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蠶蛹蟲草具有顯著之抗氧化性與自由基清除能力

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師大學報:數理與科技類 民國 92 年, 48(1,2) , 13-24

蠶桶蟲草具有顯著之抗氧化性與自由基清除能力

莊曉莉*李祥麟**黃檀溪* *中央研究院植物所 **蘇州應用蒸類研究所 蠶蝠蟲草在自然界中之產量很少,故以生技方法將蝸蟲草菌株 Cor砂ceps militaris LS901 感染家蠶大量培育蠶蝙蟲草,本文對此新產品之萃取液的抗氧化力 及其相關活性加以探討。供測樣品之種類包括 1000 C 水、 40% 乙醇溶液和 100 %乙 醇等三種萃取液。分析結果,顯示以上各萃取液之抗油脂氧化能力與清除 DPPH 所生自由基的能力,均相當於人工合成之抗氧化劑 BHT 。對亞鐵離子之贅合力則 與 EDTA 一樣強。藉由普魯士藍之生成量做為還原力之指標,比較各種萃取液與 BHT 之還原力,在最佳劑量時其相對還原力均達到 BHT 的 80%到 90% 。綜合以上 之結果,證明蠶蝙蟲草具有顯著之抗氧化力與清除自由基之能力。 關鍵詞:蝙蟲草(北冬蟲夏草)、抗氧化性、聲合能力、清除自由基、還原力

氧是維持多數生命所必需的基本成分,但氧在

體內代謝時會形成活性氧 (reactive oxygen species,

ROS)或自由基 (free radical) ,如超氧陰離子自由

基 (superoxide anion radical, O2'-) 、經基自由基

(hydroxyl radical, OH ,)與過氧化氫(非自由基型態

之活性氧)等。過多的自由基或活性氧對人體是有 害的,因為這些成份具有高化學反應性,可造成細 胞內蛋白質、核酸及脂質過氧化,進而破壞細胞、

組織及生物體的正常功能(陳惠英、顏國欽, 1998 ;

Gutteridge, 1993 ; Kehrer, 1993 ; Halliwel1 et a1.,

1992 )。故自由基對健康之傷害是多方面的,例如 細胞膜上之不飽和脂肪酸被自由基氧化會傷害細 胞膜之功能,進而影響細胞之蛋白與核酸之正常作 用(Hal1iwell et 泣, 1992) ;破壞眼睛水晶體,造成 白內障 (Spector et a1., 1995) ;破壞膜島素細胞, 引起糖尿病 (Paolisso et 泣, 1994) ;破壞血管中的 脂肪,引起動脈硬化、阻塞,進而造成高血壓、腦

中風及心肌硬塞(Giugliano et a1., 1995; J ialal

&

E:::I

Devaraj, 1996) ,以及破壞細胞,加速人體老化,甚

至基因突變引起癌症 (Ames, 1990; Kenseler

&

Trush

,

1984; Troll

&

Wiesner

,

1985) 。

為了降低自由基的傷害,細胞有許多抗氧化之 防禦系統,包括非酵素性的抗氧化劑

(non-enzymatic antioxidants)如維生素 C 、維生素 E

和委主脫甘月太(glutathione ; GSH)等,及酵素性的抗氧

化劑 (enzymatic antioxidants) 如超氧化歧化臨

(superoxide dismutase ' SOD) 、觸目每(catalase)及整脫 甘月太過氧化臨(glutathione peroxidase)等。在正常狀 態下生物體之抗氧化系統會與自由基對抗取得一 種動態的平衡以維持正常的生理狀況(陳惠英、顏 國欽, 1998) 。然而隨著年齡增長,此種防禦系統 的能力會隨之降低,而導致體內氧化還原失衡。因 此為了彌補體內抗氧化能力的損失,一方面可強化 體內之抗氧化系統,如提高 SOD 之活性或 GSH 之 含量等,另一方面則可補充體內之抗氧化物,古文營 養學家一直希望找到具有抗氧化性的天然物以期

(2)

14

莊曉莉 丰祥麟黃檀溪 能用以維持體內氧化還原之平衡 (Ramarathnam

et

a

l.,

1995

;缸, 1992 ;葉佳聖、蘇正德,

1993

;劉柏 康等, 1999) 。 冬蟲夏草或蝸蟲草均被認為可能具有減緩老 化的功效(沈均、陶榮芬,

1999)

,而抗氧化或消 除自由基能力之強弱往往叉與抗衰老有關,故有關 蟲草之抗氧化功效一直受到重視 (Zhu

et

泣,

1998)

,實驗結果也證實人工培養之冬蟲夏草的菌 絲體或子實體可以加強體內之 SOD 活性

(Yamaguchi et

此, 2000) ,蝸蟲草菌絲體之抽出物 對小鼠之肝、腎、心、腦等初代細胞(Primary

culture)

之氧化傷害亦有保護作用(管代義等, 1993) 。至於 蟲草本身抗氧化力之強弱,則由於各報告取材不 同,往往得到不同的結果(Li

et

祉, 2001) 。蠶蝸蟲 草是最近發展成功之科技產品,故相關之研究還很 少,根據對C.

militaris

LS901 所培養之蠶蝸蟲草的 分析結果(莊曉莉等,

2003)

,發現這類產品含有多 量冬蟲夏草所無之類胡蘿蔔素 (carotenoids) ,由於 類胡蘿蔔素為天然之抗氧化物,因此本丈就蠶蝙蟲 草之水萃取液及乙醇萃取物的抗氧化力及自由基 清除能力加以研究。

材料與方法

一、實驗材料 蠶蝸蟲草是以蝸蟲草菌株 Cor,吵ceps

militaris

LS901 感染蠶蝸培育而成(莊曉莉等, 2003) 。此菌 株由李祥麟教授採自甘肅烏鞘嶺,經多次單胞(利 用其分生于包子)分離,純化後接種到蠶蝸,再從所 發育之于實體分離培養,並經反覆求證所接種之菌 株與再分離之菌株完全相同。 二、酒劑與藥品 無水乙醇 (ethanol) 、二丁基甲萃 (butylated

hydroxytoluene

, BHT) 與甲醇 (CH30H) 是購自台灣

默克(MERCK) 。亞麻油酸(1inoleic

acid)

,硫氧酸鼓

(N

H

4

SCN)

,氯化亞鐵 (FeCh-4H20) ,磷酸二氫餌

(即-hP04) , α,α-ß-picrylhydrazyl

radical(DPPH)

,赤

血鹽 (K3Fe(SCN)6) ,三氯醋酸(

trichloroacetic

acid)

,

Ferrozine [ 3-(2-pyridyl)-5

,

6-diphenyl-l

,

2

,

4-triazine-4'

,

4" -disulfonic acid sodium

salt]是購自

Sigma 公司。

三、實驗方法

(一)樣品萃取 精秤蠶蝸蟲草樣品 20 克,以研僻磨成粉末, 加入蒸餾水 100

mL

'水滾煮沸 20 分鐘後,經 3M Whatman 濾祇過濾後,濾液以 8000g 離心 10 分鐘, 收集上清液(濃度為 42 mg/mL)冷凍乾燥,所得之乾 燥物儲存於-200 C 備用。進行實驗前以蒸餾水調整 萃取物至各試驗所需之濃度進行測試,此為水萃取 液(WE) ;過濾後所得之濾渣,再加入 100 mL 的 100% 乙回事,放置隔夜,以 8000g 離心 10 分鐘,收 集上清液(濃度為 10 mg/mL)以減壓冷凍乾燥,所得 之乾燥物儲存於-200 C 備用,進行實驗前以 100% 乙 醇溶液調整萃取物至各試驗所需之濃度進行測 試,此為乙醇萃取液(AE-I00) 0 另外,取蠶蝸蟲草 樣品 20 克,以研僻磨成粉末,加入 40% 乙醇溶液 於室溫下放置 3 小時後,經 3M Whatman~慮紙過濾 後,濾液以 8000g 離心 10 分鐘,收集上清液(濃度 為“ mg/mL)以減壓冷凍乾燥,所得之乾燥物儲存 於-200 C 備用,進行實驗前以 40% 乙醇溶液調整萃 取物至各試驗所須知濃度進行測試,此為 40% 乙醇 萃取液(AE-40) 。

(3)

蠶蝙蟲草具有顯著之抗氧化性與自由基清除能力 15 (二)抗油脂過氧化力測定 抗氧化力之測定是以抑制油質之過氧化為指 標,其步驟是綜合參考 Osawa 和 Namiki(1 981)及 Zaino1 等(2003)所述的方法。取 4mL 的亞麻油酸乳 化液(亞麻油酸 2.51 mL '乙醇溶液 100 mL ' 0.05M pH 7.0 磷酸鹽緩衝溶液 8mL 與 3.9mL 蒸餾水混合 後以超音波震盪 30 分鐘)及 0.02 mL 樣品萃取液於 裝有透氣蓋之 25 mL 試管中,均勻混合後於 400 C 震盪培養(每分鐘約 80 次) ,每隔 24 小時取出樣品 0.1 mL' 依序加入 9.7 mL 75% 乙醇溶液(v/v) , 0.1 mL 30%硫氧酸鼓(NH4SCN)及 0.1 mL 20 mM 氯化 亞鐵(FeCh-4H20) ,震盪均勻後反應 3 分鐘,使用 分光儀檢測 500 nm 之吸光值,吸光值越低表示樣 品的抗氧化性越佳。實驗中以 BHT 作為標準品, 並分別以 0.02 mL 的蒸餾水、 40% 乙醇溶液或 100% 乙醇取代樣品做為對照組 O (三)清除 DPPH 自由基能力之測定 自由基能力的清除是參考 Yamaguchi 等(1 998) 所述的方法,取 0.03 mL 的樣品萃取液於 96 孔之 酵素免疫分析盤(ELISA p1ate)之孔中,加入 0.12mL 之 100mM 的Tris-HC1 緩衝液(pH7 .4)混合均勻,再 加入 0.15 mL 之 500mM 的 DPPH 乙醇溶液,均勻 混合後在室溫下靜置 20 分鐘,使用盤式光譜分析

儀(BIO-TEK Power Wave X340)檢測 517 nm 的吸

光值,吸光值越低表示樣品清除自由基的能力越 強。實驗中以 BHT 作為標準品,以水、 40% 乙醇 溶液或 100% 乙醇取代樣品做為對照組。 (四)還原力測定 還原力之測定是參考 Oyaizu(1 986)所述之方 法 O 取 0.2 mL 樣品萃取液,加入 0.2 mL 0.2 M 磷 酸緩衝溶液 (pH 6.6) 及 0 .2 mL 1% 的赤血鹽 (K3Fe(SCN)拍令1. 5 m1 離心管中混合均勻後,於 50 ℃靜置 20 分鐘,再加入 0.2 mL 的 1%三氯醋酸 (trich1oroacetic acid)溶液, 6000g 離心 10 分鐘,取 上清液 0.1 mL 於 96 孔之酵素免疫分析盤之孔中, 加入 0.1 mL 的蒸餾水及 0.02 mL 之 0.1%氯化鐵 (FeC13)溶液,混合均勻後於室溫下反應 10 分鐘, 使用盤式光譜分析儀檢測 700 nm 的吸光值,吸光 值越高表示樣品還原力越強,實驗中以 BHT 作為 標準品 O (五)整合亞鐵能力的測定 參考 Boyer 和 McC1ea可(1987)所述的方法加以 修改,取 0.05 mL 的樣品萃取液於 96 孔之酵素免 疫分析盤之孔中,加入 0.18 mL 的甲醇及 0.05 mL 之 2 mM 的氯化亞鐵(FeCh -4H20)溶液,混合均句 30 秒後再加入 0.01 mL 之 5 mM F errozine '反應 10 分鐘後,使用盤式光譜分析儀檢測 562 nm 的吸光 值,吸光值越低表示樣品贅合亞鐵的能力越強。實 驗中以 EDTA 作為標準品,以水、 40% 乙醇溶液或 100% 乙醇取代樣品做為對照組 O 結果與討論 一、抗油脂之過氧化能力 以硫氧酸鐵法測定蠶蝸蟲草不同萃取物及 BHT 抗亞麻油酸之過氧化情形,發現沒有添加抗 氧化物之亞麻油酸在第三天過氧化物之累積即達 到高峰(圖一)。由於過氧化物並不安定,在氧氣充 份供應下,會再進一步生成複雜之二次代謝產物而 減緩過氧化物之累積,古文於第四天濃度開始下降,

(4)

莊曉莉 李祥麟黃檀溪 仍然維持相同抑制效果(圖一) ,顯示水萃取物和 100% 乙醇萃取物不但具有極佳之抗氧化力,而且 其抗氧化之有效成分很安定。 40% 乙醇萃取物之效 果也很好,只是於第四天開始有減弱之現象,表示 40% 乙醇萃取物之抗氧化性成分比較不安定。 16 然後維持在一個平衡點上。如在亞麻油酸中添加人 工合成之抗氧化劑 BHT(3

mg/mL)

,則油脂之過氧 化現象明顯被抑制,經過五天其抑制效果仍然沒有 改變(圖一)。以蠶輔蟲草之不同萃取物(分別為 3 mg/mL)取代 BHT' 發現水萃取物與 100% 乙醇萃取 物之抑制效果與 BHT 幾乎相同,而且經過五天後

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間一:蠶輔蟲草不同萃取物及自打之抗氧化性比較 註:各萃取物與 BHT 之濃度均為 3mg/mL 。

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BHT;

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:對照組;

0 :

100% Z:醇;

V :

40% 乙醇;口:水萃。 解各萃取物之最佳劑量的範圍,於是進一步比較不 同濃度之水萃取物(1

mg/mL; 3

mg/mL 與 5

mg/mL)

的抗氧化效果。如圖三所示 '5 mg!mL 與 3

mg/mL

之抗氧化力都很好,而且兩者之差別非常有限,至 數據為 4 重複(n=4)之平均值。 由於 BHT 為純化合物,在本測定條件下,其 劑量在 1 mg/mL 即可達到最佳抑制效果,但是蠶蝙 蟲草之各種萃取物均為混合物,其中有些成分與抗 氧化無關,故所需之最佳濃度應高於 BHT' 為瞭

(5)

17 mg/mL 以上,因其結果與水萃取物相似,故圖示從 略。 蠶蜻蟲草具有顯著之抗氧化性與自由基清除能力 於 1 mg/mL 則可能由於有效成分之濃度不足而無 明顯之抗氧化效果,故水萃取物 3 mg/mL 以上為抗 氧化之有效濃度 O 乙醇萃取物之最佳濃度亦在 3

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圖二:不同濃度水萃取物之抗氧化性比較 註:﹒:對照組;

0 :

1m

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mL ;

\l :

3mg/mL ;

<> :

5mg/mL 數據為 4 童複(n=4)之平均值。 萃取液在濃度達到 10 mg/mL 時,其自由基之清除 能力與 BHT 相同,顯示其萃取液中含有清除自由 基之良好化合物,只是含量不足,故需要較高的濃 度。至於 100% 乙醇萃取液之清除能力則略差,在 最佳劑量下約可達到 BHT 之 70% 。 二、清除 DPPH 自由基之能力 在含有 lμmolDPPH 自由基的反應系統中, 分別添加不同濃度之 BHT 及各種蠶蝸蟲草的萃取 液,如圖三所示,蠶蚵蟲草之水萃取液與 40%乙醇

(6)

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(mg/mL)

圍三:比較蠶蜻蟲草不同萃取物及自打對耳科4 自由基之清除能力 註:﹒: BHT ;

0 :

100% 乙醇; y' : 40% 乙醇;口:水萃 數據為 4 重權(n=4)之平均值。

三、 E鐵離子贅合效果

金屬離子的促氧化作用經常是造成脂質過氧 化的主要原因之一,藉由 redox cycyle 反應,只要 少量的金屬離子便可有效的產生自由基,並加速脂 質氧化的進行 (Gordon, 1990) 。在多種金屬離子 中, Fe2+經常是最具影響力的促氧化劑,它會促進 脂質氧化作用的進行(Yamaguchiet al., 1988) ,因此 化合物對亞鐵離子的贅合力往往與其抗氧化有密 切的關係。由圖四顯示,蠶蝸蟲草之水萃取物與乙 醇萃取物在 5 mg/mL 就具有很好的亞鐵離子整合 力,當濃度達到最佳劑量時均與標準品 EDTA 相 同。圓四亦顯示這些萃取物中以 40%乙醇萃取物最 強,只是我們不清楚為何其濃度在高於 15 m

g/

mL 時會有下降的趨勢。

(7)

蠶埔蟲草具有顯著之抗氧化性與自由基清除能力 19

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圖四:蠶蝙蟲草不同萃取物及 EDTA 對亞錯離子之聲合效應 註:﹒: EDTA ;

0 :

100% 乙醇 ;

\l :

40% 乙醇;口:7,/(萃 數據為 4 重複(n=4)之平均值。 四、還原力 還原力的測定是以樣品能否做為良好電子供 應者為指標 O 根據圖五所示,標準品 BHT 的劑量 在 2 mg/mL 以上時其還原力的表現即達高峰且呈 現穩定狀態。蠶蝸蟲草之水萃取物與 40% 乙醇萃取 物約在 3 mg/mL 時即達最佳濃度,其中水萃取物在 濃度從 3 mg岫L 到 30 mg/mL 之間並無明顯的變 化,而 40% 乙醇萃取物則在 15 mg/mL 以上時略有 下降現象。 100% 乙醇萃取液約在 20mg/mL 接近高 峰,然後呈穩定狀態 O 以上結果顯示各種萃取物之 最佳濃度雖然不同,但其還原力都不錯,與標準品 BHT 相比,在最佳濃度時其相對還原力約在 80% 到 90%之間。

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莊曉莉 李祥麟黃檀溪

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Concentration

(mg/mL)

圍五:蠶輛蟲草不同萃取物及自打之還原力比較 註:﹒: BHT;

0 :

100% 乙醇;

v' :

40% 乙回事;口:水萃 數據為 4 重複(n=4)之平均值。 醇萃取液均具有極佳而且穩定之抗氧化或清除自 由基之能力,這些有效成分是否來自蠶蝸蟲草所特 有之類胡蘿蔔素,或尚包括其他化合物,值得進一 步探討。 做為一種保健藥材,蠶蝙蟲草在使用上通常是 與肉類傲煮,或以白酒沖泡飲用,本實驗所用之萃 取條件如 1000 C 水或 40% 乙醇萃取等,基本上與實 際使用情況相似。根據以上之結果,水萃取液或乙

(9)

蠶桶蟲草具有顯著之抗氧化性與自由基清除能力 21

參考文獻

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4

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作者簡介

莊曉莉,台灣大學微生物與生化學研究所博士班學生

Hsiao-Li Chuang is a student in the Institute of Microbiology and Biochemis甘y of National Taiwan University.

e-mail: p650214晶ms24.hinet.net

黃檀溪,中央研究院植物研究所研究員

Tan-Chi Huang is a Researcher in Institute of Botany,

Academia Sinica.

李祥麟,蘇州應用藻類研究所研究員

Xiang-Ling Lee is a Researcher in Applied Algaelogical Institute in Suzhou.

收稿日期: 92 年 09 月 18 日 修正日期: 92 年 10 月 28 日 接受日期: 92 年 II 月的日

(11)

Joumal ofTaiwan Normal University

Mathematics, Science & Technology

2003,48(1,2),13-24

Extracts of Tsarm Yung Chung Tsao which Exhibit Remarkably

Antioxidative and Free-Radical Scavenging Activities

Hsiao-Li Chuang* Xiang-Ling Lee** Tan-Chi Huang*

*Institute ofBotany, Academia Sinica

•• Applied Algaelogicallnstitute in Suzhou

Abstract

The Chinese herbal medicine 、YungChung Tsao" is formed in nature when a species of

lepidopteran pupae is infected with Cordyc中'smilitaris. Since wild Yung Chung Tsao is rare and

difficult to collect, we have developed a method of cu1tivating a similar product by inoculating the

silkworm pupae with Cor,砂ceps militaris LS901; we name this product 、 Tsarm Yung Chung

Tsao." The antioxidative activities and other related properties of extracts (inc1uding hot water, a

40% alcohol solution and 100% alcohol solution) taken from the new product were investigated. Results indicated that the antioxidative action against lipid peroxidation and the scavenging action of the DPPH free radical were just as efficient and effective as when the synthetic antioxidant

butylated hydroxytoluene (BHT) is used. The chelating capacity ofFe2+ was as good as that ofthe

synthetic metal chelater EDT A. As for the reducing actions of the extracts of Tsarm Yung Chung

Tsao and BHT as indicated by the formation of Prussian blue, extracts of optimum concentration

displayed relative activity at 80% to 90% of BHT.

Keywords: antioxidative activity, chelating capacity, free radical, reducing aιtion, Yung Chung

參考文獻

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