行政院國家科學委員會補助專題研究計畫
□ 成 果 報 告
■期中進度報告
大腸桿菌
cAMP 與 CRP 蛋白質對 ompA 基因 mRNA
穩定性之調控研究
計畫類別：■ 個別型計畫 □ 整合型計畫
計畫編號：NSC 98－2311－B－009－003－MY2
執行期間： 2009 年 8 月 1 日至 2011 年 7 月 31 日
計畫主持人：曾慶平
共同主持人：
計畫參與人員：陳煜沛、林校賢、徐其正
成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：■精簡報告 □完整報告
本成果報告包括以下應繳交之附件：
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處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、
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□涉及專利或其他智慧財產權，□一年□二年後可公開查詢
執行單位：
國立交通大學生物科技學系（所）
中 華 民 國 99 年 5 月 30 日
中文摘要
大 腸 桿 菌 之 small RNA(sRNA)藉 由 序 列 互 補 的 方 式 ， 與 Hfq 協 同 結 合 到 messenger RNA 上 ， 可 調 控 messenger RNAs 穩 定 性 與 轉 譯 。 先 前 研 究 指 出 cAMP-CRP 活 化 一 些 sRNA 基 因 表 現，例 如 Spot42 與 RyeE，並 藉 由 結 合 到 sRNA promoter 區 域 來 調 控 。 cAMP-CRP 在 大 腸 桿 菌 又 扮 演 transcriptional activator
角 色 ， 藉 由 結 合 到 promoter， 增 加 與 RNA polymerase 之 間 的 交 互 作 用 ， 活 化
基 因 的 表 現 。
本 研 究 將 大 腸 桿 菌 野 生 菌 株 與 cya 基 因 突 變 菌 株 ， 分 別 培 養 在 LB 與 LB
加 glucose 培 養 液 ， 結 果 發 現 當 glucose 存 在 或 cya 基 因 突 變 下 ， ompA mRNA
的 表 現 量 明 顯 下 降 ， 結 果 顯 示 cAMP 可 調 控 ompA 基 因 的 表 現 ，我 們 更 進 一 步
分 析 ompA mRNA 在 early log-phase 與 log-phase 的 穩 定 性 ， 發 現 當 cAMP 不 存 在 時，ompA mRNA 穩 定 性 下 降 快 速，結 果 說 明 了 cAMP 可 增 加 ompA mRNA 的 穩 定 性 。
迄 今 cAMP 影 響 mRNA 穩 定 性 的 機 制 並 不 清 楚 ， 我 們 推 測 ompA mRNA
在 post transcription 層 次 上 的 穩 定 性 並 非 藉 由 cAMP 直 接 的 影 響。根 據 northern
實 驗 分 析 野 生 菌 株 與 cya 突 變 菌 株 ， 結 果 顯 示 gcvB、ryhA、dsrA、hfq 基 因 表
現 受 cAMP 所 影 響 。 但 是 rne 基 因 的 表 現 卻 不 受 cAMP 的 影 響 。 經 由 這 樣 的
實 驗 結 果 ， 排 除 了 cAMP-CRP 是 透 過 Rnase E 調 控 ompA mRNA 穩 定 性，未 來
一 年 的 研 究 ， 我 們 將 釐 清 cAMP-CRP 是 如 何 經 由 Hfq 與 sRNA 去 調 控 ompA
mRNA 穩 定 性 。
ABSTRACT
In E. coli, small RNAs primarily serve as regulators with Hfq to modulate messenger RNA stability and translation efficiency by base-pairing with target messenger RNAs. Previous studies have reported that cAMP-CRP regulates small RNA expression by modifying promoter activity, such as spot42 and ryeE gene. As far as we know, the cAMP-CRP acts as a transcriptional activator in E. coli, by binding to promoters and enhancing the interaction with RNA polymerase.
In this research, E. coli wild-type and cya mutant strains were grown in LB and LB+Glc, respectively. We found that the amount of ompA mRNA was down-regulated when glucose was added or cya was mutated. These results suggested that cAMP played a regulatory role on ompA expression. Furthermore, we analyzed ompA mRNA stability in early log-phase and log-phase. When cAMP was absent, the ompA mRNA was degraded rapidly. This result indicated that the stability of ompA mRNA was elevated by cAMP.
So far, the medchanism of cAMP regulation of RNA stability is not clear. In this study, we propose that post-transcription of ompA mRNA was not directly affected by cAMP. According to the northern blot analysis of wild type and cya mutant, the results showed that the expression of gcvB, ryhA, dsrA and hfq was affected by cya. However, rne was not found to regulate by cAMP. Based on these results, We’ll examine Hfq and sRNAs targeting to ompA mRNA and discovered which might indirectly participate in the regulation.
前言與研究目的
在 大 腸 桿 菌 外 膜 蛋 白 質 家 族 中，OmpA 為 主 要 蛋 白 質，功 能 是 維 持 大 腸 桿
菌 外 膜 的 穩 定 性(Wang, 2002)。 先 前 研 究 指 出 ompA 基 因 的 表 現 受 大 腸 桿 菌 轉
錄 因 子 cAMP-CRP 所 活 化 (Gibert and Barbe, 1990)， 而 cAMP-CRP 已 知 在 大 腸
桿 菌 基 因 轉 錄 層 次 上 扮 演 重 要 角 色，可 調 控 超 過 百 餘 基 因，藉 由 結 合 到 基 因 啟
動 子 鄰 近 的 區 域 ， 來 增 強 或 抑 制 該 基 因 的 表 現(Busby et al., 1999)。
Small noncoding RNA(sRNA)分 子 發 現 在 微 生 物 中，由 一 段 很 短 的 RNA 序
列 所 組 成 ， 它 不 會 轉 譯 任 何 蛋 白 質 ， 主 要 功 能 為 調 控 mRNA 的 轉 譯 與 穩 定 性
(Gottesman, 2004)。目 前 在 大 腸 桿 菌 中 已 經 有 超 過 50 個 以 上 的 sRNA 被 發 現 與
鑑 定 ， 大 多 數 的 small RNA 藉 由 序 列 互 補 的 方 式 與 標 定 的 mRNA 作 結 合 ， 影
響 該 mRNA 的 轉 譯 或 穩 定 性 。 先 前 已 有 文 獻 報 導 small RNA 可 調 控 基 因 ， 例
如 在 細 胞 內 Fe 缺 乏 時 ， sRNA RyhB 會 降 低 Fe 儲 存 蛋 白 質 基 因 的 表 現 (Mass´e
and Gottesman, 2002)。 當 細 胞 內 葡 萄 糖 增 加 時 ， Spot 42 sRNA 序 列 與 galK mRNA 互 補 ， 阻 擋 核 醣 體 結 合 位 置 ， 間 接 增 加 GalE 與 GalK 蛋 白 質 的 比 例 (Moller et al., 2002)。而 sRNA 基 因 表 現 本 身 也 受 到 調 控，在 不 同 環 境 條 件 下 ， sRNA 在 細 胞 中 的 量 也 會 有 所 不 同，例 如 當 大 腸 桿 菌 生 長 到 穩 定 後 期 (stationary phase)時， sRNA MicA 會 大 量 的 被 表 現，影 響 OmpA 蛋 白 質 的 表 現 (Rasmussen
et al., 2005)。
以 往 研 究 結 果 認 為 cAMP 為 細 胞 內 轉 錄 因 子 CRP 蛋 白 的 輔 因 子
(cofactor)， 與 CRP 形 成 cAMP-CRP 複 合 物 ， 在 轉 錄 的 層 次 上 ， 可 活 化 或 抑 制
基 因 的 表 現 ， 此 外 cAMP-CRP 複 合 物 藉 由 結 合 到 sRNA 啟 動 子 區 域 活 化 一 些
sRNA 基 因 表 現， 例 如： Spot42、 RyeE(Johansen et al., 2008)。 而 sRNA 在 細 胞
內 又 與 Hfq 共 同 作 用 ， 扮 演 著 調 控 post-transcription 層 次 上 mRNA 的 穩 定 性
或 是 轉 譯 。 所 以 我 們 認 為 cAMP 在 mRNA post- transcription 層 次 上 也 具 有 間
接 調 控 的 功 能，作 用 機 制 可 能 是 藉 由 影 響 sRNA 或 是 Hfq 所 造 成。此 研 究 中 我
們 將 焦 點 擺 在 探 討 post- transcription 層 次 上 ompA mRNA 的 穩 定 性，我 們 發 現
cAMP 存 在 下 ， 提 升 ompA mRNA 的 穩 定 性 ， 但 此 現 象 可 能 不 是 cAMP 直 接 調 控 ompA mRNA 的 穩 定 性 ， 而 是 cAMP 間 接 影 響 sRNA 或 是 Hfq 而 造 成 。 因 此
希 望 能 建 立 模 式 以 了 解 cAMP 影 響 ompA mRNA 穩 定 性 相 關 的 機 制，進 一 步 了
解 大 腸 桿 菌 生 理 與 基 因 調 控 的 關 係 。
研究方法 a. 製備 rne-lacZ operon fusion 菌株
根據Chauhan, A. K.等人所選殖 (cloning) 出的 rne 基因序列，利用 PCR 方法得到 rne 啟動
子 (promoter)，將其構築到 pRS415 質體，將構築好的質體轉型入 E. coli MC4100 菌株。挑
取藍色菌落，利用λ 噬菌體來進行大腸桿菌內基因體重組。
b. β-galactosidase 酵素活性分析
離心收集來的菌體加入緩衝液，將細胞震盪混合均勻。測定細胞內蛋白質含量，再取適當
的細胞懸浮液加含有3.5 μL/mL β-mercaptoethanol，50 μL chloroform 及 25 μL 0.1﹪SDS
(sodium dodecyl sulfate)的緩衝液 (稀釋倍數可依酵素活性大小調整，但最後反應體積為 1 mL)。震盪混和後置於 28 ℃水浴槽中進行實驗，加入 0.25 mL ONPG 後即開始反應。當反
應至呈現淡黃色時，利用2 mL 1 M 的 Na2CO3終止反應。終止反應後取1.5 mL 酵素呈色反 應液以11000 rpm 離心 17 分鐘。儘量吸取上層之液體測定 OD420及OD550吸光值。經由公 式計算即可得β-galactosidase 的酵素活性。 c. 大腸桿菌 total mRNA 製備 將大腸桿菌野生株，與突變株分別培養在LB 或含有 40 mM 葡萄糖的培養液中，培 養至對數生長期，收集菌液樣本，樣本收集後需迅速置於 –80℃的酒精浴冷卻 10 秒 鐘，然後置於冰上，立刻進行離心收取大腸桿菌菌體。所得菌體加入TRI reagemt，
打破菌體，然後以chloroform 進行萃取，接著 sodium acetate，－20℃下進行沉澱，
離心收取沉澱的mRNA，再以 DEPC 處理過的水溶解 mRNA，置於－80℃冰箱保存。
d. 大腸桿菌 mRNA 穩定性測定
將大腸桿菌如上述培養後，收集少量菌液樣本以做為 rifampin 未加入時，時間為 0 分鐘的樣本。然後再收集 150 ml 菌液，立刻加入 1 ml 的 rifampin 溶液 (含 0.1 g rifampin)，並將菌液置於 37℃返復式循環水浴槽繼續震盪培養，之後分別於不同時 間點收取菌液樣本。每次取完樣本後必需立刻置於 －80℃酒精浴冷卻 10 秒鐘，之
後置於冰上。之後mRNA 萃取方法如同大腸桿菌 total mRNA 製備的步驟。
e. Northern blotting analysis
將所萃取的mRNA 樣品，定量後進行 mRNA 的 formaldehye agarose gel 電泳，接著
將電泳後的 mRNA 轉漬到 nylon membrane，然後以 PCR DIG probe synthesis kit (Roche)，所得的 ompA DIG probe 和轉漬過的 nylon membrane 進行雜交反應，接著
再 加 入 anti-DIG-AP 與 ompA DIG probe 形 成 專 一 性 結 合 ， 然 後 以 CSPD
chemiluminescence (Roche) 進行免疫偵測。
結果與討論
一. 轉 錄 後 層 次 上 cAMP 影 響 ompA mRNA 穩 定 性
本 實 驗 觀 察 菌 體 生 長 至 早 期 對 數 生 長 期 與 進 入 對 數 生 長 期(O.D 0.3 & 0.5)
時 ，cAMP 在 轉 錄 後 層 次 上 是 否 影 響 ompA mRNA 穩 定 性 。
將 E. coli BW25113 野 生 株 (w.t)與 cya 基 因 突 變 的 菌 株 (△cya)， 分 別 培 養
於 LB 培 養 液 與 LB 加 入 40mM 葡 萄 糖 培 養 液 中，在 菌 液 生 長 至 早 期 對 數 生 長
期(O.D 0.3)時，依 據 8 個 時 間 點 (0, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 26min)分 別 取 菌 液 樣 品 ，
然 後 抽 取 總 RNA 並 進 行 北 方 墨 點 法 。 另 外 在 分 別 測 定 對 數 生 長 期 (O.D 0.5)條
件 下 ， ompA mRNA 穩 定 性 ， 相 同 以 上 作 法 敘 述 。
實 驗 結 果 發 現 ， 在 O.D 0.3 與 0.5 條 件 下 ， 野 生 菌 株 培 養 在 LB 培 養 液 與
cya 突 變 菌 株 培 養 在 LB 培 養 液 比 較 下，cya 突 變 菌 株 之 ompA mRNA 穩 定 性 明
顯 下 降(見 圖 一 與 圖 二 )。 尤 其 是 在 O.D 0.3 更 為 明 顯 ， 半 衰 期 由 13.6 分 鐘 下 降
至 3.8 分 鐘 。 而 在 O.D 0.5， 半 衰 期 由 12.3 分 鐘 下 降 至 5.5 分 鐘 。 但 是 比 較 野
生 菌 株 培 養 在 LB 培 養 液 與 野 生 菌 株 培 養 在 LB 外 加 葡 萄 糖 培 養 液 下 ， ompA
mRNA 穩 定 性 卻 沒 有 明 顯 的 變 化。在 O.D 0.3，半 衰 期 也 大 約 分 別 為 13 分 鐘 與 11 分 鐘 左 右 。 而 另 外 cya 突 變 菌 株 培 養 在 LB 外 加 葡 萄 糖 培 養 液 ， 相 較 於 cya
突 變 菌 株 培 養 在 LB 培 養 液，由 ompA mRNA 穩 定 性 變 化 可 看 出 葡 萄 糖 對 cAMP
影 響 的 現 象 消 失 了 。
所 以 由 以 上 結 果 可 知 在 大 腸 桿 菌 生 長 至 早 期 對 數 生 長 期 (OD 0.3)與 對 數
的 存 在 下 明 顯 增 加 ompA mRNA 穩 定 性 。 二. cAMP 對 rne 基因表現的影響
為瞭解cAMP 與 CRP 對 rne 基因表現之影響，將有 rne-lacZ operon fusion 的大腸桿菌
培養於LB 培養液及含有 40 mM 葡萄糖的 LB 培養液中，當菌生長到對數生長期前期，測
其β-galactosidase 活性，結果發現在加入葡萄糖後 rne-lacZ 的表現量則下降 30% 左右。進
一步使用Δcya 突變株及 Δcrp 突變株來探討 rne 基因表現是否受 cAMP 和 CRP 所調控。結
果顯示，Δcya 突變株受葡萄糖抑制現象消失，而 Δcrp 突變株亦具有相同的情形，因此我
們認為在cAMP 與 CRP 影響 rne 基因表現不明顯(圖三)。
三. cAMP 影 響 hfq 基 因 的 表 現
本 實 驗 在 菌 體 生 長 至 對 數 生 長 期 時 ， 利 用 Northern blot 觀 察 cAMP 影 響
hfq 基 因 的 表 現。將 E. coli BW25113 野 生 株 (w.t)與 cya 基 因 突 變 的 菌 株 (△cya)
分 別 培 養 於 LB 培 養 液 與 LB 外 加 葡 萄 糖 培 養 液 ， 實 驗 結 果 在 對 數 生 長 期 時 ， 野 生 株 培 養 於 LB 培 養 液 hfq 基 因 表 現 量 換 算 成 一 倍 ， 野 生 株 培 養 於 LB 外 加 葡 萄 糖 培 養 液 明 顯 上 升 約 3 倍 ， cya 基 因 突 變 的 菌 株 培 養 於 LB 培 養 液 上 升 約 2 倍 ， 而 cya 基 因 突 變 的 菌 株 培 養 於 LB 外 加 葡 萄 糖 培 養 液 上 升 約 2 倍 (見 圖 四)。所 以 在 菌 株 生 長 至 對 數 生 長 期 時，cAMP 的 存 在 明 顯 降 低 hfq 基 因 的 表 現 量 ， 所 以 cAMP 會 阻 礙 hfq 基 因 的 表 現 。
四. cAMP 影 響 small RNA 的 表 現
藉 由 生 物 資 訊 預 測 與 相 關 文獻蒐集，篩 選 出 可 能 會 受 cAMP-CRP 複合體影響的 small RNA，分別為 gcvB、 ryhA、 dsrA 三 個 small RNA。 經 由 圖 五 的 Real-time
quantitative PCR 實 驗 確 認 是 否 受 cAMP 影 響 ，結 果 在 對 數 生 長 期 時，cya 基
因 突 變 的 菌 株 之 gcvB sRNA 的 量 小 於 野 生 株 gcvB sRNA 的 量 而 ryhA 與
dsrA sRNA 的 量 反 而 是 大 於 野 生 株 ryhA sRNA 的 量 ， 經 由 Real-time PCR
確 認 三 個 sRNA 皆 會 受 cAMP 的 影 響，但 是 分 別 為 cAMP 的 存 在 增 加 了 gcvB
sRNA 基 因 的 表 現 ， 及 降 低 ryhA 與 dsrA sRNA 的 表 現 。
參考文獻
1. Busby, S. and R.H. Ebright, Transcription activation by catabolite activator protein (CAP). J Mol Biol, 1999. 293(2): p. 199-213.
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outer-membrane protein OmpA of Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett, 1990. 56(3): p.
307-11.
3. Johansen, J., et al., Down-regulation of outer membrane proteins by noncoding RNAs:
unraveling the cAMP-CRP- and sigmaE-dependent CyaR-ompX regulatory case. J Mol Biol,
2008. 383(1): p. 1-9.
metabolism in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(7): p. 4620-5.
5. Moller, T., et al., Spot 42 RNA mediates discoordinate expression of the E. coli galactose
operon. Genes Dev, 2002. 16(13): p. 1696-706.
6. Rasmussen, A.A., et al., Regulation of ompA mRNA stability: the role of a small regulatory
RNA in growth phase-dependent control. Mol Microbiol, 2005. 58(5): p. 1421-9.
7. Wang, Y., The function of OmpA in Escherichia coli. Biochem Biophys Res Commun, 2002.
292(2): p. 396-401. 附圖: wt/LB Half-live(min):13.62 0 2 4 8 12 16 20 26min wt/LB+Glc Half-live(min):11.27 0 2 4 8 12 16 20 26min △cya/LB Half-live(min):3.75 0 2 4 8 12 16 20 26min △cya/LB+Glc Half-live(min):4.26 0 2 4 8 12 16 20 26min 圖一、大腸桿菌野生株(wt)與 cya 突變菌(△cya)分別培養在 LB 與 LB 外加 40mM 葡萄糖下， 生長至早期對數生長期時(O.D 0.3)，加入 Rifampin 停止培養，並在往後 8 個時間點(0、2、 4、8、12、16、20、26 分鐘)分別抽取總 RNA 進行 Northern blot 分析 ompA mRNA 穩定性 變化。
wt/LB Half-live(min):12.25 0 2 4 8 12 16 20 26min wt/LB+Glc Half-live(min):8.66 0 2 4 8 12 16 20 26min △cya/LB Half-live(min):5.48 0 2 4 8 12 16 20 26min △cya/LB+Glc Half-live(min):4.69 0 2 4 8 12 16 20 26min 圖二、大腸桿菌野生株(wt)與 cya 突變菌(△cya)分別培養在 LB 與 LB 外加 40mM 葡萄糖下， 生長至對數生長期時(O.D 0.5)，加入 Rifampin 停止培養，並在往後 8 個時間點(0、2、4、8、 12、16、20、26 分鐘)分別抽取總 RNA 進行 Northern blot 分析 ompA mRNA 穩定性變化。
圖三、有氧環境下葡萄糖對大腸桿菌rne-lacZ表現之影響。將具有rne-lacZ的野生株 與突變株分別培養於LB或含40mM葡萄糖的LB培養液中，進行批次培養，當菌體 生長達對數生長期前期測其 rne-lacZ 的β - galactosidase 活性。□ LB；■ LB+40mM 葡萄糖。 ompA mRNA 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
Wild Type △cya △crp
β-galactos
id
(A)
wt
△cya
LB LB+Glc LB LB+Glc
(B)
圖四、(A)大腸桿菌野生株(wt)與cya突變菌(△cya)分別培養在 LB 與 LB 外加 40mM 葡萄糖
下，生長至早期對數生長期時(O.D 0.3)，停止培養並抽取總 RNA 進行 Northern blot，觀
察hfq mRNA 基因表現的變化。(B)internal control 23S 與 16S 電泳圖。
Q‐PCR gcvB, ryhA, dsrA
0 1 2
wt LB/GcvB cya LB/gcvB wt LB/ryhA cya LB/ryhA wt LB/dsrA cya LB/dsrA
23s 16s
hfq mRN
A
圖五、Real-time PCR(Q-PCR) gcvB、ryhA、dsrA sRNA 表現。大腸桿菌野
生株(wt)與 cya 突變菌培養在 LB 培養液，抽取總 RNA 並進行反轉錄成總
cDNA，Q-PCR gcvB、ryhA、dsrA sRNA 基因表現量。野生株(wt)培養在 LB
培養液 gcvB、ryhA、dsrA sRNA 量換算成一倍。縱軸為相對比較數值(relative
