Taipei Medical University Institutional Repository:Item 987654321/6767

全文

(1) . 台北醫學大學醫學檢驗生物技術學系暨研究所碩士論文. Taipei Medical University School of Medical Technology and Biotechnology Master Thesis. 指導教授：何元順博士 (Yuan-Soon Ho， Ph. D.). 探討山竹中純化之天然化合物Garcinol對乳癌細胞株內 Cyclin D3 表現之影響. Cyclin D3 is down-regulated by Garcinol in MDA-MB 231 breast cancer cells 研究生:謝承達(Chang-Da Hsieh) 中華民國九十八年六月 June 2009 I .

(2) . 中文摘要論文名稱：探討山竹中純化之天然化合物Garcinol對乳癌細胞株內 Cyclin D3 表現之影響研究所名稱：台北醫學大學醫學科學研究所醫學檢驗暨生物技術組研究生姓名：謝承達畢業時間：九十八學年度第二學期指導老師：何元順博士台北醫學大學醫學檢驗暨生物技術研究所教授 . 本研究主要是探討乳癌中過量表現的 Cyclin D3 和山竹粹取物： Garcinol 之間的關聯性。在流行病學的研究中可以看出，台灣婦女罹患乳癌的比例逐年升高，可能由於環境的逐漸西化加上生活飲食的改變。為了有效的改善和預防乳癌的發生率，從各種天然粹取物研究是否有既安全又有效的方法。山竹是富含營養的水果，而其粹取物 Garcinol 在 In vitro 的實驗中可以有效的抑制惡性的乳癌細胞 MDA-MB-231 生長，而其抑制的途徑是藉由抑制細胞生長週期中的 Cyclin D Family 的 Cyclin D3 表現量，使細胞週期停滯。另一方面，在乳癌病患的檢體中發現，除了已報導過的 HER2 等基因外，Cyclin D3 的含量也高於正常的細胞。從 Luciferase assay 中發現 Garcinol I .

(3) . 可以有效降低 Cyclin D3 promoter 的 AP-1 binding site 的作用。因此結合兩者的結果，希望可以藉由研究 Garcinol 來改善乳癌病患的情況，或者可以提早預防乳癌的發生率。 II .

(4) . Abstract Title of Thesis: Cyclin D3 is down-regulated by Garcinol in MDA-MB 231 breast cancer cells Institule: Graduate Institute of Biomedical Technology, Taipei, Medical University Author: Chang-TA Hsieh Thesis advised by: Yuan-soon Ho, Ph.D. (Professor, School of Medical Laboratory Science and Biotechnology，College of Medicine, Taipei Medical University). The purpose of this study is to figure out the correlation between over expression of Cyclin D3 in breast cancer and the components of Mangosteen：Garcinol. In the recently study of epidemiology, the higher rate getting breast cancer of women in Taiwan is serious year by year. The reason maybe is the change of lifestyle and westernization. For cure or prevention of breast cancer effectively, we try to find the components is safely and healthy from nature components. Mangosteen is a kind of very nutritional fruit. Its extraction, Garcinol, is effectively suppressing the breast tumor, MDA-MB-231, growth III .

(5) . in vitro. The pathway is via downregulation of Cyclin D3 expression, which is an important protein regulating cell cycle. The other way, we found the cyclin D3 over expression in clinical breast cancer tumor tissue than in normal tissue. In Luciferase assay, we found that Garcinol can suppress transfection factor binding on the AP-1 site of Cyclin D3 promoter. Because of these results, we research into Garcinol for cure or prevention in breast cancer. . IV .

(6) . 目錄(Contents). 中文摘要 (Abstract in Chinese). I. 英文摘要 (Abstract in English). III. 目錄 (Contents). V. 第一章緒論 (Introduction). 1. 一、 MAPK 路徑的介紹. 5. 二、轉錄因子：Activator protein-1(AP-1)的介紹. 7. 三、細胞週期與細胞凋. 9. 四、天然粹取物Garcinol 第二章實驗材料與方法 (Materials and Methods). 12. 一、藥品試劑. 13. 二、常用溶液. 17. 三、常用儀器. 21. 四、實驗方法. 23. 1. 細胞培養 Cell Culture. 23. 2. MTT cell viability assay. 25. 3. 反轉錄-聚合酶連鎖反應 RT-PCR. 25. 4. 西方墨點法 Western Blotting Assay. 27. V . 10.

(7) . 5. 免疫化學組織染色法 Immunohistochemical staining assay 6. 染色質免疫沉澱法 (ChIP) 第三章實驗結果 (Results). 28 29 32. 一、 Garcinopl 是七種天然萃取物中對 nicotine 在乳癌細胞 MDA-MB-231 表現具有良好的抑制效果。. 33. 二、天然萃取物 Garcinol 對乳癌細胞的生長具有抑制作用。. 34. 三、 Garcinol 造成 MDA-MB-231 的生長抑制起因於 G1 Cell cycle arrest。. 34. 四、 Garcinol 在 MDA-MB-231 細胞株中能抑制 Cyclin D3 蛋白質表現量的最低劑量。. 35. 五、 Garcinol 在 24 小時內即可對 Cyclin D3 造成抑制。36 六、 Garcinol 對 Cyclin D3 的影響在於抑制 C-jun 的表現量。. 37. 七、由 ChIP 和 Luciferase assay 確定 Garcinol 對 C-jun 的抑制效果。. 38. 八、 C-fos 可以穩定 Cyclin D1 的表現。九、 Garcinol 透過 p38 MAPK Signaling Pathway 抑制 VI . 39.

(8) . C-jun 表現量。. 39. 十、在兩百例檢體中發現基因 Cyclin D3 的表現高於正常乳房細胞。. 40. 十一、由 Real-time PCR 分析出 Cyclin D3 與乳癌之間的相關性。. 41. 十二、在 IHC 中發現 Cyclin D3 表現量在 Tumor tissue 中遠大於 Normal tissue。. 41. 第四章討論 (Discussion). 42. 第五章圖表 (Figures). 46. Fig.1. 47. Fig.2. 48. Fig.3. 49. Fig.4. 50. Fig.5. 51. Fig.6. 52. Fig.7. 53. Fig.8. 54. Fig.9. 55. Fig.10. 56 VII . .

(9) . Fig.11. 57. Fig.12. 58. Fig.13. 59. 附錄 (Appendices). 61. 第六章參考文獻 (Reference). 68. VIII .

(10) . 緒論 (Introduction). 1 .

(11) . 緒論前言台灣乳癌流行病學研究始自 1964 年，早年尚無乳癌登記，乳癌發生率的資料是得自 MacMahon 主持之國際研究，在過去的資料顯示，乳癌的死亡率大致隨年齡上升，和西方(高發生/高死亡率)國家相似，資料顯示，自 30 歲以後，各年齡層未婚者乳癌死亡率即高於已婚者。行政院衛生署公布癌症死因死亡率的報告內指出，至 2007 年為止，乳癌已經連續三年高居女性癌症死因排行榜第四名，國內婦女罹患乳癌的比率每年以 7%增加，且罹患的年齡層已經逐漸下降。如此高死亡率的癌症，引起了多方學者對乳癌研究的重視。乳癌是經由乳房細胞不正常的分裂、繁殖所形成的惡性腫瘤，台灣地區近年來乳癌的發生率及死亡率逐年上升，其上升的原因一般認為和國人生活習慣的西化有密切的關係。本實驗室一直以來專注於研究乳癌的相關研究，希望可以從中尋找出治療乳癌，或是降低乳癌發生率的方法。顯微鏡下的乳癌大約可區分成兩大類： 1. 源自乳房腺管的癌：腺管内癌(Intradutal carcinoma)：此型癌細胞仍侷限在腺管基底膜之內。浸潤性腺管癌(Infiltrating ductal carcinoma)：為最常見及 2 .

(12) . 最具代表性的乳癌，此時癌細胞已經穿出腺管的基底膜之外。有時因為基質(stroma)受到浸潤，產生纖維化，造成所謂的硬癌 (Scirrhous carcinoma)。髓樣腺管癌(meduLlary carcinoma)：是一種相當具有病理學特徵的類別。它由一些相當多樣化、惡性化的細胞所組成，其細胞核相當的大，其間有相當嚴重的淋巴球浸潤，而鮮有基質的纖維化。黏液腺癌(mucinous carcinoma)：一般發生於年齡較大的病人，其腫塊較軟而且含有一些灰白的粘膠狀物質。在顯微鏡下可見到在一個個的粘液湖(mucin lakes)中散落、浮游著一些癌細胞腺體。 Paget 氏病(Paget＇s disease)：乃是一種特殊性長於較大乳腺管的腺管癌，再延乳腺上皮細胞進行到乳頭的部份，造成乳頭皮膚的溼疹樣、潰瘍及糜爛。其他如 Adenoid cystic carcinoma，多發生於停經後婦女，甚少淋巴線及遠處轉移戒環型癌(signet ring cell carcinoma)。 2. 源自乳房小葉(lobule)的癌：一般少見。非浸潤性小葉癌(noninfiltrating lobular carcinoma)：此型發生在末梢腺體的癌性變化，一般不會形成觸摸得到的腫塊，甚至在乳房攝影時亦無法看出，因此相當少見。 3 .

(13) . 浸潤性小葉癌(infiltrating lobular carcinoma)：此類型容易有多發性(multicetricity)及兩側性(bilaterality)。然而在乳癌的治療上仍多使用外科手術(乳房切除術、乳房保留手術)或是放射性治療、化學治療，此外也有使用荷爾蒙治療。乳癌治療方式： 1. 乳房切除術：切除乳房及同一側腋下淋巴腺是傳統的治療方法，其適用於局部腫瘤可切除而且沒有遠端器官轉移者。雖然效果相當不錯，但需要擔心癌症細胞是否有轉移現象發生。 2. 乳房保留手術：對於小於兩公分的腫瘤，而腋下淋巴腺沒有明顯症狀者，可以使用這種治療方式，但有復發的可能。 3. 放射治療：對於腫瘤過大，擔心手術後局部仍有殘留的癌症細胞，腫瘤位於內側乳房、擔心淋巴結轉移，加上放射治療，可以減少局部復發的機會。但治療初期可能會波及或破壞正常細胞的現象，進而產生許多副作用，例如：噁心、嘔吐、全身倦怠，幾次注射後可能會脫髮、經期不規則甚至會停止等等。 4. 化學治療：化學抗癌藥物對於抑制乳癌細胞生長有相當好的效果，除了降低局部復發的機會，更可延長病人存活的時間。不過，由於化學治療會因為個人體質不同而有不同的副作用，一般來說，在使用藥物後數天之內可能會造成與放射治療相似的 4 .

(14) . 副作用，造成病患心理與生理上沉重的負擔，進而失去信心去接受繼續治療的意願。 5. 荷爾蒙治療：荷爾蒙治療法包括切除卵巢、腎上腺或腦下垂體來達到抑制癌細胞的功效，目前所使用藥物如 Tamoxifen、 Aminoglutethimide 或 MPA 都沒有明顯副作用。然而若手術取下的乳癌組織發現沒有動情激素受體(Estrogen Receptor，ER) 及黃體脂酮受體(Progesterone Receptor，PR)，則荷爾蒙治療效果就沒有預期的好。有鍵於此，除了積極鼓勵婦女定期檢查以便早期治療外，國內外學者對於乳癌的研究已著重於利用天然藥物作為預防或治療的方向。. 一、. Mitogen-activated protein kinase(MAPK) signaling. pathway MAPK是serine/threonine-specific protein kinase，當細胞受到外界mitogen刺激而活化並且調控多種細胞生理活性，如：基因轉錄活性、有絲分裂、分化與細胞的存亡(Pearson, Robinson et al. 2001; Himes, Sester et al. 2006; Weitsman, Li et al. 2006)。當細胞受到外界刺激會活化MAPK cascade: 5 .

(15) . MAP kinase kinase kinase(MKKK or MAP3K)ÆMAP kinase kinase(MKK or MAP2K)ÆMAP kinase(MAPK)(Pearson, Robinson et al. 2001)。 MAPK目前分為四類：ERKs、SAPKs/JNKs、p38 isoforms、ERK5；其作用及相關機轉如下： 1. extracellular signal-regulated kinases(ERKs)： ERK cascade的核心主要由三層不同的kinases所調控，第一層是 MAP kinase kinase kinase(MAPKKK)，包括有Raf-1(C-Raf)和 B-Raf；第二層是MAP kinase kinase(MAPKK)，也就是MEK；而第三層是MAPK，即ERK1/2。當MAPKKK受到活化時，會將MEK上的 serine/threonine磷酸化，接著活化ERK1/2。這是專一的ERK cascade路徑，但是其上游還包括許多複雜的調控機制，例如Ras、 Rap等等皆可能參與。研究報告指出，ERK cascade多半與細胞的生長有關，許多不同的刺激皆可能造成MEK/ERK cascade，例如： ERK cascade會受到生長因子和tumor promoters所誘發；另外， ERK cascade也可以調控細胞週期的進行，進而影響細胞增生和分化(Gilad, Bresler et al. 2005; Zivadinovic, Gametchu et al. 2005)。 2. SAPKs/JNKs(stress-activated protein kinase/c-jun N-terminal kinases)： 6 .

(16) . JNKs受到磷酸化後，會translocate至細胞核內，並磷酸化c-Jun 蛋白，影響轉錄因子AP-1與promoter之間的結合，並間接調控下游基因的表現；在之後的轉錄因子介紹中會有進一步說明。 3. p38 isoforms： p38和JNK訊息傳遞路徑會受到stress刺激(如：cytokunes、UV、 heat shock、osmotic shock)而活化，能調控細胞分化和凋亡。 4. ERK5：它能被生長因子和stress刺激而活化，參與細胞增生。. 二、. 轉錄因子：Activator protein-1(AP-1)的介紹 AP-1 是一種由 Fos 及 Jun 蛋白所組成的 transcription. activator，會調控細胞分裂。相對於 Jun dimer 或是 Fos dimer(幾乎不結合)而言，AP-1 以 Fos and Jun 的 heterodimer 形式存在對 DNA 結合性最高(Thierry, Spyrou et al. 1992)，以下就來簡介這個蛋白質的結構。 Jun family主要包含了：Jun(也被稱為c-Jun)、JunB和JunD；而 Fos family則包含了：Fos(也被稱做c-Fos)、FosB、Fra-1、Fra-2。另外有一些例如像ATF(ATFa, ATF-2 and ATF-3)；或是JDP (JDP-1 and JDP-2) subfamilies，也會參與AP-1 complex的形成(Hirai, 7 .

(17) . Ryseck et al. 1989; Sakai 1991)。 AP-1 整個蛋白質複合體結構是由 453 個氨基酸，包含四個分子結構(Fos、NFAT、Jun、DNA)共同形成。而各側鏈上DNA結合位置會和DNA 形成複合體而促進一些基因的表現。它們主要是形成leucine zipper 使得複合物更穩定，之後也有一些忌水性側鏈的鍵結會產生。利用 Alanine scanning mutagenesis可以發現Jun上的Arg 285 以及NFAT 上的Thr 533、Glu 527 and Ile 535 都可能參與DNA binding(Imler and Wasylyk 1989)；而突變Arg 466 and Ile 467 會直接影響NFAT 和AP-1 促進轉錄的作用力。DNA序列上與AP-1 具特異性結合力結合位 ,. ,. 置；或是TRE(TPA-responsive element)，其序列為5 -ATGAGTCAG-3 ，共九個鹼基；而其中若是突變第六個鹼基-T或是第七個鹼基-C ，將會使得AP-1 與此序列的結合力大幅降低(Risse, Jooss et al. 1989)。 AP-1 出現在很多地方，通常都被用來作為DNA activator；而它也可能是許多訊息傳遞路徑下游蛋白所影響的目標，例如： PI3K/Akt、MAPK路徑等等(Imler and Wasylyk 1989)。AP-1也可以藉由許多機制調控；其中，MAPK路徑下的JNK(Jun N-terminal kinase) 可以直接translocate至核內使Jun蛋白磷酸化，進而影響AP-1與DNA 結合(Martinez-Salgado, Rodriguez-Barbero et al. 2005)。而AP-1 的活性會受到許多生理或是病理上刺激的調控，例如：cytokines、 8 .

(18) . growth factor、壓力、訊息傳遞、或是感染等等，這些都可能使AP-1 參與致癌路徑而成為整個機轉的一份子(Imler and Wasylyk 1989; Melamed, Resnitzky et al. 1993)。. 三、. 細胞週期與細胞凋亡. 細胞週期(cell cycle)，為一連串細胞生長與分裂的過程，在正常狀況下會規律並週而復始的進行。細胞週期主要可分為四個主要的時期：G1、S、G2及M期。而細胞週期之所以能順利的進行，需要一系列cyclin dependent kinases (如cyclin D、E、A和B)及與其相關的一系列cyclin dependent kinases (如：CDK4、CDK2和CDC2)交互作用與調節。一旦細胞週期發生混亂失調時，則有可能導致癌症發生 (Hartwell and Kastan, 1994; Loden et al., 2002)。而當細胞的 DNA受到傷害時，則可能導致細胞週期停在某一個時期。但倘若DNA 傷害過大而無法修補時，便會促使細胞走向死亡的途徑，例如細胞凋亡(apoptosis)。在正常情況下，細胞增殖與死亡的速率會達到一定的平衡狀態，一旦此平衡失調，就有可能導致嚴重的疾病，例如：神經退化、AIDS、自體免疫疾病或癌症的發生。細胞死亡主要分為necrosis和 apoptosis兩種形式。Necrosis是一種細胞被動死亡方式，常因細胞 9 .

(19) . 受到嚴重外力的傷害所引起，且會造成細胞膜破裂而釋放出內容物，甚至波及鄰近的正常細胞，進而引起發炎反應發生及細胞壞死。而 apoptosis則是細胞程式凋亡，屬於自殺死亡的方式，常因細胞內DNA 嚴重受損而無法修補時所引起，藉由排除受傷或過剩的細胞來維持平橫，所以在體內保護機制扮演重要的角色。也因apoptosis不會影響正常細胞，並可有效地抑制癌症細胞生長，所以在癌症治療方面提供一項新的思路。. 四、. 天然萃取物Garcinol. Garcinol 是萃取自東南亞的水果-山竹(Mangosteen)，又名鳳果、山竹子，山竹原產於馬來半島和泰國等東南亞熱帶國家，為熱帶果樹中的珍品，加上營養素成份堪稱為女王的等級，所以有果后的美稱，是世界三大美味水果之一，在東南亞地區已普遍栽培。山竹果肉中含有大量的營養素，包括了抗氧化劑、可溶性固形物、葉酸、檸檬酸、泛酸、多種的維生素 B1、B2、C4 和礦物質，對提升人體免疫力有極佳的效果，另外還有抗癌、降低心血管疾病和抗感染等特殊的療效(Hong, Kwon et al. 2007)。除了 Garcinol 本身之外，還有另外三種衍生物，Cambogin、Garcim-1 和 Garcim-2，其中仍以 Garcinol 最具有抑制癌細胞生長的效果(附錄二)。Cyclin D3 是細胞生長週期 10 .

(20) . 中一個重要的功能蛋白，量的多寡會影響細胞生長是否旺盛，而在乳癌細胞中發現其含量高於一般正常的乳癌細胞，推測可能與乳房細胞的癌化有很高的相關性。我們將以 Gacinol 作為主要的研究目標，觀察其是否具有能抑制乳癌細胞內 Cyclin D3 基因、蛋白質等等的表現，並且探討其詳細的路徑及機制，以其能為乳癌的研究上貢獻一份心力。 . 實驗目的乳癌一直是台灣婦女好發率高的癌症之一。在乳癌病人的檢體中發現除了一些已經發表的基因外，還有一些基因的表現是異於常人的，如 Cyclin D3。乳癌檢體中的 Cyclin D3 表現量大多是高於正常乳房細胞，為了釐清乳癌產生的機制，進而研究 Cyclin D3 與乳癌發生的相關性。將山竹萃取物 Garcinol 加入乳癌細胞 MDA-MB-231 的培養基中，發現其可以有效的抑制乳癌細胞的生長。而在西方墨點法的實驗中發現，Garcinol 最主要可以抑制 Cyclin D3 的蛋白產量。因此在後續的實驗中研究探討 Garcinol 可以抑制乳癌細胞生長是經由抑制 Cyclin D3 的表現量，證明 Cyclin D3 的異常表現與癌症息息相關。. 11 .

(21) . 實驗材料與方法 (Materials and methods). 12 .

(22) . 實驗材料與方法. 一、藥品試劑 1. 下列產品購自Amresco， Inc.， Solon， Ohio， USA agarose I， albumin bovine， BCIP/NBT， Coomassie brilliant blue，DTT， EDTA， glycerol， glycine， HEPES， Magnesium chloride (MgCl2)， PMSF， RNase A， sodium chloride (NaCl)，TEMED， Trishydrochloride (Tris-HCl)， Tris-base 2.下列產品購自Cell Signaling Technology,Inc. p-ER α(Ser 104/106)，p-ER α(Ser 118) 3. 下列產品購自BDH Laboratory Supplies， Poole， England methanol， phenol， Triton X-100 4. 下列產品購自BioLabs， Inc.， New England prestained protein marker 5. 下列產品購自Biological Industries， Co.， Israel Fetal calf serum (FCS)，Fetal bovine serum(FBS) 6. 下列產品購自Bio-Rad Laboratories， Hercules， CA， USA Protein assay dye reagent concentrate， sodium dodecyl sulfate(SDS) 13 .

(23) . 7. 下列產品購自Gibco， Invitrogen Co.， Grand Island， NY， USA 1X Trypsin-EDTA， Dulbecco＇s Modified Eagle Medium (DMEM) 8. 下列產品購自ICN Biomedical Inc.，Aurora，Ohio，USA ammonium persulfate (APS) 9. 下列產品購自J.T Baler，Phillipsburg，NY，USA acetone，sodium bicarbonate (NaHCO3) 10. 下列產品購自Kanto Chemical Co.，Inc.，Tokyo，Japan isoamyl alcohol. 11. 下列產品購自Mallinckrodt， Xalostoc， Mexico sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) 12. 下列產品購自Merck，KGaA，Darmstadt，Germany acetic acid (CH3COOH)，bromophenol blue，DMSO， ethidium bromide (EtBr)，potassium hydroxide (KOH)， 37% hydrochloric acid (HCl)，sodium hydroxide (NaOH)， Tween 20 13. 下列產品購自PerkinElmer Life Sciences，Inc.，Boston，MA， USA 14 .

(24) . PVDF transfer membrane， Western lightning-chemiluminescence reagent plus (ECL) 14. 下列產品購自Pierce， Rockford， Illinois， USA albumin standardt 15. 下列產品購自Plusone， Pharmacia Biotech AB Uppsala， Sweden acrylamide PAGE， Methylenebisacrylamide 16. 下列產品購自Riedel-de Haën， Seelze Germany chloroform，potassium chloride (KCl)，sodium azide (NaN3)， sodium fluoride (NaF)， potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4) 17. 下列產品購自Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz， CA，USA GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) ， PARP (Poly ADP-ribose polymerase) ，ER-α，α-tubulin， anti-goat IgG-HRP，anti-mouse IgG-AP，anti-mouse IgG-HRP， anti-α-chicken IgG-HRP 18. 下列產品購自Sigma Chemical Co.，St. Louis，Mo，USA aprotinine，EDTA，EGTA，trypan blue，leupeptin，phenol red 15 .

(25) . free MEM， propidium iodide，sodium orthovanadate (Na3VO4)，sodium pyrophosphate，Nonident P-40 (NP-40)， β-glycerophosphate (β-gp)，N-lauroylsarcosine， paraformaldehyde， PDTC，DMSO (Dimethyl Sulfoxide) 19. 下列產品購自Wako Pure Chemical Industries， Ltd.， Japan boric acid (H3BO3) 20. 下列產品購自 ProTech Professional Technical Service， Inc. deoxynucleotide Triphosphated (dNTPs) sets 21. 下列產品購自 Yeastern Biotech Co.，Ltd. YEA Taq DNA polymerase ，pro tag DNA polymerase. 22. 下列產品購自US Biomax , Ins. Tissue microarray 23.下列產品購自Fuji Photo Film Co,Tokyo,Japan X感光片，X-ray film (Fuji) 24. 下列產品購自 GeneTeks Bioscience, Inc., Germary Taq DNA polymerase，dNTPs，100 bp DNA ladder 25. 下列產品購自 Gibco, Invitrogen Co., Grand Island, NY, USA 100X Antibiotic-antimycotic，1X Trypsin-EDTA，Minimum Essential Medium (MEM) 16 .

(26) . 26.下列產品購自Invitrogen Life Technology TRIzol Reagent 27.下列產品購自Pierce, Rockford, Illinois, USA Albumin standard 28.下列產品購自Genomic Biosd & Tech, Taipei, Taiwan. Primers 29.下列產品購自KPL, Inc., Gaithersburg, Maryland, USA BCIP/NBT(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/4-nitroblue tetrazolium) 30.下列所使用之天然萃取物皆來自國立高雄海洋科技大學水圈學院水產食品系暨研究所-潘敏雄教授 DBM、Magnolol、PSB、Curcumin、HDB、HMDB、Garcinol. 二、常用溶液 1. 0.5X TBE(Tris-Borate-EDTA)buffer 8.9mM Tris-base, 8.9mM boric acid , 0.2mM EDTA(pH 8.0)，溶於去離子水 2. 40% acrylamide/bis(37.5:1)solution 389.6 g/L acrylamide, 10.4g/L methylenebisacrylamide 溶 17 .

(27) . 於去離子水 3. Agarose gel formula 2.0% agaroseⅠ溶於0.5X TBE buffer 4. Buffer A 10 mM Tris-HCl(pH7.9), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.1%NP-40, 0.5mM DTT, 溶於去離子水 5. Buffer B 20M Tris-HCl(pH7.9), 420mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2mM EDTA, 0.5mM PMSF, 25% glycerol, , 0.5mM DTT, 溶於去離子水 6. Buffer C 20M Tris-HCl (pH 7.9), 420 mM NaCl, 1.5mM MgCl2 , 0.2 mMEDTA, 0.5 mM PMSF, 25 % glycerol, 0.5mM DTT, 溶於去離子水 7. DNA 6X loading dye 1mM EDTA, 25% bromophenol blue, 50% Glycerol, 溶於去離子水 8. Phosphate buffer saline(PBS) 8 g/L NaCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.2 g/L KCl, 0.24 g/L KH2PO4, 18 .

(28) . 溶於去離子水 9. Protease inhibitor 0.1 μg/ml leupeptin, 1 μg/ml aprotinin, 1 mM PMSF 10. Protein 5X loading dye 1.5M Tris-base (pH 6.8), 10% SDS, 0.2% bromophenol blue, 20%glycerol, 1M DTT, 溶於去離子水 11. PVDF membrane blocking buffer for alkaline phosphatase manner 5% skim milk, 0.2% NaN3, 溶於TBST 12. PVDF membrane blocking buffer for horseradish peroxidase manner 5% bovine albumin, 溶於TBST 13. SDS-PAGE running buffer 25mM Tris-base, 250mM glycine, 0.1% SDS, 溶於去離子水，調整pH 值至8.3 14. TBST buffer 10mM Tris-base, 100mM NaCl, 0.1% Tween 20, 溶於去離子水，調整pH 值至7.5 15. TE buffer 19 .

(29) . 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10mM EDTA (pH 8.0), 溶於去離子水 16. Transfer buffer for Western blotting assay 20mM Tris-base, 150mM Glycine, 20 % Methanol, 溶於去離子水,調整 pH 值至 8.3 17. CHIP lysis buffer 50 mM HEPES (pH 7.5 ), 140 mM NaCl, 1 % Triton X-100, protease Inhibitor, 0.1% Sodium Deoxycholate,溶於去離子水 18. CHIP lysis buffer (high salt) 50 mM HEPES (pH 7.5 ), 500 mM NaCl, 1 % Triton X-100, protease Inhibitor, 0.1% Sodium Deoxycholate,溶於去離子水 19. ChIP wash buffer 10 mM Tris (pH8.0), 250 mM LiCl, 0.5% NP-40, 0.5% Na Deoxy-cholate, 1 mM EDTA,溶於去離子水 20. ChIP elution buffer 50 mM Tris (pH 8.0), 1% SDS,10 mM EDTA,溶於去離子水 21. IP buffer 10 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.5% NP40, 1 mM EDTA, 1mM EGTA,溶於去離子水,使用前外加 0.2 mM sodium 20 .

(30) . orthovanadata, 0.2 mM PMSF, 10μg/ml Aprotinin, 1 μg/ml Leupeptin 22. Nuclear extraction buffer 20 mM HEPES-KOH (pH 7.9), 25% Glycerol, 420 mM NaCl,1.5 mM MgCl2, 0.2 mM EDTA, 0.5 mM DTT,使用前外加 0.2 mM PMSF 23. Sucrose-supplemented extraction buffer 300 mM sucrose, 10 mM HEPES (pH7.4), 50 mM KCl, 5 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT,使用前外加 0.2 PMSF. 三、常用儀器 1.倒立式顯微鏡: IM，Olympus 2.光學顯微鏡: Bx 50，Olympus 3.細胞培養箱(CO2 Incubater): Sanyo 4.無菌操作台(Laminar Flow): 造鑫 5.試管震盪器: Vortwx-2 genin，Scientific Industric 6.試管迴轉器:2800A，Analog-type，Labrotator， Digisystem Laboratory Instruments Inc. 7.乾浴槽: Type 17600，Dri-Bath，Therolyne 8.水浴槽: Firstek Scientific，B206 21 .

(31) . 9.加熱攪拌器: Stir/Hot plate，Corning；Stirring Hotplate，Fisher Scientific 10.烘箱: DK-500，Fored convention ovens，YihDer 11.桌上型離心機: Beckman 1300，Sorvall MC12V 12.高轉速離心機:Kubota 1720；Kubota 13.低轉速離心機:O5PR-22，Hitachi；2K15，Sigma 14.水平式電泳槽: Pico-1，Taitec；Mupid-2，Mini Gel Migration Trough，Cosmo Bio Co.，Ltd. 15.SDS-PAGE 電泳槽: G42，Mini Gel Tween，Biometra 16.酸檢測定儀(pH meter):Microcomputer pH-versin 6071，Jenco Electronics Ltd. 17.電源供應器(Power Supply):P0304，Centec Scientific；Mp-250，Major Science 18.DNA 聚合酵素反應器: Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400 19.高壓滅菌釜: TM-322，Compact high pressure steam sterilizer ，Tomin Medical Euiptment Co.； AS-5010，Chin Ku Medical Instruments Co. 20.天平: BP602，Mettler Tolodo 22 .

(32) . 21.微量天平: AB104，Mettler Tolodo 22.-80℃冰櫃: Medical freezer，Sanyo 23.分光光度計: UV-161，UV-visible Spectrophotometer，Shimadzu；U-2001， Spectrophotometer，Hitachi. 四、實驗方法細胞培養(cell culture): MDA-MB-231 cells 為人類乳癌細胞株(mammary gland；breast； epithelial；from metastastatic site：pleural effusion adenocarcinoma；[ATCC]：HTB26)，此細胞不帶有ER(Estrogen receptor)。MDA MB-231 cells 倍增時間約為 48 小時，為附著生長型的細胞。此細胞以75T培養盤培養於額外添加 10% Fetal calf serum（FCS）與1%PSA(100U/ml penicillin，100μg/ml streptomycin，0.25μg/ml amphotericin B)的DMEM/F-12 medium中，並置於溫度 37℃，溼度 95%，含 5% CO2 的細胞培養箱中培養，待培養至八、九分滿時，即可以進行細胞的次培養(subculture)。首先將原來的culture medium 抽乾，以phosphate buffered saline(PBS) 清洗細胞表層後，加入 23 .

(33) . 1ml 1% trypsin-1Mm EDTA覆蓋細胞，稍微搖晃一下使其均勻流過細胞表層，等待五分鐘。待細胞被 trypsin 切下後，以 3ml culture medium (DMEM/F-12)將細胞沖下收集，並將此細胞液放入離心管以 1200 rpm 離心三分鐘，離心完後抽掉上清液，且加入細胞培養液輕輕將細胞打散。之後取適量細胞液(0.5ml細胞液加入8ml培養液於十公分培養皿或1ml細胞液加入12ml培養液於75T培養盤中)放入細胞培養盤培養。之後每天查看細胞生長狀況，約3-4天後再進行次培養。細胞生長曲線之測定(Cell growth curve) 細胞以 5x104 cells/well 的數目培養於 6 well 培養皿中，24 小時候更換新的細胞培養液，並投予所需劑量的藥物，對照組投與等量的 DMSO 或水(依藥物之溶劑不同)，連續觀察三天，於作用時間終了時收集細胞，以 1% Trypsin-EDTA 切下附著在培養皿上的細胞，並使用等量的 0.5% Trypan blue 染色，接著以血球計數器在光學顯微鏡底下觀察沒染上 Trypan blue 的活細胞數目，並且畫出生長曲線。需經由 starvation 的實驗則是在細胞約五分滿時將 medium 換為不添加 FBS 和 PSA 的 DMEM-F12 medium 培養 24 小時，再更換回寒 10%FBS 的 DMEM-F12 medium 同時投予所需劑量的藥物。而需要 starvation 的實驗有 cell cycle time dependent 和 signal pathway detection。 MTT cell viability assay(細胞存活率分析) 24 .

(34) . 5. 在次培養時將細胞以 1x10 /well 的濃度培養於 6 well 培養皿中，之後依實驗條件不同加入藥物，待藥物作用時間結束時，加入 5μg/ml 的 MTT 溶液至細胞培養液中(比例為 1x MTT 溶液：9x 細胞培養液)，置入細胞培養箱中作用 2 小時。產生紫色結晶物後，以 suction 方式。. 小心將細胞培養液吸出，但不可吸到紫色結晶物。之後置於 37 C 烘箱乾燥，再加入溶液(DMSO：95% Alcohol=1：1)各 500μl 到每一個 well 中，置於 shaker 搖晃 10-15 分鐘，待紫色結晶顆粒完全溶解即可。每一個 well 取 100μl 的 sample 至 96 well 培養皿中，使用 ELISA-READER(O.D 540~570nm 波長)測定吸光值，再使用軟體分析數據。. 反轉錄-聚合酶連鎖反應 RT-PCR. A. 萃取 RNA 5. 次培養 3×10 cells/6cm dish，細胞附著後加藥，依不同時間點收集所有細胞，以 500μL TRIzol 處理後加入 100μL Chloroform，震盪。. 後靜置冰上 5 分鐘，然後在 4 C 以 14000rpm 離心 20 分鐘。取上清液。. 加等量體積的 Isopropanol 混合均勻並靜置冰上 10 分鐘或-80 C 。. O/N，然後於 4 C 離心 14000rpm、30 分鐘。去除上清液，加入 500μ L 70%酒精混合均勻，再於 12000rpm 離心 3 分鐘，去除上清液，加入 25 .

(35) . 。. 20μL RNase free water 溶解之，於-80 C 保存。. B. 反轉錄 Reverse Transcription 取 1μg RNA 加入 0.5μL ReverTra Ace ase，4μL RT buffer，1μ g Oligo dT，8Μl 2.5Mm dNTP，再加適當滅菌水到體積 20μL，於。. 37 C 水浴 90 分鐘後即為 cDNA。. C. 聚合酶連鎖反應 Polymerase chain reaction(PCR) 取 1μg Cdna 加入 2μL 5pmole/μL primers，1μL 2.5mM dNTP， 0.25μL Taq polymerase，2.5μL 10X Taq buffer，再加入適當的。. 滅菌水到體積 25μL，混合均勻後，先 95 C 作用 2 分鐘後，再以 95 。. 。. 。. C 30 秒、54 C 20 秒、72 C 30 秒作用 35~40 個循環，最後以 72 C 作用 1 分鐘。 Cyclin D3-154 bp (Sense : GCTTCTCCTGTGTGATTGAC)； (Anti-Sense : CAGTAGCAGAAGGGAGGAAA) GUS-198 bp (Sense : AAACAGCCCGTTTACTTGAG)； (Anti-Sense : AGTGTTCCCTGCTAGAATAGATG). 26 . 。.

(36) . D. 核酸電泳將電泳槽注滿 0.5X TBE buffer，置入 1.5% agarose gel(含 Ethidium Bromide)。取 25μL PCR 產物與 5μL 6X DNA loading dye 混合均勻注入 wells 中，以 100V 的電壓電泳，適當時間後(約 45 分鐘)於 UV 下觀察並拍照。. 西方墨點法 Western Blotting Assay 6. 次培養 2×10 cells/10 cm dish，細胞附著後加藥，之後依不同時間點收細胞。收細胞時以冰的 PBS wash 三次，加入 100μL protein extraction buffer(20mM Tris-HCl pH7.9，137mM NaCl，2mM PMSF， 10mM NaF，5mM EDTA，5mM DTT，1mM EGTA，10% Glycerol，1mM Sodium Pyrophosphate，0.1mM β-glycerophosphate，10μg/mL Aprotinine，10μg/mL Leupeptin，1% Triton X-100)將細胞刮下並收集。利用 vortex 將細胞震碎然後靜置冰上 30 分鐘共三個循環，最。. 後於 4 C 14000rpm 高速離心 30 分鐘，上清液及微 whole cell lysate 但白質萃取物。定量蛋白後，取 30μg/lane 的蛋白質萃取物與適量 5X Protein 。. loading dye 混合，置於 95 C 作用 5 分鐘後，冰上冷卻 1 分鐘，spin 27 .

(37) . down 並將蛋白質注入 SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electroresis)wells 中，以 80V 電壓進行電泳，待 protein marker 開始分離時可將電壓再提高至 120V 讓蛋白分離完全，再進行轉漬(transfer)動作，用 999mA 兩小時把蛋白質轉漬到 PVDF transfer membrane 上。轉漬完成將 PVDF transfer membrane 以 5% Non-fat milk blocking 30 分鐘，用 1X TBST 清洗 10 分鐘/次共三次，再進行免疫墨點法 (Immuno-blotting assay)。首先加入特異性一級抗體作用約兩小時 (依抗體不同略有差異)，再以 1X TBST 清洗 10 分鐘/次共三次，接著再加入二級抗體作用約 1 小時候用 1X TBST 清洗 10 分鐘/次共三次，最後利用 BCIP/NBP 呈色法或 ECL 底片感光顯像法來表現結果。 . 免疫化學組織染色法 Immunohistochemical staining assay: 乳房組織臘塊切片5 μm thick sections 置於載玻片上，使用過氧化氫，將組織上內源性的干擾因子去除，使用Cyclin D3 (Senta Curz) 抗體，1:50 稀釋在PBS 溶液中.完全覆蓋在組織切片上，作用一百二十分鐘，使用PBS清洗三次，每次五分鐘，接下來我們使用 Biotinylated link，作用三十分鐘，使用PBS清洗三次，每次五分鐘，接者使用streptavidin (conjugated to horseradish peroxidase) ，作用三十分鐘，使用PBS清洗三次，每次五分鐘，DAB Chromogen 28 .

(38) . (DakoCytomation)呈色劑，作用約三到五分鐘，接著我們使用 maryer`s hematoxylin 染細胞核，作用約三到五分鐘，使用流動的自來水清洗十分鐘後，使用75％Ethanol，上下浸泡約十次，使用85 ％Ethanol，上下浸泡約十次，使用99％Ethanol，上下浸泡約十次，準備三組xylene，上下浸泡約十次，共三次，使用封片劑封片。觀察組織中蛋白的表現。. 染色質免疫沉澱法 Chromatin Immunoprecipitation 6. 將 2×10 個細胞培養 10cm dish 中，培養 24 小時，依實驗不同加入不劑量的藥物，待藥物作用時間結束後，加入 351μL 37% Formaldehyde 室溫下作用 15 分鐘，以固定細胞、蛋白質和 DNA ；之後加入 2.5 M Glycine 作用 5 分鐘，終止 Formaldehyde 的作用。吸掉上清液，以冰的 PBS wash 三次；吸乾 PBS，並且加入 100μL ChIP lysis buffer(含 2μL 0.1M PMSF，0,5μL 2 mg/mL Aprtinin，0.1 μL 1 mg/mL Leupeptin，0.1μL 0.2 M Sodium orthovanadata)，將細胞刮下來，收集至 1.5 mL enpendorff，vortex 震盪後置冰上。. 30 分鐘共 3 個循環。Sonication 10 秒三次(DNA 震碎成片段)，於 4 C 14000 rpm 高速離心 30 分鐘，上清液即為所要的蛋白質。之後取. 上清液進行定量，取 500μg protein 進行免疫沉澱，每個 sample 加 29 .

(39) . 500μL ChIP lysis buffer(含 2μL 0.1 M PMSF，0,5μL 2 mg/mL Aprtinin，0.1μL 1 mg/mL Leupeptin，0.1μL 0.2 M Sodium orthovanadata)，外加 20μL Protein A/G 和 2μL 特異性抗體，於。. 。. 4 C rotation O/N。隔天將 sample 取出於 4 C 6000 rpm 離心 5 分鐘, 吸掉上清液到約剩 100μL(注意勿吸到 beads)。用 ChIP lysis buffer 1 mL wash 5 次，於 4 ℃ 6000 rpm 離心 1 分鐘；用 ChIP lysis 。. buffer(High salt) 1 mL wash 5 次，於 4 C 6000 rpm 離心 1 分鐘；。. 用 ChIP wash buffer 1 mL wash 5 次，於 4 C 6000 rpm 離心 1 分鐘；。. 用 TE buffer 1mL wash 5 次，於 4 C 6000 rpm 離心 1 分鐘，之後儘。. 量吸掉上清液。加入 75μL ChIP elution buffer，在 65 C 水浴 10 。. 分鐘，於 4 C 6000 rpm 離心 1 分鐘，取上清液到新的 enpendorff，。. 剩下的丟棄，將所收集的上清液置於 65 C 水浴槽水浴 O/N。隔天再。. 加入 150μL ChIP elution buffer 置於 65 C 水浴槽水浴 O/N。隔天。. 。. 加入 500μL phenol，於 4 C rotation 10 分鐘，之後於 4 C 12000 rpm 離心 5 分鐘，取上清液到新的 enpendorff，加入 500μL 。. 。. phenol/Chloroform(1:1)於 4 C rotation 10 分鐘，之後於 4 C 12000 rpm 離心 5 分鐘，取上清液到新的 enpendorff，加入 500μL 。. Chloroform，之後於 4 C 12000 rpm 離心 5 分鐘，取上清液到新的 enpendorff 並加入 1/10 體積的 3 M sodium acetate 和 2 倍體積冰 30 .

(40) . 。. 。. 的 99.9%酒精，-20 C O/N 保存。隔天 4 C 12000 rpm 離心 10 分鐘，。. 去除上清液，加入 500μL 75%酒精，於 4 C 12000 rpm 離心 10 分鐘，去除上清液並加入 15μL 滅菌水，進行 PCR。 Chromatin Immunoprecipitation primer(Cyclin D3 promoter)： (Sense：GGCCTTTCCGTTCTGTTAT) (Anti-sense：CTTATTCATTCGTCAAACCCTACT) 31 .

(41) . . 結果 (Result). 32 .

(42) . 結果. 一. Garcinol 是七種天然萃取物中對 nicotine 在乳癌細胞 MDA-MB-231 表現具有良好的抑制效果。 Nicotine 在先前的文獻中已經指出可以透過 NF-κB 促使 cell proliferation. 由於本實驗室之前的實驗已發現 10μM nicotine 作用於 MDA MB-231 這個 ER negative 乳癌細胞株，能經由 PI3K/Akt 這個訊息傳遞路徑，使 nAchR α9 的 DNA 表現量增多，進而合成更多的 nicotine receptor 並且表現在細胞膜上，產生類似正向回饋作用的效應，使癌細胞更加惡質化。因此我們先選取乳癌細胞中較為惡性的，並且添加 Nicotine 當做一個惡劣的環境因子，接著分別添加七種不同的天然萃取物來觀察那一種 6. 是比較具有潛力的。次培養時將各種 cell line 細胞培養於 2x10 cells/10cm dish，然後添加各種因子於 24 小時後收細胞以 western blotting 來觀察結果，因為 Curcumin 及其延伸物已經. 受到廣泛的研究了，所以我們挑選另一個同樣也有潛力的天然萃取物 Garcinol。(Fig 1A.)另外我們為了更證實 nAchR α9 的表現會隨著 Garcinol 的濃度增加而受到抑制，因此我們分別添加 1-20μM 然後同樣以 western blotting 來觀察。(Fig 1B.) 33 .

(43) . 二. 天然萃取物 Garcinol 對乳癌細胞的生長具有抑制作用。在乳癌細胞 MDA-MB-231 中同時添加 nicotine 和 Garcinol，前者可以刺激癌細胞更加惡化，我們希望可以藉由添加 Garcinal 5. 來抑制其生長情形。首先，次培養時將細胞以 1x10 /well 的濃度培養於 6 well 培養皿中，之後在每個 well 中加入不同濃度的藥物，並且每隔 24 小時更換 culture medium 及藥物並收細胞，待 72 小時後以 MTT viability assay 分析實驗結果。實驗結果發現，雖然 nicotine 能促進乳癌細胞株 MDA-MB-231 生長，但在加入 Garcinol 後此作用即被抑制；高劑量的 Garcinol 甚至可以完全抑制癌細胞的生長(20μM)(Fig 2.)。從此實驗結果我們認為 Garcinol 能經由某種途徑有效的抑制癌細胞成長，我們接著將去尋找並確定這個機制。. 三. Garcinol 造成 MDA-MB-231 的生長抑制起因於 G1 cell cycle arrest。除了用 MTT viability assay 去研究添加 Garcinol 後細胞的生長情況，我們更進一步以 flow cytometric analysis 去觀察細胞週期的情況，以判斷 Garcinol 可以將癌細胞有效的停止在那個 6. 週期。將細胞培養於 2x10 cells/10cm dish 後，先以 starvation 34 .

(44) . mediu 使細胞全部停止在 G1 時期，24 小時後更換回 culture medium 並加入不同劑量的 Garcinol 再培養 24 小時，以 flow cytometric analysis 去分析。(Fig 3.)我們發現 MDA-MB-231 被抑制在 G1 時期。從先前的研究中就有指出 Garcinol 對於 cell cycle 有一定程度上的影響(Balasubramanyam, Altaf et al. 2004)。此現象可能表示 Garcinol 對 G1 時期的基因或蛋白具有抑制的能力，因此接下來則探討 Garcinol 與細胞 G1 時期的關係。. 四. Garcinol 在 MDA-MB-231 細胞株中能抑制 Cyclin D3 蛋白質表現量的最低劑量。為了研究 Garcinol 對癌細胞 G1 時期的影響，我們決定在以 western blotting 去偵測一些主要在 G1 時期的蛋白表現。本實 6. 驗首先次培養 2x10 cells/10cm dish，經過 24 小時貼附後，將舊的 culture medium(DMEM F-12)吸掉，並且加入新的 culture medium 以及不同劑量的 Garcinol。之後培養 24 小時，再收集蛋白，以 western blotting 的方式觀察其 G1 時期蛋白質表現量。實驗結果發現，隨著加入的 Garcinol 濃度不同，Cyclin D3 蛋白質表現量有減少的趨勢。在濃度 20μM 的時候，Garcinol 能有效抑制 Cyclin A 和 Cyclin D3 蛋白質表現量(Fig 4.)。Cyclin 35 .

(45) . D1 和 D3 屬於同一個家族，但因其作用機制上仍有所不同，所以 Cyclin D1 並未受到 Garcinol 影響(Guller, Toualbi-Abed et al. 2008)。Cyclin D3 在較惡化的乳癌細胞株 MDA-MB-231 表現較高(附錄四)，而 Garcinol 可藉由抑制 Cyclin D3 的表現量進而抑制癌細胞生長。在這個實驗裡我們確認了 Garcinol 在 20μM 時就可以透過抑制 Cyclin D3 抑制癌細胞生長，接下來我們將探討 Garcinol 對 Cyclin D3 的影響是否隨著時間的增加而增加。. 五. Garcinol 在 24 小時內即可對 Cyclin D3 造成抑制效果。在確定 Garcinol 在 20μM 時就可以透過抑制 Cyclin D3 抑制癌細胞生長，我們要模擬 Garcinol 在添加後多久能有效對癌細胞 6. 產生作用。本實驗首先次培養 2x10 cells/10cm dish，經過 24 小時貼附後，將舊的 culture medium(DMEM F-12)吸掉，先以 starvation mediu 使細胞全部停止在 G1 時期，24 小時後更換回 culture medium 並加入最低劑量的 Garcinol 再分別培養 0、6、 12、24 小時。依不同的時間點將細胞收下來以 western blotting 觀察蛋白的表現量。(Fig 5.) 在 Garcinol 添加 12 小時後，Cyclin D3 的表現會隨著時間往下降低，因此我們判斷 Garcinol 在添加 12 小時後即可對癌細 36 .

(46) . 胞造成影響。在確定 Garcinol 的劑量和作用時間後，我們開始推測 Garcinol 是如何對 Cyclin D3 造成影響。我們開始分析 Cyclin D3 promoter 的 transcription factor binding stie，而其中最重要的 binding stie 就是 AP-1(Wei, Jiang et al. 2006; Faenza, Ramazzotti et al. 2007; Jiang, Wei et al. 2007; Ramazzotti, Faenza et al. 2008)。. 六. Garcinol 對 Cyclin D3 的影響在於其抑制 C-jun 的表現量。因為 Cyclin D3 的 Promoter 區域有 AP-1 結合位，即 AP-1 的表現量對於 Cyclin D3 的表現有正相關。AP-1 在細胞中伴演著很重要的角色，許多重要的基因都有此 binding site，其主要是由 C-jun 形成的 homodimer 或者是 C-jun 和 C-fos 形成的 heterodimer binding 在 AP-1 上以調控下游的蛋白表現(附錄五)。我們認為 Garcinol 可能對 Cyclin D3 promoter 的 AP-1 binding site 有某些程度的影響，才使得 Cyclin D3 表現量降低。 6. 我們將 MDA-MB-231 次培養 2x10 cells/10cm dish，經過 24 小時貼附後，將舊的 culture medium(DMEM F-12)吸掉，並且加入新的 culture medium 以及不同劑量的 Gacinol，再經過 24 小時後將蛋白收下，以 western blotting 觀察。(Fig 6.) 37 .

(47) . 藉由 western blotting 我們發現 AP-1 上最重要的 transcription factor，C-jun，會隨著 gacinol 的劑量增加而被抑制，這邊我們合理的推測 Garcinol 會影響 C-jun 的表現。. 七. 由 ChIP 和 Luciferase assay 確定 Garcinol 對 C-jun 的抑制效果。為了更確定 Garcinol 可以影響 C-jun 的表現量，我們以 ChIP 來做更進一步的研究。ChIP 可以判斷 transcription factor 是否直接或間接的 binding 在 promoter 上。我們將 MDA-MB-231 次 6. 培養 2x10 cells/10cm dish，經過 24 小時貼附後，將舊的 culture medium(DMEM F-12)吸掉，並且加入新的 culture medium 以及最低劑量的 Garcinol，再經過 24 小時後將細胞收下來以 ChIP assay 來做分析。(Fig 7.) 從(Fig 7.)我們可以確定 Garcinol 對 C-jun 有約 70%的抑制效果，此實驗與先前 western blotting 有一樣的結果，更能確立 Garcinol 透過抑制 C-jun 的表現來影響 Cyclin D3 進而使細胞週期停止在 G1 時期。此外，將 5X AP-1 結合位的 Promoter 接上 repoter gene 並建構在 plasmid 之中，將其 transfect 進乳癌細胞株 MDA-MB-231 之後添加不同劑量的 Garcinol，於 24 小時後以 38 .

(48) . Luciferase assay 觀察。(Fig 8.)。此實驗的情況也符合 ChIP 和 western blotting 的結果。. 八. C-fos 可以穩定 Cyclin D1 的表現。 Cyclin D1 和 D3 屬於同一個 Cyclin D 家族，因此在功能上較為相似，但為何 Garcinol 只能影響 Cyclin D3 而不包含 Cyclin D1 呢？在先前的研究中(Guller, Toualbi-Abed et al. 2008)有指出，C-fos 可以穩定 Cyclin D1 的表現使其不受外來抑制物的影響。在我們的實驗中發現，Garcinol 可以藉由影響 C-jun 進而抑制 Cyclin D3 的表現，但不能抑制 C-fos，所以 Cyclin D1 的表現並不會受到 Garcinol 的影響。(Fig 9.). 九. Garcinol 透過 p38 MAPK Signaling Pathway 抑制 C-jun 表現量。在確定 Garcinol 可以抑制 C-jun 的表現來影響 Cyclin D3 進而使細胞週期停止在 G1 時期後，接下來是研究 Garcinol 是透過那一條 signaling pathway 來影響 C-jun 的表現。從先前的研究中可以知道 C-jun 的上游訊息傳遞路逕主要是 c-Jun N-terminal kinase (JNK)和 p38 signaling pathway 構成(Eferl and Wagner 2003)。而 Garcinol 從先前的研究可以知道它可以透 39 .

(49) . 過 p38 signaling pathway 來影響下游表現(Atzori, Ghetti et al. 2001; Liao, Sang et al. 2004; Hong, Sang et al. 2006)。因此我們將研究在 Garcinol 在乳癌細胞中是否也是透過 p38 signaling pathway 來抑制下游反應。我們將 MDA-MB-231 次培養 6. 2x10 cells/10cm dish，經過 24 小時貼附後，將舊的 culture medium(DMEM F-12)吸掉，先以 starvation mediu 使細胞全部停止在 G1 時期，24 小時後更換回 culture medium 並加入不同劑量的 Garcinol 再培養 24 小時，將蛋白收下以 western blotting 觀察。(Fig 10A.) 同時，我們為了更確定 Garcinol 是經由 p38 signaling pathway，我們選用了 p38 kinase inhibitor 來觀察他們在 western blotting 的表現。(Fig 10B.). 十. 在兩百例檢體中發現基因 Cyclin D3 的表現高於正常乳房細胞。除了在細胞實驗中看到 Garcinol 對 Cyclin D3 的影響，我們也希望能在臨床的數據分析中找到 Cyclin D3 與乳癌的相關性。實驗室中平時有與醫院(附錄七)合作，收集了許多乳癌病人的檢體並將其轉成 cDNA。在兩百例的乳癌病人檢體中，Cyclin D3 的基因表現量高於正常的乳房細胞(Fig 11.)。 40 .

(50) . 十一. 由 Real-time PCR 分析出 Cyclin D3 與乳癌之間的相關性。為了解臨床中 Cyclin D3 與乳癌的相關性，我們將 RT-PCR 中表現較為明顯的 94 例病人以 Real-time PCR 分析。(fig 12A.) 其中可以看到 tumor 組織中 Cyclin D3 的表現遠高於 normal 組織。(fig 12B、C.)其中也可以看出 Cyclin D3 在 tumor 組織中的表現可能與 tumor size、stage 和淋巴轉移情形成正相關，與 differentiation 負相關。(fig 12D.). 十二. 在 IHC 中發現 Cyclin D3 表現量在 Tumor tissue 中遠大於 Normal tissue。我們把收集的蠟塊檢體請病理科切片，然後用 Cyclin D3 的抗體去做 IHC 實驗，發現組織中的 Cyclin D3 在癌細胞中含量較正常乳房細胞多，很多不同病人的病理切片中也都看到了 Cyclin D3 與癌症的相關性。(fig 13.). 41 .

(51) . 討論 (Discussion ). 42 .

(52) . 討論. 在許多的癌症病例中，我們發現了細胞週期調控蛋白之一的 Cyclin D3在大部份的病人裡有增加的趨勢，而本實驗中所嘗試的天然藥物Garcinol正好可以有效的抑制Cyclin D3的表現量，進而使細胞週期停止在G1時期以抑制癌細胞的生長。對於這個發現我們是充滿了期待，也因此在實驗中努力去嘗試了解Garcinol對Cyclin D3的調控機制。每一例的乳癌病患因為檢查的結果不同，會有不同的治療方法。Estrogen receptor (ER)大量表現時，使用Tamoxifen 等荷爾蒙治療法是較有效的；當HER2 over expression時，Herceptin就是非常有用的治療藥物。我們也希望Garcinol抑制Cyclin D3的成效可以利用在乳癌病人中Cyclin D3表現較為突出的族群。 Cyclin D Family是細胞週期中最重要的調控者之一，其影響著細胞是否能通過check point以進入S期，其中最主要的就是cyclin D1 和D3，在先前的研究指出，cell cycle中D-type cyclin主要以Cyclin D3為主。以往對癌細胞的治療方式主要分為兩大類，一種是刺激癌細胞進入apoptosis，使癌細胞死亡進而達到治療效果，另一種是cell cycle arrest，使癌細胞停止生長控制癌症的影響範圍。如果我們能有效的調控Cyclin D Family的表現量，就可以使細胞停止增生來達 43 .

(53) . 到第二種治療方法。實驗中所使用的天然藥物Garcinol萃取自富有營養的水果-山竹，其對於癌症的治療效果已經在許多的文獻中證明。在本實驗中，首先看到Garcinol在20μM時能有效抑制Cyclin D3的表現量，因此可以在flow cytometric analysis中發現癌細胞皆呈現G1 arrest的情形，而更高的濃度則有可能使癌細胞走向apoptosis。當某一蛋白會被添加物所抑制時，其作用的可能性有很多種，可能是抑制其RNA level，也可能是抑制蛋白的活化或是使其更易於被分解，而抑制此蛋白基因的promoter則是本實驗所出現的情形。一段基因的表現能力有很大的因素是在其promoter的表現能力，而promoter上有很多的調控位置，即transcription factor binding site。大部份的promoter都有許多不同的transcription factor binding site，有些是促進基因的表現，有些是則是抑制，複雜的調控方式穩定了一個蛋白在體內的情形。先前的文獻已經說明AP-1是Cyclin D3 promoter中最重要的binding site(Faenza, Ramazzotti et al. 2007; Ramazzotti, Faenza et al. 2008)。AP-1是由C-jun形成的homodimer 或者是C-jun和C-fos形成的heterodimer binding在AP-1上以調控下游的蛋白表現。實驗中我們可以看到C-jun會受到Garcinol的抑制，使得C-jun對Cyclin D3 promoter的binding減少以達到抑制Cyclin D3蛋白的表現量進而使細胞週期停止。Garcinol是天然的萃取物，其 44 .

(54) . 作用於細胞內的機制不會只有本實驗中這一條路逕，在先前的文獻也指出他對於很多Cell cycle和apoptosis的基因有一定程度的影響 (Balasubramanyam, Altaf et al. 2004)。我們認為Garcinol可能透過不止一條途徑來抑制Cyclin D3，而其他的可能性還需要更多的研究來證明其機制。巨觀的來說，Garcinol能透過很多方式使得癌細胞受到抑制更甚至死亡，而經由p38 signal pathway來抑制C-jun表現進而到Cyclin D3和細胞週期只是其中一個現象，但他對Cyclin D3 的抑制效果正好可以利用在目前部份乳癌病人中Cyclin D3表現偏高的情形，如果Garcinol能針對此族群有良好的治療效果，這將會使乳癌病人有更多治療方式的選擇，而且Garcinol本身為天然萃取物，比起其他的化學合成藥物應該會有較小的副作用。除了治療的觀點外，以保健預防的角度來看，山竹也是富營養的水果，多攝取山竹可以有效的避免乳癌甚至是其他癌症的發生率。乳癌是台灣癌症中好發率較高的，且因為生活作息和環境的影響下，病發的年齡層有逐漸下探的趨勢，做好有效的預防和保健工作，可以使癌症的發生率下降，保障大家的健康。 . 45 .

(55) . 附圖. 46 .

(56) . Fig 1. (A). (B). Fig1. NAchR α9, a cell proliferation maker, is downregulated by Garcinol . MDA MB-231 cells were seeded in 10cm dishes (2x106 per dish), which been detected nAchR α9 expression in Western blotting after 24 hours. There are several nature compound, D: DBM, M: Magnolol, P:PSB, Cur: Curcumin, HD: HDB, HM: HMDB, G: Garcinol and positive control N: Nicotine. (A) There were seven drugs we treated to select for suppress cell proliferation. Garcinol is the best choice because curcumin and its derivatives has been research almost. (B) nAchR α9 expression is downregulated does dependently (1-20μM) by Garcinol.. 47 .

(57) . Fig 2.. Fig 2. Cell growth of breast cancer cell line is suppressed by garcinol. MDA MB-231 cells were seeded in 10cm dishes (2x106 per dish), which been treated different doses Garcinol after 24hours. Then we detected by MTT assay. Nicotine is a positive control, which induced breast cancer cell growth. Cell growth of breast cancer cell line is suppressed does dependently by garcinol.. 48 .

(58) . Fig 3.. Fig 3. Garcinol induce the cell cycle arrest in G1 phase. MDA MB-231 cells were seeded in 10cm dishes (2x106 per dish), which been treated different doses Garcinol after 24 hours. Then we detected by flow cytometric analysis. The level of G1 arrest is more obvious does dependently.. 49 .

(59) . Fig 4.. Fig 4. Cyclin D3 was inhibited by Garcinol. MDA MB-231 cells were seeded in 10cm dishes (2x106 per dish), which been treated different doses Garcinol. Then we detected Cyclin D3 expression by Western blotting. Cyclin D3 is down regulated at 20μM of Garcinol.. 50 .

(60) . Fig 5.. Fig 5. Cyclin D3 was downregulated by Garcinol in 24 hours. MDA MB-231 cells were seeded in 10cm dishes (2x106 per dish), which changed to 10%FBS DMEM-F12 and treated Garcinol 20 μM after starvation medium 24 hours. Then we detected Cyclin A, Cyclin D1, and Cyclin D3 expression with time course by Western blotting . Cyclin D3 is downregulated after treating Garcionl 20μM at 6 hours.. 51 .

(61) . Fig 6.. Fig 6. Garcinol inhibits C-jun expression is the major reason affecting Cyclin D3 expression. MDA MB-231 cells were seeded in 10cm dishes (2x106 per dish), which been treated different doses Garcinol. Then we detected Cyclin D3 and C-jun expression by Western blotting.. 52 .

(62) . Fig 7.. Fig 7. Promoter binding activity of C-jun was downregulation by Garcinol. MDA MB-231 cells were seeded in 10cm dishes (2x106 per dish), which been treated 20μM Garcinol. C-jun was immunoprecipitated and Cyclin D3’ promoter expression was detected by RT-PCR. Input is mean standard and positive control is MDA-MB-231 cDNA form the dish prepared before. Garcinol inhibits Cyclin D3 promoter binding activity by affecting C-jun. The fold of lane 4 is 30% comparing with control.. 53 .

(63) . Fig 8.. Fig 8. Expression of AP-1 was downregulated dose dependently by Garcinol. MDA-MB-231 cells were seeded in 6 well culture plates. We transfect 5X AP-1 and 5X mutant ap-1 promoter into MDA-MB-231 cells after 24 hours, then treating different doses Garcinol in cells 24 hours. Nicotine is a positive control, which induced breast cancer cell growth. Then 5X AP-1’expression was detected by Luciferase Assay.. 54 .

(64) . Fig 9.. Fig 9. C-fos stabilized Cyclin D1 expression. MDA MB-231 cells were seeded in 10cm dishes (2x106 per dish), which been treated different doses Garcinol. Then we detected Cyclin D1, Cyclin D3, C-jun and C-fos expression by Western blotting.. 55 .

(65) . Fig 10. (A). (B). Fig 10. P-p38 was downregulated time dependently by Garcinol. MDA MB-231 cells were seeded in 10cm dishes (2x106 per dish), which changed to 10%FBS DMEM-F12 and treated Garcinol 20 μM after starvation medium 24 hours. (A) Then we detected P-p38 and p38 expression with time course by Western blotting. (B)SB203580 is an inhibitor for P-p38, we detected P-p38 expression whether through P-p38 pathway. We treated SB203580 before treating Garcinol 1 hours, and detected P-p38 expression after traeating garcinol 5 minutes by Western blotting. 56 .

(66) . Fig 11.. Fig 11. 200 patients have been detected for Ccnd3 expression by RT-PCR. T>N is about 50%. We detected 200 patients for Cyclin D3 expression to observe the relation ship between Cyclin D3 and clinical data.. 57 .

(67) . Fig 12. (A). (B). (C). . (D). Fig 12. 94 patients have been detected for Ccnd3 expression by Real-Time PCR. Cyclin D3 is relation to tumor size, differentiation, lymph node transfer and stage. We detected 94 patients for Cyclin D3 expression to observe the relation ship between Cyclin D3 and clinical data. 58 .

(68) . Fig 13.. 59 .

(69) . Fig 13. Cyclin D3 which has been detected by IHC is over expression in breast cancer patient. Paraffin the breast tumor tissue to cut into slices, and Cyclin D3 was over expression in brown. (A) Red frame was tumor by 40X, and blue frame was normal tissue by 40X. (B), (C) Red frame and blue frame enlarged by 200X. (D) The sequence slice with HE stain. Red frame was tumor by 40X, and blue frame was normal tissue by 40X. (E), (F) Red frame and blue frame enlarged by 200X. (G), (H) Red frame and blue frame enlarged by 400X. (I), (J) ) Red frame and blue frame enlarged by 400X with HE stain.. 60 .

(70) . 附錄. 61 .

(71) . 附錄一：Garcinol 影響癌細胞的路徑圖. 62 .

(72) . 附錄二：Garcinol及延伸物的結構式. 63 .

(73) . 附錄三：Nicotine 與 cancer 之間的關係. 附錄四：Cyclin D3 與不同性質之乳癌細胞的相關性. 64 .

(74) . 附錄五：Cyclin D3 之 promoter 研究文獻. 附錄六：目前乳癌治療方式分析. 65 .

(75) . 附錄七：乳癌檢體病歷資料. 66 .

(76) . 67 .

(77) . 參考文獻. 68 .

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