每一種處理做 5 瓶，且每一瓶中培養 5 顆小苗， 培養於雙層培養基四個月後計算平均類原球體形成率. 試驗結果以鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Mutiple Range Test）進行平 均值的差異比較（P < 0.05）。. . 43.
(54) a . b. c. d . e . f. 圖 3-1. 蝴蝶蘭之播種（bar） a. 二倍體台灣阿媽蝴蝶蘭（Phalaenopsis aphrodite subsp. formosana） （26.8 mm） b. 授粉 120 後採收之果莢（16.3 mm） c. 在解剖型顯微鏡底下看到之蝴蝶蘭種子（0.2 mm） d. 以 TTC 溶液測試種子活力之結果圖（0.6 mm） e. 播種於 1/2MS 培養基一個月後有發芽以及褐化之種子（1.4 mm） f. 播種於 1/4MS 培養基一個月後有百分之百的種子發芽率（0.8 mm）. . 44.
(55) a . b. c. d . e. f. g . h. i. 圖 3-2. 蝴蝶蘭之試管內形態發生（bar） a. 試管內形態發生實驗中在基底部位形成之類原球體（3.3 mm） b,c. 抽芽後之未長根的類原球體（2.5, 3.3 mm） d. 有長根之類原球體（5 mm） e. 在基底部位形成並有抽芽現象之大量類原球體（1.4 mm） f. 在培植體的葉片部位形成之類原球體（2 mm） g,h,i. 在培植體的葉片部位形成之類原球體（初期）（0.5, 0.4. 0.5 mm）. . 45.
(56) a . b. c. d . e. f. g . h. i. 圖 3-3. 蝴蝶蘭之試管內形態發生之類原球體於葉片部位形成圖.a（bar） a,c,d. 類原球體於葉尖及葉緣形成（2.5, 3.3, 2.5 mm） b,f. 類原球體於葉緣形成（3.3, 3.3 mm） e,g. 類原球體於葉片表面葉尖及葉緣形成（2.5, 2.5 mm） h. 在葉片背面形成之類原球體（5 mm） i. 在葉片的每一個位置都有類原球體的形成（2.5 mm）. . 46.
(57) a . b. c. d . e. f. 圖 3-4. 蝴蝶蘭之試管內形態發生之類原球體於葉片部位形成圖.b（bar） a. 培植體同時在葉片部位和基底部位形成類原球體（1.3 mm） b. 類原球體於新葉片生長部位形成（5 mm） c. 在葉脈及葉緣形成之類原球體（3.3 mm） d,e. 在一顆培植體裡，同時有兩個葉片形態發生之情形（3.5, 3.3 mm） f. 類原球體的形成使培植體的葉片畸形（3.3 mm）. . 47.
(58) a . b. c. d . e. f. g . h. i . 圖 3-5. 蝴蝶蘭葉片部位形成之類原球體的抽芽情形（bar） a,d,e. 在葉緣形成之類原球體的抽芽（3.6, 5, 4.5 mm） b,c,f. 在葉面及葉尖形成之類原球體抽芽並有增殖情形（4, 4, 3.3 mm） g,h. 在葉尖形成之類原球體成功抽芽（4, 2.6 mm） i. 在葉緣形成之類原球體抽芽且生根（4.5 mm）. . 48.
(59) seedling culture in control . seedling culture in PGRs a . b . 圖 3-6. 蝴蝶蘭之試管內形態發生試驗中植物生長調節劑對培植體的影響 （bar） a. 培養於控制組之實生苗葉片形狀正常，根部發達，但培養於含有植物 生長調節劑之培養基的實生苗葉片周圍形成波浪狀，且其葉片及根部 生長有都受到抑制的情形（0.6 mm） b. 培養於含有植物生長調節劑之實生苗之根尖部位有腫大的情形（1.5 mm）. . 49.
(60) a . b . 圖 3-7. 類原球體之植株再生（bar） a. 形態發生實驗所生長之類原球體培養於再生培養基（8 mm） b. 培養兩個月後獲得有生根之再生植株（10 mm）. . 50.
(61) 第四章 參考文獻 陳健忠, 張唯勤. (2002) 蘭花之試管內形態發生. 科學農業. 50：150-155. 高景輝. (1989) 植物荷爾蒙. pp：586. 華香園出版社, 台北市. 張育森. (1996) 形態形成.園藝科技術語. pp：148. 農資中心資訊科學叢書 (2). 農業科學資料服務中心, 台北. Arditti, J. (1977) Clonal propagation of orchids by means of tissue culture a manual. In: Orchid Biology Reviews and Prospectives, Cornell University Press, Ithaca. pp. 203-209. Arditti, J. and Ernst, R. (1993) Micropropagation of Orchids , John Wiley ＆ Son Inc., New York, pp：665. Arndt, F., Rusch, R., Stillfried, H.V., Hanisch, B. and Martin, W.C. (1976) a new cotton defoliant. Plant Physiol. 57：s-99 (Abstr.). Chang, C. and Chang, W.C. (1998) Plant regeneration from callus culture of Cymbidium ensifolium var. misericors. Plant Cell Rep. 17：251-255. Chen, J.T., Chang, C. and Chang, W.C. (1999) Direct somatic embryogenesis. . 51.
(62) on leaf explants of Oncidium Gower Ramsey and subsequent plant regeneration. Plant Cell Rep. 19：143-149. Chen, J.T. and Chang, W.C. (2000) Plant regeneration via embryo and shoot bud formation from flower-stalk explants of Oncidium Sweet Sugar. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 62：95-100. Chen, J.T. and Chang, W.C. (2000) Efficient plant regeneration through somatic embryogenesis from callus cultures of Oncidium (Orchidaceae). Plant Sci. 160:87-93. Chen, J.T. and Chang, W.C. (2001) Effects of auxins and cytokinins on direct somatic embryogenesis on leaf explants of Oncidium 'Grower Ramsey'. Plant Growth Regul. 34：229-232. Chen, J.T. and Chang, W.C. (2002) Effects of tissue culture conditions and explant characteristics on direct somatic embryogenesis in Oncidium “Grower Ramsey”. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 69：41-44. Chen, J.T. and Chang, W.C. (2003) 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid enhances direct somatic embryogenesis for Oncidium leaf cultures. Biol. Plant. 46：455-458. . 52.
(63) Chen, J.T. and Chang, W.C. (2003) Effects of GA3, ancymidol, cycocel and paclobutrazol on direct somatic embryogenesis of Oncidium in vitro. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 72：105-108. Chen, J.T. and Chang, W.C. (2004) Induction of repetitive embryogenesis from seed-derived protocorms of Phalaenopsis amabilis var. formosa Shimadzu. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 40：290-293. Chen, J.T. and Chang, W.C. (2006) Direct somatic embryogenesis and plant regeneration from leaf explants of Phalaenopsis amabilis. Biol. Plant. 50：169-173. Chen, T.Y., Chen, J.T. and Chang, W.C. (2002) Multiple shoot formation and plant regeneration from stem nodal explants of Paphiopedilum orchids. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 38：595-597. Chen, T.Y., Chen, J.T. and Chang, W.C. (2004) Plant regeneration through shoot bud formation from leaf explants of Paphiopedilum orchids. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 76:11-15.. Chen, W. H. and Wang, Y. T. (1996) Phalaenopsis orchid culture. Taiwan Sugar Research Institute. 43: 11-16. . 53.
(64) Chung, H.H., Chen, J.T. and Chang, W.C. (2007) Plant regeneration through direct somatic embryogenesis from leaf explants of Dendrobium. Biol. Plant. 51：346-350. Dodeman, V.L., Ducreux, G. and Kreis, M. (1997) Zygotic embryogenesis versus somatic embryogenesis. J. Exp. Bot. 313：1493-1509. Dressler, R. L. (1981) The Orchids. Harvard University Press, Cambridge. Mass., London. Duncan, D.B. (1955) Multiple range and multiple F test. Biometrics. 11：1-42. Gow, W.P., Chen, J.T. and Chang, W.C. (2008) Influence of growth regulators on direct embryo formation from leaf explants of Phalaenopsis orchids. Acta Physio. plant. 30：507-512. Griesbach, R.J. (1983) The use of indoleacetylamino acids in the in vitro propagation of Phalaenopsis orchids. Sci. Hortic. 19：366-376. Haccius, B. (1978) Question of unicellular origin of non-zygotic embryos in callus cultures. Phytomorphology. 28：74-81. . 54.
(65) Hasegawa, A. and Goi, M. (1987) Shoot-tip culture. J. Jap. Soc. Hortic. Sci. 56：70-78. Hong, P.I., Chen, J.T. and Chang, W.C. (2008) Plant regeneration via protocorm-like body formation and shoot multiplication from seed-derived callus of a maudiae type slipper orchid. Acta Physiol Plant. 30：755－ 759. Huang, L.C. (1998)A procedure for asexual multiplication of Paphiopedilums in vitro. Amer. Orchid Soc. Bull. 274-278. Huang, L. C., Lin, C. J., Kuo, C. I., Huang, B. L. and Murashige, T. (2001) Paphiopedilum cloning in vitro. Sci. Hort. 91：111-121. Huan, L.V.T. and Tanaka, M. (2004) Callus induction from protocorm-like body segments and plant regeneration in Cymbidium（Orchidaceae）. J Hortic Sci Biotechnol. 79：406-410. Huan, L.V.T., Takamura, T. and Tanaka, M. (2004) Callus formation and plant regeneration from callus through somatic embryo structures in Cymbidium orchid. Plant Sci. 166：1443-1449. . 55.
(66) Ishii, Y., Takamura, T., Goi, M. and Tanaka, M. (1998) Callus induction and somatic embryogenesis of Phalaenopsis. Plant Cell Rep. 17：446-450. Jonojit, R., Soumi, N., Madhumita, M. and Nirmalya, B. (2007) Direct and callus-mediated protocorm-like body induction from shoot-tips of Dendrobium chrysotoxum Lindl. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 90：31-39. Kerbauy, G.B. (1984) Plant regeneration of Oncidium varicosum (Orchidaceae) by means of root tip culture. Plant Cell Rep. 3：27-29. Kraus, J.E. and Monterio, W.R. (1989) Formation of protocorm-like bodies from root apices jof Catasetum pileatum (Orchidaceae) cultivated in vitro. I. Morphological aspects. Ann. Bot. 64：491-498. Kuo, H.L., Chen, J.T. and Chang, W.C. (2005) Efficient plant regeneration through. direct. somatic. embryogenesis. from. leaf. explants. of. Phalaenopsis 'Little Steve'. In Vitro Cell. Dev. Biol.– Plant. 41：453-456. Lee, Y. I. and Lee, N. (2003) Plant regeneration from protocrom-derived callus of Cypripedium formosanum. In Vitro Cell. Dev. Biol.Plant. 39： 475-479. . 56.
(67) Lin, Y. H., Chang, C. and Chang, W. C. (2000) Plant regeneration from callus culture of a Paphiopedilum hybrid. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 62：21–25. Lu, M.C. (2004) High frequency plant regeneration from callus culture of Pleione formosana Hayata. Plant Cell Tissue Organ Cult. 78：93-96. Mitra, G.C., Prasad, R.N. and Roy, C.A. (1976) Inorganic salts and differentiation of protocorms in seed-callus of an orchid and correlated changes in its free amino acid content. Indian J Exp Biol. 14：350-351. Mok, M.C., Mok, D.W.S., Armstrong, D.J., Shudo, K., Isogai, Y. and Okamoto, T. (1982) Cytokinin activity of N-phenyl-N’-1,2,3,thiadiazol-5-ylurea (Thidiazuron). Phytochemistry. 21：1509-1511. Morel, G.M. (1960) Producing virus-freeCymbidiums. Amer. Orchid Soc. Bull. 29：495-497. Murashige, T. and Skoog, F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15：473-479. Park, S.Y., Murthy, H.N. and Paek, K.Y. (2000) Mass multiplication protocorm like bodies using bioreactor system and subsequent plant. . 57.
(68) regeneration in phalaenopsis. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 63：67-72. Park, S.Y., Murthy, H.N. and Paek, K.Y. (2002) Rapid propagation of Phalaenopsis form floral stalk-derived leaves. In Vitro Cell. Dev. Biol.-plant. 38：168-172. Park, S.Y., Murthy, H.N. and Paek, K.Y. (2003) Protocorm-like body induction and subsequent plant regeneration from root tip cultures of Doritaenopsis. Plant Sci. 164：919-923. Rittershausen, B. and Rittershausen, W. (2002) The Practical Encyclopedia of Orchids. Lorenz Books, Anness Publishing Inc., New York, pp：256. Rosmah, M., Kuik, S.H., Choo, K.S., Mariam, A.L., Zaleha, A.A. and Rimi, R. (2006) High frequency multiplication of Phalaenopsis gigantea using trimmed bases protocorms technique. Sci. Hort. 111：73-79. Roy, J. and Banerjee, N. (2003) Induction of callus and plant regeneration from shoot-tip explants of Dendrobium funbriatum Lindl. var. oculatum Hk.f. Sci Hortic. 97：333-340. Roy,J., Naha, S., Majumdar, M. and Banerjee, N. (2007) Direct and callus. . 58.
(69) mediated protocorm-like body induction from shoot-tips of Dendrobium chrysotoxum Lindl. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 90：31-39. Sheenhan, T. J. and Sheehan, M. (1994) An Illustrated Survey of Orchid Genera. pp：421. Timber Press Inc., Portland. Shimasaki, K. and Uemoto, S. (1991) Rhizome induction and plantlet regeneration of Cybidium goeringii from flower bud cultures in vitro. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 25：49-52. Shrestha, B.R., Tokuhara, K. and Mii, M. (2007) Plant regeneration from cell suspension-derived protoplasts of Phalaenopsis. Plant Cell Rep. 26： 719-725. Steward, J. and Button, J. (1975) Tissue culture studies in Paphiopedilums. Amer. Orchid Soc. Bull. 44：591-599. Tanaka, M., Hasegawa, A. and Goi, M. (1975) Studies on the clonal propagation of monopodial orchids by tissue culture. I. Formation of protocorm-like bodies from leaf tissues in Phalaenopsis and Vanda. J. Jap. Soc. Hortic. Sci. 44：47-58. . 59.
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