含錳超氧化物岐化酶之N3O2五牙配位基擬態化合物的合成、性質及超氧化物反應性探討

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(1)國立台灣師範大學化學系碩士論文. 指導教授：李位仁博士. 含錳超氧化物岐化酶之 N3O2 五牙配位基擬態化合物的合成、性質及超氧化物反應性探討. Synthesis, Characterization and Superoxide Reactivity of Manganese N3O2 Complexes Relevant to the Active Site of Manganese Superoxide Dismutase. 研究生：朱其翊. 中. 華. 民. 國. 一. 百. 零二. 年. 八月.

(2) 謝誌首先，感謝指導教授李位仁老師在我求學期間不辭辛勞地指導與教誨，並授予我許多重要的化學知識和觀念並提供良好的研究環境，給予我學習成長的機會，使我受益良多，在此致上最真誠的感謝與敬意。感謝口試委員清華大學廖文峯教授和王雲銘教授於百忙之中抽空參加口試及論文審查，並於口試期間不吝指正，給予我許多寶貴的意見與建議，使論文能夠更臻完善，在此致謝。研究期間特別感謝國科會在研究經費上的資助和貴儀中心的技術支援及本所提供 X-光單晶結構解析和質譜之測定及台大提供元素分析之測定，使研究過程得以順利進行。感謝汪子立、江建緯、張皓晴、陳許志勇、李柏毅、鄒毓旂、蔡佩真學長姊和實驗室夥伴們周彥甫、林耘瑄、劉玟季、林昱辰、溫淑如以及學弟妹王俊傑、楊于凡、王舒慶、陳虹伶等的陪伴與協助，使研究生活更加充實及歡樂。最後感謝對我無怨無悔付出與支持的家人，使我能夠心無旁騖地完成學位。最後要感謝陪伴我並給我鼓勵的語騏，將此論文獻給你們，並獻上我衷心的感謝和祝福。. 朱其翊謹致民國一百零二年八月于台師大.

(3) 目錄中文摘要………………………………………………………………...Ι 英文摘要...................................................................................................II 圖索引………………………………………………………………….III 表索引…………………………………………………………………..V 附錄索引………………………………………………………………..VI. 第一章緒論前言…………………………………………..….………………….1 第一節研究動機與目的……………………..….………………….3 第二節含金屬超氧化物歧化酶的相關文獻探討…………………6 第三節含錳超氧化物歧化酶擬態化合物的相關文獻探討……..15. 第二章實驗部分第一節實驗儀器、藥品及條件……………………………………24 第二節配位基的合成與鑑定……………..………………………31 第三節錯合物的合成與鑑定……………………………………..38 第四節二價錳錯合物 1 與超氧化鉀之反應……………………..44 第五節三價錳錯合物 4 與超氧化鉀之反應………………. .…...44.

(4) 第三章結果與討論第一節含錳超氧化物歧化酶(MnSOD)結構模擬之錳金屬錯合物探討…………………………………………………...…..45 第二節模擬 MnSOD 之錳擬態錯合物電化學探討…………….57 第三節模擬MnSOD之錳擬態錯合物與超氧化物的反應性及機制之探討……………………………………………………………………….65. 第四章結論與展望………...…………………………………….…....72. 參考文獻…………………………………………………………….….74. 附錄.

(5) 摘要為了模擬含錳過氧化物歧化酶(MnSOD)，本研究沿用之前本實驗所合成C2對稱的N3O2 五牙配位基(H2BDPP)，經去質子化後與MnCl2 反應可得五配位二價錳錯合物Mn(BDPP) (1)，錯合物1經氧化後可得穩定的三價錳錯合物 Mn(BDPP)(OH) (2)、 Mn(BDPP)(Cl) (3)及 [Mn(BDPP)(H2O)](BF4) (4)，並利用紫外/可見光光譜、X光繞射結構解析以及循環伏安法，進行鑑定及探討。相對於Ag/Ag+參考電極，超氧離子歧化反應的還原電位應介於−0.24與+0.96伏特之間，使超氧離子的單電子氧化還原最好位於此範圍的中間值，錯合物1及4的還原電位分別為+0.125及−0.3伏特，有機會與KO2進行反應。當錯合物1與KO2 於−80 ˚C下反應時，在UV/vis可見光譜上可以觀察到370, 447及720 nm處有特徵吸收峰，與過去文獻中MnIII-OOH中間態化合物的吸收光譜相似，就MnSOD的催化循環而言，MnIII-OOH確實參與反應機制當中。另一方面，錯合物4與KO2於室溫下反應，其紫外/可見光光譜與錯合物2相近，我們推測其反應過程為KO2將錯合物4去質子化後形成錯合物2。. 關鍵字:超氧化物歧化酶、還原電位. I.

(6) Abstract In order to mimic the active site of MnSOD, a C2-symmetric N3O2 pentadentate ligand, H2BDPP prepared previously by our lab, was deprotonated and employed to react with MnCl2 to give a five-coordinate Mn(BDPP) (1). Complex 1 can be oxidized to form stable MnIII complexes, Mn(BDPP)(OH) (2), Mn(BDPP)(Cl) (3) and [Mn(BDPP) (H2O)](BF4) (4), which are characterized by UV/vis spectroscopy, X-ray crystallography and cyclic voltammetry. The reductive potential for dismutasing superoxide anion should be between −0.24 and +0.96 V (vs. Ag/Ag+), and preferentially near the middle of this range for one-electron oxidation and reduction of superoxide. The reductive potential of complexes 1 and 4 were +0.125 and −0.3 V, respectively. They have the potential to react with KO2. When complex 1 reacted with KO2 at −80 ˚C, three electronic absorptions (λmax = 370, 447, 720 nm) were observed. The UV/vis spectrum of the reaction mixture is similar to that of MnIII-OOH intermediate. According to the proposed MnSOD catalytic cycle, MnIII-OOH intermediate is certainly involved in the catalytic cycle. On the other hand, when complex 4 reacted with KO2 at room temperature, a UV/vis spectrum similar to that of complex 2 was obtained. We proposed that complex 4 was deprotonated by KO2 to form complex 2.. Keyword:Superoxide dismutase、Reductive potential. II.

(7) 圖索引圖 1.1 自由基的生成·······························································································3 圖 1.2 自由基的種類·······························································································4 圖 1.3 三類型超氧化物歧化酶的活性中心···················································7 圖 1.4 Cu/ZnSOD 的蛋白質結構與活性中心················································7 圖 1.5 Cu/ZnSOD 進行氧化還原的反應機構················································8 圖 1.6 大腸桿菌 Escherichia coli········································································8 圖 1.7 MnSOD 的蛋白質結構與活性中心·····················································8 圖 1.8 MnSOD 對超氧離子之歧化反應··························································9 圖 1.9 MnSOD 於文獻上利用理論計算推測之反應機制······················10 圖 1.10 FeSOD 的蛋白質結構與活性中心·····················································11 圖 1.11 鏈黴菌 Streptomyces 及藍綠藻 cyanobacteria································12 圖 1.12 NiSOD 的蛋白質結構與活性中心·····················································12 圖 1.13 NiSOD 對超氧離子之歧化反應··························································13 圖 1.14 NiSOD 於文獻上推測之反應機構·····················································14 圖 1.15 MnSOD 之擬態化合物 AEOL 10113 及 AEOL 10150·················15 圖 1.16 MnSOD 之擬態化合物 EUK-113 及 EUK-134·······························16 圖 1.17 MnSOD 之擬態化合物 EUK-113 的修飾·········································17 圖 1.18 脲基團與過氧化氫反應之示意圖······················································17 III.

(8) 圖 1.19 MnSOD 之擬態化合物 M40403··························································18 圖 1.20 上:超氧離子的 EPR 圖譜；下:M40403 與超氧離子反應後的 EPR 圖譜······································································································19 圖 1.21 MnSOD 之擬態化合物[(L)MnII(ClO4)](ClO4)·······························20 圖 1.22 [(L)MnII(ClO4)](ClO4)與超氧化鉀反應之吸收光譜圖··············21 圖 1.23 EUK-113 修飾的八種取代基·······························································21 圖 1.24 EUK-113 與其修飾化合物對 SOD 活性比較·································22 圖 1.25 修飾後的 EUK-113 之示意圖·······························································22 圖 3.1 錳超氧化物之歧化反應·········································································46 圖 3.2 配位基 H2BDPP 之結構········································································46 圖 3.3 配位基 H2BDPP 之合成········································································47 圖 3.4 錯合物 1 之 X-ray 結構解析圖·····························································48 圖 3.5 去質子化示意圖························································································49 圖 3.6 錯合物 2 之 X-ray 結構解析圖······························································50 圖 3.7 錯合物 3 之 X-ray 結構解析···································································52 圖 3.8 錯合物 4 之 X-ray 結構解析···································································54 圖 3.9 五配位構型計算示意圖·········································································55 圖 3.10 錯合物 1 之 CV 圖譜················································································57 圖 3.11 左：MnII(BDPP) 中：[Mn(Phimp)2] 右：[Mn(ntb)(Hsal)]·······58 IV.

(9) 圖 3.12 錯合物 2 之 CV 圖譜·················································································59 圖 3.13 錯合物 3 之 CV 圖譜·················································································59 圖 3.14 錯合物 4 之 CV 圖譜················································································60 圖 3.15 左：[MnIII(BDPP)(H2O)](BF4) 右：MnIII(tac)································61 圖 3.16 MnCl2 與 H2BDPP 合成一系列錯合物之示意圖···························62 圖 3.17 錯合物 1 和 4 與其他擬態錯合物及酵素之半電位比較············63 圖 3.18 錯合物 1 和 4 與 MnSOD 之比較·························································64 圖 3.19 錯合物 1 與超氧化鉀反應之 UV/vis 光譜變化······························66 圖 3.20 錯合物 1 與超氧化鉀反應之推測路徑·············································66 圖 3.21 Thomas C. Brunold 教授利用模擬光譜推測之中間體···············67 圖 3.22 錯合物 1 與超氧化鉀反應與 MnSOD 之反應機制比較·············69 圖 3.23 錯合物 4 與超氧化鉀反應其溫度變化之吸收光譜圖················70 圖 3.24 錯合物 4 與超氧化鉀之推測反應機制·············································71. V.

(10) 表索引表 3.1 錯合物 1 之鍵長與鍵角··········································································52 表 3.2 錯合物 2 之鍵長與鍵角··········································································53 表 3.3 錯合物 3 之鍵長與鍵角··········································································55 表 3.4 錯合物 4 之鍵長與鍵角··········································································57 表 3.5 錯合物 1、2、3、4 之鍵長比較··························································57 表 3.6 錯合物 1 與其他錳二價錯合物之半電位比較·······························60 表 3.7 錯合物 4 與其他錳三價錯合物之半電位比較·······························63 表 3.8 錯合物 4 與超氧化鉀及錯合物 2 之 UV/vis 吸收光譜比較······72. VI.

(11) 附錄索引附錄 A. NMR 圖譜. 附錄 B. X-ray 單晶繞射解析結構及晶體常數. VII.

(12) 第一章緒論前言活性氧化物(reactive oxygen species, ROS)其組成包括了以氧為中心的自由基 1，如氫氧自由基（hydroxyl radical, •OH）、超氧陰離子自由基(superoxide anion, O2•−)，及其他和氧有關的活性物質，如過氧化氫(H2O2)。大部分的活性氧化物和活性氮氧化物都屬於自由基或很容易生成自由基，自由基是指外層電子軌域具有未共用電子對之分子或離子。自由基(free radicals)是一種極活潑、不穩定、生命週期短的化合物，因為不穩定，所以會與體內的細胞組織產生化學反應，這些化學反應可統稱為氧化，會使組織細胞失去正常功能，甚至破壞 DNA，造成損害或突變，引起癌症。為了對抗自由基所帶來的傷害，生物體需要一種抵禦機制來對抗自由基帶來的破壞，而這種抵禦機制為含金屬酵素之超氧化物歧化酶 (superoxide dismutases, SODs)：此些酵素為生物體內對抗自由基的一道重要防線，能將毒性強的超氧離子轉化為毒性較低或較無害的物質—過氧化氫與氧氣，使自由基轉變為較穩定的狀態，並終止其連鎖破壞效應，達到預防疾病及避免生物體細胞死亡而造成老化的效果。. 1.

(13) 故我們以二價錳金屬鹽類與有機配子反應生成錳錯合物，以作為模擬含錳超氧化物歧化酶的擬態化合物，模擬其結構與特性，進行與酵素相同反應的研究，並與酵素的催化反應進行比較，冀望在未來能將此研究應用在醫療方面。. 2.

(14) 第一節研究動機與目的過去自由基的產生多半是由於身體機能的病變所引起，然而自由基的生成在近數十年有更多的危害來源，如X光、空氣汙染、輻射能源、精神壓力、紫外光……等，這些危害來源皆會導致DNA的破壞，進而對人體產生健康上的危害。. 圖 1.1 自由基的生成. 自由基(free radical)是一類非常活躍的化學物質，是個有不成對 (奇數)電子的原子、原子團、分子或離子。它可聚集在體表、心臟、血管、肝臟和腦細胞中。如果它沉積在血管壁上，會使血管發生纖維性病變，導致動脈硬化，高血壓，心肌梗塞；沉積在腦細胞時，會引起老年人神經官能不全，導致記憶、智力障礙以及抑鬱症，甚至老年性痴呆等，是造成人類衰老和疾病的元兇，人體內最常見的自由基即超氧離子自由基(superoxide anion radical, O2•−)。 3.

(15) 圖 1.2 自由基的種類. 2. 超氧離子為生物體進行吸收作用時所產生之副產物，廣泛存在於生物體內，為一具高活性之物質。在生物體內，易與水分子或其他含氧物質產生活性氧化物ROS。ROS具有相當高的反應性，其半生期很短且極不穩定，可攻擊生物分子而引發自由基連鎖反應。在生理所需的低濃度下，ROS可行使正常細胞功能清除老化細胞；但若ROS過量生成，則可能造成細胞中DNA、脂質、蛋白質等分子過度氧化，而造成正常細胞的傷害。為了抗衡這種由自由基所帶來的病變，在生物體內也有防禦機制來抵抗這些自由基，而超氧化物歧化酶，即為生物體內對抗自由基的重要防線之一，為含金屬的蛋白酵素，根據其活性中心的結構可區分成三大類：(1)Cu/ZnSOD (2)Mn及FeSOD (3)NiSOD。這些酵素皆以O2•−為反應基質，可將超氧離子轉變成毒性較低的過氧 4.

(16) 化氫(H2O2)及氧氣(O2)，使體內自由基維持在低濃度，以達到預防疾病的功能。. 5.

(17) 第二節含金屬超氧化物歧化酶的相關文獻探討自1938年由Marn等人首次從牛肝紅血球中分離得到超氧化物歧化酶迄至，相關研究已有七十多年的歷史；而1969年Fridovich和 McCord等首先發現超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)是存在生物體內的抗氧化劑3，廣泛分布於各種生物體內，如動物，植物，微生物等。當超氧離子在生物體內中濃度升高時，超氧化物歧化酶使對超氧離子進行歧化反應並將其轉變為O2和H2O2 (pH = 7.4，反應速度約為 1.5 × 105 M-1 s-1)4。因此超氧化物歧化酶的存在對於生物體因體內所生成的自由基有相當的抵禦機制，藉由歧化作用來降低自由基所帶來的危害，為生物體內重要的抗氧化劑之一。超氧化物歧化酶(SOD)的歧化反應可分為兩個步驟：氧化反應：M(n+1)-SOD + O2•− → Mn+-SOD + O2 還原反應：Mn+-SOD + O2•− + 2H+ → M(n+1)-SOD + H2O2 其中M可為Cu (n = 1)、Ni (n = 2)、Fe (n = 3)、Mn (n = 2)等金屬離子，即超氧化物歧化酶有銅/鋅、錳或鐵、鎳等三類型。而在反應過程中，金屬的氧化態在n和n+1之間轉換。. 6.

(18) 圖 1.3 三類型超氧化物歧化酶的活性中心. 針對目前已被發現的三類超氧化物歧化酶分別做介紹：一、銅/鋅超氧化物歧化酶，Cu/ZnSOD. 圖 1.4 Cu/ZnSOD 的蛋白質結構與活性中心 5. 1938 年由 Mann 與 Keilin 等人從牛肝紅血球中分離出含銅及鋅的蛋白質，當時不認為其具有酵素功能，只認為具有儲存金屬功用的蛋白質。直到 1969 年，Fridovich 和 McCord 發現此物種含銅/鋅的蛋白質具有轉化 O2•−的功能，因此將它取名為超氧化物歧化酶，並陸續發現此類酵素存在於各生物體當中。 Cu/ZnSOD 的蛋白質在多數真核細胞中呈淡藍色，分子量約為 32 kDa，具兩個相同次單元體(subunit)，每個次單元體都有一個活性中心，含一個銅離子與一個鋅離子。由 X-光單晶繞射解析可發現銅離 7.

(19) 子在活性中心是由四個 His 上的氮原子與其配位，而銅鋅之間以一個 His 做為橋樑連結，而鋅離子則被兩個 His 及一個 Asp 配位。歧化反應中銅離子扮演了氧化及還原的角色，鋅離子本身並沒有參與作用，主要功能在安定整個酵素結構。 Cu/ZnSOD 進行氧化還原的反應機構如圖 1.4。. 圖 1.5 Cu/ZnSOD 進行氧化還原的反應機構 6. 二、錳或鐵超氧化物歧化酶，Mn or FeSOD. 圖 1.6 大腸桿菌 Escherichia coli. 圖 1.7 MnSOD 的蛋白質結構與活性中心 7,8 8.

(20) 1970 年 Keele 團隊首先在大腸桿菌中分離出 MnSOD，此酵素呈暗紫色，在細菌中以二聚體存在；生物體內則以四聚體型式存在，並存在於原核細胞與真核細胞的粒線體中，為粒線體中主要的抗氧化酵素，負責轉化粒線體中產生的超氧離子。MnSOD 的每個單體分子量約 19−24 kDa，其上有一個錳離子。錳離子與三個 His 及一個 Asp 鍵結組成活性中心，而活性中心的周圍涵蓋兩個 His、Trp 及 Tyr。 MnSOD 以 TBP (trigonal bipyramidal)構型存在，赤道位以兩個 His 及一個 Asp 鍵結，軸位以一個 His 鍵結，而第五配位的配子(OH− 或 H2O)則依中心錳金屬的氧化態而決定。其催化反應如圖 1.13 所示，氧化態 MnSOD 與還原態 MnSOD 之間的轉變，使 O2•−進行歧化反應轉變成 O2 和 H2O2 釋出。. 圖 1.8 MnSOD 對超氧離子之歧化反應. 目前推測 MnSOD 的反應機制之一如圖 1.14 所示，首先以 O2•−進入氧化態 MnSOD 與三價錳金屬離子鍵結(路徑 A)，O2•−以 end-on 方式鍵結在錳金屬離子上，錳金屬離子上的 O2•−會經電子轉移而將氧化 9.

(21) 態 MnSOD 還原成還原態 MnSOD，且 O2•−氧化為 O2。接著於氧化反應，O2•−配位至還原態 MnSOD (路徑 C)，是先以 side-on 方式鍵結在二價錳離子上，由於此鍵結方式較不穩定，因此進行質子轉移後，將以較穩定的 end-on hydroperoxo 存在。此時，第五配位的水分子這時所扮演提供氫質子的角色，水分子上的氫原子與 Mn-OOH 上的氧原子產生氫鍵作用力，隨之以 H2O2 離去(路徑 D)，而二價錳活性中心則被氧化回到三價錳氧化態活性中心，完成此催化循環。. 圖 1.9 MnSOD 於文獻上利用理論計算推測之反應機制 9. 10.

(22) 圖 1.10 FeSOD 的蛋白質結構與活性中心 10, 11. 此酵素從大腸桿菌中被純化出來，呈淡黃色，分布於藻類、原核細菌細胞質中，動物組織內幾乎沒有發現 FeSOD 的存在。FeSOD 是由兩個蛋白質單位體組成，其活性中心配位方式以三個 His 及一個 Asp 與鐵離子鍵結，分子量約為 8.5-22 kDa，在核酸與胺基酸序列上與 MnSOD 相似。 FeSOD 進行氧化還原的反應機構如下： -. Fe3+SODOH + O2•− + H+ → Fe2+SODH2O + O2 -. Fe2+SODH2O + O2•− + 2H+ → Fe3+SODOH + H2O2 其還原態與氧化態如下圖 12：. 11.

(23) 三、鎳超氧化物歧化酶，NiSOD. 圖 1.11 鏈黴菌 Streptomyces 及藍綠藻 cyanobacteria. NiSOD 存在於鏈黴菌(Streptomyces)及藍綠藻(cyanobacteria) (圖 1.6)，由四個蛋白質單元體組成，分子量約 53.7 kDa，其活性中心為鎳離子做為中心金屬，周圍由 His1、Cys2、Cys6 等胺基酸所組成(圖 1.7)。. 圖 1.12 NiSOD 的蛋白質結構與活性中心 13. 還原態 NiSOD 活性中心的配位環境如圖 1.12 左所示，在鎳離子中心赤道面的平行四邊形上，配位著 His 上末端 amine 的 N 及 backbone 上 amide 的 N 以順式位向(cis arrangement)占據平面四邊形的兩個角，與兩個亦為順式位向配位於平面四邊另外兩個角的 Cys 上 thiolate 的 S，形成 NiIIN2S2 平面四角形結構；氧化態 NiSOD 之活. 12.

(24) 性中心則為原平面四邊構型上由軸位 His 上 imidazole 的 N 配位置鎳離子中心，而形成 NiIIIN3S2 平面四角錐結構(圖 1.8 右所示)。. 圖 1.13 NiSOD 對超氧離子之歧化反應 14. 圖 1.9 為目前 NiSOD 所推測反應機構之一，其 O2•−進入還原態 NiSOD 與鎳離子中心金屬鍵結後(路徑 A)，可藉由活性中心周圍的胺基酸殘基 Tyr9、Cys2 與 Cys6 利用氫鍵穩定 O2•−，接著進行還原反應，將 O2•−還原成 H2O2 釋出(路徑 B)，同時二價鎳中心氧化為三價鎳離子，而因中心金屬缺電子關係，伴隨著 His1 上 imidazole 的 N 配位於鎳金屬中心；緊接著氧化態 NiSOD 的三價鎳離子繼續與 O2•−反應(路徑 C)，同樣地，藉由 Tyr9、Cys2 及 Cys6 上的氫鍵穩定鍵結至鎳離子中心的 O2•−，隨之進行氧化還原反應，使三價鎳中心還原，並使 O2•−氧化為 O2 釋出(路徑 D)，而原配位在軸位的 His1 則離開鎳離子中心，且鎳離子還原回二價，活性中心變回平面四邊的構型，完成 NiSOD 分別催化 O2•−為 O2 與 H2O2 的循環。. 13.

(25) 圖 1.14 NiSOD 於文獻上推測之反應機構 15. 14.

(26) 第三節含錳超氧化物歧化酶擬態化合物的相關文獻探討過去文獻所合成的 MnSOD 擬態化合物，一般來說皆以 N 及 O 的配位方式模擬 MnSOD 的配位環境。然而，仍有科學家顛覆原始配位的概念，合成出以 porphyrins、salen 及 polyamines 的配位基合成的 MnSOD 擬態化合物，且在模擬超氧化物歧化酶的活性上仍具有可觀的反應性，因此針對這一系列的 MnSOD 擬態化合物，列舉幾個具有代表性的 MnSOD 擬態化合物來作說明：一、Manganese(III) Metalloporphyrins. 圖 1.15 MnSOD 之擬態化合物 AEOL 10113 及 AEOL 1015016. Manganese(III)meso-tetrakis(N-ethylpyridinium-2-yl)porphyrin (AEOL 10113) 及 Manganese(III)meso-tetrakis(N-ethylImidazole-2-yl) porphyrin (AEOL 10150)皆以紫質(porphyrin)作為配位基(圖 1.15)，並分別在配位基上進行修飾。一般來說，MnSOD 進行 O2•−的歧化反應時其錳氧化態介於 Mn(II)與 Mn(III)之間；而過氧化氫酵素酶的反應則介於 Mn(IV)與 Mn(V)之間. 17. 。此兩種化合物在人體大腦局部敗血. 15.

(27) (ischemia)的研究上具有催化抗氧化行為(catalytic antioxidants)。AEOL 10150 在 SOD 活性模擬的效果上比 AEOL 10113 多近兩倍(表 1.1)，且合成 AEOL 10113 須由多種的立體異構物才可得，另外單離 AEOL 10113 的過程相當困難，因各種嚴厲的條件限制，製藥階段接受度不高；相對而言，AEOL 10150 的製備過程中不含有立體異構物的存在，較容易生產，並可在組織階段作精準的測試。. 表 1.1 MnSOD 之擬態化合物 AEOL 10113 及 AEOL 10150 的 SOD 活性測試. 二、Manganese(III) salen complexes. 圖 1.16 MnSOD 之擬態化合物 EUK-113 及 EUK-13414. Manganese(III)-[methoxy-N,N ' -bis(salicyldene)ethylenediamine acetate (EUK-113)及 Manganese(III)-[methoxy-N,N'-bis(salicyldene) ethylenediamine chloride (EUK-134)皆以 salen 配位基與錳金屬離子鍵. 16.

(28) 結而得(圖 1.16)，第五配位分別為 OAc 及 Cl，由於它的分子量較低，合成條件容易，因此在作為口服藥的製造上比其餘幾種模擬化合物更具優勢 18。Mn(salen)系列的錯合物除了對 O2•−具有歧化的功能外，同時也具有模擬過氧化氫酵素酶的活性(catalase-mimetic activity)，將 H2O2 轉變為無毒性的氧氣及水分子。2006 年，Tsunehiko Higuchi 教授將 EUK-113 進行一系列配位基的修飾(圖 1.17)，其效果最顯著為脲基(ureido group)的取代基，其脲基主要功能在於過氧化氫與脲基形成兩個氫鍵(圖 1.18)，並穩定錯合物存在，隨之轉換為氧氣及水分子，增加過氧化氫之轉換效率。. 圖 1.17 MnSOD 之擬態化合物 EUK-113 的修飾. 圖 1.18 脲基團與過氧化氫反應之示意圖. 17.

(29) 三、Manganese(II) (pentaazamacrocyclic ligand)-based complexes. 圖 1.19 MnSOD 之擬態化合物 M40403. 早期針對哺乳類體內SOD酵素，設計具有活性並穩定的模擬化合物，應用於人類之相關疾病，研究發現有些許的金屬錯合物可將O2•− 進行歧化反應，然而卻發現這一類的金屬錯合物也會與過氧化氫進行似芬頓反應(Fenton-like reaction)17，將產生毒性比起超氧離子還強的氫氧自由基(hydroxyl radical, •OH)。此研究設計可使錯合物本身並不會與氧化劑(oxidants)產生反應，如過氧化氫及次氯酸鹽。因此Riley 利用Manga nese(II)dichloro -{(4R,9R,14R,19R)-3,10,13,20,26pentaazatetracyclo[20.3.1.0.0,]hexacosa -1(26),-22(23),24-triene} (M40403)為以多胺(polyamines)作為配位基之MnSOD擬態化合物(圖 1.19)，其具有四種主要準則，對超氧離子具有較高SOD活性、穩定度、選擇性及能在生物體內運行，其對於分解超氧離子具有非常好的效果 (圖1.20)。此外，M40403分別於高與低劑量時有不同效果，低劑量時可作為消炎藥；高劑量時能作為抑制發炎反應前的細胞激素. 18.

(30) (proinflammatory effects)，雖然後者仍然有副作用的存在，然而對未來醫藥相關的研究仍具貢獻。. 圖 1.20 A:超氧離子的 EPR 圖譜；B:M40403 與超氧離子反應後的 EPR 圖譜. 19.

(31) 近數十年來對於 MnSOD 的相關研究，其擬態化合物不外乎是由 N 及 O 的配位環境加以模擬並探討(圖 1.15) 因此針對下列 MnSOD 擬態化合物來作說明：. 圖 1.21 MnSOD 之擬態化合物[(L)MnII(ClO4)](ClO4). 於2007年，Clotilde Policar及Anxolabehere-Mallart教授以五牙配位基 N-methyl-N,N',N'-tris(2-pyridylmethyl)ethane-1,2-diamine 合成出 [(L)Mn(II)(ClO4)](ClO4) (圖1.21) ，並且於−25 ºC，以KO2作為氧化劑與其反應，產生深藍色中間體，經由UV/vis吸收光譜分析，可觀察在 430、590 nm處有特徵吸收峰(圖1.22)。中間體於反應三十分鐘後逐漸降解，且經由ESI-MS圖譜分析，可觀察到m/z = 434.1 amu的訊號，精算結果為[(L)Mn(II)O2]+，由於未得到晶體，作者認為中間體可能為 manganese(III) peroxo或manganese(II) superoxo。. 20.

(32) 圖 1.22 [(L)MnII(ClO4)](ClO4)與超氧化鉀反應之吸收光譜圖. 另一擬態化合物， 2013 年 Tsunehiko Higuchi 教授進階修飾 EUK-113，除過去所合成配位基上具有脲基的錯合物，更增加至八種取代基的置換(圖1.23)，對於SOD的活性總體而言皆比EUK-113來的好，且錯合物3b、3c及3f的效果更為顯著18 (圖1.24)。. 圖 1.23 EUK-113 修飾的八種取代基. 21.

(33) 圖 1.24 EUK-113 與其修飾化合物對 SOD 活性比較. 此系列化合物除了 SOD 活性效果明顯提升之外，對於模擬過氧化氫酵素酶的活性效果，也比過去文獻好。Tsunehiko Higuchi 教授發現將取代基置換為帶有吡啶(pyridyl)的基團，可大幅提升活性，在此，吡啶所扮演的角色如胺基酸內組胺酸(histidine)，作為酸鹼調節的催化劑(acid-base catalyst)，並加快反應中高價數錳金屬錯合物的生成，隨之分解過氧化氫為氧氣及水分子 18 (圖 1.25)。. 圖 1.25 修飾後的 EUK-113 之示意圖 22.

(34) 據上述 MnSOD 相關的文獻探討，本研究將利用本實驗室江建緯學長所設計較為剛性(rigidity)之含氮氧五牙配位基與二價錳離子配位，合成錳金屬擬態化合物，以模擬 MnSOD 之配位環境予以研究。並期望經由氧化劑氧化後，可得到三價錳的穩定金屬錯合物。利用合成的錳金屬錯合物，進行關於超氧化物歧化酶的結構及活性上的比較及探討。. 23.

(35) 第二章實驗部分第一節. 實驗儀器、藥品及條件. 一、實驗儀器 1. 核磁共振光譜儀(NMR Spectrometer) 機型：Burker AVANCE 400 NMR 測量方法：將樣品溶於氘化溶劑中測定 1H 或 13C 光譜，化學位移以 ppm 為單位。 2. X-光單晶繞射儀(X-ray Single Crystal Diffractometer) 機型：荷蘭 Bruker Enraf-Nonius Kappa APEX II 單晶繞射儀德國 Bruker Kappa APEX II 單晶繞射儀測量：委由國立台灣師範大學貴重儀器中心郭頂審先生代為收集繞射點數據及解析結構。 3. 元素分析儀(Elemental Analyzer) 機型：德國 Heraeus varioIII-NCH Analyzer 測量：委由國立台灣大學貴儀中心陸靖蔚小姐代為測定。 4. 電子順磁共振光譜儀(Electron paramagnetic resonance) 機型：Bruker EX 10 Model Spectrometer 測量：委由國立清華大學貴儀中心陳若琪小姐代為測定。. 24.

(36) 5. 紫外光/可見光吸收光譜儀(UV/vis Spectrophotometer) 機型：Hitachi Model U-3501 和 U-4100 測量方法:將樣品溶於有機溶劑中，放入石英偵測容器中測定。 6. 溶劑純化系統型號：MBRUN mb-sps Compact 以此系統純化的溶劑有乙醚、乙腈、二氯甲烷和己烷。 7. 循環伏特安培儀(Cyclic voltammetry) 機型：CHI611D 測量方法：本系列化合物在電化學方面的測量上使用三電極系統：其工作電極為 2 mm 玻璃碳電極，參考電極為 Ag/AgCl，輔助電極為鉑電極，輔助電解質使用 0.1M[(n-Butyl)4N](BF4)。 8. 二次超純水純化系統型號：Milli-RO 60 9. 厭氧操作箱型號：MBRAUN Unilab-B 10. 氣相層析-質譜儀(GC-MS) 機型：GC(HP 6869)-MS(HP 5973) 測量方法：使用定量瓶配置溶液，且使用 10 微升氣密式針筒以三明治注射法注入 1 微升的溶液偵測。 25.

(37) 二、實驗藥品 1. 溶劑：甲苯(Toluene)，AR 級，Mallinckrodt chemicals。甲醇(Methanol)，AR 級，Mallinckrodt chemicals。乙醇(Ethanol)，AR 級，J. T. Baker。乙腈(Acetonitrile)，GR 級，Merck。乙醚(Diethyl ether)，GR 級，Merck。乙酸乙酯(Ethyl Acetate)，AR 級，Mallinckrodt chemicals。丙酮(Acetone)，HPLC 級，J. T. Baker。己烷( Hexanes)，AR 級，Mallinckrodt chemicals。二氯甲烷(Dichloromethane)，GR 級，Merck。二次超純水(Water)，取自化學系上 Milli-RO 60 water purification system。四氫呋喃(Tetrahydrofuran)，GR 級，Merck。氘化氯仿(Chloroform-d1, CD3Cl)：CIL。. 26.

(38) 2. 在氮氣環境下使用的溶劑，採用試藥級溶劑，蒸餾除水後始可使用。純化方法如下： (1)甲醇(Methanol, CH3OH) 於氮氣下加入鎂粉(Mg)和碘(I2)，一開始溶液顏色為褐色，在氮氣中迴流5個小時後，顏色會變為鐵灰色，在氮氣下迴流蒸餾至少24 小時後再取用。 (2)四氫呋喃(Tetrahydrofuran, C4H8O) 於氮氣下加入切成細碎片狀的鈉金屬，在氮氣下至少迴流蒸餾12 小時，以二苯酮(Benzophenone)為指示劑，待溶液呈紫色再取用。 (3)戊烷(Pentane, C5H12) 於氮氣下加入切成細碎片狀的鈉金屬，在氮氣下至少迴流蒸餾12 小時，以二苯基甲酮 (Benzophenone) 作為指示劑及乙二醇二甲醚 (ethylene glycol dimethyl ether)作為助溶劑，待溶液呈紫色再取用。. 27.

(39) 3. 合成配位基所使用的藥品： Ammonium chloride (NH4Cl)，99.5%，extra pure，ACROS。 Bromobenzene (C6H5Br)，99%，試藥級，ACROS。 1,2-Dibromoethane (C2H4Br2)，99%，ACROS。 Ethyl chloroformate (C3H5ClO2)，99%，ACROS。 Hydrobromic acid, ca. 48 wt% solution in water (HBr)，ACROS。 Magnesium powder (Mg)，試藥級，SHOWA。 Magnesium Sulfate, anhydrous (MgSO4)，試藥級，YAKURI。 Patassium carbonate (K2CO3)，試藥級，Fisher Scientific。 Patassium hydroxide (KOH)，85%，分析級藥錠，ACROS。 L-Proline (C5H9NO2)，99 +%，ACROS。 2,6-Pyridinedimethanol (C7H9NO2)，98%，ACROS。 Sodium chloride (NaCl)，試藥級，OSAKA。 Sodium hydroxide (NaOH)，試藥級藥錠，OSAKA。. 4. 合成錯合物所使用的藥品： Manganese(II) chloride (MnCl2)，98%，ACROS。 Sodium hydride (NaH)，試藥級，ACROS。. 28.

(40) 5. 進行反應性所使用的藥品： Potassium superoxide(KO2)，試藥級，Aldrich。 Oxygen(O2)，豐明氣體。三、實驗條件：在氮氣環境下反應的實驗，一律使用 Schlenk technique 或在手套箱(N2(g)-filled glove box maintained at below 0.1 ppm of O2 and 0.1 ppm of H2O)下操作。使用的玻璃器材、雙頭鋼針、不鏽鋼接頭、鋼針都需放置在烘箱中以 120 ºC 烘烤過，使用時再從烘箱中取出。從手套箱秤取藥品時，皆需使用血清塞及 Para film 封住反應瓶或樣品瓶口再送出手套箱。若由反應瓶側管接真空系統時，則需將側管部分抽真空、以火焰槍烤過、灌入氮氣回壓，重複上述動作 3 次後，最後於氮氣下，轉開氣閥連接反應瓶與真空系統，再進行後續的實驗操作。若是以樣品瓶或圓底瓶進行反應時，則需先取另一空樣品瓶塞上血清塞及 Para film 封口後，將真空系統的橡皮管接上不鏽鋼針頭並插入此空樣品瓶，抽真空後，灌入氮氣回壓，反覆動作 3 次後，再於氮氣下將鋼針轉插入含藥品的樣品瓶內；或是將真空系統接上鋼針後持續吹出氮氣約 10 秒後，把鋼針轉插入含藥品的樣品瓶中，再進行後續的實驗操作。在空氣下秤取藥品於反應瓶或樣品瓶中進行反應的實驗，或是要使用組裝好的養晶瓶、過濾裝置等玻璃器材時，皆需 29.

(41) 使用血清塞封住瓶口後，再將真空系統接上鋼針插入組裝好的玻璃器材內，或是由反應瓶側管接上真空系統，再將反應系統抽真空，以火焰槍烤過（註一），再灌入氮氣回壓，纏上 Para film 封口，反覆進行上述動作 3 次後，最後於氮氣下進行後續的實驗操作。實驗過程皆在氮氣正壓下操作，使用蒸餾過保存在氮氣下的溶劑，溶液的轉移則是以雙頭鋼針引導。養晶過程需要在氮氣下進行者，必要時使用真空凡士林封住血清塞有針孔的部分。在空氣下反應的實驗，其過程在空氣下操作，並旋上樣品瓶蓋避免灰塵掉入，使用一般試藥級溶劑，溶液的轉移以滴管吸取加入；養晶過程則是置於養晶塔內。 (註一)：若是藥品含有過氯酸根(ClO4-)時，火焰切勿烤到藥品部分，避免爆炸的危險性。. 30.

(42) 第二節配位基的合成與鑑定由本實驗室江建緯學長合成而得含氮五牙基 H2BDPP19：. 1. (S)-N-Ethoxycarbonylproline methyl ester. 秤取 L-脯胺酸 7.0 克(60.8 毫莫耳)與碳酸鉀 16.8 克(121.6 毫莫耳) 於含磁石的 250 毫升圓底瓶中，將圓底瓶抽真空 5 分鐘再使瓶內充滿氮氣，重複抽灌動作 3 次後，並使瓶內充滿氮氣後，加入除水甲醇 100 毫升至圓底瓶中，形成白色混濁溶液，並於瓶外架一冰浴水盆，使溫度降至 0 ºC。冰浴 5 分鐘後，以針筒慢慢加入醯氯甲酸乙酯 17.4 毫升(182.4 毫莫耳)，讓反應溫度維持在 0 ºC 下 2 小時，再將冰浴移去，持續於室溫下反應 16 小時。反應完畢後，以迴旋濃縮機抽去溶劑，加入二次去離子水 100 毫升，以二氯甲烷萃取 3 次(200 毫升 × 3)，收集的有機層以飽和氯化鈉水溶液再萃取 1 次(100 毫升)，接著用無水硫酸鎂乾燥有機層溶液並過濾，將溶劑抽乾後即可得到 11.01 克 ( 產率 90%) 的. 31.

(43) (S)-N-Ethoxycarbonylproline methyl ester ，產物呈透明油狀液體。 C9H15NO4 (F.W. = 201.22), 1H−NMR (400 MHz, CDCl3, ppm)： δ 4.26−4.18 (m, 1H), 4.06−3.93 (m, 2H), 3.62, 3.61 (ss, 3H), 3.51−3.30 (m, 2H), 2.19−2.07 (m, 1H), 1.94−1.76 (m, 3H), 1.16, 1.09 (tt, 3H, J = 8.8)。 13. C NMR (100 MHz, CDCl3, ppm)：δ 173.1, 173.0, 154.8, 154.3, 61.0,. 60.9, 58.8, 58.5, 51.8, 51.8, 46.4, 46.0, 30.6, 29.6, 24.0, 23.3, 14.4, 14.4。(NMR 光譜詳見於附錄 A-1, A-2)。. 2. (S)-2-(Diphenylhydroxymethyl)-N-ethoxycarbonylpyrrolidine. 合成 (S)-2-(Diphenylhydroxymethyl)-N-ethoxycarbonylpyrrolidine 之前，必須先製備體積莫耳濃度為 1.0 M 的溴化苯基鎂，首先將鎂粉 2.674 克(110.0 毫莫耳)秤於三頸瓶內，並架上迴流管與加液漏斗，抽真空 20 分鐘再使瓶內充滿氮氣反覆抽灌動作 3 次，於氮氣環境下加入 100 毫升四氫呋喃，接著加入活化劑二溴乙烷 0.7 毫升(8.0 毫莫耳)，並於加液漏斗加入溴苯 10.5 毫升(100.0 毫莫耳)，再慢慢將溴苯加至反應瓶中，反應過程會劇烈放熱，反應完畢後，待其回到室溫後取用。. 32.

(44) 秤取(S)-N-Ethoxycarbonylproline methyl ester 8.05 克(40.0 毫莫耳) 置於 250 毫升雙頸瓶中並架上迴流管，抽真空 5 分鐘再使瓶內充滿氮氣，反覆抽灌動作 3 次，於瓶內充滿氮氣的環境下加入 10 毫升四氫呋喃將起始物溶解，在冰浴下攪拌 10 分鐘後，以針筒抽取 1.0 M 溴化苯基鎂的四氫呋喃溶液 80 毫升(80.0 毫莫耳)慢慢加至雙頸瓶中，在冰浴下攪拌反應 2 小時。反應完畢後，使反應維持在冰浴下並維持0 ºC，以滴管吸取飽和氯化銨水溶液，慢慢加至雙頸瓶中止反應，用量大約50毫升，直到溶液顏色由深黑色轉變為灰白色後，將冰浴盆移除，使用迴旋濃縮機抽去溶劑中的四氫呋喃，剩餘水層利用乙酸乙酯萃取3次(200毫升 × 3)，收集的有機層以飽和氯化鈉水溶液再萃取1次(100毫升)，將有機層以無水硫酸鎂乾燥並過濾，抽乾後可得到白色固體，加入乙酸乙酯加熱使產物溶解，將過飽和溶液靜置於室溫下再結晶，可得到透明六角柱狀晶體產物(S)-2-(diphenylhydroxymethyl)-N-ethoxycarbonylpyrrolidine 10.45 克，產率為 83% 。分子式 : C20H23NO3 (F.W. = 325.17), 1H NMR(400 MHz, CDCl3, ppm) δ 7.41−7.24 (m, 10H), 4.94−4.91 (dd, 1H), 4.14−4.08 (m, 2H), 3.45−3.38 (q, 1H), 2.96 (s, 1H), 2.14−2.04 (m, 1H), 1.98−1.91 (m, 1H), 1.51−1.49 (m, 1H), 1.26−1.22 (t, 3H), 0.83 (s, 1H); 13. C NMR(100 MHz, CDCl3, ppm) δ 146.3, 143.6, 128.1, 127.8, 127.6, 33.

(45) 127.4, 127.1, 127.1, 81.6, 65.9, 61.9, 47.7, 29.6, 22.9, 14.6。(NMR 光譜詳見於附錄 A-3, A-4)。. 3. (S)-2-(Diphenylhydroxymethyl)pyrrolidine. 秤取 (S)-2-(Diphenylhydroxymethyl)-N-ethoxycarbonylpyrrolidine 4.18 克(12.8 毫莫耳)與氫氧化鉀 25.3 克(385 毫莫耳)置於 500 毫升圓底瓶中，加入乾燥過的乙醇 125 毫升，反應迴流 48 小時(140 ºC)。反應完畢後，以迴旋濃縮機將溶劑抽乾，隨後以等量的二氯甲烷與水之混和液萃取(150毫升 × 3)。將有機層收集後並加入無水硫酸鎂除水過濾，將濾液抽乾後得乳白色油狀物，在室溫下靜置風乾可得乳白色晶體(S)-2-(Diphenylhydroxymethyl)pyrrolidine 3.2 克(12.6毫莫耳，產率：98%)。分子式：C17H19NO (F.W. = 253.34)，1H NMR (400 MHz, CDCl3, ppm)：δ 7.57 (d, 2H, J = 7.4 Hz), 7.50 (d, 2H, J = 7.3 Hz), 7.31−7.25 (m, 4H), 7.18−7.14 (m, 2H), 4.28−4.24 (t, 1H), 3.04−3.01 (m, 1H), 2.98−2.93 (m, 1H), 1.76−1.69 (m, 2H), 1.67−1.54 (m, 2H);. 13. C. NMR(100 MHz, CDCl3, ppm) δ 148.1, 145.4, 128.2, 127.9, 126.3,125.8, 125.5, 77.1, 64.5, 46.7, 26.3, 25.5。(NMR 光譜詳見於附錄 A-5, A-6)。 34.

(46) 4. 2,6-Bis(bromomethyl)pyridine. 秤取 2,6-吡啶二甲醇 5.00 克(36.0 毫莫耳)於 250 毫升圓底瓶，於磁石攪拌時，緩緩加入氫溴酸水溶液 50 毫升，加熱迴流 5 小時。反應完畢後，待其溶液溫度降至室溫，於冰浴下將 40%氫氧化鈉水溶液以滴管慢慢加入反應瓶內，並使用廣用試紙檢測，直至 pH 值約等於 6 時停止加入，可再加入少許二次蒸餾水稀釋。隨後以二氯甲烷萃取水層 3 次(200 毫升 × 3)，有機層以無水硫酸鎂乾燥並過濾，濾液以迴旋濃縮機抽乾，再以管柱層析法分離產物，沖提液為二氯甲烷，並以薄層分析法(TLC)追蹤，收集 Rf = 0.8 之溶液，將溶液抽乾後可得到白色粉末狀的產物 2,6-Bis(bromomethyl)pyridine 3.82 克(產率 40%)，另外再以乙醚作為沖提液可得到副產物 2-Bromomethyl pyridine-6-methanol 3.04 克(產率 42%)。C7H7Br2N (F.W. = 264.95)，1H NMR (400 MHz, CDCl3, ppm)：δ 7.69 (t, 1H, J = 9.7 Hz)，7.36 (d, 2H, J = 9.7 Hz)，4.53 (s, 4H)。13C NMR (100 MHz, CDCl3, ppm)：δ 156.7, 138.1, 122.7, 33.4。(NMR 光譜詳見於附錄 A-7, A-8)。. 35.

(47) 5. 2,6-Bis(((S)-2-(diphenylhydroxymethyl)-1-pyrrolidinyl)methyl)pyr idine. 秤取(S)-2(Diphenylhydroxymethyl)pyrrolidine 1.02 克(4.03 毫莫耳)、2,6-Bis(bromomethyl)pyridine 0.53 克(2.02 毫莫耳)與碳酸鉀 0.56 克(4.03 毫莫耳)於 250 毫升雙頸瓶內並架置迴流管後，加入試藥級乙醇 150 毫升，加熱迴流 72 小時。反應完畢後，以迴旋濃縮機抽去溶液中的乙醇，加入二次水150 毫升，以二氯甲烷萃取3次(200毫升 × 3)，收集的有機層以飽和氯化鈉水溶液再萃取1次(100毫升)，接著利用無水硫酸鎂乾燥有機層溶液並過濾，再以迴旋濃縮機抽乾濾液。最後，以少量二氯甲烷將產物溶解，並利用大量正己烷使固體析出沉澱，將上層澄清溶液移除後，再加入正己烷，反覆3次，最後將固體抽乾即可得到0.8克(產率75%) 的 2,6-Bis(((S)-2-(diphenylhydroxymethyl)-1-pyrrolidinyl)methyl) pyridine (H2BDPP)，產物呈白色固體。H2BDPP的合成步驟總共五個階段，總產率為55%。其分子式為C41H43N3O2 (F.W. = 609.80)，1H NMR (400 MHz, CDCl3, ppm)：δ 7.68−7.66 (d, 4H), 7.59−7.57 (d, 4H), 7.48−7.43 (t, 1H), 7.30−7.26 (t, 4H), 7.22−7.14 (m, 6H), 7.08−7.04 (t, 2H), 6.87−6.85 36.

(48) (d, 2H), 5.20 (s, 2H), 4.12−4.08 (q, 2H), 3.37−3.28 (q, 4H), 2.95−2.92 (q, 2H), 2.50−2.48 (q, 2H), 1.95−1.92 (m, 2H), 1.78−1.75 (m, 2H), 1.66−1.61 (q, 4H);. 13. C NMR(100 MHz, CDCl3, ppm) δ 158.8, 147.9,. 146.6, 136.5, 128.1, 128.0, 126.3, 126.2, 125.8, 120.4, 78.1, 70.7, 61.6, 55.6, 29.8, 24.4。(NMR 光譜詳見於附錄 A-9, A-10)。. 37.

(49) 第三節錯合物的合成與鑑定一、錯合物 MnII(BDPP) (1)的合成. 圖 2.1 錯合物 1 之反應式. 秤取 H2BDPP 0.12 克(0.2 毫莫耳)於含磁石的 50 毫升反應瓶內，將其抽真空並用火烤，10 分鐘後使瓶內充滿氮氣，重複此步驟 3 次，最後將反應瓶維持真空狀態下送入手套箱。於手套箱內秤取 12.0 毫克(0.5 毫莫耳) NaH 與 25.3 毫克(0.2 毫莫耳) MnCl2 於反應瓶中，並加入約 15 毫升的乙腈作為溶劑，於室溫下反應 16 小時，溶液顏色由乳白色轉變為乳黃色。反應完畢後，將乳黃色溶液以矽藻土過濾，並使用真空系統將溶液抽乾，加入少許二氯甲烷將固體溶解，再加入約 30 毫升的乙醚使固體析出後靜置，待淡黃色固體完全沉澱，將上層澄清溶液移除，此動作重複 3 次後，再將固體抽乾，以約 5 毫升的二氯甲烷將產物回溶，在氮氣下過濾並於−30 ºC 冰箱內使用乙醚以緩慢擴散法養晶，一天後可得金黃色方形晶體，固體產率為 55%，以 X-ray 繞射解析鑑定此晶體結構，並得其分子式為：C41H41Cl0MnN3O2 (F.W. = 662.71)。元素分 38.

(50) 析之理論值：N, 5.82; C, 69.35; H, 5.92。實驗值：N, 6.121; C, 69.509; H, 6.176。UV/vis (THF)：338 nm (450 M-1 cm-1)。. 二、錯合物 MnIII(BDPP)(OH) (2)的合成. 圖 2.2 錯合物 2 之反應式. 秤取 H2BDPP 0.12 克(0.2 毫莫耳)於含磁石的 50 毫升反應瓶內，將其抽真空並用火烤 10 分鐘，之後使瓶內充滿氮氣，重複此步驟 3 次，最後將反應瓶維持真空狀態下送入手套箱，於手套箱內秤取 12.0 毫克(0.5 毫莫耳) NaH 與 25.3 毫克(0.2 毫莫耳) MnCl2 於反應瓶中，並加入約 15 毫升的乙腈作為溶劑，於室溫下反應 16 小時，溶液顏色由乳白色轉變為乳黃色。反應完畢後，將乳黃色溶液由手套箱送出，並將其乳黃色反應物於空氣下反應 4 小時，此時溶液顏色由乳黃色轉變為暗紫色；反應 30 分鐘後，將溶液抽乾，利用四氫呋喃將固體溶解並以矽藻土過濾，隨之將其抽乾。而後以些許四氫呋喃溶解，再加入約 30 毫升的乙醚使固體析出並靜置，待紫黑色固體完全沉澱，將上層澄清溶液移除。此動作重複數次後，再將固體抽乾，以約 5 毫升的四氫呋喃將產物回 39.

(51) 溶，以矽藻土過濾，並以乙醚作為子液於室溫下藉由緩慢擴散法養晶，兩天後可得紫色針狀晶體，固體產率為 52%，以 X-ray 繞射解析鑑定此晶體結構，並得其分子式為 C41H42MnN3O3。元素分析之理論值：N, 5.66; C, 69.62; H, 6.52。實驗值：N, 5.83; C, 69.786; H, 6.53。 UV/vis (THF)： 398 nm (306 M-1 cm-1) , 533 nm (192 M-1 cm-1)。. 三、錯合物 MnIII(BDPP)(Cl) (3)的合成. 圖 2.3 錯合物 3 之反應式. 秤取 H2BDPP 0.12 克(0.2 毫莫耳)於含磁石的 50 毫升反應瓶內，將其抽真空並用火烤 10 分鐘，之後使瓶內充滿氮氣，重複此步驟 3 次，最後將反應瓶維持真空狀態下送入手套箱於手套箱內。秤取 12.0 毫克(0.5 毫莫耳) NaH 與 25.3 毫克(0.2 毫莫耳) MnCl2 於反應瓶中，並加入約 15 毫升的乙腈作為溶劑，於室溫下反應 16 小時，溶液顏色由乳白色轉變為乳黃色。反應完畢後，秤取[Cp2Fe](BF4) 0.066 克(0.2 毫莫耳)於反應瓶內，此時溶液顏色由乳黃色數秒間轉變為草綠色；反應 4 小時後，將溶液抽乾，利用四氫呋喃將固體溶解並以矽藻土過濾，隨之將其抽乾。之 40.

(52) 後以些許四氫呋喃溶解，再加入約 30 毫升的乙醚使固體析出並靜置，待草綠色固體完全沉澱，將上層澄清溶液移除，此動作重複數次後，再將固體抽乾，以約 5 毫升的四氫呋喃將產物回溶，以矽藻土過濾，並讓乙醚於室溫下緩慢擴散於四氫呋喃溶液，兩天後可得草綠色針狀晶體，固體產率為 44%，以 X-ray 繞射解析鑑定此晶體結構，並得其分子式為 C41 H41ClMnN3O2。元素分析之理論值：N, 6.02; C, 70.53; H, 5.92。實驗值：N, 6.337; C, 70.197; H, 6.093。UV/vis (THF)：323 nm (1750 M-1 cm-1), 470 nm (306 M-1 cm-1), 641 nm (324 M-1 cm-1)。. 四、錯合物 [MnIII(H2O)(BDPP)](BF4) (4)的合成. 圖 2.4 錯合物 4 之反應式(方法一). 錯合物 4 可以兩種方法合成：方法一：秤取 MnII(BDPP) (1) 0.132 克(0.2 毫莫耳)與[Cp2Fe](BF4) 0.066 克(0.2 毫莫耳)於含磁石的 50 毫升反應瓶內，並加入約 15 毫升的四氫呋喃作為溶液，於室溫下反應 4 小時，溶液顏色由金黃色轉變為深綠色，顏色變化時間約在兩分鐘以內。反應完畢後，將深綠色溶液抽乾，利用四氫呋喃將固體溶解並以矽藻土過濾，隨之將其抽乾。 41.

(53) 而後以些許四氫呋喃溶解，再加入約 30 毫升的乙醚使固體析出並靜置，待草綠色固體完全沉澱，將上層澄清溶液移除，此動作重複數次後，再將固體抽乾，以 5 毫升的四氫呋喃將產物回溶，以矽藻土過濾，並讓乙醚於室溫下緩慢擴散於四氫呋喃溶液，兩天後可得深綠色針狀晶體，固體產率為 45%。. 圖 2.5 錯合物 4 之反應式(方法二). 方法二：秤取 MnIII(BDPP)(Cl) 0.14 克(0.2 毫莫耳) 於含磁石的 50 毫升反應瓶內，並加入 AgBF4 0.039 克(0.2 毫莫耳)於反應瓶內，並加入約 15 毫升的四氫呋喃作為溶液反應 4 小時，溶液顏色由深綠色慢慢轉變為深咖啡色。反應完畢後，以矽藻土過濾，隨之將其抽乾。利用四氫呋喃將固體溶解並以矽藻土過濾，隨之將其抽乾。而後以些許四氫呋喃溶解，再加入約 30 毫升的乙醚使固體析出並靜置，待草綠色固體完全沉澱，將上層澄清溶液移除，此動作重複數次後，再將固體抽乾，以 5 毫升的四氫呋喃將產物回溶，以矽藻土過濾，並讓乙醚於室溫下緩慢擴散於四氫呋喃溶液，兩天後可得深綠色針狀晶體，固體產率為 42.

(54) 55% 。以 X-ray 繞射解析鑑定晶體結構，並得其分子式為 C45H51BF4MnN3O4。元素分析之理論值：N, 5.33; C, 62.81; H, 5.56。實驗值：N, 5.41; C, 62.96; H, 5.89。UV/vis (THF)：320 nm (1330 M-1 cm-1), 464 nm (168 M-1 cm-1), 616 nm (179 M-1 cm-1)。. 43.

(55) 第四節二價錳錯合物 1 與超氧化鉀之反應秤取錯合物 1 6.62 毫克(0.01 毫莫耳)於 10 毫升定量瓶之中，並加入 10 毫升的四氫呋喃，使溶液濃度為 10-3 M，溶液呈淡黃色。於氮氣下，準備石英槽，並加入超氧化鉀約 50 倍當量，抽真空後並灌入氮氣回壓，反覆動作 3 次後，加入 3 毫升 10-3 M 的淡黃色溶液，接著於−80 ˚C 下利用 UV/vis 吸收光譜儀偵測，從−80 ˚C 逐漸升溫至 0 ˚C，並隨其溫度的變化觀察其吸收光譜的變化。. 第五節三價錳錯合物 4 與超氧化鉀之反應秤取錯合物 4 7.67 毫克(0.01 毫莫耳)於 10 毫升定量瓶之中，並加入 10 毫升的四氫呋喃，使溶液濃度為 10-3 M，溶液呈深綠色。於氮氣下，準備石英槽，並加入超氧化鉀約 50 倍當量，抽真空後並灌入氮氣回壓，反覆動作 3 次後，加入 3 毫升 10-3 M 的深綠色溶液，接著於−80 ˚C 下利用 UV/vis 吸收光譜儀偵測，從−80 ˚C 逐漸升溫至 30 ˚C，並隨其溫度的變化觀察其吸收光譜的變化。. 44.

(56) 第六節二價錳錯合物 1 與氧氣之反應本實驗欲利用低溫紅外線光譜儀來偵測二價錳錯合物 1 與氧氣於−80 ˚C 下之變化。低溫紅外線光譜儀須先暖機兩小時，並利用氮氣將探頭水氣移除，接著注入液氮於儀器當中，以冷卻雷射光源。暖機完畢後，將特製反應瓶組裝至探頭上，於轉接處使用封口膜纏住，以防止漏氣問題。隨後將反應瓶抽至真空 5 分鐘，再使瓶內充滿氮氣，重覆以上動作 3 次後，於瓶內充滿氮氣的環境下，隨即進行儀器校正動作。儀器校正完畢後，即可進行實驗。秤取錯合物 1 66.2 毫克(0.1 毫莫耳)於反應瓶之中，並加入 10 毫升的二氯甲烷，使溶液濃度為 10-2 M，將配置好的起始溶液注入至反應瓶當中，進行實驗。實驗光譜偵測時間為一小時，每兩分鐘偵測光譜一次。前十分鐘先偵測起始物的光譜，以便與之後反應光譜作比較。隨後灌入氧氣，並於後五十分鐘偵測光譜反應變化。反應初期即可發現在 1200 nm 處有特徵吸收峰，1200 nm 處推測來自於錯合物 1，然而隨著時間的增加，1200 nm 處的訊號逐漸衰退，而 3100 nm 處有新的特徵吸收峰生成。. 45.

(57) 圖 2.6 錯合物 1 與氧氣於低溫紅外線光譜儀偵測之光譜上: 錯合物 1 於−80 ˚C 下: 錯合物 1 與氧氣於−80 ˚C. 46.