年齡與運動對於腦部血管新生路徑與發炎指標的效應

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(1)國立臺國立臺灣師範大學體育學灣師範大學體育學系博士學位博士學位論文學位論文. 年齡與運動對於腦部血管新生路徑與發炎指標的效應. 研究生：研究生：李若屏指導教授：指導教授：方進隆. 中華民國九十九中華民國九十九年一月中華民國台北市.

(2) 年齡與運動對於腦部血管新生路徑與發炎指標的效應日期：民國九十九年一月. 研究生：李若屏指導教授：方進隆. 摘要目的：目的：研究一為分析大腦組織中血管新生機制於兩週運動訓練過程的變化；研究二為觀察單次運動對於高齡大腦血管新生機制之影響；研究三為觀察兩週運動訓練對於大腦血管新生機制之影響。方法方法：方法：研究一使用 3 個月齡之雄性 SD 鼠，進行兩週且每天 90 分鐘的運動，收集動作皮層和海馬回組織的時間包括運動前(n=6)以及運動第 1 天(n=6)、第 7 天(n=6)和第 14 天(n=6)後一小時。研究二將使用 3 個月和 12 個月齡之雄性 SD 鼠，分為年輕控制組(YC，n=6)、年輕運動組(YE，n=6)、老年控制組(OC，n=6)和老年運動組(OE，n=6)，並於 90 分鐘單次游泳運動後 1 小時進行組織收集。研究三進行長期運動訓練，以與研究二相同的組別設計於兩週游泳運動後隔天收集組織。分析指標包括微血管密度、血管內皮生長因子(VEGF)、VEGF 接受器-2 (Flk-1)、VEGF 接受器-1 (Flt-1)、angiopoietin-1 (Ang1)和 angiopoietin-2 (Ang 2)與 Tie2、eNOS、糖化產物接受器(RAGE)、巨噬細胞標的蛋白(CD68)、超氧化物歧化酶(SOD1)以及第 1 類型葡萄糖轉運蛋白 (GLUT1)之表現量。結果結果：結果：研究一發現動作皮層區 VEGF、Ang1 和 eNOS 於運動第 1 天顯著增加後便回復至運動前水準，其接受器 Flt-1 和 Tie2 則分別於運動第 1 和 7 天後顯著增加並持續至第 14 天，而 CD68 於運動第 1 至 iii.

(3) 14 天均顯著增加，動作皮層區之微血管密度於運動第 7 天顯著減少而第 14 天又回升；海馬回區之 VEGF、Flt-1 和 Ang1 以及 CD68、SOD1 和 GLUT1 於運動第 1 天期間內顯著增加後便回復至運動前水準，海馬回之微血管密度於兩週運動期間無顯著變化。研究二發現 OC 組動作皮層區及海馬回區之 SOD1 均顯著高於 YC 組，且僅 OC 組動作皮層區之 Flk-1 mRNA 以及 Flt-1、 eNOS、Ang1 和 CD68 蛋白表現均顯著高於 YC 組，而這些差異並無出現於海馬回；OE 組與 OC 組之血管新生因子和發炎指標均無顯著差異。研究三發現兩週運動後，YE 組之兩腦區血管新生因子和發炎指標與 YC 組多無顯著差異，OE 與 OC 組之比較亦獲得相同結果，僅 YE 組和 OC 組動作皮層之 CD68 均顯著高於 YC 組，以及 OE 組海馬回之 CD68 顯著高於 OC 組； YE 組於動作皮層和海馬回之微血管密度均顯著高於 YC 組，OE 組之 CD31 呈色亦有高於 OC 組之趨勢，而 OC 組的 AP 和 CD31 呈色均顯著低於 YC 組僅出現於海馬回區域。結論結論：結論：本研究顯示兩週且每日 90 分鐘之游泳運動有助於腦部血管網路的汰換，且海馬回的血管新生因子相較於動作皮層區具有較快的調適反應，然海馬回區域相較於動作皮層區提早出現血管網路的退化，而兩週游泳運動訓練可引致年輕腦部之血管新生，亦可能對於中老年腦部血管結構具正面效應。. 關鍵詞：關鍵詞：運動挑戰、運動挑戰、老化、老化、血管新生因子血管新生因子. iv.

(4) Age and exercise effects on brain angiogenic pathway and inflammatory factors Date: Jan., 2010. Student: Jo-Ping Lee Advisor: Chin-Lung Fang. Abstract Purposes: Study I was to examine the time-course changes in brain angiogenic mechanism during 2-week exercise; study II to determine acute exercise effect on brain angiogenic mechanism for the middle-aged; and study III to investigate the effect of 2-week exercise on brain angiogenic mechanism. Methods: Study I recruited 3 months old male SD rats to 14-day swimming exercise for 90 minutes/day. Tissues from motor cortex and hippocampus were collected pre-exercise (n=6) and after 1 hour post-exercise at day 1(n=6), day 7 (n=6) and day 14 (n=6). Study II assigned 3 and 12 months old male SD rats to young control (YC, n=6), young exercise (YE, n=6), old control (OC, n=6) and old exercise (OE, n=6) groups. Tissues were collected within 1 hour after one single-bout swimming for 90 minutes. Study III included the same group design as Study II and tissues were collected on the next day after 2-week swimming program.. Measurements included capillary density, the expression. of vascular endothelial growth factor (VEGF), VEGF receptor-2 (Flk-1), VEGF receptor-1 (Flt-1), angiopoietin-1 (Ang1), angiopoietin-2 (Ang2), Tie2, eNOS, receptor for AGE (RAGE), macrophage marker (CD68), superoxide dismutae (SOD1) and glucose transportor-1 (GLUT1). Results: Study I founded that VEGF, Ang1 and eNOS expression were significantly higher post exercise at day 1 and then returned to pre-exercise level. Their receptors were significantly higher post exercise at day 1 or 7 and then remained to day 14. CD68 was significantly higher post exercise during day 1 to 14. Capillary density in motor cortex was significantly lower post exercise at day 7 and then v.

(5) returned at day 14. For hippocampus, VEGF, Flt-1 and Ang1as well as SOD1, CD68 and GLUT1 were significantly higher post exercise at day 1 and then returned to pre-exercise level. No significant changes in capillary density were noted in hippocampus during 2-week exercise. Study II founded that significantly higher SOD1 was noted in OC motor cortex and hippocampus than YC. Also, higher Flk-1 mRNA and the protein expression of Flt-1, eNOS, Ang1 and CD68 were noted only in OC motor cortex than YC but not hippocampus. No significantly difference of angiogenic and inflammatory factors was noted between OE and OC. Study III denoted that no significantly difference of most angiogenic and inflammatory factors in both brain areas was found between YE and YC after 2-week exercise. The same results came to the comparison between OE and OC. Only significantly greater CD68 was founded in YE and OC motor cortex comparing to YC as well as in OE hippocampus comparing to OC. Further, capillary density in YE motor cortex and hippocampus were significantly higher than YC. Meanwhile, CD31-positive stain tended to be higher in OE than OC. Only for hippocampus, both AP and CD31-positive stains were significantly lower in OC comparing to YC. Conclusions: These findings suggested that 2-week swimming exercise with 90 minutes per day may cause turnover in vascular network. Angiogenic factors in hippocampus had rapid adaptation rather than motor cortex in response to exercise, while the early onset of degeneration in vascular network was noted in hippocampus prior to motor cortex. Additionally, 2-week swimming exercise can enhance angiogenesis for young brain and might have positive effect on vascular structure for middle-aged.. Key Words: exercise challenge, aging, angiogenic factors vi.

(6) 謝誌 “If I looked compared to others far, is because I stand on giant's shoulder.” 這是牛頓說過的話，這是牛頓說過的話，因此我要深深地感謝這些巨人們：方進隆教授不倦地給予我學術上因此我要深深地感謝這些巨人們和生活態度上的正向啟發；郭家驊教授源源不絕的點子和提醒，讓我有機會不斷翻新自己；卓俊辰教授、唐德成教授和謝伸裕教授給予我的研究論文諸多的指點。感謝家人感謝家人給我莫大的力量和包容家人給我莫大的力量和包容，給我莫大的力量和包容，讓我無後顧之憂，讓我無後顧之憂，可以往自己的目標努力可以往自己的目標努力邁進自己的目標努力邁進：我親邁進愛的李爸爸、李媽媽、李姊姊；；我的賢內助+賢外助---老公智旗；；水林的爸爸、媽媽。感謝北體運動生化實驗室的伙伴感謝北體運動生化實驗室的伙伴給我支持北體運動生化實驗室的伙伴給我支持、給我支持、歡笑、歡笑、關懷、關懷、幫助和指導幫助和指導：毓國老師、慕聰和指導教授、文志教授、奕仁教授、美枝教授、勁宏老師、建文學長、饅頭、惟翔、明杰、Dr. Mallik、思賢、昱青、嘉倫、欣玫、紫彤、大雄、慧蘭老師、柏志、方春、阿凱、興州、宗憲、献堂、家蓁、銘芬、采薇、謝銘、阿薰、韻嘉、姿妏、秀純老師、智傑、國龍老師、榮錫老師、桂玉學姐、心怡學姐、立妍老師、一雄老師、映捷、阿良感謝那一段段共同、分享生活點滴的日子感謝那一段段共同趕共同趕交國科會計畫、交國科會計畫、跑社區、跑社區、生理實驗室收生理實驗室收 data、分享生活點滴的日子：的日子泰諭、玫秀、鈺彥、靜宜、志瑋、勇志、騰丘、家欣學長、小歐、佳佳、晉嘉、姜醫師、國生、蕙甄學姐感謝一起感謝一起上課的革命情感一起上課的革命情感：蕙娟、宏如、智偉、光獻老師、建得、政龍、士正、琪玲、上課的革命情感許多學弟妹感謝老師們給我感謝老師們給我由物理治療老師們給我由物理治療跨至體育由物理治療跨至體育領域跨至體育領域的鼓勵領域的鼓勵和信心的鼓勵和信心：黃長福教授、鄭志富教授、施和信心致平教授、王鶴森老師、徐孟達老師、蔡虔祿教授、家慶學長感謝其他關心我的長輩及感謝其他關心我的長輩及好友們好友們：舅媽秋鳳老師、王淑芬教授、師大健康中心的同事與朋友們、其他可愛的朋友們感謝每天載我於師大分部和天母 606 公車司機感謝每天載我於師大分部和天母台北體院和天母台北體院之間奔波台北體院之間奔波，之間奔波，長達 3 年之久：台北年之久方老師曾跟我說：當你拿到博士學位後，你的社會責任就更重了我會繼續努力，就像 ”A tree should grow taller, accept more brightness, then its root must be deeper and darker.” -Nietzsche。. vii.

(7) 目次中文摘要……………………………………………………………………………………..iii 英文摘要………………………………………………………………………………….…..v 謝誌…………………………………………………………………………………………..vii 目次……………………………………………………………………………………...…..viii 表次…………………………………………………………………………………………...x 圖次……………………………………………………………………………………….…..xi. 第壹章. 緒論. 第一節研究背景…………………………..………….……………………..……………….1 第二節研究目的…………………………………………………..………………..……… .4 第三節研究假設…………………………………………………..…………………….… ..5 第四節研究限制…………………………………………………..…………………….…. .5 第五節研究重要性………………………………………………..…………………….… ..6. 第貳章. 文獻探討. 第一節血管病變與血管新生不良為慢性疾病之重要病因……………...…..…….......…..8 第二節血管新生的機制與重要性……………...………….………...……..…….………...11 第三節血管新生因子間的合作……………………………………...……..……….……...13 第四節年齡對血管新生因子的影響………………………………...……..….…………...15 第五節運動對血管新生因子的效應……………………………….……..…..................…17 第六節運動對於老化組織的血管新生能力之效果……………...……….............…….....19 第七節總結…………………………………………………………………..……..……….20. 第參章. 方法. 第一節動物受試者……………………………………..…………………………..…….....22 viii.

(8) 第二節測試流程………………………………………..…………………………………..23 第三節組織處理方式與分析指標………………………..……………………………..…25 第四節分析方式與步驟…………………………………..……………………………..…26 第五節資料分析……………………………………………..……………………………..30. 第肆章. 結果. 研究一：不同腦區血管新生路徑和發炎指標於運動過程中之時序性變化......................32 研究二：單次運動對年輕和中老年腦部血管新生路徑和發炎指標的效應......................33 研究三：年齡與運動訓練對於腦部血管新生路徑和發炎指標之影響..............................35. 第伍章. 討論. 研究一：不同腦區血管新生路徑和發炎指標於運動過程中之時序性變化......................37 研究二：單次運動對年輕和中老年腦部血管新生路徑和發炎指標的效應......................45 研究三：年齡與運動訓練對於腦部血管新生路徑和發炎指標之影響..............................52. 第陸章. 結論與建議. 第一節結論………………………..…………………..…………………………..……......57 第二節建議………………………………...…………..……………………………….…..58. 引用文獻引用文獻……………………………..……………………………………..…….….….…...60 文獻. ix.

(9) 表次表一、受試老鼠於(A)研究一、(B)研究二和(C)研究三的體重、腦重、腦重百分比、脂肪重和脂肪重百分比。…………………………………………….………………………….72. x.

(10) 圖次圖一、研究二之年輕受試鼠和高齡受試鼠之葡萄糖耐受度測試曲線，包括(A)血糖以及(B) 胰島素之曲線。………………………………………………………………………….….73 圖二、研究三之年輕運動組和高齡運動組於運動前後之葡萄糖耐受度測試曲線，包括(A) 血糖以及(B)胰島素之曲線。………………………………..…….…………………….….74 圖三、動作皮層區中(A) VEGF、(B) Flk-1、(C) Flt-1、(D) Ang1、(E) Ang2 和(F) Tie2 mRNA 表現量於兩週運動過程中的時序性變化。………………………………………………..75 圖四、海馬回區中(A) VEGF、(B) Flk-1、(C) Flt-1、(D) Ang1、(E) Ang2 和(F) Tie2 mRNA 表現量於兩週運動過程中的時序性變化。………………………………………………..76 圖五、動作皮層區中(A) VEGF、(B) Flk-1、(C) Flt-1、(D) eNOS、(E) Ang1、(F) Tie2、 (G) Ang2、(H) RAGE、(I) SOD1、(J) CD68、(K) GLUT1 之蛋白表現量於兩週運動過程中的時序性變化。…………………………………………………………………………..77 圖六、海馬回區中(A) VEGF、(B) Flk-1、(C) Flt-1、(D) eNOS、(E) Ang1、(F) Tie2、(G) Ang2、(H) RAGE、(I) SOD1、(J) CD68、(K) GLUT1 之蛋白表現量於兩週運動過程中的時序性變化。………………………………....…………………………………………..…83 圖七、(A)動作皮層和(B)海馬回區域於運動過程中血管型態之時序性變化。……..….89 圖八、動作皮層區域於運動過程中微血管密度之時序性變化，(A)動作皮層區域之 AP 染色以及(B)動作皮層區域之 CD31 免疫染色。………………………………………….....90 圖九、海馬回區域於運動過程中微血管密度之時序性變化，(A)海馬回區域之 AP 染色以及(B)海馬回區域之 CD31 免疫染色。……………………………………………….……91 圖十、年輕與高齡組之動作皮層區(A) VEGF、(B) Flk-1、(C) Flt-1、(D) Ang1、(E) Ang2 和(F) Tie2 mRNA 表現量於單次運動後的變化。……………………...……………..…..92 圖十一、年輕與高齡組之海馬回區(A) VEGF、(B) Flk-1、(C) Flt-1、(D) Ang1、(E) Ang2 和(F) Tie2 mRNA 表現量於單次運動後的變化。………………………………...………93 圖十二、動作皮層區中(A) VEGF、(B) Flk-1、(C) Flt-1、(D) eNOS、(E) Ang1、(F) Tie2、. xi.

(11) (G) Ang2、(H) RAGE、(I) SOD1、(J) CD68、(K) GLUT1 之蛋白表現量於年輕無運動組 (Young non-exercise, YC)、年輕單次運動組(Young exercise, YE)、高齡無運動組(Old non-exercise, OC)和高齡單次運動組(Old exercise, OE)之變化。………………..…….....94 圖十三、海馬回區中(A) VEGF、(B) Flk-1、(C) Flt-1、(D) eNOS、(E) Ang1、(F) Tie2、 (G) Ang2、(H) RAGE、(I) SOD1、(J) CD68、(K) GLUT 之蛋白表現量於年輕無運動組 (Young non-exercise, YC)、年輕單次運動組(Young exercise, YE)、高齡無運動組(Old non-exercise, OC)和高齡單次運動組(Old exercise, OE)之變化。………………….….…100 圖十四、年輕與高齡組之動作皮層區(A) VEGF、(B) Flk-1、(C) Flt-1、(D) Ang1、(E) Ang2 和(F) Tie2 mRNA 表現量於兩週運動後的變化。……………………………………......106 圖十五、年輕與高齡組之海馬回區(A) VEGF、(B) Flk-1、(C) Flt-1、(D) Ang1、(E) Ang2 和(F) Tie2 mRNA 表現量於兩週運動後的變化。………………………………………..107 圖十六、動作皮層區中(A) VEGF、(B) Flk-1、(C) Flt-1、(D) eNOS、(E) Ang1、(F) Tie2、 (G) Ang2、(H) RAGE、(I) SOD1、(J) CD68、(K) GLUT1 之蛋白表現量於年輕無運動組 (Young non-exercise, YC) 、年輕運動組 (Young exercise, YE) 、高齡無運動組 (Old non-exercise, OC)和高齡運動組(Old exercise, OE)之變化。………………………….…108 圖十七、海馬回區中(A) VEGF、(B) Flk-1、(C) Flt-1、(D) eNOS、(E) Ang1、(F) Tie2、 (G) Ang2、(H) RAGE、(I) SOD1、(J) CD68、(K) GLUT1 之蛋白表現量於年輕無運動組 (Young non-exercise, YC) 、年輕運動組 (Young exercise, YE) 、高齡無運動組 (Old non-exercise, OC)和高齡運動組(Old exercise, OE)之變化。………………………….…114 圖十八、(A)動作皮層區和(B)海馬回區中血管型態於年輕無運動組(Young non-exercise, YC)、年輕運動組(Young exercise, YE)、高齡無運動組(Old non-exercise, OC)和高齡運動組(Old exercise, OE)之變化。……………………………………………………………..120 圖十九、動作皮層區中(A) AP 染色以及(B) CD31 免疫染色所呈現之微血管密度於年輕無運動組(Young non-exercise, YC)、年輕運動組(Young exercise, YE)、高齡無運動組(Old non-exercise, OC)和高齡運動組(Old exercise, OE)之變化。……………………….…....121 圖二十、海馬回區中(A) AP 染色以及(B) CD31 免疫染色所呈現之微血管密度於年輕無運動組(Young non-exercise, YC)、年輕運動組(Young exercise, YE)、高齡無運動組(Old non-exercise, OC)和高齡運動組(Old exercise, OE)之變化。…………………….…........122. xii.

(12) 1. 第壹章緒論. 第一節研究背景血管新生能力不良為許多老化相關之腦部疾病如腦血管疾病、神經退化性疾病的主要危險因子；生物體的適應能力(adaptation)不足以應付壓力 (stress)時便會加速老化的過程(Parsons, 2003)，血管新生或血管密度增加被視為一種適應能量改變的結果，因而運動會造成組織對於能量的需求增加而可促進血管密度增加(Ding 等, 2006; Iemitsu, Maeda, Jesmin, Otsuki, & Miyauchi, 2006)。然而，雖然血管新生能力不良與老化有關，但並非所有證據均支持血管新生因子(angiogenic factors)因老化而降低表現量(Gavin, Westerkamp, & Zwetsloot, 2006; Iemitsu 等, 2006)，對於腦部組織而言，海馬回區域常被認為與腦部老化疾病的發生有關，過去僅發現海馬回區域之血管內皮生長因子(VEGF)濃度至中老年階段會降低(Shetty, Hattiangady, & Shetty, 2005)，但少有研究探討海馬回區域之血管新生能力於年齡增長過程中的變化；同時，過去藉由時序性(time-course)變化之結果，發現不同部位的肌肉組織之血管新生因子面對運動挑戰的適應反應有所不同(Amaral, Sanchez, Chang, Rossoni, & Michelini, 2008; Lloyd, Prior, Yang, & Terjung, 2003)，過去已發現運動訓練有助於與動作產生相關之腦部區域如皮層 (cortex)進行血管生長作用(Ding 等, 2006)，而運動對於其他腦區如海馬回區域的血管新生能力的影響亦值得探究；因此，本研究即探討不同腦部區域.

(13) 2. 包括海馬回與動作皮層區域面對運動挑戰所引致之血管新生適應反應，以及高齡對於腦部血管新生能力的影響，俾將有助於臨床慢性腦疾的預防應用。血管新生作用主要是經由血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)啟動而調節，另需要其他血管新生因子(angiogenic factors)協助成熟血管(mature vessels)的形成；血管內皮生長因子透過下游分子 eNOS 可引致血管內皮細胞的位移(migration)、增長(proliferation)和細胞存活(survival)以及促進血管通透性(permeability)，而其他重要的血管新生因子如 angiopoietin-1 (Ang1)和 angiogpoietin-2 (Ang2)則分別可促進血管內皮細胞和周邊細胞間結構的穩定(stable)和不穩定(unstable)，有助於調節內皮細胞間的連結而分支出新的成熟血管。因此 VEGF 和 Ang 路徑的啟動可促使血管新生以適應能量的改變，改善因缺血所產生之能量不足並提供組織足夠血流量，以及減緩周邊組織受損程度(Greenberg & Jin, 2005)。老化會引致血管新生能力不良或血管病變，進而導致許多疾病的產生；而海馬回(hippocampus)常被視為與腦部老化疾病有關的重要腦部區域，但其血管新生能力較少被驗證。近來許多研究均認為神經退化性疾病不僅與年齡有關，亦與血管網路的結構有密切關連(Firbank 等, 2007; Fotenos, Snyder, Girton, Morris, & Buckner, 2005)，即生長不良的血管網路會導致血液無法供應至局部組織，而造成局部組織缺乏能量來源，長期缺乏.

(14) 3. 能量便會引致許多疾病發生，因此血管新生能力對於預防腦部老化有正面助益，但血管新生因子如 VEGF 的表現量於年齡增長過程中的改變並未反映血管密度下降的現象，過去研究已顯示老年鼠之心肌中 VEGF 和 VEGF 接受器的表現量減少(Iemitsu 等, 2006)，然另外的研究卻發現老年鼠的骨骼肌中 VEGF 表現量較年輕者為高(Gavin 等, 2006)，對於腦部海馬回而言， VEGF 濃度至中老年階段便顯著下降，但血管密度的變化仍未知(Shetty 等, 2005)；這些相異的發現也顯示 VEGF 並非造成血管老化的必要因子，其他血管新生因子如 Ang1 和 Ang2 也應為研究對象。另外，血管病變是因血管處於持續性發炎反應而引致的血管通透度過高、血管硬化等慢性血管病變，這些均為許多慢性疾病的死因，而血管長期發炎反應是由糖化產物 (advanced glycation end product, AGE)和其接受器(receptor for AGE, RAGE) 所啟動的反應，RAGE 表現量顯著的位置被發現均位於 AGE 大量表現的區域(Ritthaler 等, 1995; Schmidt, Yan, & Stern, 1995)，因而 RAGE 被視為血管發炎之關鍵指標；因此探討年齡對腦部血管的影響時，RAGE 也是一項重要指標。運動過程中會造成能量分布的改變，同時造成不同區域組織的血管新生反應表現不同，但目前仍不清楚不同腦部區域如動作皮層和海馬回區域之血管新生因子(VEGF、Ang1 和 Ang2)面對運動挑戰而產生的反應；過去研究已證實運動訓練可增加 VEGF 的作用而促進組織中血管密度增加(Ding.

(15) 4. 等, 2006; Ding 等, 2004; Iemitsu 等, 2006)，且骨骼肌的血管新生因子 mRNA 表現量於運動第 8 天後便產生適應而不再顯著變化，同時於第 12 天達最顯著的血管密度變化，但也觀察到快肌和慢肌面對運動挑戰的表現方式有所不同(Lloyd 等, 2003)，另外的研究亦指出動作參與之肌肉(locomotor muscle)的 VEGF mRNA 對於跑步運動刺激會產生顯著表現，而該現象並不會出現於非動作參與之肌肉(non-locomotor muscle)(Amaral 等, 2008)；就腦部而言，過去僅知與動作產生有關之大腦皮層(cortex)區域經過短期運動訓練後血管數量有增加的情形，VEGF mRNA 表現量亦高於無運動訓練組 (Ding 等, 2006)，然少有研究顯示海馬回區域之血管新生作用於運動挑戰下的變化，以及不同腦部區域隨年齡增長時面對運動挑戰所引致之血管新生適應反應的差異。. 第二節研究目的本研究的目的如下：一、研究一：分別分析動作皮層和海馬回區域之血管新生因子、發炎指標和微血管密度於運動前、運動第 1 天後、運動第 7 天後、運動第 14 天後的變化。二、研究二：比較年輕與高齡大腦中血管新生因子和發炎指標的差異，並探討單次運動對於兩年齡組別之血管新生因子和發炎指標所產生的.

(16) 5. 影響。三、研究三：探討兩週運動介入對於年輕與高齡大腦之血管新生因子、發炎指標和微血管密度的影響。. 第三節研究假設本研究之假設如下：一、大腦組織中血管新生因子於運動第 1 天後和運動第 7 天後的表現量相較於運動前均有顯著差異，微血管密度則於運動第 7 和第 14 天後較運動前為緻密，而發炎指標於運動第 14 天後較運動前為低。二、年輕與老年大腦組織中的血管新生因子和發炎指標具顯著差異，且年輕大腦中的血管新生因子於單次運動前後具顯著差異，而老年大腦中的血管新生因子於單次運動前後則不具顯著差異。三、年輕大腦中的血管新生因子、微血管密度和發炎指標於兩週運動訓練前後均有顯著差異，而老年大腦中的血管新生因子、微血管密度和發炎指標於兩週運動訓練前後則不具顯著差異。. 第四節研究限制本研究因涉及大腦組織的分析，以人體大腦組織為分析對象的困難度高，因此本研究將藉由動物大腦組織之分析以探討年齡和運動對於血管新生能力的影響，大鼠實驗雖無法廣泛推論至其他物種，但因同為哺乳動物.

(17) 6. 的特性，可經由大鼠大腦組織的實驗結果，推論人類物種於運動介入和不同年齡族群的變化與差異。. 第五節研究重要性研究重要性血液循環不僅對於能量調節非常重要，更是大腦與身體其他組織之間的溝通管道，許多老化疾病如中風或神經退化性疾病如阿茲海默氏症均被認為是由血管退化和血管結構病變所引致，進而導致大腦功能的損傷如認知能力減損或動作功能障礙等不良臨床症狀，而控制認知學習功能的重要腦區為海馬回，但海馬回之血管新生能力於年齡增長過程中的改變卻少有研究探討；最近的研究更指出慢性疾病與血管產生發炎反應有關，該發炎反應是由糖化產物(advanced glycation end products, AGE)所引致，且被認為與老化有關，本研究將進一步驗證該發炎反應與血管新生能力不良的關聯性。許多慢性疾病均與能量調節的適應能力有關，而運動可藉由導致體內能量的改變，以增進生物體對於能量改變之適應能力。血管內皮生長因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF)為啟動血管新生的關鍵因子，且近期文獻也指出 VEGF 需要其他血管新生因子如 angiopoietin 的協助，以形成成熟的血管結構；運動已被認為具有促進血管新生的效果，但過去研究對於運動引致腦部海馬回之血管新生反應的效果仍缺乏證據。本研究將了解.

(18) 7. 不同年齡大腦中血管新生因子和血管型態學的差異，以便提供現今老化相關疾病之病因機制，另外提供運動對於腦部區域之血管新生因子和微血管增生效應的證據，並同時瞭解不同年齡的腦部區域對於運動之適應性，作為設計運動處方的參考。.

(19) 8. 第貳章第貳章文獻探討. 第一節血管病變與血管新生不良血管病變與血管新生不良為慢性疾病之與血管新生不良為慢性疾病之重要病因為慢性疾病之重要病因血液供應胚胎生長與發展過程中所需的養分，以促成各器官組織的形成，因此血液循環對於成體的生存亦非常重要(Ferrara, 1999a)；而大腦為調控生理反應的重要樞紐，大腦需藉由血液循環與各器官溝通，更需要血液循環以利於大腦中神經細胞的營養代謝和存活(Nehlig, 1997; Rao, Oz, & Seaquist, 2006)，有助於組織修復之能力(Atwood, Bowen, Smith, & Perry, 2003; Ferrara, 2004)。老化為許多慢性疾病產生的危險因子，中風和神經退化疾病均是老年族群常見之慢性腦部疾病，且其病因與血管病變有關；瞭解老化對於腦部血管新生機制之影響，將有助於建立慢性腦部疾病之預防和治療策略。老化會造成血管退化或易於產生血管病變而造成局部組織供血不足，導致該缺血部位之能量運用和細胞的存活能力受到威脅，臨床上造成許多慢性疾病的產生，而發生血管病變的關鍵結構是血管內皮細胞；內皮細胞位於血管壁最內層，介於血管壁和流動的血液之間(Brandes, Fleming, & Busse, 2005)，其角色不僅是保護作用，亦具有抗凝血的功用，並可分泌一氧化氮等物質以調節血管張力(Fleming & Busse, 1999; Radziszewski 等, 1995)，而一氧化氮亦被發現可抑制白血球附著於血管壁以及避免血拴細胞的堆積.

(20) 9. (Kubes, Suzuki, & Granger, 1991; Mellion 等, 1981)，然當內皮細胞因退化而失去功能，此時若沒有新的內皮細胞來進行修復機制，便會致使血管病變疾病的產生(Brandes 等, 2005)。最近的證據顯示慢性血管病變是引致慢性疾病的重要原因，而慢性血管病變是由於長期血管發炎或氧化壓力過高所引起，糖化蛋白產物 (advanced glycation end product, AGE)則為引起長期血管發炎或氧化壓力過高的主要因子，目前許多研究已發現 AGE 與類風濕性關節炎、糖尿病、心血管疾病和神經退化性疾病等慢性疾病有密切關係(Schmidt, Yan, Wautier, & Stern, 1999)，且其接受器 RAGE (receptor for AGE)被視為血管發炎的指標因子。AGE 產生發炎反應的原因為血液中葡萄糖濃度過高，此時蛋白質中的特定胺基酸易於受到葡萄糖的修飾，而形成 AGE，免疫系統會以 AGE 為非自體物質而產生自動免疫反應，導致 AGE 所處的細胞受損而引起發炎反應；近期的研究更指出 AGE 與 AGE 接受器的結合而引起下游訊息傳遞為導致發炎反應和氧化壓力持續產生的關鍵(Unoki & Yamagishi, 2008)，而 AGE 接受器分佈於許多種類的細胞上，其中即包括血管內皮細胞，因此 AGE-RAGE 結合所引起的持續性發炎反應或氧化壓力是造成血管功能失調 (vascular dysfunction)的重要原因(Ramasamy 等, 2005; Ramasamy, Yan, & Schmidt, 2005; Schmidt 等, 1999)，並造成許多對於血管的傷害包括減少血管壁的屏障效果、引致血管內皮細胞間連接分子(vascular cell adhesion.

(21) 10. molecule, VCAM)的表現增加、改變凝血因子的特性而造成凝血物質的產生 (Bucala, Tracey, & Cerami, 1991; Esposito, Gerlach, Brett, Stern, & Vlassara, 1989; Schmidt 等, 1995; Vlassara, Bucala, & Striker, 1994; Wautier 等, 1996)，另一方面又可致使巨噬免疫細胞分泌細胞激素或發炎物質，這些物質可破壞原來的血管內皮細胞，但又可促進血管新生作用的發生。RAGE 表現量顯著的位置被發現均位於 AGE 大量表現的區域(Ritthaler 等, 1995; Schmidt 等, 1995)，而 RAGE 的作用也已被視為一種臨床治療糖尿病相關併發症的方法(Shoji 等, 2006)。老化是造成血糖升高的危險因子，因此近期的研究發現慢性病患組織中的 AGE 濃度較高(Miyata 等, 1997; Schleicher, Wagner, & Nerlich, 1997; Stitt 等, 1997)，過去的研究亦已指出老化會伴隨較高的氧化壓力或是較低的抗氧化能力(Miquel, Economos, Fleming, & Johnson, 1980; Sanz, Pamplona, & Barja, 2006)，而其他的文獻也認為神經退化性疾病的產生與新血管的生成或血管的修復能力有關(Lange-Asschenfeldt & Kojda, 2008)，AGE 引起血管的發炎反應和氧化壓力的損害可能是引致神經退化性疾病的病理機制 (Moreira 等, 2005)。近期的文獻已認為血清或腦脊髓液中的 AGE 濃度可作為神經退化性疾病的早期檢測指標(Takeuchi 等, 2007)；AGE 的產生和累積常見於慢性或是老化相關之疾病，如糖尿病(Schleicher 等, 1997)、阿茲海默氏症(Smith 等, 2005)、血管硬化(Stitt 等, 1997)和慢性腎衰竭(Miyata 等,.

(22) 11. 1997)等。另一方面，運動雖會造成氧化壓力的升高，但運動訓練則有助於抗氧化物質的活性增加(Itoh 等, 1998)，亦有助於延緩神經退化性疾病的病症(Lautenschlager 等, 2008)，而目前針對運動對 RAGE 的影響或關聯性仍未知。血管新生能力不良(impaired angiogenesis)與老化有關，亦會引致許多老化相關之慢性疾病；血管新生是指由已存在之血管長出血管分枝的過程，當組織面對能量缺乏的挑戰時會引發血管新生，如低氧(hypoxia)、運動或局部缺血狀態均會啟動血管新生作用(Ferrara, 1999b; Lange-Asschenfeldt 等, 2008)。血管新生作用的關鍵啟動因子為血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，同時配合另一血管生長因子 angiopoietin 的作用，以形成成熟血管；過去證據發現神經退化性疾病與大腦組織的血管新生功能不良有關(Thirumangalakudi, Samany, Owoso, Wiskar, & Grammas, 2006)，因此促進血管新生能力便成為避免慢性腦性疾病產生的重要策略。. 第二節血管新生的機制血管新生的機制與重要性生的機制與重要性血管內皮新生因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)於 1983 年首次被描述為一種腫瘤所分泌的血管通透因子(vascular permeability factor, VPF)，其蛋白分子至 1989 年被純化並排序出來，同時也開始被發現其具有.

(23) 12. 引起血管新生的能力，當時許多研究均認為 VEGF 為促進血管新生的因子，並注意到其與腫瘤、類風濕性關節炎、糖尿病之視網膜病變有關；另外的研究發現 VEGF 基因缺失的胎兒，其心臟上的血管網路會發展不全 (Carmeliet 等, 1996; Ferrara 等, 1996)，且也發現因為缺少 VEGF 基因而影響內皮細胞的生長及血管的形成，進而導致生物體的死亡(Fong, Rossant, Gertsenstein, & Breitman, 1995; Shalaby 等, 1995)，因此血管內皮生長因子開始被認為與血管生長有關。血管內皮生長因子的主要作用為促進血管新生，並可增加血管通透率，而 eNOS 為啟動這些作用的重要訊息傳遞因子；離體實驗已發現 VEGF 會促使許多內皮細胞連結成類似微血管之網狀結構(Pepper, Ferrara, Orci, & Montesano, 1992; Pepper, Wasi, Ferrara, Orci, & Montesano, 1994)，另外研究發現血管新生、血管直徑、血流速度和血管滲透度與 eNOS 的表現量有關，且血管內皮生長因子可透過 NO 而提升血管通透性(Morbidelli 等, 1996; Parenti 等, 1998; Ziche, 1999)和增加微血管密度(Namba 等, 2003)，而 eNOS 缺失不僅會使藉由血管內皮生長因子路徑而引起的血管新生能力降低，也會造成血管滲透度不良(Morbidelli 等, 1996; Parenti 等, 1998; Ziche, 1999)。血管內皮生長因子可作用於神經細胞、軟骨細胞或是內分泌器官，主要發生於組織生長發育或修復之過程(Carlevaro, Cermelli, Cancedda, & Descalzi Cancedda, 2000; Gerber 等, 1999; Haigh 等, 2003; Raab 等, 2004)，.

(24) 13. 該些過程中不僅會產生細胞增生，亦伴隨血管新生，許多研究已證實 VEGF 的嚴重減少會造成血管網絡減少、阻礙生物體生長和器官發育、細胞易於退化以及死亡率增加(Haigh 等, 2003; Raab 等, 2004; Zimmermann 等, 2001)。臨床應用上，血管內皮生長因子被認為具有延緩病症嚴重度的功用；過去研究發現 VEGF 與其接受器會於腦部缺血區域的微血管內皮細胞和神經細胞中大量表現，以中腦動脈(middle cerebral artery)血管阻塞的實驗模式發現，VEGF 的表現量於血管阻塞後 6 個小時顯著增加，且多分佈於缺血區域邊緣，而血管阻塞後 48 小時之內，血管內皮生長因子接受器亦顯著增加，此時位於缺血區域邊緣之血管內皮細胞亦開始增生，於是缺血區域邊緣便形成新的血管網絡(Marti 等, 2000)，另外的研究發現腦部 VEGF 表現量於增加缺血後 8 小時(Mu 等, 2003)，且於腦室中注射適量 VEGF 可使老鼠大腦之缺血區塊縮小(Gertz 等, 2006; Hayashi, Abe, & Itoyama, 1998; Wang 等, 2006)，同時有助於改善老鼠中風後的感覺動作功能。. 第三節血管新生因子間的合作血管新生因子間的合作 VEGF 為血管形成過程中重要的生長因子，近來也發現其他生長因子參與血管形成過程，且不同的生長因子所產生的作用亦不相同，這些血管新.

(25) 14. 生因子即為 angiopoietin (Yancopoulos 等, 2000)，其為成熟血管形成的關鍵因子。 Angiopoietin 可與 VEGF 進行協同作用而促使血管內皮細胞形成血管管狀結構 (vascular formation)，angiopoietin 中以 Ang1 和 Ang2 的角色常於研究中廣泛探討；Ang1 和 Ang2 互為拮抗的作用，Ang1 有助於成熟血管的形成和維持血管結構的穩定性(stability)，但 Ang2 則會造成成熟血管失去穩定性(de-stability)而處於具有可塑性的狀態，若沒有 VEGF 的共同調節，Ang2 的大量增加會造成血管裂解(regression)，但 Ang2 在 VEGF 的共同作用下則可促使血管產生新的血管分支(angiogenic sprouting)(Yancopoulos 等, 2000)。 Ang1 可由內皮細胞或周邊細胞分泌，並作用於促進血管網路的修建 (remodeling)及血管成熟(vessel mature)；缺乏 Ang1 基因的老鼠，其血管發育過程中可透過 VEGF 的作用而促進基本的血管成熟，但卻無進一步成熟血管的形成(Suri 等, 1998)，因此單是 VEGF 的作用僅會促使血管數量增加，當 VEGF 和 Ang1 共同作用時才能促使成熟血管的形成。Ang2 和 Ang1 互為同形異構物(homologus)，兩者均與 Tie2 接受器具有高度親和性，Ang1 和 Tie2 接受器結合後會促進細胞與細胞間的連結(Loughna & Sato, 2001)，但 Ang2 會抑制 Tie2 接受器的活性，進而造成細胞間的連結能力下降；研究發現 Ang2 基因過度表現會造成過多的不成熟血管形成於視網膜處(Feng.

(26) 15. 等, 2007)，然缺乏 Ang2 基因的眼球部位亦無法產生血管網路修整作用 (vascular remodeling)(Gale 等, 2002)；因此，血管修建過程中必須由 Ang2 引致血管結構失去穩定性，使血管具有可塑性，並於 VEGF 的合作下進行血管重建與分支的作用，若無 VEGF 的合作，血管便會裂解而死亡。 VEGF 為血管形成過程中的關鍵因子，血管形成過程中仍需要其他血管生長因子的協同作用才能形成完整的血管；VEGF 是由需要進行血管新生之周邊細胞產生並釋放至血液中，並經由血液循環徵召骨髓中的增生細胞 (progenitor cell)隨血液循環位移(migration)至欲進行血管新生之部位，增生細胞於位移過程中會逐漸分化成內皮細胞(endothelial cell)，而這些內皮細胞可形成原始的血管架構(primitive vasculature)，再經由 VEGF 和 Ang1 作用而修建(angiogenic remodeling)成完整且成熟的血管(mature vessel)，此過程中若僅有 VEGF 的作用而無 Ang1，則會形成出血性的血管(leaky and heamorrhagic vessel)；另外，成熟血管要產生血管分支時會需要 Ang2 的作用以形成不穩定且鬆散的血管結構，並由 VEGF 再徵召內皮細胞至所需進行血管新生的部位(Yancopoulos 等, 2000)。. 第四節年齡對血管新生因子的影響 VEGF 於腦部老化過程中所扮演的角色仍未有定論，但缺乏 VEGF 確實會造成血管新生能力不良，因此 VEGF 的缺失應為引致老化形成的原因.

(27) 16. 之一，然目前的研究結果對於不同組織的 VEGF 於老化過程中變化的結果並不一致。過去研究針對 VEGF 和腦部老化的研究僅觀察 VEGF 蛋白濃度於中老年鼠隻的海馬回區域中顯著下降，而老年鼠隻之海馬回中的 VEGF 並不會持續下降(Shetty 等, 2005)；而針對心肌的研究更指出 VEGF 路徑隨老化而降低表現量，包括 VEGF 和其接受器的表現量均下降(Iemitsu 等, 2006)，然有些研究卻認為 VEGF 的表現量並非決定老化的主要因素，骨骼肌研究比較老年鼠和年輕鼠肌肉中的血管內皮生長因子表現量，結果發現老年鼠較年輕鼠反而具有更高表現量的血管內皮生長因子(Gavin 等, 2006)；另外的研究則認為老年組織中的血管新生因子雖然減少，但仍具有一定的表現量以維持血管新生能力的進行，該研究發現老年老鼠肌肉中的 VEGF 和 Flt-1 接受器表現量較年輕組為低，而 Flk-1 接受器則沒有顯著變化，且對於 Ang1 和 Ang2 的表現量亦無顯著影響，但其接受器 Tie2 的表現量有顯著下降(Wagatsuma, 2006)；而血管平滑肌細胞中的 HIF-1 會因老化而減少蛋白表現量，但 VEGF 並不會因老化而減少 mRNA 表現量(Yeh, Kim, & Peresie, 2008)；視網膜組織研究中亦發現老年老鼠之血管內皮生長因子及其接受器 Flk-1 蛋白表現量增加(Smith & Steinle, 2007)。因此，年齡與 VEGF 表現量的關係不一致，其原因來自於不同的實驗設計、不同的年齡組別和不同的組織，而過去研究雖已發現海馬回中 VEGF 的濃度於中老年老鼠組.

(28) 17. 織中顯著降低(Shetty 等, 2005)，但對於 VEGF 接受器及其他因子如 Ang1、 Ang2 表現量於年輕與高齡腦部間的差異仍未知。. 第五節運動對血管新生因子運動對血管新生因子的效因子的效應的效應運動對於慢性疾病如中風和心血管疾病患者非常重要，運動訓練不僅有助於促進心肺適能、延緩肌肉量的減少和增進肌力與協調能力等效用，其最重要的功用在於啟動血管生長的作用(Bloor, 2005; Gustafsson & Kraus, 2001; Haas, 2002; Prior 等, 2004; Prior, Lloyd, Yang, & Terjung, 2003; Richardson 等, 2000)。許多研究證據顯示運動訓練可減少中風患者腦部缺血區域和改善功能性表現(Gertz 等, 2006)，另有研究發現缺血區域會產生血管新生的現象，而運動更有助於該血管新生作用的產生(Ding 等, 2004)，而缺血模式之動物實驗結果亦顯示每天 30 分鐘且持續一週、三週或六週的運動訓練均可造成中風鼠隻腦部血管內皮生長因子 mRNA 表現量增加，血管密度則於三週運動後顯著增加，同時中風鼠隻的功能缺失和缺血之腦部區域均較少(Ding 等, 2004)。最近以非患者之人體研究亦發現運動有助於血管新生的證據，該結果顯示單次運動可促進 VEGF 的表現量， VEGF 蛋白分子和 mRNA 的表現量增加於單次阻力訓練後第 2 個小時和 4 個小時，雖 VEGF 接受器(Flt-1)的表現量並無改變(Gavin 等, 2007)，但研究仍認為運動引致之 VEGF 表現量增加，將有助於血管新生作用。.

(29) 18. 過去不論是缺血模式或非缺血模式之實驗均已證實運動對於血管新生作用的效果，且 VEGF 已被認為會對運動訓練產生適應性；缺血模式之動物實驗結果發現運動訓練至第 8 天時，接受股動脈阻斷之鼠隻，其後腿肌肉呈現顯著的 VEGF 和其接受器的表現量，(Lloyd 等, 2003)，而血管密度則至運動第 12 天時便達最大值，同時每個血管生長因子之表現量多於運動第 8 天後其便回復至運動前的水準；非缺血模式之動物實驗結果顯示經過八週常氧下跑步訓練後兩天，鼠隻肌肉中的 VEGF 和接受器並無顯著增加的現象，但若於單次跑步訓練後則均會顯著增加，而接受八週運動訓練後再進行單次相同的跑步運動，VEGF mRNA 表現量仍會增加，但其增加幅度不如單次運動後的反應為高，而其接受器 mRNA 表現量則會降低(Olfert, Breen, Mathieu-Costello, & Wagner, 2001b)，運動被證實可透過 VEGF 路徑促進血管新生，而當血管網路足以應付能量需求時，血管新生因子的表現量便隨之降低，然而腦部對於運動挑戰的適應反應仍未確切驗證。海馬回與學習記憶能力有關，且被視為許多慢性腦部疾病重要的病理變化區域，然而運動介入對於海馬回區域血管新生能力的效果卻少有研究探討。過去以時序性(time-course)實驗模式去探討血管新生能力對於運動挑戰的反應，研究結果發現不同部位組織的血管新生適應反應不盡相同，過去發現快肌的血管新生因子面對運動挑戰所引致之變化相較於慢肌為快 (Lloyd 等, 2003)，另外的研究亦顯示與步行動作相關之脛前肌肉(tibialis.

(30) 19. anterior muscle)的血管新生因子會於跑步運動訓練期間產生顯著變化，但與步行動作無關之顳肌(temporalis muscle)血管新生因子並不會發生變化 (Amaral 等, 2008)，因此血管新生反應即是一種適應能量變化的結果，且能量需求越多的組織所表現的血管新生反應越顯著；而動作皮層區和非動作相關之腦區於運動過程中的能量需求之異同則缺乏證據說明，過去已有研究指出單次運動會造成不同功用之腦區如動作皮層和海馬回區域使用能量的速率均增加(Vissing, Andersen, & Diemer, 1996)，但也有研究發現單次運動後僅海馬回區域之 VEGF 表現量顯著增加，皮層區並無顯著變化(Tang, Xia, Wagner, & Breen, 2009)，因此仍未有研究同時探討動作皮層和海馬回區域於運動期間之血管新生反應；而因為血管新生能力不良為許多慢性疾病的病因，因此藉由瞭解因運動引致之血管新生能力於不同腦區的表現，將有助於針對腦部疾病族群的運動訓練之應用。. 第六節運動對於老化組織的血管新生能力運動對於老化組織的血管新生能力之效果能力之效果老化目前被認為會降低運動對於血管新生的效應，但運動訓練對於高齡族群之血管新生能力的正面功用仍有證據支持；過去研究已顯示運動訓練對於血管新生的效應具有年齡的差異，但部分研究也認為運動對於血管生長因子的效應並無因年齡而不同。過去的人體實驗發現老年組骨骼肌中的 VEGF mRNA 表現量於中強度之單次運動後的反應低於年.

(31) 20. 輕組的反應，且 Flt-1 mRNA 於單次運動後反而有下降的現象(Croley 等, 2005)，但另外的人體實驗卻也顯示老年組和年輕組骨骼肌於單次運動後的 VEGF mRNA 表現量均增加(Ryan 等, 2006)，而動物實驗也顯示出 VEGF 對於運動的適應反應不受年齡影響，研究顯示 24 個月大老鼠之小腿肌肉中 VEGF mRNA 表現量高於 3 個月大老鼠，老年鼠和年輕鼠於單次中低強度運動後 VEGF mRNA 表現量均增加，且並無年齡上的差異 (Gavin 等, 2007; Gavin 等, 2006)；最近的研究結果雖已發現每天 30 分鐘跑步，為期四週的運動訓練後，22 個月大的老鼠腦部組織中之 VEGF 和血管新生有關之蛋白分子表現量有顯著增加(Ding 等, 2006)，且老年運動組之血管數量相較於未運動老年族群有增加的現象，然該研究並未比較不同年齡層的差異；其他的證據則顯示接受運動訓練之老年鼠腿部缺血後，其 VEGF 的表現量以及血清中 VEGF 含量均增加，肌肉中微血管密度亦增加(Leosco 等, 2007)，然此研究以引致老化組織缺血的實驗模式說明運動訓練對於血管新生的效果，因此目前仍無證據說明年輕和高齡腦部因運動引致血管新生能力的差異性。. 第七節總結一、. 血管新生能力不良已被認為與老化有關聯性，然對抗老化壓力時，. 血管內皮生長因子 VEGF 所扮演之角色於不同組織的研究結果中仍有爭.

(32) 21. 議，過去多數研究均針對 VEGF 與年齡增長進行探討，尚缺乏研究探討大腦組織中 angiopoietin 於年齡增長過程中的變化。二、. 運動造成生物體內能量的需求增加而引致能量的重新分配，運動訓. 練有助於啟動血管生長的作用並提高血管密度，而血管新生促進於慢性疾病的預防和治療應為一項非常重要的策略，研究均已證實與動作產生有關的組織如肌肉、心肌和皮層及網狀體，會因運動訓練而促進血管新生，然與動作產生無直接相關的區域如海馬回，面對運動挑戰而產生之血管新生適應反應仍需確定。三、. 老化易於導致血管發炎反應的發生，而運動對於血管發炎指標. RAGE 的影響仍未知。血管內皮細胞受到持續性發炎反應或氧化壓力提高的威脅，而導致血管病變，進而成為許多慢性疾病的病因，包括糖尿病、類風濕性關節炎和神經退化性疾病；RAGE 已被視為可反映 AGE 含量多寡的指標，而 RAGE 面對運動挑戰而產生的改變仍未知。.

(33) 22. 第參章第參章方法. 本章將針對以下內容進行說明，包括：「動物受試者」、「測試流程」、「組織處理方式與分析指標」、「分析方式與步驟」、「資料分析」。其中因為「組織處理方式與分析指標」及「分析方式與步驟」於研究一、研究二和研究三均相同，因此並未於內容中依據三個研究而分別描述，而「動物受試者」、「測試流程」及「資料分析」內容中則依據研究一、研究二和研究三而分別描述。. 第一節動物受試者本研究計畫通過台北市立體育學院的動物管理小組審核後執行。研究一將使用 3 個月齡(年輕)且來自於相同品系之雄性 Sprague Dawley (SD)鼠共 44 隻，將鼠隻安置於台北體育學院運動動物中心，施以一星期之適應期，以熟悉環境與日夜周期，養育環境的溫度維持於 21℃，並維持 12：12 個小時之夜日周期，食物將使用 LabDiet 5001 Rodent diet 大鼠飼料(PMI Nutrition International, LLC., Brentwood, MO, USA)。本研究採用之運動訓練均依據過去研究使用之運動方式和研究結果進行調整後而得，運動訓練為固定運動量之游泳運動，每天 90 分鐘且持續 14 天(Iemitsu 等, 2006; Lloyd 等, 2003)。研究二將使用年齡 3 個月(年輕)和 12 個月(中老年)且來自於相同品系之雄性 SD 鼠各 12 隻，共 24 隻受試鼠隻，將鼠隻安置於台北體育學院運動動.

(34) 23. 物中心，施以一星期之適應期，以熟悉環境與日夜周期，養育環境的溫度維持於 21℃，並維持 12：12 個小時之夜日周期，食物將使用 LabDiet 5001 Rodent diet 大鼠飼料(PMI Nutrition International, LLC., Brentwood, MO, USA)。年輕組和高齡組各依據體重配對分配為控制組和單次運動組，因此本研究中共分為四組包括年輕控制組(6 隻)、年輕單次運動組(6 隻)、高齡控制組(6 隻)和高齡單次運動組(6 隻)。同時，研究二以代謝能力作為年齡差異之指標，因代謝能力可反映生物體老化狀態，因此採用葡萄糖耐受度測試 (oral glucose tolerance test, OGTT)評估年輕和高齡受試鼠之代謝能力。研究三將使用年齡 3 個月(年輕)和 12 個月(中老年)且來自於相同品系之雄性 SD 鼠各 22 隻，共 44 隻受試鼠隻，將鼠隻安置於台北體育學院運動動物中心，施以一星期之適應期，以熟悉環境與日夜周期，養育環境的溫度維持於 21℃，並維持 12：12 個小時之夜日周期，食物將使用 LabDiet 5001 Rodent diet 大鼠飼料(PMI Nutrition International, LLC., Brentwood, MO, USA)。年輕組與高齡組又分別分為控制和運動組，因此本研究之四個組別包括年輕控制組(11 隻)、年輕運動訓練組(11 隻)、高齡控制組(11 隻)和高齡運動訓練組(11 隻)。. 第二節測試流程研究一將兩週運動訓練期間分四個時間點採集動物組織，包括運動.

(35) 24. 前、運動第 1 天後、運動第 7 天後和運動第 14 天後，動物組織均於當天運動後一小時進行採集，每個運動時間點犧牲 6 隻受試鼠作為血管因子和發炎指標分析之用，另 5 隻受試老鼠之大腦作為灌流並進行染色切片之用（如下圖所示）。. 研究二中分為年輕無運動組、年輕單次運動組、高齡無運動組和高齡單次運動組，接受單次運動組之年輕和中老年受試鼠進行單次 90 分鐘游泳且無負重運動，組織樣本均於運動後一小時進行採集。研究三中分為年輕無運動組、年輕運動組、高齡無運動組和高齡運動組，採用之運動訓練均依據過去研究使用之運動方式和研究結果進行調整後而得，運動訓練為持續兩週且每天 90 分鐘之游泳運動，運動訓練前將進行一週的適應期，期間的游泳時間依序為 15、15、30、45、60、90、90 分鐘(Iemitsu 等, 2006)。受試鼠(n=6)於運動訓練結束後隔天進行犧牲並擷取組織作為訊息核糖核酸(mRNA)和蛋白質分析之用，而另外的受試鼠(n=5)於運動訓練結束後第 2 天進行葡萄糖耐受度測試，並於第 3 天灌流以便進行組.

(36) 25. 織切片染色分析之用（如下圖所示）。研究三以葡萄糖耐受度測試所得之代謝能力作為年齡差異之指標，並於運動訓練前後亦進行葡萄糖耐受度測試之評估。. 第三節組織處理方式與分析指標組織處理方式與分析指標犧牲動物以截取大腦組織作為訊息核糖核酸(mRNA)和蛋白質分析之用，另灌流犧牲以作為組織切片染色之用。犧牲動物以截取大腦組織前，先將動物以 0.004 ml/kg 之水化氯醛(chloral hydrate)麻醉後，並取下海馬回和動作皮層之大腦區域組織，將組織取下後立即以液態氮冷凍並置於液態氮中存放。灌流犧牲則先將動物以 0.004 ml/kg 之水化氯醛(chloral hydrate) 麻醉後，以含 4%甲醛(formaldehyde)之 0.1M PBS 溶液進行灌流，取出整個.

(37) 26. 大腦組織後先置於含 30%蔗醣(sucrose)之 0.1M PBS 溶液中脫水，經 5-7 天完全脫水後即以冷凍包埋膠急速冷凍於液態氮中，並保存於-80℃冰箱。分析指標包括血管密度、血管生長因子蛋白和 mRNA 表現分析。血管密度分別以鹼性去磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)和以 CD31 為標的蛋白之免疫染色方式(immunohistochemistry)進行分析；蛋白表現則包括血管內皮生長因子(VEGF)、VEGF 接受器(Flk-1)、VEGF 接受器(Flt-1)、VEGF 路徑下游之蛋白分子 eNOS 以及其他與血管形成有關之生長因子包括 Angiopoietin-1(Ang1)和 Angiopoietin-2(Ang2)及其接受器 Tie2，另外發炎指標則分別為 AGE 接受器(receptor for advanced glycation endproduct, RAGE)、CD68(巨噬免疫細胞標的蛋白)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)，以及與能量調節有關之第一類型葡萄糖轉運蛋白 (GLUT1)；同時分析 VEGF、Flk-1、Flt-1、Ang1 和 Ang2 及其接受器 Tie2 之 mRNA 表現量。. 第四節分析方式與步驟分析方式與步驟一、即時聚合酶鏈式反應定量分析(real-time polymerase chain reaction, RT-PCR) 訊息核糖核酸(mRNA)定量分析是以 RT-PCR 方式進行，首先需先進行組織中 RNA 萃取(RNA isolation)，進行萃取大腦神經組織之 RNA 是以 RNAQiagen 之 RNeasy® Mini Kit (Qiagen Inc., CA, USA)進行，並將萃取完.

(38) 27. 成的 total RNA 置於冰上，後續以 spectrophotometer 進行核酸定量，再以反轉錄(reverse transcriptase)的試藥組(iScriptTM cDNA Synthesis Kit，Cat# 170-8890，BioRad, Inc., Hercules, CA, USA)將 RNA 反轉錄為互補式去氧核糖核酸(cDNA)。最後進行定量之 RT-PCR 是將特定之 forward primer、reverse primer 和 TAMRA probe(如下表)各 1 微升(µl)、1 微升(µl)和 0.5 微升(µl)依序加入 5 微升(µl)樣本 cDNA 中，並加入 12.5 微升(µl)的 iQ supermix 酵素 (BioRad, Inc., Hercules, CA, USA)以促進即時聚合酶鏈式反應，且以 β-actin 為 housekeeping gene，最後以 MyiQ 2.0 RT-PCR(BioRad, Inc., Hercules, CA, USA)儀進行定量。 Forward primer. Reverse primer. Probe. VEGF. AACGAAAGCGCAAGAAATCCC. GTCTGCGGATCTTGGACAAAC. TCCTGGAGCGTTCACTGTGAGCCT. Flk-1. GTGGTGGAAGTGAGCATGTTG. ATTAGGGTAGGAAACAGCACAGG. CAGTAGCCCAACCGTGAGAGCAAGCAAC. Flt-1. ACCAGACCCAGTAAGTCATTAGC. TGTGCCTCTCTCGTTTGCTG. CCTCAGAAAGGGACCCAGAGCACGCT. Ang1. GACGCTGATAACGACAACTGTATG. AGTGTAGAACATTCCGTTTAGATTGG. AGGCATCAAACCACCAACCTCCTGTTAGCA. Ang2. TGGCTGGGCAACGAGTTT. TGGATCTTCAGCACGTAGCG. TCTCCCAGCTGACCAGTGGGCA. Tie2. TACATAAGATACTGTTCATTAACCATTCCC. AGTAACCCACATTCTAACACAATTCG. AGTTCCCTCGCTTTTCTTCCTGTGCTGTCA. β-actin. GACCCAGATCATGTTTGAGACCTTC. GAGTCCATCACAATGCCAGTGG. CGACCAGAGGCATACAGGGACAACACAGC. 二、蛋白質分析蛋白質分析前先進行蛋白質定量(Lowey protein assay)，再以西式點墨法(western blotting)，並配合 BioRad Quantity One (BioRad, Inc., Hercules, CA,.

(39) 28. USA)進行蛋白表現量分析。取 20-30 毫克(mg)動作皮層或海馬回組織經組織均質機(Polytron PT3100 Benchtop Homogenizer, Kinematica, Switzerland) 勻漿後與 sample buffer 混合致使蛋白質變性，並於變性之蛋白質樣本溶液中取出含 120 微克(µg)蛋白之樣本溶液進行 SDS-PAGE 蛋白電泳，電泳完成之後以半乾式轉漬電槽(Trans-blot® SD Semi-dry Transfer Cell, BioRad, Inc., Hercules, CA, USA)將蛋白質轉移到 PVDF 膜上(Fluorotrans®W transfer membrane, Pall Life science, NY, USA)，並利用各個抗體溶液以 1:100 濃度於 4℃下進行隔夜浸泡，抗體包括 VEGF 抗體、Flk-1 抗體、Flt-1 抗體、eNOS 抗體、Ang1 抗體、Ang2 抗體、Tie2 抗體、RAGE 抗體、CD68 抗體、SOD1 抗體和 GLUT1 抗體(Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA, USA)，第二天將 PVDF 膜以濃度 1:000 之二級抗體(特定物種之 HRP- IgG 抗體，Cell Signaling Technology, Inc., MA, USA)於室溫下浸泡 1 小時，再以冷光呈色劑方式(Western Lightning Plus ECL, Perkin Elmer Life and Analytival Sciences, Shelton, CT, USA)顯現，最後以 BioRad Quantity One (BioRad, Inc., Hercules, CA, USA)與電腦配合定量，並以 β-actin (A5441, Sigma Aldrich, San Louiss, MO, USA)作為內在控制蛋白。. 三、血管密度血管密度是以組織切片染色呈現，並計算每平方毫米(mm2)面積內的染.

(40) 29. 色呈色個數，染色方式包括以鹼性去磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)染色和以 CD31 為標的蛋白之免疫染色方式(immunohistochemistry)進行，血管呈色直徑小於 8 微米(µm)者方計算為血管個數(Schneider 等, 2007)，而血管密度計算方式為每片大腦切片上任選四個鏡頭範圍(field)，鏡頭範圍面積均為 0.25*0.25 毫米(mm)，將四個鏡頭範圍內各自計算所得之的血管個數加總後所得數值，即為每片大腦切片之血管數量，而每個樣本均有四片大腦切片，將這四片大腦切片之血管數量平均後所得之數值即為每個樣本單位面積之血管密度。首先是進行大腦組織切片，即將冷凍包埋處理之大腦組織取出後置於切片機(Leica CM1850 cryostat, Leica Microsystem Inc., IL, USA)組織台上進行冷凍切片，維持-25 ℃的切片溫度，每切片厚度為 16 微米(µm)，每個樣本之玻片上黏置四面大腦組織切片，組織切片先以丙酮(acetone)固定 5 分鐘後，置於室溫風乾 30 分鐘之後便可進行各項染色。 AP 染色可呈現微血管位置，且主要是呈現微血管動脈端部分(arteriolar capillary portion)(Koyama, Xie, Gao, Suzuki, & Batra, 1998)，其染色方式是將組織切片置於基質液槽內，維持於室溫下 30 分鐘，再以 dH2O 浸泡 2 分鐘 2 次，完成後立即置於 Olympus 顯微相機系統(Olympus America Inc., Center Valley, PA, USA)下進行拍照；而基質液中包括 10 毫克(mg)之 Naphthol AS-MX phosphate (N-5000, Sigma Aldrich, San Louiss, MO, USA) 、50 毫升.

(41) 30. (ml) 之 dH2O、50 毫升(ml) 之 0.2M Tris buffer (ph=8.5) 和 60 毫克(mg) 之 Fast Red TR salt (F-8764, Sigma Aldrich, San Louiss, MO, USA)。本研究之免疫染色方式是以 CD31 為標的蛋白，CD31 為一種內皮細胞間的連接蛋白(Fujiwara, 2006; Woodfin, Voisin, & Nourshargh, 2007)，因此可用以標定內皮細胞。其染色方式是將組織切片先以 10% normal Goat Serum (S-1000, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)浸泡，接著以 PBS 液清洗後，再以 CD31 抗體(550300, BD Bioscience Pharmingen, CA, USA)標定血管內皮細胞(endothelial cell)，隔夜搖晃後依序以二級抗體 IgG (biotinylated anti-mouse IgG, BA-9200, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)和 ABC 試劑組(Vectastain Elite standard ABC kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)進行標定蛋白的訊號放大，接著以 DAB 溶液(D5905, Sigma Aldrich, San Louiss, MO, USA)呈色，且以蘇木紫(hematoxylin)作背景染色，最後以 75%、85%、95%、100%之乙醇和二甲苯(xyline)依序進行脫水和褪色。完成封片的組織切片置於 400 倍 Olympus 顯微相機系統(Olympus America Inc., Center Valley, PA, USA)鏡頭進行拍照。. 第五節資料分析本研究採用 SPSS 11.0 版進行資料分析，第一類型錯誤率設定 α 為 0.05，所有測試數值以平均數±標準誤來表示。研究一採用單因子變異數分.

(42) 31. 析以比較血管新生因子和發炎指標於四個運動訓練時間點組別間的差異，並以 Tukey 檢定作為兩組組間之事後比較。研究二採用單因子變異數分析以比較所有檢測指標於年輕控制組、年輕單次運動組、高齡控制組和高齡單次運動組別之差異並以 Tukey 檢定作為兩組組間之事後比較。研究三採用單因子變異數分析以比較所有檢測指標於年輕控制組、年輕運動訓練組、高齡控制組和高齡運動訓練組別之差異，並以 Tukey 檢定作為兩組組間之事後比較。.

(43) 32. 第肆章結果. 研究一：研究一：不同腦區血管新生路徑和發炎指標於運動過程中之時序性變化不同腦區血管新生路徑和發炎指標於運動過程中之時序性變化研究一之受試鼠的體重、腦重、脂肪重、腦重百分比和脂肪重百分比顯示於表一(A)。動作皮層和海馬回中的 VEGF、Flk-1、Flt-1、Ang1、Ang2 和 Tie2 之 mRNA 表現量變化分別顯示於圖三和圖四中。動作皮層中 Flk-1 之 mRNA 表現量於運動第 7 天後相較於運動前顯著增加（圖三(B)），而 VEGF、Flt-1、Ang1、Ang2 和 Tie2 之 mRNA 表現量則於運動介入後無顯著變化（圖三）；海馬回中的 VEGF、Flk-1、Flt-1、Ang1、Ang2 和 Tie2 之 mRNA 表現量則於運動介入後均無顯著變化（圖四）。動作皮層和海馬回中的血管新生因子與發炎指標之蛋白表現量變化分別顯示於圖五及圖六。動作皮層中 VEGF 蛋白表現量於運動第 1 天後顯著增加（圖五(A)），而其接受器 Flt-1 則於運動第 1 天、第 7 天和第 14 天後均顯著增加（圖五(C)），血管新生路徑因子 eNOS 則於運動第 1 天後有顯著增加（圖五(D)），Ang1 亦於運動第 1 天後顯著增加（圖五(E)），其接受器 Tie2 於運動第 7 天和第 14 天後顯著增加（圖五(F)）。巨噬免疫細胞標的蛋白 CD68 會於運動第 1 天至第 14 天後顯著增加（圖五(J)），其他發炎指標並無顯著改變。海馬回中 VEGF 蛋白於運動第 1 天後顯著增加（圖六(A)），而其接受.

(44) 33. 器 Flk-1 無顯著增加（圖六(B)），另一接受器 Flt-1 亦僅於運動第 1 天後顯著增加（圖六(C)）；Ang1 於運動第 1 天後顯著增加（圖六(E)），Ang2 則於運動第 7 天顯著低於運動前（圖六(G)），兩者之接受器 Tie2 於運動過程中均無改變（圖六(F)）。海馬回中的 CD68 於運動第一天後顯著增加（圖六 (J)），另 GLUT1 亦於運動第一天後顯著增加（圖六(K)）。 AP 染色和免疫染色結果顯示於圖七。動作皮層和海馬回中的血管型態於運動過程中之變化趨勢不同，AP 染色所呈現之動作皮層區域微血管密度於運動第 1 天後及運動第 7 天後的微血管密度則有顯著減少（圖八(A)），另動作皮層區域的 CD31 標的蛋白呈現之微血管密度運動第 7 天後亦顯著減少（圖八(B)），至運動第 14 天後動作皮層區域的微血管密度均有回復至運動前狀態的現象（圖八(A)(B)）；而海馬回區域之微血管密度則無顯著改變（圖九）。. 研究二：研究二：單次運動對年輕和中老年腦部血管新生路徑和發炎指標的效應研究二之受試鼠的體重、腦重、脂肪重、腦重百分比和脂肪重百分比顯示於表一(B)，高齡組之體重、脂肪重和脂肪百分比均顯著高於年輕組，而高齡組與年輕組之腦重和腦重百分比則無顯著差異。另外，年輕和高齡受試鼠之葡萄糖耐受測試曲線則顯示於圖一。高齡老鼠之葡萄糖數值與年輕老鼠無顯著差異（圖一(A)），但胰島素濃度則顯著高於年輕組（圖一(B)）。.

(45) 34. 年輕單次運動組之動作皮層和海馬回區域血管新生因子 mRNA 的表現量與年輕無單次運動組無顯著差異（圖十和圖十一）。高齡動物之動作皮層區域之 Flk-1 mRNA 顯著高於年輕動物（圖十(B)），高齡單次運動組之血管新生因子與高齡無運動組亦無顯著差異。年輕單次運動組之動作皮層和海馬回區域的血管新生因子 VEGF 和 Flt-1 的蛋白表現量相較於年輕無運動組為高（圖十二(A)(C)和圖十三 (A)(C)），惟年輕單次運動組之動作皮層區 eNOS 蛋白表現顯著高於年輕無運動組（圖十二(D)），且年輕單次運動組之動作皮層中 Ang1 蛋白表現量亦顯著高於年輕無運動組（圖十二(E)），但高齡運動組相較於高齡無運動組則無顯著影響；另外，年輕運動組於單次運動後之動作皮層和海馬回區域的 CD68 蛋白表現量較年輕無運動組為高（圖十二(J)和圖十三(J)），海馬回區域 SOD1 和 GLUT1 蛋白表現量較年輕無運動組為高（圖十三(I)(K)），但動作皮層區域的 SOD1 和 GLUT1 則無顯著差異（圖十二(I)(K)）。高齡動物之動作皮層區域的 Flt-1 和 Ang1 均較年輕動物為高（圖十二 (C)(E)），但 VEGF 和 Tie2 卻無同步增加（圖十二(A)(F)），血管新生路徑因子 eNOS 和 CD68 以及抗氧化酵素 SOD1 亦均顯著高於年輕動物（圖十二 (D)(J)(I)）；高齡動物之海馬回區域則顯示 Flt-1 和 Ang1 並無顯著改變（圖十三(C)(E)），而發炎指標 RAGE 和 CD68 亦無顯著差異（圖十三(H)(J)），僅抗氧化酵素 SOD1 顯著高於年輕動物（圖十三(I)）。.

(46) 35. 研究三：究三：年齡與運動訓練對於腦部血管新生路徑和發炎指標之影響研究三之受試鼠的體重、腦重、脂肪重、腦重百分比和脂肪重百分比顯示於表一(C)，老年組之體重、脂肪重和脂肪百分比均顯著高於年輕組，而高齡組之腦重百分比均顯著低於年輕組，運動介入對於年輕組或高齡組均未造成體重、脂肪重和腦重達到顯著差異。另外，年輕和高齡受試鼠於運動前後之葡萄糖耐受度測試曲線則顯示於圖二。年輕運動組之第 30 和 60 分鐘的葡萄糖數值於運動後顯著下降（圖二(A)），而高齡運動組之胰島素濃度於空腹和第 30、60 及 120 分鐘的胰島素數值於運動後均顯著下降，但仍均高於年輕組（圖二(B)）。血管新生因子之 mRNA 表現量於各組的變化呈現於圖十四和圖十五之中，年輕運動組與年輕無運動組之血管新生因子並無顯著差異，且老年運動組與高齡無運動組之血管新生因子亦無顯著差異，僅高齡無運動組之動作皮層區 Flk-1 mRNA 表現量顯著高於年輕無運動組（圖十四(B)）。年輕運動組之動作皮層和海馬回區域之血管新生因子蛋白表現量相較於年輕無運動組並無顯著差異，而高齡運動組與高齡無運動組之血管新生因子蛋白表現量亦然（圖十六(A)至(G)及圖十七(A)至(G)）；然年輕運動組之動作皮層 CD68 的蛋白表現量相較於年輕無運動組顯著為高（圖十六 (J)），而高齡無運動組之動作皮層區域 CD68 蛋白表現量亦顯著高於年輕.