中 華 大 學
碩 士 論 文
不同月齡豬背最長肌微陣列晶片基因表現之比 較
Comparison of microarray mRNA profiles expressed in longissimus dorsi in porcine of
different ages
系 所 別 ： 資訊工程學系碩士班 學號姓名 ：M09402035 張世璋 指導教授 ： 張慧玫 博 士
中華民國 九十八 年 七 月
中文摘要
本研究利用生物晶片以 Cy3/Cy5 的訊號比判定對於豬肉背長肌中發育有 影響的基因，本研究嘗試利用六頭不同月齡在目前最常被飼養的混種豬來尋 找影響豬肉肉質的基因。將此六頭豬以年齡區分，可分成三個時期：出生期(一 週)、成長期(三個月)、成豬(八個月)，取出 Total RNA 樣本之後將帶有人類 cDNA 序列探針的商用 Agilent 生物晶片偵測其中的基因轉錄的表現量，藉此
尋找基因的變化，經過校正、排除極端值、矛盾點之後，將 log2為底的
Cy3/Cy5(M 值)大於 1 或小於-1 進行倍數篩選，經上述步驟之後，本研究發現：
(1)晶片與晶片之間以同一月齡個體所得基因表現量之變化的相關係數具有良 好的相關性，(2) 晶片與晶片之間有一致性，可根據多重複點基因表現量之變 化計算得到，(3) 從出生期到成長期有 1106 個基因屬於表現量上調的基因，
360 個為下調基因，成長期到成豬有 596 個為上調基因，229 個為下調基因，
以 3 個時期做交集發現以本研究所定義的 M 值為條件所取出的基因共有 218 個，以生長時期區分，若出生期到成長期稱為前階段變化，成長期到成豬為 後階段變化，M 值均為負的基因共 52 個，前階段變化 M 值為負且後階段變 化 M 值為正的基因共 27 個，前階段變化 M 值為正且後階段變化 M 值為負的 基因共 24 個，前/後階段變化 M 值均為正的基因共有 116 個。
關鍵字：生長期 mRNA 表現， cDNA 晶片，豬肉質
Abstract
We use mRNA microarrays to study possible differential expressed genes responsible for longissimus dorsi in pork. Six sibling pigs of the most commonly reared hybrid species in Taiwan were collected at three stages: the birth period (at one week), the growing period (at three months), and the finishing period (at eight months). Total RNA samples were obtained and hybridized with the human cDNA probes from Agilent commercial microarrays. The experiment data were normalized, ruled out the unreasonable blank outliers, filtered out with the conflicting data. We set the threshold of the log2 value of the Cy3/Cy5 ratio (M value) greater than 1 or less than -1 for a selection standard. The results showed that (1) the same individuals had good correlation coefficients; (2) within-array comparison of the replicated genes had fair consistency; and (3) there are 1106 up-regulated genes and 360 down-regulated genes from birth to growing term. There are 596 up-regulated genes and 229 down-regulated genes from growing to finishing term. A total of 218 genes showed changes at all three periods, of which 143 genes up-regulated, 75 down-regulated.
Keywords: mRNA growth performance, cDNA microarray, pork meat quality
誌謝
在中華大學的期間，是師長與家人的鼓勵，才能讓我順利完成在研究所的課 業。
首先感謝我的指導老師，張慧玫 博士，感謝她的諄諄教誨與細心指導，總是 讓我在快絕望的時候重新燃起自信心，在我面臨問題與考驗時總是不厭其煩的提 供方向還有糾正，讓我在研究的過程中少走許多迷途，再來感謝提供珍貴研究資 料的金悅祖博士與劉世華老師，感謝您們的大力協助，另外還有黃俊燕博士及系 上老師們給予的生物資訊上的指導，開啟了我對生物資訊的熱誠。
其次要對我的家人獻上誠摯的謝意與歉意，對於我的任性總是不厭其煩的包 容，在我灰心冷意的時候鼓勵我，讓我在最後的最後能夠完成這篇論文。套句陳 之藩先生的話「因為需要感謝的人太多了，就感謝天罷」。
最後，僅將此文獻給我的家人以及在去年甫過世的祖母。
目 錄
中文摘要……….………II 英文摘要………III 誌謝………IV 目錄………...……….……… ....V 圖目錄………...……….………...VII 表目錄………....………. VIII
壹、 文獻探討……….……...1
I. 豬肌肉研究的重要性………..………1
一、豬的經濟性...1
二、豬的肉質組織標準………..……..…2
三、豬的肉質相關基因的研究...4
II. cDNA microarry 簡介……….7
一、原理………..…..7
二、應用原則………....……9
三、Microarry 實驗的流程………..….…..11
四、資料處理………....…..14
(1) 品質控制………..…...…...14
(2) 背景值之扣除………14
(3) 資料轉換與分析………....…14
貳、 研究目的...………...………....…..16
參、 實驗材料與方法...……… ………..……..17
一、實驗動物………...17
二、cDNA 晶片實驗設計………..…...18
三、研究方法……….21
(1) 資料前置處理………..…...21
(2) 差異表現基因篩選………...…...28
肆、 結果與討論………...32
伍、 文獻………...………..……...56
陸、 附錄………...………..…...65
附錄 1 實驗基本資料..……….………...…....65
附錄 2 晶片內所含的資料...70
圖目錄
圖 1：基因晶片實驗的一般流程…..……..….………...13
圖 2：威健公司後續晶片雜合資料報告……….………...18
圖 3：本研究晶片與實驗樣本 cDNA 實驗流程………….…………...20
圖 4：晶片中無放置基因處的訊雜比...21
圖 5：各晶片中調整後 blank 訊雜比...22
圖 6：晶片基本資料...22
圖 7：晶片中 blank 散佈位置...23
圖 8：異常 blank 值刪除前與刪除後.... ...24
圖 9：重複基因的異常訊雜比值之過濾...26
圖 10：標示無效需刪除的基因...27
圖 11：將已刪除無效基因資料合併...27
圖 12：前置資料作業流程...28
圖 13： 單一基因在相同月齡差比較呈正表現與負表現為矛盾數據…….…...30
圖 14： 取 Normalized Exprssion Ratio 取 log2之(M)值數據取大於 1 小於-1 作篩 選標準... ...30
圖 15：篩選基因分群………..31
圖 16：兩組基因表現量...32
表目錄
表 1：豬隻年齡層及採樣部位………..18
表 2：RNA 樣品純度…………...….……….….….…19
表 3：資料前置處理…………...….……….…21
表 4：Blank 刪除誤差點的個數...23
表 5：符合自訂 M 值標準基因...33
表 6：於選定之 M 值中基因表現最顯著變化的前 3 個基因………43
表 7：生長期到成豬端點期之寬幅變化理論變化譜與真實實驗變化譜之比 較……….………47
壹、文獻探討
I. 豬肌肉研究的重要性
一、 豬的經濟性
台灣早期因為曾受多民族統治，因此在豬隻眷養上也十分多元化，在分類 上，台灣本地豬隻均分類為台灣野豬亞種，而外來豬種則可分為四大類：藍瑞 斯、約克夏、杜洛克及漢布夏，在日治時代即有引進外來豬種之記載，到今日 為止，台灣的猪種已經混合了各種豬隻的血緣。
豬肉消費佔全世界紅肉消費的 43%，也是為我國當前農業各單項產業之最 大宗。根據 93 年行政院農委會報告指出：肉豬年產值達 575 億元，占我國畜牧 業總產值之 51.05％，佔農業總產值之 16.06％(洪瑜穗,2004)。為了提升豬隻經 濟價值大多是從 2 方向著手：(一)是提升肉質水準，從消費者的觀點，豬隻的 瘦肉率、豬肉中油脂分布、抗生素含量、生長激素含量等等都是被關心的量測 標準。(二)是提升存活率與適應力，從生產業者的觀點，如何降低成本增加產 值，例如：提升豬隻生產性能，單位母豬或種豬可生產更多健康之仔豬量(Farmer and Petit, 2009)；或者疾病的對抗能力、飼養環境適應(Lebret et al, 2006)、飼料 配方與效率(Apple, 2007; Mulla et al, 2009)；或是選汰豬隻找出優質品種，針對 背脂含量與腰眼肌肉的可遺傳性作育種特徵改善方向，以提升豬肉經濟價值 (Johnson et al, 2003; Schwab et al, 2006) 等方面就顯得非常重要。
就豬隻性能來說，我們可大約分成三大方面，分別是：繁殖性能、生長性 能及屠體性能。
本論文主要探討對於影響猪隻肉質的基因，尋找對於猪隻肉質影響的基因 來改進豬隻肉質上的風味及口感，例如油花的分布、肥肉與瘦肉的比例等。
二、 豬的肉質組織標準
影響豬肉品質的因素主要受遺傳、營養、飼養及屠宰加工條件等多種因素 影響。
肉品質(簡稱肉質)主要指瘦肉的感官品質如色澤、嫩度、多汁性和風味及 營養價值。胴體品質和肉品質既有不同，又有相關。長期以來，養豬業著重追 求選育瘦肉產量高、脂肪含量低的品種，這對肉質帶來了一些不利影響，如現 代豬肉肉色蒼白或深暗，水分滲出或堅硬，豬肉粗糙，且缺少風味。而飼料對 肉品品質有較大影響。
嫩度測定方法
嫩度是豬肉口感的首要物理指標，是豬肉質地和蛋白質結構特性的反映。
嫩度受多種因素影響，如品種。年齡、解剖學部位、肌纖維直徑與密度、大理 石紋程度、羥脯氨酸含量等。
屠宰加工技術對嫩度有顯著影響，特別是正確的電刺激熟化條件和整胸體 冷藏、酶製劑、酸處理和高壓處理都有益於改善嫩度。
宰後胸體冷凍速度的控制可以有效地防止冷收縮和解凍僵直，防止老化。
此外，豬肉在烹飪時熱處理的溫度和時間對嫩度亦有重大影響。肉的嫩度是所 有肉質指標中還不穩定，最易 受干擾的量化指標。因此，嫩度的度量必須對諸 多因素加以嚴格限定。
世界各國為了量化豬隻屠體評級的參考量表，通常會對豬隻屠體訂定適 當量測項目，在北美豬隻屠體評級依生理特徵已有許多細節的規定，包括屠 前體型測量值（活體重、體高、胸深、胸寬、臀寬、胸圍、體長及前管圍）、
屠體性狀（屠體重、屠體長、第 1 肋/最後肋/最後腰此三點之平均背脂厚度）
等。將項目量測值依公式計算來評級，由 AMSA, 1978 與 NSIF, 1987 等規定。
其中 NSIF 在 1987 年訂出一個豬隻屠體特徵量化公式：
72.57
0.1406(
) 2.66(
- ) 0.06(
36.922 溫屠體重 最後肋背脂厚度 背長肌面積)
肌肉百分比
計量單位分別為：溫屠體重以公斤計，最後肋背脂厚度以公分計，背長肌以 平方公分計。(Forrest, 1995)。而如何在屠宰前即能選擇就必須有非侵入性的 量測，研究超音波屠體量測標準或其他量測方法(Rozeboom, 1994；Honikel, 1998)。
藉由特定程序(Honikel, 1998)所獲得屠體的肉質之客觀標準，包括猪隻肉 質色澤(1 級分為淡粉紅灰到 5 級分為深紫紅色)、油花的分布(1 級分為＜2%
肌內脂肪到 5 級分＞8%肌內脂肪)、柔軟度(1 級分為高含水而柔軟到 5 級分 為乾而硬)、以 Warner-Bratzler 機作剪力(shear force)測試、肥肉與瘦肉的比 例、第 9~10 肋間腰眼肌肉化學組成（水分、粗蛋白質含量），將影響風味 及口感( NPPC, 1991)。其中針對豬隻肥肉與瘦肉的比例、蛋白質降解之不同 (Kretchmar et al, 1994)、肌肉化學組成的差異作比較分析(Ryu and Kim, 2006)，一直是許多研究關注的議題。
三、 豬的肉質相關基因的研究
本論文主要探討對於影響猪隻肉質的基因表現譜。所以先就和猪隻肉質的 可能有關連的基因做背景的介紹。一直以來，凡猪隻肉質特徵較優質的豬種，
早就在畜產業從育種觀點仔細的作交配選殖過程中，已經累積有許多品系資 料。豬種在特殊設計雜交後，經過追蹤觀察這些優質猪肉質特徵有那些是可遺 傳後代的，再將可遺傳性的外型(phenotype)肉質特徵，世代觀察這些外型特徵 的重組交換率，經過遺傳統計計算後，可被對應到基因型(genotype)並定位到染 色體相對位址(連鎖基因座)，最終希望能找出對應的標竿基因(marker genes)。
這種根據可遺傳的肉質特徵外型所找到的基因座，稱為 quantitative trait loci(QTL)。當子代外型特徵交換率 1%定義為 1 cM(百分摩爾根單位)，換算成 人類染色體長度約為 100 萬鹼基對(即 1 million base pairs, Mbp)。目前 QTL 解 析度已經從傳統遺傳學的 10 cM 單位進步到約 1.6 cM 單位，也就是相當於約 160 萬鹼基對 DNA 序列密碼，這樣的 DNA 區間很有可能包含 5~10 基因不等。
解析度不夠因而造成 QTL 染色體相對位址上所含連鎖基因座不能對應到唯一 基因的問題存在。
目前現有純種豬生理特徵資料庫(資料詳見
http://www.ansi.okstate.edu/breeds/swine/ )。跨國際的豬隻遺傳連鎖圖譜，稱為 PiGMaP 基因定位計畫(Archibald et al , 1995; Rohrer et al, 1996)，另外豬隻基因 體由蘇格蘭與美國合作解碼，由 Mote 與 Rothschild 專文發表(Mote and
Rothschild, 2006;資料詳見 www.thearkdb.org 與 http://www.animalgenome.org)。
從 1994 年及至 2006 年共 110 篇論文發表了 1675 個豬隻遺傳 QTL 位址，其中 肉質相關表徵，如：脂肪組成、肉質色澤、氣味、柔軟度、質地占 609 個豬隻 遺傳 QTL 位址。QTL 位址中的候選基因要被鑑定為肉質導因基因至少必須符 合 2 個條件：(1) 該基因若人為突變會造成肉質特徵的改變，這必須來自該突 變基因的轉殖動物的表型證據，但所需成本較高。或者在不同豬種之間，天然
自發性肉質特徵差異，檢驗 QTL 位址中的候選基因在各豬種的單鹼基多型性的 關聯，也能找出線索將外型歸屬到特定導因基因。(2) 該基因表達符合肉質發 育的時間性和在符合肉質專一性的細胞型表達。這可以來自該基因在肉質發育 時序或肉質細胞與非肉質細胞對比的基因晶片表達譜分析以得到證據。而從肉 質相關表徵 QTL 位址，目前釐清出少數肉質導因基因（causative genes），包括 位於第 2 條染色體的 IGF2 基因和肌肉發育相關 (Vykoukalová et al, 2006)、Ｃ ＡＳＴ基因和肉質柔軟度相關、PRKAG3 基因（位於第 15 條染色體）、HAL 基因與 RN 基因(Enfält et al, 1997)和肉質相關、MC4R 基因和背脂相關。
如何系統化地整理猪肉質各特徵的 QTL，已經有研究報導(Mohrmann et al, 2006)；然而由於豬基因組解碼與基因標註解析度還不夠完整，猪肉質各特徵的 QTL 所對應的基因仍不能明確鑑定出來。對這議題，特別引發探討猪肉質各特 徵的基因表達譜與猪肉質 QTL 之間的對應關係(Rothschild et al, 2007; Li et al, 2008)。
另一方面，過去以單基因或少數量基因作豬隻肉質研究，也設法找出豬肉 質相關的基因，如：fatty acid binding protein-4(Damon et al, 2006)、heart fatty acid-binding protein (H-FABP) gene，肌肉發育調節基因(Gerbens et al, 1998 and 1999; Urban et al, 2002; Pang et al, 2006)，如：myogenin(Kim et al, 2009)、myf6 與 calcium release channel receptor (CRC) gene。其他報導，如：豬的 myoglobin (Newcom et al, 2004)、2,4-dienoyl CoA reductase 1 (DECR1) (Amills et al, 2005)、
acyl-CoA synthetase long-chain 4 (Mercadé et al, 2006)、cathepsin B (CTSB)、
cystatin B (CSTB)(Russo et al, 2002)、insulin-like growth factor-1(Suzuki et al, 2004)、corticotropin-releasing hormone(Muráni et al, 2006)、Malic enzyme 1(Vidal et al, 2006)、cortisol-binding globulin(Geverink et al, 2006)基因 as a marker gene for selection 被發現與肌纖維特質、瘦肉率、及肉質性狀有關。Leptine 和 leptine receptor(Amills etal, 2008)、splicing factor serine-arginine rich protein (SFRS18) (Wang et al, 2009)、LEPR gene(Mackowski et al, 2005)、phosphodiesterase 4B
(PDE4B)(Kim et al, 2008)基因高油脂比的背長肌有高表現量，表示這些基因與 肌間油花（intramuscular fat, IMF）的多少是正相關的。
II. cDNA microarry 簡介
一、 原理
DNA 微陣列晶片是一種小而高通量的核酸分析技術，利用 DNA 雜交為基 礎，對未知的核酸族群同時間且大量分析的平台。生物晶片起源於 1990 年代早 期，Affymetrix 公司的 Steve Fodor 與其共事者所研發出來的(Fodor et al, 1993)。
數以千萬計的單股 DNA 寡核酸，被直接化學合成或合成後用光學法固定在特 殊材質 (如矽片、玻璃或薄膜等)的表面上。這些特殊材質的表面上單股 DNA 寡核酸，被稱為探針群，通常為序列是已知的。使用者在使用這些預先點好的 DNA 微陣列晶片，是將使用者想探討的基因群(如：不同組織或不同狀態的基 因轉錄體族群)， 也轉換成單股 DNA 並標定螢光作追蹤，當未知樣品中特定序 列的 DNA 與晶片點盤上的探針序列互補時，不同強度的 DNA 分子雜交(DNA hybridization)訊號即可被檢測出來。由於晶片點盤上的每個固定位點的探針序 列是預先挑選紀錄編排過，使雜交互不干擾。依照探針長短，預先點盤 DNA 晶片可分為寡核甘酸、cDNA 和基因片段等類型，又因為主要用於研究基因結 構及其表現，故又稱基因晶片。生物晶片的引子排列以縱，橫兩度空間為設計 藍圖，縱列代表不同的實驗控制組，橫列則代表不同的基因樣本，一般來說，
基因數目比實驗組多，以常識而言，晶片上還需包括重複的引子序列，以作為 比對和參照的基準。
以往傳統的北方墨點法研究基因上的表現，將欲觀察的基因某部分特定的 序列片段以放射性同位素標誌當探針，與由細胞萃取出來的全部 mRNA 進行 雜合反應，經由底片感光以呈現出此基因受調控的情形，一次進行一個或少數 個基因的實驗，但對於研究多基因參與的生化過程，則需要化費相當多的時間 來完成。
而 cDNA microarray 是將 多個代 表基因全 長特性的 EST （expressing sequence tag）片段，將 EST 以打點的方式固定在玻璃片或耐綸薄膜上，與欲進 行雜合的測試樣品及對照樣品分別標誌上兩種不同的螢光染劑，再同時以不同 波長的雷射光去激發對照樣本與待測樣本晶片，並利用電腦程式分析晶片上顏 色的變化，互相對照基因表現的情形。
而生物晶片材質可區分為三大類：陶瓷材質：為玻璃或矽晶片，優點為低 成本，但相對的對於破壞容忍性較差。熱塑性材質：主要是聚丙烯和聚甲基丙 烯，優點為抗濕性強其高破壞容忍度。金屬複合材質：以金和二氧化鈦為主要 材料，除了具備熱塑性材質特性之外，尚有高傳導度之優點。
目前在 cDNA microarray 上，常見以陶瓷及熱塑性材質為主，而金屬複合 材質則用在高壓電晶體上。
二、 應用原則
一般而言，同一生物體中，每個細胞都含有完整的全套基因組(genome)，
但並不是所有的基因在每一個細胞都會同時表達。換言之，每個細胞因不同時 間或空間條件，會選取全基因組中的部分子集合基因群來表達，以反應該時空 狀況。被表達的基因按分子層次，可分為所使用的各基因轉錄出的 mRNA 的總 集合(此時稱為該細胞在該狀態下的轉錄體, transcriptome)；或所使用的各基因 轉譯出的蛋白質的總集合(此時稱為該細胞在該狀態下的蛋白體, proteome)。基 因晶片主要是檢測基因群體轉錄活性的工具，建立在一個假設條件下，就是基 因活性的高低，可能與該基因轉錄出來的 RNA 表現量有某種程度的正相關。
因為 RNA 的高表現量容易造成蛋白質轉譯的高產量，而高產量的蛋白質往往 和高的蛋白質活性相關。我們了解基因蛋白質活性正相關於 RNA 表現量為不 真是有可能的，原因可能是轉譯效率因不同 RNA 或不同時間而有不同、後轉 譯修飾影響蛋白質活性、蛋白質壽命有差異等。不過由於假設基因蛋白質活性 正相關於 RNA 表現量為不真的機率非常小，在初階探討轉錄體作為基因群體 蛋白質活性推論上的參考已經廣被接受。而最真實的驗證這個假設所得結果，
則必須借助後續對各個基因蛋白質活性檢測來證實。
由於 DNA 微陣列晶片是根據 DNA 雜交為基礎，它也被應用在基因體序 列比較、基因群 copy 數的變化等(Pandita et al, 1999)。也有應用蛋白質結合後 染色質絲的變化來，檢測轉錄因子，稱為 chip-ChIP (Harbison et al, 2004)。
在細胞的代謝運作是同時多個基因表現(即 mRNA 和蛋白質)而達成，過去 研究者能夠觀察一個或幾個基因的表現，卻受限於傳統分析方法(北方點墨法和 西方點墨法 ) 之不足，無 法同時偵測所 有同 時表現的基因(Service R F et al,1998)。採用生物晶片分析則可以同時研究多個基因，甚至可達到偵測全基因 組(genome)表現的水準，或是同時比較眾多基因在不同狀態下的表現情況。其 作法是先採用兩種不同來源的 mRNA，分別先以 PCR 反應，標幟不同的螢光 標記 ， 再 經等量混合後 ， 與微陣列 上之 DNA 探針雜 合。此稱為雙雜合 (two-hybrid)。此方法要用兩種不同波長的鐳射激發螢光物質，再分別收集激發 螢光的強度，經電腦圖像處理後，即可確定兩樣品的基因表達差異(Golub TR et al,1999)。
三、 Microarray 實驗的流程
基因晶片大約有 4 大典型步驟：從細胞樣品萃取 RNA，經由反轉錄作成相 對應的互補 DNA (稱作 cDNA)，因為 cDNA 比 RNA 較穩定且不易降解。實驗 組 cDNA 與對照組 cDNA 在經過不同螢光標定後，一起雜交到基因晶片的探針 上。直接觸點(spotting)方式所製成之 cDNA 晶片 如圖一所示，cDNA 片段以機 械原理直接點觸於玻片上的蛋白膜。雜交反應後，利用清洗步驟去除不能被雜 交結合的樣品。清洗後的晶片再以共軛焦顯微鏡獲取點盤螢光影像。基因晶片 螢光影像必須經過數據擷取軟體，在扣除區域背景值後，取得每個點的螢光強 度，此時稱作原始資料(raw data)。若由單一樣品雜交所得讀值直接以個別單點 螢光強度來代表該基因 RNA 表現量，稱作單頻(one channel)型式；若由測試組 與對照組螢光標定再一同競爭雜交，會獲得測試組對對照組螢光比值，稱作雙 頻(two channel)型式。一般測試組基因轉錄群以 cy3(綠色)螢光標定而對照組基 因轉錄群以 cy5(紅色)螢光標定，一同競爭雜交。雜交(hybridization)反應的過程 需要在反應槽(hybridization chamber)內進行，可控制的變因包括溫度，反應時 間，反應目標(Target)濃度等，需要計算的參數有擴散常數(diffusion coefficient)，
附著力常數，反應目標均勻程度等，目前，絕大多數的引子 ─ 目標反應以被 動擴散的方式進行，其反應均勻程度和速率皆有大幅提昇的空間。
雜交時，依探針序列的相同程度所得 Tm 與適當鹽類濃度的緩衝溶液，使 探針與實驗樣品能有專一性序列互補結合。雜交完成後，非專一性序列互補結 合的實驗樣品被沖洗除去。晶片點盤上留下的螢光，經過共軛激發光來讀取，
由掃描儀加上適當軟體判讀螢光訊號點，轉換成數值。一般設定單點中位數像 素值為訊號讀值，以圖像切割法選取反應點，利用過濾器計算背景值，像素值 辨識度設定在允許不超過 1%的反應點為飽和點。此步驟使用特製的掃描器，
以內附的固定波長雷射來刺激，掃描標飾著 Cy3/Cy5 或其它螢光劑的反應後晶
片，晶片上的樣本會放射(emit)出另一種固定波長的光源，此光源將通常以圖像 的方式被紀錄和儲存，以便於影像資料的處理和解析。
雙頻型式對照組之選取，分為狀態對照組(specific reference control)和通用 對照組(common reference control)。狀態對照組，通常是指與實驗細胞樣品只有 一個實驗條件差別的細胞樣品，在時序實驗(time course experiment)中，通常以 前一個時間點的細胞樣品作狀態對照組來作差異比對。通用對照組，通常是指 與實驗細胞樣品同類的細胞(來自各種不同個體或遺傳背景)混合樣品作所有同 性質實驗通用對照組來作差異比對。經過通用對照組比對的結果，可排除個體 差異，方便與其他研究結果結合對照。
圖一：基因晶片實驗的一般流程
研究目的
晶片設計
表達差異
多態性分析
樣品選擇處理
實驗設計
晶片製作
探針設計
點印探針 原位合成 PCR擴增
螢光標定cy3cy5
雜交檢測
圖像掃描
訊號擷取
數據分析
實際應用
資料庫、
模組最佳化、
KEGG 基因濃度
控制系統
四、資料處理
(1) 品質控制
為了確保數據品質與判讀結果的準確性，晶片點盤上探針必須設有內在控 制點(internal control)，內在控制點可分作 2 類：(1)定性內在控制點，包括空白 點、正反應內在控制點(positive control)、負反應內在控制點(negative control)、
無同源性其他物種基因之外參考點。(1)定量內在控制點，利用管家基因、已知 量的基因用來作讀取時定量修正。
(2) 背景值之扣除
晶片點盤上所得初始螢光讀值稱為前景值(foreground)，基因點之外區塊非 來自反應所得螢光讀值稱為背景值(background)，因此基因點上反應所得螢光讀 值應該是前景值扣除掉背景值而得，最終取得整片低背景值並單點高信噪比知 最佳化結果。
(3) 資料轉換與分析
無論單頻或雙頻晶片都是在找 RNA 表現量或雜交訊號點，具有特殊明顯 差異的基因(differential expressed genes, DEGs)，因此如何從原始資料選取特徵 數據(feature extraction) 就顯得非常重要。特徵數據的選擇包括 2 大方向：(1) 倍數變化(fold change)與(2)演算法分析。Microarray 數據資料分析上最早應用的 倍數變化方法(Mutch et al ,2002)，此方法非常直觀，就是先取各基因數據點的 cy3/cy5 的比值，又稱 R/G 值。將基因晶片的 cy3/cy5 的比值從大到小排序，一 般而言，ratio 值介於 0.5 到 2.0 範圍內的基因代表不存在顯著的表達差異，而
超出此範圍之外則被認為基因的表達出現顯著改變。由於實驗條件的不同，此 門檻值的範圍應根據可信區間而有所調整(Tamayo P et al,1999)。此一方法的優 點是不受變數異較大的基因表現值影響、需要的晶片少，節約研究成本。其缺 點則是結論會過於簡單，很難發現更高層次功能的線索因為除了有非常顯著的 倍數變化的基因外，其他變化倍數較小的基因可能因倍數未能超出標準，而遭 剔除在顯著表現基因的行列。這種方法對於實驗初步篩選具特異表達的基因或 許有其簡易可行的優點，但由於倍數取值標準是任意給定的(arbitrary)，因此有 可能會是不恰當的，例如，假設以 2 倍為標準篩選差異表達基因，有可能沒有 任何一筆入選，使實驗的敏感性為零。但在另一種狀況下也可能分析之後會出 現甚多具差異表達的基因。故有人認為倍數篩選法是一種盲目的推測 (Cui X,
2003)。許多已發表的演算法，以各行各列基因表現量的找出適當的中位數來做 標準化或正規化(standardization or normalization)。這些演算法包括 Affymetrix 的 MAS、RMA (Irizarry et al, 2003)、PDNN (Zhang et al, 2003)、dCHIP (Li and Hung Wang, 2001) and ANOVA (Kerr et al, 2001) 。
貳、研究目的
本研究利用生物晶片以 Cy3/Cy5 的訊號比判定對於豬肉背長肌中發育有影響 的基因，本研究嘗試利用六頭不同年齡層在目前最常被飼養的混種豬來尋找 影響豬肉肉質的基因。將此六頭豬以年齡區分，可分成三個時期：出生期(一 週)、成長期(三個月)、成豬(八個月)。
至於一星期, 三個月, 8~9 個月在豬發育代表意義分別是：
1. 一星期：初生和哺乳期
2. 三個月：生長期 growing pigs 結束。這段期間之前，豬體內堆積蛋 白質為主，較少堆積脂肪組織(稱為生長期)。這段期間之 後，則是堆積脂肪組織為主(稱為肥育期)
3. 8~9 個月：此階段豬體重平均約達 120 公斤，為上市屠宰體重 finishing pigs，消費者與學者較關心這階段肉的質與量。
以上三個期間的肌肉生長模式均是增大肌纖維(也就是肌肉細胞)的體積，而不 增加肌纖維數目(肌纖維數目在出生之後即固定不再變動)
參、實驗材料與方法 一、 實驗動物
本研究是利用台灣常用外來豬之混種後代豬的背長肌 (Longissimus dorsi)，依 三個豬隻生長期取樣來作生物晶片的實驗組及對照組，實驗的樣品取自台灣動物 科技研究所。本文所使用的豬隻為源自丹麥的藍瑞斯(Landrace)、英國北部的約克 夏(Yorkshire)、美國東北部的杜洛克(Duroc-Jersey)三種外來豬種的雜交種，是基於 以下的理由：第一，此雜交種是目前台灣主要肉豬品系的來源，這顯示出此雜交 種在台灣有足夠的選汰適應度，有相當的遺傳穩定度。第二，此雜交種是主要肉 豬品系，這顯示出此雜交種符合在台灣消費者的肉質要求，所以值得探討台灣消 費者的肉質要求基因譜，有助於將來育種上更能掌握優肉質取向的選汰。第三，
若能得著此雜交種基因譜，將非常容易與國際間優肉質豬隻品種的基因譜作直接 比對，避免本土豬種遺傳背景值的雜訊處理步驟。針對混種豬特徵的比較早有報 告探討 (Kuhlers et al, 1988)
二、 cDNA 晶片實驗設計
生長期樣本由威健公司(前身為台北進亞生技)來作生物晶片的前端製程和 後續晶片雜合分析，其過程示於圖 2。本研究是採用 Agilent 公司人類 cDNA 微 陣列基因晶片，每個晶片包含 119 行 156 列的探針點，共含 9551 個基因。
圖 2、威健公司後續晶片雜合資料報告
樣本如下：
表 1、豬隻年齡層及採樣部位
豬隻年齡 品種 採樣部位 單隻編號
一星期 混種 背部肌肉 139-2 (後稱為 T1a)
139-3 (後稱為 T1b)
三個月 混種 背部肌肉 196-6 (後稱為 T2a)
196-10(後稱為 T2b)
八個月 混種 背部肌肉 300-4 (後稱為 T3a)
300-5 (後稱為 T3b)
cDNA 樣品分析
在進行實驗分析之前，必須先對實驗樣本作 RNA 的品質檢測〈表 2〉，藉 以判別該樣本品質是否符合生物晶片的要求。
品質確定符合要求之後，再進行實驗配對，並將其 RNA 反轉錄成 cDNA，
並在其上加入螢光標幟。
表 2、RNA 樣品純度
樣本編號 樣本名稱 樣本重量
(g)
RNA 濃度 (μg/μl)
RNA 總量 (μg)
OD260/280 Ratio
#1 139-2(T1a) 0.05 0.83 33.2 2.03
#2 139-3(T1b) 0.28 1.29 51.6 2.01
#3 196-6(T2a) 0.6 2.99 119.6 1.97
#4 196-10(T2b) 0.53 4.06 162.4 1.8
#5 300-4(T3a) 0.27 1.25 50 2.01
#6 300-5(T3b) 0.4 1.55 62 2.01
本實驗樣本委託威健生技公司來製作生物晶片前段製程以及之後晶片的分 析處理，其流程於圖 1 表示。
圖 3、本研究晶片與實驗樣本 cDNA 實驗流程
晶片的準備 樣品的準備
商用晶片(人類DNA探針) 抽取背長肌組織之總RNA
(total RNA)，作為待測樣品
待測樣品RNA轉錄成cDNA
分別標示螢光分子(Cy3為月齡較小 肌肉cDNA， Cy5為月齡較大肌肉 cDNA
雜交
分析圖像數據
三、研究方法
(1) 資料前置處理
(a) blank 無放置基因處之資料處理：
表 3：資料前置處理
晶片代號 樣品時期 Cy3(g)
訊雜比
Cy5(r) 訊雜比 1405 T 1-a Cy3(g) T 2-a Cy5(r)
0.13 1.01 1407 T 1-b Cy3(g) T 2-b Cy5(r)
0.16 0.65 1409 T 1-b Cy3(g) T 3-a Cy5(r)
0.13 0.64 1411 T 2-a Cy3(g) T 3-a Cy5(r)
0.17 0.67 1413 T 2-b Cy3(g) T 3-b Cy5(r)
0.18 0.25
圖 4：晶片中無放置基因處的訊雜比
各晶片 BLANK 訊雜比
-50.00 -30.00 -10.00 10.00 30.00 50.00
0 2 4 6 8 10 12
T 1-aCy3(g) T 2-a Cy5(r)
T 1-b Cy3(g) T 2-b Cy5(r)
T 1-b Cy3(g) T 3-a Cy5(r)
T 2-a Cy3(g) T 3-a Cy5(r)
T 2-b Cy3(g) T 3-b Cy5(r)
圖 5：各晶片中調整後 blank 訊雜比
圖 6：晶片基本資料
Agilent Human 1 cDNA Microarray 的 Raw data 有 18564 點，Extracted data 有 18563 點，空白校正點有 872 點，平均分布在每個晶片點盤上，average blank Cy3 and Cy5 得知本實驗數據和一般雙頻晶片一樣有 Cy3 螢光標定比 Cy5 強的 情形。訊雜比(signal/noise ratio) z value >2 定為誤差點(outlier)，背景扣除後訊號 值≦200 屬於弱訊號，訊號為負值必須過濾掉將成為丟失訊號點。正反應控制
調整後訊雜比
-50 -30 -10 10 30 50
0 5 10 15
調整後訊雜比
片內校正：已經由 LOWESS 內建軟體分析所得，可以 permuted TOST 方法 找出 DEGs。有效數據點先扣除空白點、控制點、矛盾點，在以累積分布函數 取得有效數據點。
片內矛盾點：單片內 4~28 重複次數重複點中，Cy3 Cy5 背景值的 z value >2 定為誤差點(outlier)，將予以濾除。
圖 7：晶片中 blank 散佈位置
表 4：於 Blank 中刪除誤差點的個數
1405 1407 1409 1411 1413
cy3 6 11 9 10 15
cy5 10 10 9 10 9
各晶片中的 Blank 應該接近背景值，我們於是對異常 blank 值作刪除如下 圖 8 (a)和(b)中為 Blank 刪除誤差點前後的比較，目的在於檢查晶片間的誤差，
在刪除誤差點後，晶片的表現值趨於一致。
Blank 散佈位置
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
0 20 40 60 80 100 120 140
row
col Col
(A)
T1a/T2a blank
-50.00 0.00 50.00 100.00 150.00 200.00
1 90 179 268 357 446 535 624 713 802
gBGSubSignal/g BGUsed rBGSubSignall/r BGUsed
(B)
圖 8：異常 blank 值刪除前(A)與刪除後(B)
本圖數值取用自晶片#1405 一星期對三個月背長肌基因變化之比較，晶片#1405~#1413 均予一一以異常 blank 值刪除處理。
(b) 同個體樣本在不同晶片相關係數(r)之處理：
片間校正：將以個體 T2a 與個體 T2b 同個體內樣本在 Cy3 與 Cy5 分別標定 作自身比較(各有 2 組數據)，用以了解系統重複穩定性與數據片間比較數據較 的根據。相關係數(correlation coefficient, r)定義為以下公式：
T1a/T2a blank
-50.00 0.00 50.00 100.00 150.00 200.00
1 52 103 154205 256 307 358 409 460511 562613664 715766817 rBGSubSignal/rBGUsed gBGSubSignal/gBGUsed
相關係數對於分析生物晶片的重複性有一定的參考價值，應用方面可分為 兩種：一是對同一晶片上兩種訊號重複性的評估，二是對兩片重複晶片上同種 mRNA 訊號值做相關系數比較，即片間比較實驗，用以檢測兩片晶片之間的重 複性，在本實驗中，以個體 T2a 與 T2b 來當作片間比較的依據，得到 T2a 的相 關係數為 0.903201，T2b 的相關係數為 0.851194，在過去的研究中指出相關係 數大於 0.7 作為判斷重複實驗成功的依據。
(c) 同個晶片同基因重複點一致率 (r)之處理：
一致率(consistence rate, CR)是用來查核片間矛盾點，單片內 2~28 重複次數重複 點中，Cy3 Cy5 背景值的 z value >2 定為同基因數值非收斂的誤差點(outlier)，
將予以濾除。單數據點中，在不同片間中，M 有出現正值和負值數值，表示基 因表達上調又下調，相互矛盾；或該基因屬於波動型表達模式；或探針序列有 非專一性雜交混雜結果，故不於列入。
(A)
gBGSubSignal/gBGUsed
-50.00 -30.00 -10.00 10.00 30.00 50.00
0 5 10 15 20 25 30
訊雜比值
i
i i
i i
i
y y x x
y y x x r
2
2( )
) (
) )(
(
(B)
圖 9：重複基因的異常訊雜比值之過濾，A 為刪除前，B 為剔除後，
單片內 2~28 重複次數重複點中，取 4 重複以上為基準，Cy3 Cy5 背景值的 z value >2 定為同基因數值非收斂的誤差點(outlier)，將予以濾除。
手足個體差異校正：個體 T2a 與個體 T2b 同胎手足個體(siblings)，享有至 少 1/4 全套基因型相似度，凡與個體 T2a 與個體 T2b 比對後所得的 DEGs，互 相重疊，即可排除個體差異造成的隨機 DEGs，而得到該階段時期特異性表達 DEGs。將以個體 T2a 與個體 T2b 同個體內樣本在 Cy3 與 Cy5 分別標定作整合 自身比較(共有 4 組數據)，用以了解系統重複穩定性與數據片間比較數據較的 根據。
(d) 不能對應到適當序列資料的基因之刪除處理：
在進行生物晶片基因資料分析之前，為了確保資料的正確性(Service et al, 1999)，必須先對資料無效的資料樣本刪除，不適當的資料是指，
(i) 去除表現值在臨界值以下的基因(Chee M,1996)。
(ii) 無基因名稱及無基因表現量的。
(iii) 商用晶片中，不能對應到公開網站適當序列資料的專利基因。
gBGSubSignal/gBGUsed
-50.00 -30.00 -10.00 10.00 30.00 50.00
0 5 10 15 20 25 30
訊雜比值
B
圖 10.標示無效需刪除的基因，黃色部份即為需刪除之部分。
圖 11.將已刪除無效基因，資料合併，上述編號為各基因晶片之數值。
1405 1407 1409 1411 1413
圖 12.前置資料作業流程
(2) 差異表現基因篩選
筛選差異性基因是同時對生物晶片中所有基因做比較，用來探討基因在不 同年齡層中表現的差異程度，藉此可得知哪些基因在何種時期有明顯變化，對 肌肉發育有正面幫助，或是某些基因並無明顯改變，相對上則對肌肉發育並無 幫助，以下是表示本文如何處理差異表現基因的過程說明：
1. 將已篩選後有效晶片之 Normalized Exprssion Ratio 取 log2之值，讓 資料分布從零到無限大變成負無限大到正無限大，使資料分佈趨於 常態分配。
2. 本晶片資料結構可分為兩部份，一為一星期齡對三個月齡，往後以
代號 A 稱之；另一為三個月齡對八個月齡，往後以代號 B 稱之。
各晶片中的原始數據
刪除各晶片中無效的資料
將刪除無效資料後的晶片數具合併成一張資料表
含有效數據整合及基因代號之整合表
3. 因為晶片數據處理為單一晶片，但是因為比對生物有個體差異，因 此在初步篩選之後，先剔除晶片上有個體差異之數值。剔除結果如 圖 14 所示。
4. 將 A、B 兩組的 log2值之單一基因數據各取平均值之數據用以正負 1 篩選，利用 Microsoft 統計軟體 Excel 函數計算，可得多筆符合結 果數據。其篩選結果如圖 15 所示。
5. 將已剔除含有個體差異之矛盾數據後，比對 A、B 各組當中是否有
重複數據。
6. 將四片晶片(1405, 1407, 1411, 1413)分成兩組，其中 1405, 1407 為成 長前期固分為一組，而 1411, 1413 為後期分為一組，將此兩組中 log2(M 值)挑出，粗分此兩組中正表現及負表現之基因為四小組，
即兩大組中各有一正表現和一負表現之基因，再以交叉比對找出各 時期顯著基因，比對方式為正正、正負、負正、負負，表格中即為 篩選結果，當中包含單一晶片之 M 值及兩者平均值。如圖 16：
7. 將上述步驟基因分為四群，基因表現可分為：前後期均下降、前期
下降後期增長、前期增長後期下降、前後期均增長。如圖 17 所示：
圖 13.單一基因在相同月齡差比較呈正表現與負表現為矛盾數據
含有個體差異之矛盾基因篩選，圖中 F 欄及 Q 欄利用判別兩片相同月齡差 的組合比較晶片中，任何單一基因在其中一片為正(上調)表現另外一片為 負(下調)表現的情形。
圖 14. 取 Normalized Exprssion Ratio 取 log2之(M)值數據取大於 1 小於-1 作篩選標準
圖 15.篩選基因分群
前述提到步驟 4 選用取 Normalized Exprssion Ratio 取 log2之(M)值採取正 負 1 當作選特異性基因的標準，這是因為若採用正負 2 當做篩選標準的話，
經由步驟 4 到五僅有 3 筆可認為是具有特異表現的基因，但若採用正負 1 當 做篩選標準，則可得到 218 筆可認為具有表現性差異的基因，此佔生物晶片 中總基因數的 2.18%。
另本研究中嘗試利用兩組晶片相互交乘產生的理論數據與原本晶片中代 號 1409 晶片中的資料相互比較，晶片之間的關係請參照表 2 所示，因為實驗 設計上的關係，因此將晶片代號 1405 及 1411 的 M 值相乘可得到虛擬的一週 齡對 10 個月齡數據，同樣的，在晶片代號 1407 及 1413 上也能得到相同虛擬 數據，將此兩片虛擬數據再與原本晶片代號 1409 的數據照上述篩選步驟進 行，與原本的晶片數據取定義的 M 值之後相互交集，可得到 178 筆可認為具 有表現性差異的基因，這與原本所得到的數據少了 40 筆，此資料列於表 7。
晶片分組(1405, 1407, 1411, 1413)
前階段(1405, 1407)一星期對 三個月
後階段(1411, 1413) 三個月對 八個月
前階段正表現基 因
前階段負表現基 因
後階段正表現基 因
後階段負表現基 因
肆、結果與討論
藉由倍數篩選後，得到具有特異表現的基因數為 220 個，經整理之後將 這 220 個基因分為取 Normalized Exprssion Ratio 取 log2之(M)值正 1 以上和負 1 以下的基因，把特異基因表現值在正 1 以上的設定為正調控，負 1 以下的設 定為負調控，發現在一星期對三個月組中成正調控有 1106 個基因，成負調控 者有 360 個基因，而三個月對八個月組中成正調控者有 596 個基因，成負調 控者有 229 個基因(圖 18)，由於在這兩組中呈現特異性升高或降低的基因在 彼此間有相當的差異，除了顯示這些基因在不同年齡層肌肉的發育趨勢外，
也代表這些基因在不同晶片上的重複性並不高，因此需要做進一步的分群處 理，查看哪些基因在什麼時期是提高或降低。
1106
596 360
229
0 200 400 600 800 1000 1200
前階段 後階段
正調控 負調控
圖 16.兩組基因表現量
A 組為一星期對三個月基因數據之比較， B 組為一星期對三個月基因 數據之比較。
在圖 11 中表示，特異變化完全皆在生物晶片上有表現的基因共有 219 個，其中有 79 個基因是呈現下降，141 個基因是呈現上升。
為了方便檢閱，將這些特異性基因列在下表，此外，為了確認這些基因 是否與哺乳動物有關聯性還有確認是否有相關討論，本研究加入了人與小鼠
是介於人與小鼠之間，因此對於豬、人、小鼠有相關的參考文件均詳細列出，
此外也可了解本研究採用的人類 cDNA 探針晶片偵測豬肌肉基因的表現是否 與已發表過的文獻有關聯性。
以下分為 A、B、C、D 4 個表格，分別對應前後階段基因表現狀況，依 序可分為：(A) 前後階段均有下降 (B) 前階段下降後階段上升 (C) 前階段上 升後階段下降 (D) 前後階段均上升
表 5：符合自訂 M 值標準基因 (A) 前後階段均有下降
Systemati
cName gene name 前階段 後階段 平均
AA24367 5
solute carrier family 1 (neuronal/epithelial high affinity glutamate transporter, system Xag),
member 1
-1.27 -1.00 2.27
AAA3940
6 laminin A-chain -1.08 -1.08 2.16
AB02088 0
Human mRNA for squamous cell carcinoma
antigen SART-3, complete cds. -1.79 -1.17 2.96
AF00298 6
Human platelet activating receptor homolog
(H963) mRNA, complete cds. -1.39 -1.99 3.38
AF03798 9
Human STAT-induced STAT inhibitor-2 mRNA,
complete cds. -1.05 -1.06 2.12
AF07348
2 myotubularin related protein 7 -1.29 -1.18 2.46
AF07351 9
Human small EDRK-rich factor 1, long isoform
(SERF1) mRNA, complete cds. -1.16 -1.32 2.48
AF11710 7
Human IGF-II mRNA-binding protein 2 (IMP-2)
mRNA, complete cds. -1.29 -1.34 2.63
AF12884 6
Human indolethylamine N-methyltransferase
(INMT) mRNA, INMT-1 allele, complete cds. -1.30 -1.26 2.56
AF15688 4
Human RIP-like kinase (RIP3) mRNA, complete
cds. -1.25 -1.48 2.73
AF15864 4
Human metalloprotease-disintegrin (ADAM21)
gene, complete cds. -1.52 -1.5 3.09 AF16755 Human growth inhibitory protein ING1 (ING1) -1.16 -1.16 2.33
1 gene, exon 2 and partial and complete cds.
AF19513
9 Human pinin (PNN) gene, complete cds. -1.75 -1.06 2.81
AF23039 3
Human tripartite motif protein TRIM27 alpha
mRNA, complete cds. -1.21 -1.21 2.42
AF27986 5
Human kinesin-like protein GAKIN mRNA,
complete cds. -1.35 -1.23 2.58
AF28874 2
Human oxysterol binding protein 2 (OSBP2) gene,
complete cds. -1.65 -1.02 2.67
AF31861
6 Human synaptojanin 2 mRNA, complete cds. -1.30 -1.56 2.86
AF34023 4
Human genotype a-b+ Dombrock blood group
glycoprotein (DO) gene, exon 2 and partial cds. -1.02 -1.49 2.51
AJ001873 Homo Sapiens mRNA, partial cDNA sequence
from cDNA selection, DCR1-16.0 -1.17 -1.29 2.46
AJ298105 Human PDX1 gene for lipoyl-containing
component X, exons 1-11. -1.34 -1.31 2.64
AK00214 9
Human cDNA FLJ11287 fis, clone PLACE1009596, weakly similar to
VEGETATIBLE INCOMPATIBILITY PROTEIN HET-E-1.
-1.07 -1.57 2.64
AK02481
8 matrix metalloproteinase 1 (interstitial collagenase) -1.05 -1.11 2.16
BC00420 7
Human, protein kinase Chk2, clone MGC:4081
IMAGE:3532866, mRNA, complete cds. -1.34 -1.66 3.00
BC00774 1
Human, Similar to delta-like homolog (Drosophila), clone MGC:12806 IMAGE:4128269,
mRNA, complete cds.
-1.55 -1.70 3.25
BC00911 7
Human, chondroitin sulfate proteoglycan BEHAB/brevican, clone MGC:18150 IMAGE:4154474, mRNA, complete cds.
-1.38 -1.71 3.09
BC00992 4
Human, Similar to neuronal pentraxin 2, clone MGC:3292 IMAGE:3508049, mRNA, complete
cds.
-1.13 -1.03 2.16
BE67632
0 lymphoid nuclear protein related to AF4 -1.13 -1.44 2.56
BF807922 alkaline phosphatase, placental-like 2 -1.39 -1.09 2.48
D15049 Human mRNA for protein tyrosine phosphatase -1.60 -1.06 2.67
precursor, complete cds.
D32201 Human mRNA for adrenergic receptor alpha 1C
isoform 3, complete cds. -1.22 -1.14 2.36
D78155 Human mRNA for rasGTPase activating protein,
complete cds. -1.10 -1.44 2.54
K01383 Human metallothionein-I-A gene, complete coding
sequence. -1.88 -1.06 2.94
L23808 Human metalloprotease (HME) mRNA, complete
cds. -1.32 -1.29 2.60 L34640 Human platelet/endothelial cell adhesion
molecule-1 (PECAM-1) gene, exons 7, 8 and 9. -1.39 -1.22 2.61
L35545 Human endothelial cell protein C/APC receptor
(EPCR) mRNA, complete cds. -1.29 -1.16 2.45
M26393 Human short chain acyl-CoA dehydrogenase
mRNA, complete cds. -1.50 -1.29 2.79
M60974 Human growth arrest and DNA-damage-inducible
protein (gadd45) mRNA, complete cds. -1.19 -1.30 2.49
M88163 Human global transcription activator homologous
sequence mRNA, complete cds. -1.70 -1.40 3.10
U09648 Human carnitine palmitoyltransferase II precursor
(CPT1) mRNA, complete cds. -1.55 -1.18 2.73
U28282 Human zinc finger protein (ZNF741) mRNA,
complete cds. -1.08 -1.32 2.40 U33881 Human beta 1 integrin isoform C (ITGB1) gene,
exon C. -1.40 -1.14 2.54
U37688 Human RATS1 mRNA, complete cds. -1.17 -1.02 2.20
U51241 Human eosinophil eotaxin receptor (CMKBR3)
gene, complete cds. -1.35 -1.26 2.61
U63810 Human WD40 protein Ciao 1 mRNA, complete
cds. -1.05 -1.22 2.26
U93305
Human A4 differentiation-dependent protein (A4), triple LIM domain protein (LMO6), and synaptophysin (SYP) genes, complete cds; and
calcium channel alpha-1 subunit (CACNA1F) gene, partial cds.
-1.36 -1.22 2.57
X02812 Human mRNA for transforming growth factor-beta
(TGF-beta). -1.38 -1.26 2.64
X07289 Human HF.10 gene mRNA. -1.66 -1.65 3.32
X65873 kinesin family member 5B -2.15 -1.12 3.26
X75308 Human mRNA for collagenase 3. -1.81 -1.61 3.42
X82018 Human mRNA for ZID protein. -1.27 -2.57 3.84
X92744 Human mRNA for hBD-1 protein. -1.19 -1.70 2.89
(B) 前階段下降後階段上升 Systematic
Name gene name 前階段 後階段 平均
M64082 flavin containing monooxygenase 1 -2.60 1.16 1.44
U54617 Human pyruvate dehydrogenase kinase isoform 4
mRNA, complete cds. -2.09 1.08 1.00 NM_00707
5 JM5 protein -2.19 1.29 0.89
AI925424 calcium/calmodulin-dependent protein kinase
kinase 2, beta -1.63 1.01 0.62 BC005155
Human, Similar to Rho guanine nucleotide exchange factor (GEF) 1, clone MGC:3842 IMAGE:3530329, mRNA, complete cds.
-1.74 1.14 0.59
BG680961 fibulin 2 -1.59 1.00 0.58
BI831193 lymphocyte cytosolic protein 2 (SH2
domain-containing leukocyte protein of 76kD) -1.02 1.49 0.47
AF048731 cyclin T2 -1.05 1.52 0.46
Y08136 acid sphingomyelinase-like phosphodiesterase -1.62 1.19 0.42
BG110735 pre-B-cell colony-enhancing factor -1.01 1.37 0.36
BI837083 folate receptor 2 (fetal) -1.38 1.74 0.36
J04970 carboxypeptidase M -2.08 2.42 0.34
AF236085 Human CYP4F11 mRNA, complete cds. -1.09 1.37 0.27
M31211 Human myosin light chain 1 slow a (MLC1sa)
mRNA, complete cds. -1.45 1.71 0.26 BG820096 zinc finger protein 145 (Kruppel-like, expressed
in promyelocytic leukemia) -1.17 1.42 0.25 BF338113 complement component 4B -1.58 1.33 0.24
AB002454 Human mRNA for leukotriene B4
omega-hydroxylase, complete cds. -1.32 1.08 0.22 BG569292 angiogenin, ribonuclease, RNase A family, 5 -1.45 1.63 0.18
polypeptide
AU134033 forkhead box O3A -1.28 1.39 0.11
M98398 Human antigen CD36 (clone 13) mRNA,
complete cds. -1.62 1.50 0.11 NM_00506
0 RAR-related orphan receptor C -1.13 1.02 0.10
AY008841 cytochrome P450 isoform 4F12 -1.41 1.32 0.08
M74099 Human displacement protein (CCAAT) mRNA. -1.02 1.08 0.05
X79440 Human mRNA for NADP+-dependent malic
enzyme. -1.07 1.11 0.04 NM_00345
1 zinc finger protein 177 -1.04 1.08 0.04
BC001401
Human, Similar to sterile-alpha motif and leucine zipper containing kinase AZK, clone MGC:808
IMAGE:3051317, mRNA, complete cds.
-1.27 1.27 0.00
(C) 前階段上升後階段下降 Systematic
Name gene name 前階段 後階段 平均
AA826766 FXYD domain-containing ion transport regulator 3 1.21 -1.09 0.11
AB000114 Human mRNA for osteomodulin, complete cds. 1.84 -1.34 0.49
AB017430 Human mRNA for kinesin-like DNA binding
protein, complete cds. 1.70 -1.06 0.64 AF045458 Human serine/threonine kinase ULK1 (ULK1)
mRNA, complete cds. 1.81 -1.05 0.75 AF119859 P311 protein 3.12 -2.71 0.40
AJ005371 Human mRNA for Glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase. 3.06 -1.03 2.02 AL046845 calponin 1, basic, smooth muscle 1.12 -1.04 0.06
BC001014
methylenetetrahydrofolate dehydrogenase (NADP+
dependent), methenyltetrahydrofolate cyclohydrolase, formyltetrahydrofolate synthetase
1.25 -1.58 0.33
BC001157
Human, RAB33A, member RAS oncogene family, clone MGC:1488 IMAGE:3510745, mRNA,
complete cds.
1.01 -1.07 0.065
BC001350 arginase, type II 4.10 -2.46 1.63
BC001454 phosphoenolpyruvate carboxykinase 2 1.44 -2.46 1.03
(mitochondrial)
BC007031 Human, elastase 1, pancreatic, clone MGC:12394
IMAGE:3950124, mRNA, complete cds. 1.29 -1.04 0.24 BC009288
Human, nuclear receptor subfamily 4, group A, member 2, clone MGC:14354 IMAGE:4298967,
mRNA, complete cds.
1.62 -1.67 0.04
BC012738 Wiskott-Aldrich syndrome
(eczema-thrombocytopenia) 1.79 -1.04 0.74 BF690275 pyruvate kinase, muscle 4.33 -1.11 3.21
BG400371 phosphoserine aminotransferase 2.39 -1.37 1.01
K01911 neuropeptide Y 1.63 -1.03 0.58
NM_00213
5 nuclear receptor subfamily 4, group A, member 1 2.47 -1.2 1.26
NM_00731
7 kinesin-like 4 2.31 -1.61 0.69
NM_01584
9 pancreatic elastase IIB 1.73 -1.2 0.52
U91641 alpha2,8-sialyltransferase 1.35 -1.26 0.08
X04327 2,3-bisphosphoglycerate mutase 2.65 -1.04 1.59
X63575 Human mRNA for plasma membrane calcium
ATPase. 1.77 -1.10 0.66 Y10275 phosphoserine phosphatase 1.83 -1.54 0.27
(D) 前後階段均上升 Systematic
Name gene name 前階段 後階段 平均
AA143153 cytochrome P450, subfamily XIA (cholesterol side
chain cleavage) 1.29 1.11 2.40 AA593632 S100 calcium-binding protein A2 1.08 1.04 2.12
AA768000 f-box and leucine-rich repeat protein 5 1.28 1.69 2.97
AA843678 M-phase phosphoprotein 9 1.05 1.47 2.52
AA863199 cadherin 2, type 1, N-cadherin (neuronal) 1.51 1.02 2.53
AB000220 Human mRNA for semaphorin E, complete cds. 1.34 1.11 2.45
AB003184 immunoglobulin superfamily containing
leucine-rich repeat 2.72 1.51 4.24
complete cds.
AB038951 amyotrophic lateral sclerosis 2 (juvenile)
chromosome region, candidate 3 1.23 1.09 2.33 AF000670 E74-like factor 4 (ets domain transcription factor) 1.23 1.59 2.81
AF007140 interleukin enhancer binding factor 3, 90kD 1.14 1.18 2.32
AF007152
Homo sapiens cDNA: FLJ21339 fis, clone COL02601, highly similar to AF007152 Homo sapiens clone 23649 and 23755 unknown mRNA
1.20 1.50 2.70
AF014958 Human chemokine receptor X (CKRX) mRNA,
complete cds. 1.68 1.18 2.86 AF020761 ubiquitin-conjugating enzyme E2D 1 (homologous
to yeast UBC4/5) 1.22 1.40 2.62 AF026692 secreted frizzled-related protein 4 1.12 1.09 2.21
AF027159 Human Ig gamma heavy chain (T6J/g) mRNA,
partial cds. 1.51 3.43 4.94 AF034996 amphiphysin (Stiff-Mann syndrome with breast
cancer 128kD autoantigen) 1.56 1.19 2.75 AF039023 RAN binding protein 6 2.15 1.07 3.22
AF074002 lectin, galactoside-binding, soluble, 8 (galectin 8) 1.71 1.27 2.98
AF101051 claudin 1 1.35 1.04 2.39
AF153605 Human androgen induced protein (AIG-1) mRNA,
complete cds. 1.08 1.14 2.21 AF191017 Human E2IG1 (E2IG1) mRNA, complete cds. 1.02 1.08 2.10
AF199235 Human nicotinic acetylcholine receptor subunit
alpha 10 mRNA, complete cds. 1.31 2.26 3.57 AF230388 ataxia-telangiectasia group D-associated protein 1.08 1.56 2.64
AF329692 Human AFG3L1 isoform 2 mRNA, partial
sequence. 1.01 1.51 2.52 AF384555 nuclear receptor subfamily 1, group H, member 4 1.47 1.35 2.82
AI042325 iduronate 2-sulfatase (Hunter syndrome) 1.11 1.15 2.26
AI061430 ESTs, Highly similar to A60592 T-cell surface
glycoprotein E2 precursor [H.sapiens] 1.85 1.02 2.87 AI186786 Ras-related associated with diabetes 1.19 1.4 2.61
AI279608 claudin 7 1.92 1.11 3.03
AI498125 pvt-1 (murine) oncogene homolog, MYC activator 1.04 1.96 3.00
AI566904 hippocalcin-like 1 1.48 1.07 2.55
AI631542 nucleophosmin/nucleoplasmin 3 1.62 1.09 2.70
AI671747 Homo sapiens cDNA: FLJ21927 fis, clone 1.39 1.14 2.54
HEP04178, highly similar to HSU90909 Human clone 23722 mRNA sequence
AI743597 peroxisomal biogenesis factor 11B 1.13 1.02 2.15
AI962856 Putative prostate cancer tumor suppressor 1.30 1.05 2.35
AJ297436 prostate stem cell antigen 1.20 1.33 2.52
AK021761
Human cDNA FLJ11699 fis, clone HEMBA1005047, highly similar to RAS-RELATED PROTEIN RAB-24.
1.30 1.42 2.72
AK022742
Human cDNA FLJ12680 fis, clone NT2RM4002438, weakly similar to Xenopus
laevis putative Zic3 binding protein mRNA.
1.09 1.02 2.12
AL041002 phosphofructokinase, liver 2.49 1.19 3.68
AL043506 coatomer protein complex, subunit alpha 1.32 1.03 2.35
AL522843 adaptor-related protein complex 1, sigma 1 subunit 1.37 1.15 2.53
AL525471 replication factor C (activator 1) 5 (36.5kD) 2.08 1.11 3.19
AL536237 tubulin, beta, 5 1.18 1.61 2.79
AL545241 galactosidase, beta 1 1.48 1.00 2.47
AL552941 solute carrier family 31 (copper transporters),
member 2 1.37 1.18 2.55 AU121309 coagulation factor II (thrombin) 1.63 1.60 3.23
AU141268 lipase A, lysosomal acid, cholesterol esterase
(Wolman disease) 1.28 1.45 2.73 AV651189 neural precursor cell expressed, developmentally
down-regulated 4 1.10 2.14 3.24 AV713821 S100 calcium-binding protein A4 (calcium protein,
calvasculin, metastasin, murine placental homolog) 1.38 1.16 2.54 AW450911 membrane protein, palmitoylated 2 (MAGUK p55
subfamily member 2) 1.29 1.16 2.45 AW471415 kallikrein B, plasma (Fletcher factor) 1 1.22 1.04 2.26
AW959214 colony stimulating factor 2 receptor, beta,
low-affinity (granulocyte-macrophage) 1.13 1.16 2.28 AW965948 NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1, subcomplex
unknown, 1 (6kD, KFYI) 1.02 1.17 2.20 AW976741 ubiquitin-conjugating enzyme E2L 6 2.11 1.05 3.17
AY029486 Human G-protein gamma subunit 13 mRNA,
complete cds. 1.29 1.53 2.82 BC005280 Human, cyclin H, clone MGC:12330
IMAGE:3930062, mRNA, complete cds. 1.19 1.06 2.25
BC007008 Human, crystallin, alpha B, clone MGC:12326
IMAGE:3933748, mRNA, complete cds. 1.16 1.50 2.66 BC007921
Human, Spi-B transcription factor (Spi-1/PU.1 related), clone MGC:14093 IMAGE:4309499,
mRNA, complete cds.
1.50 1.34 2.84
BC015626 par-6 (partitioning defective 6, C.elegans) homolog
alpha 1.82 1.20 3.02 BE045964 ribonuclease HI, large subunit 1.57 1.22 2.79
BE503729 carbohydrate (keratan sulfate Gal-6)
sulfotransferase 1 1.54 1.41 2.95 BE735810 integrin, beta 4 1.67 1.35 3.02
BE798732 translocase of outer mitochondrial membrane 34 1.06 1.12 2.18
BF726634 crystallin, alpha B 1.30 1.53 2.84
BG110532
ESTs, Highly similar to C560_HUMAN SUCCINATE DEHYDROGENASE
CYTOCHROME B560 SUBUNIT, MITOCHONDRIAL PRECURSOR [H.sapiens]
2.02 1.43 3.45
BG235918 epiregulin 1.50 1.33 2.83
BG235961 formin-like 1.76 1.14 2.90
BG257364 ras homolog gene family, member H 1.24 1.15 2.39
BG272792 tumor necrosis factor (ligand) superfamily,
member 13 1.22 1.54 2.76 BG436824 tumor necrosis factor receptor superfamily,
member 9 1.05 1.16 2.21 BG568800
ESTs, Moderately similar to A Chain A, Human Beta-Glucuronidase At 2.6 A Resolution {SUB
21-633 [H.sapiens]
1.14 1.18 2.32
BG697981 glutathione transferase zeta 1 (maleylacetoacetate
isomerase) 1.14 1.51 2.65 BG748809
v-rel avian reticuloendotheliosis viral oncogene homolog B (nuclear factor of kappa light
polypeptide gene enhancer in B-cells 3)
1.50 1.41 2.91
BG754034 Spi-B transcription factor (Spi-1/PU.1 related) 1.05 1.07 2.12
BG761337 carbamoyl-phosphate synthetase 1, mitochondrial 1.50 1.10 2.60
BG822570 glutathione peroxidase 2 (gastrointestinal) 1.80 1.47 3.28
D43945 transcription factor EC 2.01 1.29 3.30
D83699 Human brain 3'UTR of mRNA for neuronal death
protein, partial sequence. 1.59 1.12 2.71
D87460 paralemmin 1.16 1.27 2.43
D90042 Human liver arylamine N-acetyltransferase (EC
2.3.1.5) gene. 1.08 1.16 2.24 J04127 cytochrome P450, subfamily XIX (aromatization
of androgens) 1.77 1.82 3.59 L21998 Human intestinal mucin (MUC2) mRNA, complete
cds. 1.34 1.24 2.59 L40027 Human glycogen synthase kinase 3 mRNA,
complete cds. 1.36 1.42 2.78 M27877 Human HPF1 protein, complete cds. 1.25 1.20 2.45
M75914 Human interleukin 5 receptor alpha mRNA,
complete cds. 1.75 1.46 3.21 M82882 E74-like factor 1 (ets domain transcription factor) 1.14 1.05 2.19
NM_00011
1 solute carrier family 26, member 3 1.04 1.20 2.24
NM_00107 7
UDP glycosyltransferase 2 family, polypeptide
B17 1.11 1.04 2.15
NM_00120
3 bone morphogenetic protein receptor, type IB 1.36 1.14 2.51
NM_00199
2 coagulation factor II (thrombin) receptor 2.52 1.00 3.52
NM_00241 0
mannosyl (alpha-1,6-)-glycoprotein
beta-1,6-N-acetyl-glucosaminyltransferase 1.21 1.06 2.28 NM_00286
4 pregnancy-zone protein 2.18 1.23 3.41
NM_00393
5 topoisomerase (DNA) III beta 1.06 1.06 2.12
NM_00468
3 regucalcin (senescence marker protein-30) 1.06 2.82 3.88
NM_00523
2 EphA1 1.02 1.11 2.13
NM_00605
8 Nef-associated factor 1 1.41 1.07 2.48
NM_00654
7 IGF-II mRNA-binding protein 3 1.12 1.04 2.16
S49953 DNA-binding transcriptional activator 1.89 1.12 3.01
S50732 Ig M light chain V region=anti-lipid A antibody
[Human, hybridoma cell line HR78, mRNA Partial, 1.73 1.29 3.02
460 nt].
U17473 calcitonin receptor-like 1.41 1.00 2.42
U28281 Human secretin receptor mRNA, complete cds. 1.04 1.27 2.30
U31215 Human metabotropic glutamate receptor 1 alpha
(mGluR1alpha) mRNA, complete cds. 1.09 1.03 2.13 U38254 Human amiloride sensitive sodium channel delta
subunit (dNaCh) mRNA, complete cds. 1.01 1.70 2.72 U46922 fragile histidine triad gene 1.17 1.35 2.52
U53786 envoplakin 1.02 1.36 2.37
U97018 Human echinoderm microtubule-associated protein
homolog HuEMAP mRNA, complete cds. 1.10 1.08 2.18 X02851 Human mRNA for interleukin-1 precursor (pre
IL-1). 1.65 1.27 2.92 X57814 Human rearranged Ig lambda light chain mRNA. 1.12 2.17 3.28
X57817 Human rearranged Ig lambda light chain mRNA. 1.10 1.89 3.00
X59812 Human CYP 27 mRNA for vitamin D3
25-hydroxylase. 1.12 1.18 2.30 X63282 Human mRNA for alpha2-subunit of soluble
guanylyl cyclase. 1.15 1.53 2.68 X66079 Spi-B transcription factor (Spi-1/PU.1 related) 1.63 1.09 2.72
X74929 Human KRT8 mRNA for keratin 8. 1.18 1.17 2.36
X95762 X-prolyl aminopeptidase (aminopeptidase P)-like 1.24 1.33 2.58
Y09788 mucin 5, subtype B, tracheobronchial 1.23 1.12 2.35
另外從上面 4 張表中各取出表現值特別強烈的前 3 個基因列於下表 6 表 6. 於選定之 M 值中基因表現最顯著變化的前 3 個基因
(A) 於前後階段均呈現下降
SystematicName gene name M 值之平均
(絕對值)
X82018 Human mRNA for ZID protein. 3.85 X75308 Human mRNA for collagenase 3. 3.42 AF002986
Human platelet activating receptor homolog (H963) mRNA,
complete cds.
3.39
(B) 於前階段呈現下降、後階段呈現上升
SystematicName gene name M 值之平
均(絕對值)
M64082 flavin containing monooxygenase 1 1.44 Y08136 acid sphingomyelinase-like
phosphodiesterase 1.00 BG820096 zinc finger protein 145 (Kruppel-like,
expressed in promyelocytic leukemia) 0.89
(C) 於前階段呈現上升、後階段呈現下降
SystematicName gene name M 值之平均
(絕對值)
BF690275 pyruvate kinase, muscle 3.21 AJ005371
Human mRNA for Glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase.
2.02
BC001350 arginase, type II 1.63
(D) 於前後階段均呈現上升
SystematicName gene name M 值之平均
(絕對值)
AF027159 Human Ig gamma heavy chain
(T6J/g) mRNA, partial cds. 4.94 AB003184 immunoglobulin superfamily
containing leucine-rich repeat 4.24 NM_004683 regucalcin (senescence marker
protein-30) 3.88
M64082 基因於本研究為前階段呈現下降、後階段呈現上升，在文獻中 Cloning, primary sequence, and chromosomal mapping of a human
flavin-containing monooxygenase (FMO1).( Dolphin C et al, 1991)指出此基因在
