行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
國科會專題研究計畫成果報告
Preparation of NSC Project Reports
計畫編號：NSC 91-2113-M-002-020
執行期限：91 年 8 月 1 日至 92 年 7 月 31 日
主持人：何國榮 執行機構: 國立台灣大學化學系
計畫參與人員：陳逸然、鄭杏玲、沈振峰、曾美郡、李福
安、王志宏、白珮瑾 、林佩怡、周秉鋒
一、 中文摘要 本計劃主要分成三個方向 (1) 毛細電泳質譜相關技術之發展與應用。 利用結合兩個斜口毛細管製成低輔助 流毛細電泳質譜介面，介面中的兩個斜口 毛細管，一個作為毛細電泳分離用，另一 個作為供給輔助溶液之用。使用斜口的設 計不但降低了液體流速的需求，並且不需 輔助氣體，因而提升界面的靈敏度。由於 本界面並沒有任何死腔體積(dead volume) 的存在，樣品的毛細電泳分離效率並不會 因為界面而降低分離解析度。另外，此界 面不須減小毛細管開口口徑，並且使用一 般毛細電泳常用的毛細管規格(375m o.d., 75m i.d.)，因此本界面較一般的低流速界 面耐用且容易操作。 除了有效正確的鑑定樣品外，為了增 加分析通量，縮短樣品分析時間，而發展 多重毛細管電泳/電灑法質譜儀。使用四根 鞘流式電灑探針並列在質譜儀進樣孔前， 進樣孔和電灑探針間，配置一片具缺口的 金屬圓轉盤。實驗結果顯示此裝置可以把 四根不同毛細管電泳同步分析所得的訊號 於同一段時間內平行收集，而得到個別毛 細管電泳的層析質譜訊號，達到省時、高 通量的目標。 針 對 carbonyl 化 合 物 ， 以 pentafluorophenylhydrazine(PFPH) 為 衍 生 試劑，進行衍生化反應生成其 PFP-衍生物 (hydrazone)，嘗試瞭解其於大氣壓下電子捕 捉 離 子 化 反 應 的 情 形 。 初 步 以 Nabumentone 及 Testosterone 為分析物，觀 察其 PFB-衍生物的反應。 結果顯示在負 大氣壓化學離子化模式( negative APCI ) 下，PFP-衍生物皆生成 [ M-20 ] 離子，此 現象和傳統低壓下所進行 ECNCI 的結果類 似。 Nabumentone-PFP 及 Testosterone-PFP 之 偵 測 極 限 分 別 為 500fg 及 1pg (SIM mode) ， 和 正 大 氣 壓 化 學 離 子 化 (positive APCI)比較，靈敏度提升了 300 及 25 倍， 和正電灑法(positive ESI) 比較，靈敏度提 升了 30 及 5 倍。 選定實驗室曾以毛細電泳分析之西 藥化合物，做為研究的分析物，改變不同 靈 敏 度 之 分 析 物 的 濃 度 探 討 共 流 析 (coanalyte)對於目標分析物訊號。由實驗 得知當存在離子化效率好且濃度高的化合 物會抑制分析物質譜訊號，所以有必要提 高層析的解析度。 (2) 醣類分析技術之開發應用 負離子電灑法-質譜分析直鏈和分支寡 醣之鍵結點與分支點。先以已知結構之直 鏈寡醣使之閉環標記 (非還原胺化標記法) 上對胺基苯甲酸乙酯後，在質譜/質譜和質 譜/質譜/質譜分析下，觀測到具有鍵結點的 特徵裂解離子。寡醣還原端的特徵裂解相 似於對胺基苯甲酸乙酯閉環標記雙糖之特 徵裂解，然而還原端以外的鍵結點，特徵 裂解與未衍生化之雙糖情形類似。基於這 些特徵裂解離子, 將之應用於分析直鏈之 寡醣，其所有鍵結點皆可明確地被分析。一般看來，位在分支點的糖之特徵裂解與 直鏈之情況有些不同。然而，許多的特徵 離子亦產生於特定分支點。藉由這些特徵 斷裂再加上用於直鏈寡醣之判斷方法，具 有分支之寡醣其所有鍵結點皆可被分析。 (3) 快速分析系統之自動化 吹氣捕捉氣相層析法對於環境中揮發 性有機化合物的微量分析而言乃是廣泛被 採用的方法之一。由於傳統吹氣捕捉氣相 層析質譜法並不具線上偵測的能力，因此 我們結合了連續式吹氣捕捉系統以及快速 氣相層析質譜儀兩項技術建立一套具有線 上偵測能力的快速分析系統。本研究使用 非親水性高分子聚合吸附劑〈Tenax-TA〉 進行樣品捕捉與濃縮，並利用致冷晶片幫 助降溫，以縮短分析時間；配合氣相層析 質譜儀上的事件與繼電器、電動閥門之整 合，即可完成此系統的自動化。目前已成 功以此系統進行線上自來水中消毒副產物 的自動化分析。 關鍵詞：毛細電泳質譜、低流速、多重毛 細管電泳質譜、高通量、pentafluoro phenylhydrazine (PFPH)、大氣壓下電子捕 捉離子化、醣類結構、鍵結點、分支點、 質譜/質譜、自動化快速分析吹氣捕捉氣相 層析法、快速氣相層析質譜儀、非親水性 高分子聚合吸附劑〈Tenax-TA〉、致冷晶 片、消毒副產物、自動化 Abstract
There are three major directions in this research proposal
(1) The development and applications in CE/MS
A simple and rugged capillary electrophoresis- mass spectrometry (CE-MS) interface with low make-up flow has been developed for interfacing capillary zone electrophoresis (CZE) with electrospray-spectrometry (ESI-MS). The
use of dual beveled tips capillaries as the ESI emitter in this interface reduces the requirement of make-up flow rate to operate at optimal performance. In return, sample dilution by make-up flow was minimized and sensitivity was enhanced.
In addition to the sample characterization, how to increase the throughput and minimize the analysis time has been an important subject. Multi-channels CE/MS is studied in this research. Four sheath-flow electrospray probes are placed in front of the sample inlet of the mass spectrometer. Between the probes and the sample inlet, a round metal disk is used as a shield. The results demonstrated that the interface could be used in multi-channels CE/MS analysis and the throughput was increased by a factor of 4.
Atmospheric pressure chemical ionization is a sensitive and wildly applicable technique. The chemical ionization process is initiated through a corona discharge and the HPLC eluents usually are served as chemical ionization reagent at relatively high pressure. Negative APCI of compounds with acidic functional group usually gives the [ M-H ] -ions with a proton transfer process. Recently, Ian A. Blair et al. demonstrated the attomole sensitivity of several PFB-derivatives in electron capture APCI1. In this study, two carbonyl drugs, nabumentone and testosterone were derivatized with pentafluorophenylhydrazine(PFPH). All PFP-derivatives were identified with LC/MS and they all gave (M-20)- ions. The limit of detection of nabumentone-PFP and testosterone-PFP were 500 fg and 1 pg respectively. These results were 300 and 25 fold sensitive than postiveESI.
In previous work, sixteen synthetic drugs had been analysis by CE/ESI-MS. These drugs were chosen as target analytes. To study the effect of coanalyte, compounds with different ESI-MS sensitivities and concentrations were studies. The results showed that analyte with high ESI sensitivity and concentration suppressed the signals of
other analytes.
(2) Linear as well as branched oligosaccharides were labeled with p-aminobenzoic ethyl ester (ABEE) using the glycosylamine closed-ring labeling approach and analyzed by negative-ion electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS). Linkage specific fragment ions of ABEE labeled linear oligosaccharides were proposed based on the MS2 and MS3 data for several ABEE labeled linear oligosaccharides with konwn linkage configurations. Fragmentation at the reducing end was similar to that observed for ABEE disaccharides whereas the fragmentation pattern not involving the reducing end was similar to underivatized disaccharides. Based on these ions, all the linkages of linear oligosaccharides could be unambiguously determined. The fragmentation pattern at the branched sugar was in general not quite the same as the linear one. However, many linkage specific fragment ions were also observed for linkages at the branched sugar. These ions along with the ions proposed for linear oligosaccharides were found to be quite useful for the determination of all the linkages of branched oligosaccharides.
(3) In our study, an analytical method based on continuous-flow purge-and-trap and fast gas chromatography mass-spectrometry has been developed for on-line monitoring of trihalomethane (THMs) in drinking water. Connection the gas chromatography event with the automated valve by using a relay, the system could be automated. An automated system is more suitable for on-line sample analysis.
Keywords: CE/MS, low flow,
high-throughput, multi- channel CE/MS APCI, electron capture, carbonyl, pentafluorophenylhydrazine(PFPH), structure of carbohydrates, linkage, branch, MS/MS, fast automated analysis, continuous-flow purge-and-trap and fast gas chromatography mass-spectrometry, on-line monitoring, trihalomethane (THMs). 二、緣由與目的 Part. A 低輔助流毛細電泳質譜界面的設計 以及於樣品線上濃縮的應用 以質譜儀作為毛細管電泳偵測器可以 提供一個除了電泳速率以外加上以樣品分 子量或是特徵斷裂分離及鑑定樣品的方法 (1-3)。而鞘流界面可說是目前最方便且被廣 泛使用的界面，以鞘流界面將毛細管電泳 與質譜儀連接時，鞘流溶液扮演著幾個角 色，第一、維持毛細電泳分離的電通路。 第二、有機相的鞘流組成降低表面張力以 增加電灑效應。第三、使用不同的 pH 針對 具有不同酸性或是鹼性機團的化合物提高 離子化的程度。 然而，鞘流界面在某些應用上仍存在 著一些缺點，其中最常被提出的就是一般 所使用的鞘流溶液流速（數個 L/min）要 較毛細管電泳的流速（每分鐘數百 nL/min） 高出許多。這使得從毛細電泳分離出的分 析物勢必遭受到大量的稀釋而導致偵測靈 敏度下降。為了解決稀釋的問題最直接的 方法就是使用無鞘流界面的設計，這個界 面的原始設計首先由 R.D Smith 所提出（4） 並經過多方面的改良與設計（5-20） 。 雖然無鞘流界面有上述的優點，但無 鞘流界面本身仍然存在著幾個問題，第 一、毛細管電泳的流速及使用的管徑與電 灑法的最佳流速無法配合，導致電灑過程 較不穩定。第二、由於沒有鞘流溶液中所 含有機相的輔助，降低溶液表面張力，增 加電灑效率以及降低放電的機率，使得緩 衝溶液被限制為必須含有一定比例以上的 有機溶液組成才適用。第三、對於一些不 易在緩衝溶液中形成預成離子（Preformed Ion）的分析物靈敏度不佳。通常調整緩衝 溶液的 pH 值可幫助這類分析物形成較多 的預成離子並提昇偵測靈敏度，但這卻有 可能降低毛細電泳的分離效率。其中第 二、三點縮小了毛細電泳緩衝溶液選擇的 範圍，使得在某些狀況下必須在靈敏度與 分離效率這兩個因素上作取捨。 在最近的研究中我們發現，使用斜口 的毛細管可以在不降低出口口徑的條件 下，藉由改變不同毛細管出口的幾何形
狀，降低電灑法最佳流速的範圍。使用斜 口的設計可使得在電灑的過程中泰勒錐 (Tayler Cone)只在斜口的最尖端形成。相較 於傳統平口的設計，斜口的泰勒錐可以產 生較小泰勒錐。由於泰勒錐的大小與流速 有關（22） ，越低流速所形成的泰勒錐就越 小，然而相同口徑的平口毛細管並無法形 成如此小的泰勒錐。這樣的設計使得電灑 法質譜儀可以在毛細管電泳的流速範圍 下，不須任何輔助液體就可達到靈敏度的 最佳化。 雖然使用斜口毛細管可以解決毛細電 泳流速與電灑法最佳流速無法配合的問 題。然而無鞘流界面緩衝溶液選擇有限的 問題仍待解決。有鑑於此，本計劃利用合 併兩個斜口毛細管設計一個新的毛細管電 泳界面。此界面綜合了傳統鞘流以及無鞘 流界面的優點。兩個毛細管中，一個提供 毛細電泳的分離，另一個提供極低流速（～ 300 nL/min）類似鞘流介面所使用的輔助溶 液。相較於傳統鞘流界面，由於本界面使 用斜口的設計，不需很高流速的輔助溶液 就可達到電灑法的最佳流速。因此輔助溶 液所產生稀釋的效應並不大。而相較於無 鞘流界面，低流速的輔助溶液減少了毛細 電泳緩衝溶液使用上的限制。 Part. B 負離子電灑法質譜/質譜分析標記 發色團寡醣之鍵結點和分支點 本研究中採用保有還原糖環狀結構的 閉環標記衍生化(非還原胺化法)寡醣，在負 離子電灑法-質譜/質譜進行分析，此方法先 前已成功應用於鑑別雙糖之鍵結點、簡單 三醣（maltotriose、isomaltotriose、panose）、 及全為 1-4 鍵結的五醣（maltopentaose）之 分析3。然而，可否用於不同鍵結種類之直 鏈寡醣？對於具有分支之寡醣其鍵結點與 分支點的分析可否適用？單以質譜/質譜、 或(和)質譜/質譜/質譜方法能分析到多大的 寡醣？面對此一極限，我們勢必需要尋求 能逐步水解較大醣鏈的方法，而此方法最 好能自寡醣的還原端逐一將單糖水解下來 (非還原端的結構訊息常是較微弱的)！我 們期望能將此分析方法拓展至所有醣蛋白 之醣鏈鍵結點與分支點分析，從水解醣蛋 白的醣鏈、至? 化(可藉由閉環標記的一特 殊優點：有益於液相層析分離後的 UV 偵 測且? 化後各個醣型式的閉環標記可去 除)、分析各個醣型式、最後獲取各個醣型 式所有鍵結點與分支點之結構訊息！作一 系列的方法開發與探討！ Part. C 電子補捉大氣壓下化學離子化法於 血漿中西藥成分之分析 近 來 ， 液 相 層 析 儀 串 聯 質 譜 儀 (LC/MS/MS)在分析各種生化樣品中藥物 成分方面，展現出極高的靈敏度及廣泛的 應用性。 然而有報導指出；在生化樣品複 雜的基質下，電灑法較易受不同基質影響 而有不同程度之離子抑制現象，進而對定 量分析的精密度及準確度造成誤差(1)。大氣 壓下化學離子化法( atmospheric chemical ionization, APCI )是定另一應用相當廣泛 的一種大氣壓下離子化法(2-3)，其原理是利 用電暈放電( corona discharge )游離周遭氣 體成分生成試劑離子，再和分析物進行一 連串離子-分子反應，產生分析物離子。 大 氣壓下化學離子化法通常進行的是質子傳 遞反應( proton transfer ) ，生成[ M-H ]-或 [ M+H ]+離子。 近來發現(4)，利用電暈放 電 過 程 中 產 生 之 熱 電 子 以 PFB- 衍 生 物 (pentafluorobenzyl-derivatives) 進 行 電 子 捕 捉 離 子 化 可 獲 得 和 傳 統 低 壓 下 所 進 行 ECNCI 類似的結果，靈敏度上亦有 25-100 倍的提升。 本研究針對 carbonyl 化合物， 進 行 衍 生 化 反 應 生 成 其 PFP- 衍 生 物 (hydrazone)，嘗試瞭解其於大氣壓下電子捕 捉離子化反應的情形。 Part. D 建立與設計可程式化自動化連續式 吹氣捕捉法結合快速氣相層析質譜儀與薄 膜送樣結合樣品前濃縮／快速氣相層析質 譜儀兩系統 目前實驗室已建有一套連續式高流速 吹氣/冷凍聚焦捕捉系統 1，其是以傳統吹 氣捕捉氣相層析質譜法的分析流程為基 礎，採用連續式的吹氣捕捉系統以減少樣 品前處理的步驟並縮短樣品前處理的時 間。其在快速氣相層析質譜儀方面，則藉
由使用較短的層析分離管柱來縮短分析時 間，利用快速氣相層析技術來將待測物進 行初步分離，然後再由質譜儀加以測定。 因此本實驗研究的主要目標為改良目前實 驗室已建有之連續式吹氣捕捉法結合快速 氣相層析質譜儀系統外，並且要將此系統 自動化2，以符合在實際應用上之需求。最 後希望能將系統成功的實際應用於分析偵 測水中消毒副產物---三鹵甲烷，並能夠提 供即時而有用的數據。 Part. E 多重毛細管電泳/質譜儀介面之發 展 近年來由於人類基因圖譜計畫、蛋白 質體學或是組合化學等新興科學，所產生 的大量待檢樣品，對分析化學界所帶來的 衝擊是一種新的挑戰。分析技術的開發除 了要求準確外，分析時間也經常是另一個 層次的考量。然而近年來儀器不斷的精 進，遂使得分析速率的瓶頸漸漸轉移到儀 器以外的分析方法上，故有不少分析方法 的發展，著重在如何減少樣品的前處理步 驟，期藉此縮短勞力需求以及人工操作誤 差及時間的損耗。而這樣的做法僅能做到 讓單一樣品的分析時間盡量壓縮，時間上 若要再縮短其效益已然不大。故近來有研 究轉向到如何讓多個樣品於同一時間同步 分析上，進而更進一步的縮短整批樣品的 分析時間。 Part. F 鞘流溶液、緩衝溶液、分析物之解 離常數及界面活性劑對於毛細電泳質譜分 析靈敏度的影響 在質譜儀眾多之游離技術中，近年來 以電灑法最引人重視，因為具有操作方 便，液體可直接導入，再加上具有良好的 靈敏度、分析速度、再現性及廣泛的分析 範圍1-4等優點，儘管電灑游離法有以上的 優點，但是溶液中的其他介質與目標分析 物之間的相互影響，造成無法直接從質譜 所觀測的訊號強度來推算溶液中的分析物 濃度5。因此本實驗主要目的將若以毛細電 泳電灑法質譜儀分析樣品，其層析解析度 不佳致使樣品同一時間流析出來之後進入 質譜儀被分析時，是否會因共流析分析物 (coanalyte)與目標分析物在離子化過程互 相競爭，導致在定量上造成誤差。 三、結果與討論 Part. A 低輔助流毛細電泳質譜界面的設計 以及於樣品線上濃縮的應用 圖 1 所示為本界面的示意圖，此界面 由兩個斜口毛細管所結合而成。當兩個斜 口毛細管結合在一起後原先的泰勒錐也會 結合在一起，此時兩個管柱的溶液就會互 相混合共同形成一個泰勒錐。在毛細電泳 質譜的操作上，我們使用一個斜口毛細管 負責樣品的毛細電泳分離，另一個斜口毛 細管負責補充輔助液體。此設計與一般傳 統或是低流速鞘流界面最大的不同點就是 輔助液體是平行的補充，而不是利用同軸 的外管補充鞘流液體至毛細管尖端。利用 同軸鞘流包覆分離毛細管會使得泰勒錐體 積大幅的提高，就像傳統界面的設計，使 用一個約為 400m 內徑的金屬管提供鞘流 溶 液 ， 這 使 得 泰 勒 錐 的 體 積 就 類 似 於 400m 內徑的金屬管作電灑法所產生的大 小，由於產生較大的泰勒錐，因此需要高 流速的液體維持穩定電灑，因而導致界面 對輔助溶液的需求的大幅提高。 雙 斜 口 介 面 所 產 生 的 泰 勒 錐 極 小，因 此 此 介 面 不 需 要 高 流 速 便 維 持 穩 定 的 電 灑，因 此 界 面 的 設 計 可 以 大 幅 度 的 降 低 樣 品 受 到 輔 助 溶 液 的 稀 釋 效 應，也 可 得 到 輔 助 溶 液 所 帶 來 的 好 處 ( 電 灑 法 穩 定 ， 可 使 用 幫 助 離 子 化 的 添 加 劑 ) 。 由 於 電 灑 法 質 譜 儀 是 屬 於 濃 度 靈 敏 度 的 儀 器，因 此 當 分 析 物 進 入 質 譜 的 濃 度 上 升 時 樣 品 的 偵 測 靈 敏 度 也 會 上 升 。此 外，本 界 面 的 死 腔 體 積 (dead volume)，僅 在 泰 勒 錐 的 部 分 ， 而 本 界 面 為 一 低 流 速 的 界 面 ，泰 勒 錐 極 小 ，因 此 毛 細 電 泳 的 分 離 效 率 不 會 因 為 界 面 的 死 腔 體 積 過 大 而 導 致 分 離 解 析 度 的 下 降 。
圖 2 示為使用本界面在正離子模式下 分離黃連指標成分的結果，此條件的電滲 流流速約為 400 nl/min。本界面在正離子模 式下使用輔助溶液流速在 250 nl/min 時可 得到穩定的電灑信號。相較於傳統的鞘流 界面(圖 3 所示)，使用本界面的信號強度可 以明顯的提升。 圖 4為 在 負 離 子 模 式 下，使 用 本 界 面 所 得 到 的 結 果。在 本 實 驗 中，輔 助 溶 液 的 流 速 在 500 nl/min可 以 得 到 低 稀 釋 倍 率，電 灑 法 穩 定 的 結 果 。在 圖 4 我 們 可 以 看 到 ， 所 有 的 化 合 物 均 可 在 15 分 鐘 內 被 分 離 開 來 。 而 圖 5為 使 用 傳 統 鞘 流 界 面 所 得 到 結 果。比 較 兩 個 界 面 所 得 到 的 結 果 可 以 瞭 解 使 用 本 界 面 在 負 離 子 模 式 下 也 能 得 到 較 高 的 靈 敏 度 。 Liquid A Liquid B
Taylor Cone of Liquid A
Taylor Cone of Liquid B Conductive Coated Beveled Tip Capillary I.D. 75um O.D. 90 um
Electrospray High Voltage
Electrospray High Voltage
Liquid A
Liquid B
ESI High Voltage
Taylor Cone of Liquid A and B Combine 圖 1、雙斜口介面示意圖。 圖 2、雙斜口介面在正離子模式下分離黃連 指標成分的結果，使用 CHES 20mM pH=10 作為緩衝溶液。
MeOH:H2O=4:1+1% Acetic Acid 作為
輔助溶液，流速為 250 nl/min。 RT:0.00 - 22.86SM:7G 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 Time (min) 0 20 40 60 80 1000 20 40 60 80 100 Relative Abundance 0 20 40 60 80 100 NL: 1.83E7 m /z= 319.5-320.5 M S nov0900-3 NL: 1.78E7 m /z= 335.5-336.5 M S nov0900-3 NL: 2.46E7 m /z= 351.5-352.5 M S nov0900-3 Coptisine M/Z=320 Int.=1.83E7 Berberine M/Z=336 Int.=1.78E7 Palmatine M/Z=352 Int.=2.46E7 RT:0.00 - 30.03 SM:7G 0 5 10 15 20 25 30 Time (min) 0 20 40 60 80 1000 20 40 60 80 100 R el ati v e A b u n d a n c e 0 20 40 60 80 100 NL: 1.17E6 m/z= 319.5-320.5 F: + c SIM ms [ 319.50-320.50, 335.50-336.50, 351.50-352.50] MS HUAN_050698_6 NL: 7.86E6 m/z= 335.5-336.5 F: + c SIM ms [ 319.50-320.50, 335.50-336.50, 351.50-352.50] MS HUAN_050698_6 NL: 2.42E6 m/z= 351.5-352.5 F: + c SIM ms [ 319.50-320.50, 335.50-336.50, 351.50-352.50] MS HUAN_050698_6 Coptisine M/Z=320 Int.=1.17E6 Berberine M/Z=336 Int.=7.86E6 Palmatine M/Z=352 Int.=2.42E6
圖 3、傳統鞘流介面介面在正離子模式下分 離黃連指標成分的結果。使用 CHES 20mM pH=10 作為緩衝溶液。MeOH:H2O=4:1+1% Acetic Acid 作為鞘流溶液，流速為 5000 nl/min。 圖 4、雙斜口界面在負離子模式下分析 40 ppm 的酚類化合物，注入的方式為使用重 力注入 15mbar, 15 秒。分離的緩衝溶液為 20mM CHES pH=10 緩衝水溶液。輔助溶液 為 80% 的 IPA 再加上 0.5 % NH4OH，流速 為 500 nl/min。 RT:5.00 - 20.00 SM:7G 6 8 10 12 14 16 18 20 Time (min) 0 50 1000 50 1000 50 100 Relative Abundance 0 50 1000 50 100 N L: 1.80E5 m /z= 137.5-138.5 M S no v2300-1 N L: 5.51E5 m /z= 182.5-183.5 M S no v2300-1 N L: 5.06E5 m /z= 196.5-197.5 M S no v2300-1 N L: 1.13E5 m /z= 194.5-195.5 M S no v2300-1 N L: 3.38E5 m /z= 264.5-265.5 M S no v2300-1 圖 5、傳統鞘流介面在負離子模式下分析 40 ppm 的酚類化合物，注入的方式為 使用重力注入 15mbar, 15 秒。分離 的緩衝溶液為 20mM CHES pH=10 緩衝水溶液。輔助溶液為 80% 的 IPA 再加上 0.5% NH4OH，流速為 5000 nl/min。 RT:5.00 - 20.00 SM:7G 6 8 10 12 14 16 18 20 Time (min) 0 50 1000 50 1000 50 100 Relative Abundance 0 50 1000 50 100 NL: 5.84E6 m/z= 137.5-138.5 MS dec2200-4 NL: 1.31E7 m/z= 182.5-183.5 MS dec2200-4 NL: 8.87E6 m/z= 196.5-197.5 MS dec2200-4 NL: 3.75E5 m/z= 194.5-195.5 MS dec2200-4 NL: 4.26E6 m/z= 264.5-265.5 MS dec2200-4 4-Nitrophenol m/z=138 Int.=5.84E6 2,4-Dinitrophenol m/z=138 Int.=1.31E7 2-Methyl-4,6-Dinitrop henol m/z=197 Int.=8.87E6 2,4,6-Trinitrophenol m/z=195 Int.=3.75E5 2,4,6-Trinitrophenol m/z=195 Int.=3.75E5 4-Nitrophenol m/z=138 Int.=1.80E5 2,4-Dinitrophenol m/z=138 Int.=5.51E5 2-Methyl-4,6-Dinitrophenol m/z=197 Int.=5.06E5 2,4,6-Trinitrophenol m/z=195 Int.=1.13E5 Pentachlorophenol m/z=266 Int.=3.38E5
Part. B 負離子電灑法質譜/質譜分析標記 發色團寡醣之鍵結點和分支點 1. 直鏈寡醣的第一鍵結之裂解與 ABEE 閉環標記雙糖之裂解相似，而第一鍵結 以 外 的 鍵 結 則 與 未 衍 生 化 的 裂 解 相 似，如表 1 所列 ABEE 閉環標記直鏈寡 醣的特徵裂解離子。 2. 大致來說，在分支點的鍵結特徵裂解離 子與直鏈的並不相同，因此導入表 2 來 鑑定分支點的鍵結。 3. 藉由 ABEE 閉環標記/負離子電灑法-質 譜/質譜及(/或) 質譜/質譜/質譜實驗並 利用表 1 和表 2 可清楚地可鑑定出直鏈 及分支寡醣的所有鍵結點。 4. 六醣以上之寡醣，非環原端特徵裂解離 子訊號微弱，需要逐步水解還原端， 產生較小的醣，即可得非環原端結構訊 息。
Table 1. Specific linkage fragment ions for ABEE closed-ring labeled linear oligosaccharides.
Fragments of the first linkage (reducing end )
Fragments other than the reducing end 1-2＊ 0,2X, 0,4X C-18, 0,4A-18, 1,3A 1-3 0,3X No cross-ring fragments 1-4 0,2A-18 0,2A , 0,2A-18 1-6 0,3A C-18, 0,2A, 0,3A, 0,4A
Table 2. Specific linkage fragment ions for linkages at the branched sugars.
Part. C 電子補捉大氣壓下化學離子化法於 血漿中西藥成分之分析 Part. D 建立與設計可程式化自動化連續式 吹氣捕捉法結合快速氣相層析質譜儀與薄 膜送樣結合樣品前濃縮／快速氣相層析質 譜儀兩系統 實驗室已建有之連續式高流速吹氣/冷 凍聚焦捕捉系統將連續式的吹氣捕捉系統 與快速氣相層析質譜儀之優點結合，成為 具有快速分離的能力，而又無須繁雜之樣 品前處理之線上快速分析系統。由於連續 式高流速吹氣/冷凍聚焦捕捉系統利用液態 PFP-derivative of
10ug Testo-PFPHD,5ppm, 80% MeOH,0.8, HyC84.6/50
350 360370 380 390400 410420 430 440450 460470 480490 500 510520 530540 m/z 0 100 % LC900705015 150 (2.559) Cm (141:162-(166:175+136:144)) Scan AP- 1.20e7 448 PFP-derivative of
10ug Nabu-PFPHD,5ppm, 80% MeOH, 0.8, HyC84.6/50
320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 m/z 0 100 % LC900705012 120 (2.069) Cm (107:129-(136:151+90:104)) Scan AP- 2.41e7 388 389
Detection Limits of PFP-derivatives and Non-derivatized Drugs
Linkage the other
linkage at the branched point Fragments for linkages at branch points 1-3 1-4 Z-H (loss of hexose units) 1-6 Z-H (loss of hexose units) 1-4 1-3 0,2A-18, 0,4X/Z-H 1-6 0,2A-18 1-6 1-3 C-18, 0,3A, 0,4A 1-4 0,3A/W
氮將分析物冷凍聚焦於一段毛細空管中， 因此其注入之樣品帶（sample band）較一 般傳統式吸附劑捕捉法為窄，觀察其實驗 所得之圖譜上也可發現較窄的層析峰寬 （四個分析物的質譜層析峰帶寬在 2 秒之 內）；利用液態氮降溫，可大幅縮短降溫 時間，如此則可減少分析的時間，然而， 由於連續式高流速吹氣/冷凍聚焦捕捉系統 為利用空的毛細管進行分析物之吹氣捕 捉，若欲將分析物滯留於空管中，則必須 使用相當低之吸附溫度，以其實驗為例， 其所使用之吸附溫度為-165℃，為避免因 低溫所凝結之水氣干擾實驗結果，高流速 吹氣/冷凍聚焦捕捉系統將樣品注射溫度設 於 0℃，然後再進行升溫，但是，此時被冷 凍聚焦的水氣會在一瞬間大量的進入質譜 儀中，可能會對質譜儀的燈絲造成損害。 為了改善此問題，我們將液態氮以填充固 體吸附劑配合致冷晶片取代，若選擇適當 的吸附劑，可將吸附捕捉的溫度設在室 溫，不會凝結水氣；利用致冷晶片，可將 降溫的效率提高，有效縮短分析時間。此 外，由於連續式高流速吹氣/冷凍聚焦捕捉 系統乃藉由冷凍聚焦注入系統的低溫將分 析物捕捉，但同時隨著吹氣所帶出的水氣 也會被冷凍於此。為了避免過量的水氣被 凍結成冰而阻塞毛細管，所以在系統必須 控制吹氣進樣總體積（purge volume），使 進樣時間內通過的水氣量在毛細管可以承 載的範圍內。所以一旦選定吹氣捕捉毛細 管的管徑，可承受的最大進樣總量也就受 此限制，以選擇 0.32 mm 內徑的毛細管柱 作為樣品捕捉的毛細管為例，其可承受的 最大進樣總量約為 3.15mL。此限制了其對 三鹵甲烷之吹氣效率。倘若使用吸附劑則 無此缺點，因為吸附管溫度可設定在室 溫，且可在高溫直接進行樣品注射，而不 需要將注射溫度設於 0℃以凍結水氣，自然 不會有因過量的水氣被凍結成冰而阻塞毛 細管的問題，即其可承受的最大進樣總量 並不受到水氣的限制，然而，此系統最大 進樣總量乃受到吸附劑對分析物的破出體 積所限制。以氯仿為例，在吸附管溫度為 20℃時，Tenax TA 吸附劑對其之破出體積 為 19mL/mg，即當使用 1 毫克 Tenax TA 吸 附劑時，其最大進樣總量不要超過 19mL， 否則氯仿會由吸附劑上脫附出。相比之 下，以吸附劑捕捉系統的最大進樣總量限 制較連續式高流速吹氣/冷凍聚焦捕捉系統 寬鬆的多。同時，若欲以長時間連續偵測 而言，液態氮的補充會是一個極大的問 題，使用致冷晶片則無此問體。 Part. E 多重毛細管電泳/質譜儀介面之發 展 1. 利用質譜儀內部訊號來驅動圓轉盤轉 動與質譜儀掃瞄同步化，確認了多重毛 細管電泳電灑質譜儀介面的可行性。 2. 由於質譜儀掃瞄時間及電灑探針擺設 空間上的限制，目前可達到四重毛細管 電泳電灑質譜同步分析。 3. 細心的調整探針位置除了可以避免交 叉干擾外更可獲得較佳的靈敏度。 4. 實驗證實四重毛細管電泳電灑質譜系 統在濃度高達 2000ppm 仍未發現交叉 干擾現象。 5. 若利用減小最大離子進樣時間，或減少 微掃瞄次數，以爭取層析峰的點數，有 機會達八重毛細管電泳電灑介面。 Part. F 鞘流溶液、緩衝溶液、分析物之解 離常數及界面活性劑對於毛細電泳質譜分 析靈敏度的影響 本研究以實驗室曾利用毛細區帶電泳 分離 16 種常見的西藥，以其中一組共流析 化合物 Ethoxybenzamide 和 Diazepam 來做 探討。由圖 1 中可知當存在高濃度且靈敏 度 好 的 Diazpam 時 ， 即 使 提 高
Ethoxybenzamide 的濃度至 10-3M 還是無法 達到不含有 10-4 M Diazepam 時所測得的質 譜訊號。由於表面空間有限，靈敏好且濃 度高(10-4 M)之 Diazepam，一直佔據著大部 分 的 表 面 空 間 ， 所 以 既 使 提 高 Ethoxybenzamide 濃 度 仍 然 無 法 與 Diazepam 競爭表面。相較於沒有 10-4M Diazepam 的存在時，表面有足夠的空間讓 所 有 的 Ethoxybenzamide 跑 至 液 滴 的 表 面，所以可以偵測到較強的質譜訊號。因 此可得知當混有於質譜的離子化效率好的 化合物且濃度達 10-4 M 以上就會抑制其他 共同存在的分析物。 見圖 2 當 Diazepam 濃度達約 5×10-5 M 便 使得 10-4 M Ethoxy- benzamide 應有的訊號 下降了，表示 5×10-5 M Diazepam 已佔據了 相當程度的表面，致使離子化效率較差的 Ethoxybenzamide 維持不住它原有的質譜 訊號強度。所以同時存在高濃度且離子化 效率較差之分析物似乎不會影響 Diazepam 的訊號。 經 由 ACDlabs38 軟 體 計 算 得 知 Diazepam、Etthoxybenzamide、Salicylamide 的 pKa ([M+H]+M+H+ )分別為，3.4、-1.18 及-1.08，以上述的 pKa 值與 10-6 M 分析物 濃度及溶液 pH 值(pH=2.8)所計算出的離子 濃 度 為 Diazepam ～ 10-6M 、 Ethoxybenzamide～1×10-10M、Salicylamide ～1.3×10-10 M 可知質譜訊號的相對大小應 Diazepam> Ethoxybenzamide Salicylamide。縱使預測 Ethoxybenzamide Salicyl- amide 但 是 所 觀 測 Ethoxybenzamide 訊 號 遠 大 於 Salicyamide ， 由 這 兩 個 分 析 物 的 結 構 來 看，Ethoxybenzamide 只比 Salicyamide 一 個乙基，因此推測 Ethoxybenamide 表面親 和力大於 Salicyamide，而造成 10 倍左右的 訊號的差異。這個實驗顯示出表面親和力 對分析物的靈敏度似乎有相當程度的影 響。 為了瞭解表面親和力對質譜訊號的影 響，我們探討不同表面親和力(不同碳鏈) 的四級銨鹽對於 Diazepam 訊號的影響，由 圖 3 可知發現當增加表面親和力（碳鏈） 對於 Diazepam 的影響越大，於四乙基銨鹽 (TEAI) 下 還 看 得 到 低 濃 度 (10-6M) Diazepam 之訊號，當碳鏈增加至四戊基銨 鹽(TPAI)或四辛基銨鹽(TOctAI)時是抑制 情 形 相 當 嚴 重 ， 已 經 無 法 看 到 低 濃 度 Diazepam 之訊號，至於 TPAI 與 ToctAI 對 於 Diazepam 的抑制程度，似乎並未有太大 的差異，我們猜測其原因是該濃度(10-4 M) 已經達到質譜訊號的飽和。 圖 1、固定 Diazepam 濃度於 10-4 M 改變 Ethoxybenzamide 的濃度所觀測之質譜訊號 圖 2、固定 Ethoxybenzamide 濃度於 10-4M 改變 Diazepam 的濃度所觀測之 質譜訊號
四、計畫成果自評 Part. A 低輔助流毛細電泳質譜界面的設計 以及於樣品線上濃縮的應用 1. 本研究成功的發展出低輔助流流速鞘 流界面。 2. 雙斜口低輔助流界面結合了無鞘流以 及鞘流界面的優點。除了改進無鞘流界 面緩衝溶液選擇有限的問題之外，也改 進了鞘流界面大量稀釋樣品的問題。 3. 我們除了改進了此界面的設計，使這一 個界面更容易使用外，也將此系統應用 於一般低流速鞘流界面較少應用的負 離子模式上來分析酚類化合物。 Part. B 負離子電灑法質譜/質譜分析標記 發色團寡醣之鍵結點和分支點 此方法可以成功地分析六醣以下寡醣 之鍵結點與分支點。 Part. C 電子補捉大氣壓下化學離子化法於 血漿中西藥成分之分析 已成功利用衍生化反應，針對 carbonyl 藥物引入 PFPH 電子捕捉基團，在大氣壓 下進行電子捕捉離子化。相較於未衍生之 藥 物 在 APCI+ 或 ESI+ 模 式 之 靈 敏 度 ， PFPH-衍生物接表現出較佳的靈敏度。 Part. D 建立與設計可程式化自動化連續式 吹氣捕捉法結合快速氣相層析質譜儀與薄 膜送樣結合樣品前濃縮／快速氣相層析質 譜儀兩系統 本實驗中利用連續式吹氣∕雙閥門/ 吸附劑捕捉系統與快速氣相層析質譜儀之 整合，對於水中的三鹵甲烷可以達到良好 的分離及偵測，並且能夠在 6.5 分鐘完成 一次樣品分析，使系統具有線上偵測的能 力。而系統對於三鹵甲烷的偵測極限皆在 低的 ppt 濃度範圍，可實際應用於飲用水 中三鹵甲烷的監測。此外由於系統自動 化，除了可有效節省人力資源外，還可以 避免人為誤差，同時可以進行連續全天候 分析監測。 Part. E 多重毛細管電泳/質譜儀介面之發 展 1.利用質譜儀內部訊號來驅動圓轉盤轉動 與質譜儀掃瞄同步化，確認了多重毛細 管電泳電灑質譜儀介面的可行性。目前 可達到四重毛細管電泳電灑質譜同步分 析。 2.實驗證實四重毛細管電泳電灑質譜系統 在濃度高達 2000ppm 仍未發現交叉干擾 現象。 Part. F 鞘流溶液、緩衝溶液、分析物之解 離常數及界面活性劑對於毛細電泳質譜分 析靈敏度的影響 1. 高濃度且高靈敏度的分析物會抑制共流 析分析物的質譜訊號。 2. 分析物的表面親和力對於電灑法質譜儀 靈敏度有相當程度的影響。 3.對於同一層析峰存在有高濃度且高靈敏 度的化合物會抑制目標分析物的離子 化，而產生定量上的問題，所以是有必 要提高層析解析度，來避免共流析所造 成的問題。 五、參考文獻 Part. A 低輔助流毛細電泳質譜界面的設計 以及於樣品線上濃縮的應用
[1] J. A. Loo, H. R. Udseth, R. D. Smith,
Rapid Common. Mass Spectrom., 2 (1988)
207.
[2] R. D. Smith, J. A. Loo, C. J. Barinaga,
Rapid Common. Mass Spectrom., 4 (1990)
54.
[3] R. D. Smith, J. A. Loo, C. J. Barinaga, C. G. Edmonds, H. R. Udseth, J. Am. Soc.
Mass Spectrom,. 1 (1990) 53.
and S. A. Hofstadler, Anal. Chem., 65, 574A (1993).
[5] 3. J.A. Olivares, N.T. Nguyen, C.R.
Yonker, R.D. Smith, Anal. Chem.,59, 1230 (1987).
[6] 4. R.D. Smith, J.A. Olivares, N.T.
Nguyen, and H.R. Udseth, Anal. Chem., 60, 436 (1988).
[7] J. H. Wahl and R. D. Smith, J. Cap.
Elec.,1,62 (1992)
[8] J. H. Wahl, D. C. Gate and R.D. Smith, J.
Chromatogr., 659, 217 (1994).
[9] D. Figeys, I. van Ostveen, A.Ducret. and R. Aebersold, Anal. Chem., 68, 1822 (1996).
[10] D.R.Barnidge, S.Nilsson, K.E.Markides,
H. Rapp, and K.Hjort, Rapid Commun.
Mass Spectrom., 13, 994 (1999).
[11] M.S. Kriger and K.D. Cook, Anal.
Chem., 67, 385 (1995).
[12] J. F. Kelly, L. Ramaley, and P. Thibault,
Anal. Chem., 69, 51(1997).
[13] Severs, J. C.; Harms, A. C.; Smith, R.D.
Rapid Commun. Mass Spectrom., 10,
175(1996).
[14] Severs, J. C.; Smith, R.D. Anal. Chem., 69, 2154 (1997).
[15] J. N. Alexander IV G. A. Schultz, and J.
B. Poli, Rapid Commun. Mass Spectrom., 12, 1187 (1998).
[16] K. P. Bateman, R. L. White, and P.
Thibault, Rapid Commun. Mass
Spectrom., 11, 307 (1997).
[17] K. P. Bateman, R. L. White, M. Yaguchi and P. Thibault., J. Chromatogr. A , 794, 327, (1998).
[18] 18. L. Fang, R. Zhang, E.R. Williams
and R.N. Zare, Anal. Chem., 66, 3696 (1994).
[19] P. Cao, and M. Moini, Rapid Commun.
Mass Spectrom., 11, 561 (1998).
[20] M. Mazereeuw, A. J. P. Hofte,
U.R.Tjaden and J. van der Greefi, Rapid
Commun. Mass Spectrom., 11, 981(1997).
[21] Y. Z. Chang, G. R. Her, Anal. Chem., 72,
626 (2000)
[22] M. S. Wilm, M. Mann, Int. J. Mass Spec.
Ion Proc., 136, 167 (1994)
[23] S. E. Moring, J. C. Colburm, P. D.
Grossman and H. H. Lauer; LC-GC Intl. 3 46-52 (1990)
[24] R. L. Chien and D. S. Burgi; Anal.
Chem. 64 489A-496A (1992)
[25] F. E. P. Mikkers, F. M. Everaerts and Th.
P .E. M. Verheggn; J. Chromatogr. 169 1-10 (1979)
[26] Tsai, Cheng-Yuan; Her, Guor-Rong; J.
Chromatogr. A, 743(2), 315-321 (1996)
Part. B 負離子電灑法質譜/質譜分析標記 發色團寡醣之鍵結點和分支點
[1] Her, G. R.; Santikarn, S.; Reinhold, V.
N.; Williams, J. C. Simplified Approach to HPLC Precolumn Fluorescent Labeling of Carbohydrates: N-(2-pyridinyl)glycosylamines. J. Carbohydr. Chem. 1987, 6(1), 129-139.
[2] Li, D.T.; Her, G.R. Linkage Analysis of
Chromophore-Labeled Disaccharides and Linear Oligosaccharides by Negative Ion Fast Atom Bombardment Ionization and Collisional-Induced Dissociation With B/E Scanning. Anal. Biochem.
1993, 211(2), 250-257.
[3] Li, D.T.; Her, G.R. Structural Analysis of
Chromophore-Labeled Disaccharides and Oligosaccharides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry and High-Performance Liquid Chromatography/Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Mass Spectrom.
1998, 33, 644-652.
[4] Li, D.T.; Sheen, J.F. Her, G.R. Structural Analysis of Chromophore-Labeled Disaccharides by Capillary Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry Using Ion Trap Mass Spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom.
2000, 11, 292-300.
Part. C 電子補捉大氣壓下化學離子化法於 血漿中西藥成分之分析
[1] R. King, R. Bonfiglio, C. Fernandez-Metzler, C. Miller-Stein, T. Olah, J. Am. Soc. Mass. Spectrom., 2000, 11, 942.
[2] A. P. Bruins, Trends Anal. Chem., 1994, 13, 37.
[3] S. Bajic, D. R. Doerge, S. Lowes, and S. Preece, Am. Lab., 1993, 25(2), 40B.
[4] D. F. Hunt, G. C. Stafford, Jr.; F. W. Crow, J. W. Russell, Anal. Chem., 1976, 48, 2098. Part. D 建立與設計可程式化自動化連續式 吹氣捕捉法結合快速氣相層析質譜儀與薄 膜送樣結合樣品前濃縮／快速氣相層析質 譜儀兩系統 [1] 陳作青 連續式吹氣捕捉法與快速氣相 層 析 質 譜 系 統 偵 測 水 中 消 毒 副 產 物 --- 三鹵甲烷 碩士論文 國立台灣大學 化學研究所（2000）. [2] 陳思偉 揮發性有機物質自動化分析系 統之軟硬體規畫與整合 碩士論文 國 立中央大學化學研究所（1999）. Part. E 多重毛細管電泳/質譜儀介面之發 展 [1] Anal. Chem., 1999, 71 (23), 5354. [2] High Throughput Screen., 1999, 2,
327.
Part. F 鞘流溶液、緩衝溶液、分析物之解 離常數及界面活性劑對於毛細電泳質譜分 析靈敏度的影響
[1] P.F. Crain, In Electrospray Ionization
Mass Spectromertry; R. B. Cole, Ed.;
John Wiley and Sons: New York, 1997; Vol. 1, pp 421-548.
[2] Y. Ohasi, In Electrospray Ionization
Mass Spectromertry; R. B. Cole, Ed.;
John Wiley and Sons: New York, 1997; Vol. 1, pp459-498.
[3] M.R. Emmett, R. M. Caprioli, J. Am. Soc.
Mass Spectrom,. 1994, 5, 605.
[4] J.A. Loo, R.O. Loo, In Electrospray
Cole,., Ed.; John Wiley and Sons: New York, 1997; Vol. 1, pp385.
[5] Z.L. Cheng, K.W. M. Siu, R. Guevrement and S.S. Berman, J. Am. Soc. Mass
