中南美洲原生觀賞用鳳梨與臺灣重要商業品種之遺
傳親緣性分析
Genetic Relationship Between Ornamental Bromeliads of Centric South America
and Commerical Cultivars in Taiwan.
陳鴻吉
1許圳塗
1林順福
2邱輝龍
1,.3鍾仁彬
1by
Hung-Chi Chen, Chou-Tou Shii, Shun-Fu Lin, Huei-Long Chiu, Jen-Ping Chung
關鍵字：逢機增殖DNA 片段、遺傳親緣性、鳳梨科
Key words：Randomly Amplified Polymorphic DNA, genetic relationship, Bromeliaceae
摘要：
本試驗以市場上商業價值較高的7 屬 18 種觀賞鳳梨為材料，進行逢機增 殖DNA 片段(Randomly Amplified Polymorphic DNA, RAPD)的分析。由 20 個 RAPD 引子所產生的條帶之中，共獲得119 個具多型性的分子標誌。在屬間鑑別上，4 個 為 Cryptanthus 屬所特有，3 個為 Dyckia 屬所特有，2 個為 Guzmania 屬所特有，12 個為 Neoregelia 屬所特有，1 個為 Tillandsia 屬所特有，1 個為 Vriesea 屬所特有。在 種間鑑別上，30 個多型性的分子標誌為各種間所特有之差異條帶，其它則為多型性 條帶，可以用來分辨不同的物種，尤其是外觀相似的不同物種。利用Jaccard 方法所 求出不同樣本之間的相似度及UPGMA 方法所建立出來的親緣關係圖，除結果顯示 與形態分類學一樣之外，本試驗結果所得之屬與種專一性分子標誌更可提供日後觀 賞鳳梨栽培品種鑑別良好工具。前 言
觀賞鳳梨屬鳳梨科(Bromeliaceae)，原產於中南美洲雨林區，除了少數屬於高海拔而耐寒者外，大 多屬熱帶性，為CAM 型植物。觀賞鳳梨具有肉質、堅實硬挺的單葉，簇生於短縮莖上，葉面常成孤 狀曲垂，葉緣常具銳刺。植株長大後，由頂芽抽穗開花，或圓錐花序或穗狀花序，全體呈圓錐狀、立 體圓柱，或群聚呈頭狀，由其總苞、小花、萼片及苞片之型、色、質地來展現其美麗外觀。開花後結 的漿果亦常因量多、色美、型殊而亦具觀賞價值，故觀賞鳳梨除了以其挺拔的株型與葉群，美麗的葉 面斑紋、斑點或鑲邊等造成亮麗的葉色，而得以於室內觀葉植物群中，佔有重要之一席外；事實上， 它碩大、色彩繽紛、造型殊異的花序，或串串鮮麗、突顯的果實，使其觀賞性更形提昇。1980 年代在1. 國立台灣大學園藝學系碩士班學生. 教授. 博士班研究生及博士後研究員。Graduate student . Professor . PhD Graduate student, Postdoctor researcher, respectively, Department of Horticulture, National Taiwan University, Taipei, R.O.C.
2. 國立台灣大學農藝學系助理教授。Assistant Professor, Department of Agronomy, National Taiwan University, Taipei, R.O.C. 3. 農業試驗所作物種原室助理。Assistant, Crop Genetic Resources Laboratory, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung, R.O.C. 4. 本文於民國 90 年 12 月 12 日收到。Date received for publication: Dec. 12, 2001. -201
歐美發展為新興觀賞植物及室內植物(Miller, 1991)。在荷蘭則躍居成為僅次無花果類之第二大室內植 物，年產值超過6 億元，年產量依序為 Guzmania、Vriesea、Neoregelia 及 Aechmea(WPI, 1987)。近幾 年觀賞鳳梨在台灣已迅速成長為五大盆花之一，栽培面積大約有20 公頃 (阮, 1997)，根據民國八十六 年農林廳出版的「台灣盆花調查」中顯示觀賞鳳梨之總栽培盆數高達一百三十多萬盆。 由於中南美洲幅員廣闊，加上高山海拔的變化，造就了許多不同的地理生態氣候型。正因如此， 中南美洲的觀賞鳳梨在長久的演化過程中，種源歧異性大，估計約有50 個屬，2400 多個原生種，但 被商業化生產的屬種只有少數，如：Guzmania、Vriesea、Neoregelia、Aechmea、Cryptanthus、Dyckia 及 Tillandsia 等。分子標誌為作物種原或品種鑑定之一良好工具，雖然有利用 RAPD markers 在鳳梨品 種上的鑑定報告，但仍偏重食用鳳梨屬Ananas 之研究(El-Tarras, et al., 1999；Ruas, et al., 1995) ，因此 商業觀賞鳳梨品種相關的遺傳研究報告較為缺乏。另外，部份不同種觀賞鳳梨物種間之外觀極相似， 若非專業人士仔細判別則不易區分，分子標誌可望提供客觀而簡便之物種分析工具。由於鳳梨科植物 族群龐大，材料收集不易，故本試驗乃是針對國內外較常見且觀賞價值高之重要野生觀賞鳳梨屬種及 商業品種，進行RAPD 分析。主要目的是在建立觀賞鳳梨遺傳資料庫，以及尋找這些屬種之特殊條帶， 因此本試驗的完成將可建立重要觀賞鳳梨種源的遺傳標誌供品種鑑定及育種的參考，並且提供一種方 式瞭解來自中南美洲觀賞鳳梨的親緣關係。
材料及方法
1.植物材料： 以市場上商業價值較高的7 屬 18 種觀賞鳳梨品種為試驗材料，如表一所列。包括原生於巴西的蜻 蜓鳳梨(Aechmea fasciata)及巴西至哥倫比亞的青天鳳梨(Aechmes tillandsioides cv. Kienastii)，原生於巴 西的紅葉小鳳梨(Cryptanthus acaulis var. ruber)、絨葉小鳳梨(Cryptanthus bivittatus)及虎紋小鳳梨 (Cryptanthus zonatus)，原生於巴西及阿根廷的厚葉鳳梨(Dyckia brevifolia) 。重要商業品種包括有紫擎 天鳳梨(Guzmania cv. Amaranth)、橙擎天鳳梨(Guzmania cv. Cheery)、國王擎天鳳梨(Guzmania cv. Carine) 、達摩擎天鳳梨(Guzmania with whiteline)、中斑五彩鳳梨(Neoregelia carolinae cv. Tricolor)及端 紅鳳梨(Neoregelia spectabilis)，原生於厄瓜多爾的玉扇鳳梨(Tillandsia cyanea)、美國東南至阿根廷與智 利的松蘿鳳梨(Tillandsia usneoides)及墨西哥的犀牛角鳳梨(Tillandsia ehlersiana Rauh)，原生於巴西的鸚 歌鳳梨(Vriesea carinata)、虎斑鳳梨(Vriesea splendens)及園藝雜交種的紅羽鳳梨(Vriesea erecta) (表 1)。 2.基因組 DNA 的抽取：依 Dellaporta et al.（1983）所發表之方法，萃取觀賞鳳梨染色體組 DNA，即從各供試材料上，各 取其嫩葉0.5~0.75 克，加液態氮並磨成粉狀，加入萃取液(100 mM Tris-HCl，50 mM EDTA，500 mM NaCl，10 mM β-mercaptoethanol)及 20% SDS，混合後置於 65 ℃水浴 10 分鐘，之後加入 5 M 醋酸 鉀激烈搖動後置入0℃下 20 分鐘，在 4℃下以 12000 rpm 離心 20 分鐘（Sigma 2 K 30，rotor 12153）， 取上清液加入RNase A（5mg / ml），於室溫下反應30 分鐘，加入等體積的酚/氯仿（phenol / chloroform） 充分混合後，於11000 rpm 下離心 15 分鐘；取出上清液加入 10 μl NaOAc 及 0.54 X 體積的異丙醇 （isopropanol），在-20℃沈澱 DNA 20 分鐘。可見 DNA 出現，以玻璃管所製之鉤子鉤取 DNA，於 70 % 酒精中洗去鹽類，再於95 %酒精中洗去多餘水分，風乾後加入適量 1X TE 溶液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM Na2-EDTA），並使 DNA 完全溶解後，在 OD 260nm 下測其 DNA 的濃度。
表 1. 參試 18 種觀賞鳳梨樣品及其原生地。
Table 1. Eighteen collected accessions of Bromeliacea and countries of origin. Eighteen collected accessions of Bromeliacea
中名 學名 原生地
蜻蜓鳳梨 Aechmea fasciata 巴西
青天鳳梨 Aechmes tillandsioides cv. Kienastii 巴西至哥倫比亞
紅葉小鳳梨 Cryptanthus acaulis var. ruber 巴西
絨葉小鳳梨 Cryptanthus bivittatus 巴西 虎紋小鳳梨 Cryptanthus zonatus 巴西 厚葉鳳梨 Dyckia brevifolia 巴西、阿根廷 紫擎天鳳梨 Guzmania cv. Amaranth 栽培種 橙擎天鳳梨 Guzmania cv. Cheery 栽培種 國王擎天鳳梨 Guzmania cv. Carine 栽培種 達摩鳳梨 Guzmania with whiteline 栽培種
中斑五彩鳳梨 Neoregelia carolinae cv. Tricolor 栽培種
端紅鳳梨 Neoregelia spectabilis
玉扇鳳梨 Tillandsia cyanea 厄瓜多爾
松蘿鳳梨 Tillandsia usneoides 美國東南至阿根廷與智利
犀牛角鳳梨 Tillandsia ehlersiana Rauh 墨西哥
鸚歌鳳梨 Vriesea carinata 巴西
虎斑鳳梨 Vriesea splendens 巴西 紅羽鳳梨 Vriesea erecta
3.逢機增殖 DNA 片段分析：
以100 個引子(Operon A、B、C、D、S kits)做初步的篩選，然後由其中選出解析度良好並具有多 型性DNA 條帶的 20 個引子(表 2)進行試驗，每個樣品有 3 個重複。
4. PCR(Polymerase Chain Reaction)聚合反應：
PCR 的反應如下：25 ng 的 DNA 模板在含 15 mM Tris HCl，pH 8.4； 40 mM KCl，1.5 mM MgCl2， 300 µM 的 dNTP，0.4 µM 的引子（primer）及 1 unit 的 Taq 聚合酶溶液中，放置在 PCR 加熱反應器(Perkin Elmer Cetus 9700 型)中反應。聚合反應的條件如下：94℃下 5 分鐘使基因組 DNA 變性，再進行 94℃ 40 秒、42℃ 40 秒、72℃ 60 秒，總共進行 40 次循環，最後一個反應在 72℃下 7 分鐘使反應完全。 當反應結束後，取10μl 的樣品和 1.5μl 的追蹤劑(loading dye)混合，在 2.0%的瓊膠進行電泳分析，再 用ethidium bromide 染色，在 UV 燈下觀察並照相記錄。 5.資料分析： 以DNA 片段估算不同樣本間遺傳的距離，乃採用 Jaccard 在 1908 年所提之相似度計算公式計算 各樣本間的相似度，其公式如下： 遺傳相似性 = Nab / ( Na + Nb - Nab) Na ：樣本 a 的條帶數 Nb ：樣本 b 的條帶數 Nab：樣本 a、b 的共有條帶數 依此法將所有的樣本間的相似度計算出來。所得的相似度矩陣則使用NTSYS 軟體所提供 UPGMA 程式統計兩樣本間的遺傳距離，並繪製成相似關係數樹狀圖（dendrogram）。
表 2. 適合觀賞鳳梨 RAPD 分析之 20 個引子序列。
Table 2. Sequences of twenty RAPD primers for Bromeliaceae genotypes identification. Primer (Code no.) Sequences (5’→3’)
OPA-8 GTGACGTAGG OPA-9 GGGTAACGCC OPA-10 GTGATCGCAG OPA-11 CAATCGCCGT OPA-15 TTCCGAACCC OPB-1 GTTTCGCTCC OPB-5 TGCGCCCTTC OPB-6 TGCTCTGCCC OPB-10 CTGCTGGGAC OPB-11 GTAGACCCGT OPC-6 GAACGGACTC OPC-16 CACACTCCAG OPC-19 GTTGCCAGCC OPD-2 GGACCCAACC OPD-5 TGAGCCGACA OPD-16 AGGGCGTAAG OPD-18 GAGAGCCAAC OPD-20 ACCCGGTCAC OPS-5 TTTGGGGCCT OPS-11 AGTCGGGTGG
結果和討論
本試驗以7 屬 18 種觀賞鳳梨為材料，如表一所列。抽取這些樣本的 DNA 當作模板，由 100 個引 子中篩選得到20 個具有多型性且條帶明顯之寡核苷酸鏈引子，如表 2 所列。共得到 119 個逢機增殖 DNA 片段(RAPD markers)。圖 1 為用 OPB5 引子所增幅出來的 RAPD markers 電泳圖譜。在本試驗中 得到具多型性之RAPD markers 之中有 1 個為本研究參試的 7 屬 18 種觀賞鳳梨所共有，4 個為參試的Cryptanthus 屬所特有，3 個為 Dickia 屬所特有，2 個為 Guzmania 屬所特有，12 個為 Neoregelia 屬所
特有，1 個為 Tillandsia 屬所特有，1 個為 Vriesea 屬所特有，30 個為單一樣本所有，其它則為 2 個物 種以上共有之多型性條帶，可以用來分辨不同的樣本(表 3)。把每一個 DNA 的條帶，當做一個獨立的 性狀，計算不同樣本之間的遺傳相似性，其結果列在表 4。而由此表中所列出不同樣本間之遺傳相似 性，再利用UPGMA 來建立這 18 個樣本之間親緣關係的樹狀圖(圖 2)。由圖 2 顯示，本試驗所參試 7 屬18 種觀賞鳳梨的聚類分析符合現行型態分類學的屬種歸類，表示本研究所示不同觀賞鳳梨樣本之間 的關係可信度很高。 由圖2 顯示，本試驗所參試的 7 屬 18 種觀賞鳳梨樣本平均 RAPD 標誌遺傳相似性只有 24％左右， 可能是因為由100 個引子中經初步篩選具有多型性之引子，將共有之 DNA 分子標誌省略，所造成物 種間遺傳相似性偏低，但此種結果應不影響物種間相對之差異與分群分析。而本試驗利用PAPD 技術 可先將所參試的7 屬觀賞鳳梨分為兩大群，一群由 Aechmea、Tillandsia、Guzmania 及 Vriesea 此四屬 組成；另一群則由 Cryptanthus、Dyckia 及 Neoregelia 此三屬組成。
1000 bp
500 bp
圖 1. 十八種觀賞鳳梨以 OPB-5 引子進行 RAPD 分析所得之條帶型。
Fig. 1. RAPD amplification products obtained from eighteen genotypes of Bromeliaceae with Operon primer B-5.
圖 2. 十八種觀賞鳳梨樣本 RAPD 分析所得到的叢群分析樹狀圖。
Fig. 2. The dendrogram of eighteen genotypes of Bromeliaceae based on RAPD markers.
在 Aechmea、Tillandsia、Guzmania 及 Vriesea 這四屬當中，以 Aechmea 屬和 Tillandsia 屬具有較大 遺傳相似性(節點 1)，再和 Guzmania 屬叢聚在節點 2，最後再和 Vriesea 屬叢聚在節點 3，可推測 Vriesea 與另三屬之遺傳距離較遠。其中，紅羽鳳梨(Vriesea erecta)為彩苞鳳梨(V. polemanii) ×五杖鳳梨(V. rex) 的雜交種，而彩苞鳳梨和五杖鳳梨亦來自複雜的屬內雜交，故紅羽鳳梨為一遺傳組成相當複雜的
. 表 3. 參 試觀賞鳳 梨 RAPD 共 同標誌、屬間及種間專一性分子標誌。 Table 3. Th e spe cific RAPD mar kers for g
enus and species of or
na ment al Brome li ace ae
表 4. 十八種 觀賞鳳 梨 物種之 RAPD 條帶 以 Jaccard 方法分析所得之相似 度 。 Table 4. Gen eti c simil arity of RA PD banding patt ern among eight een g enotypes of Bromeliacea
according to th
e Jaccard co
efficien
t
of simila
rity
.
羽鳳梨先和同為 Vriesea 屬的金馬鸚歌鳳梨叢聚在節點 4 後，再和同為 Vriesea 屬的虎斑鳳梨叢聚在節 點5，驗證了上述的推論。
另外，值得注意的是 Cryptanthus、Dyckia 及 Neoregelia 這三屬觀賞鳳梨，其中 Cryptanthus 及 Dyckia 這兩屬觀賞鳳梨的植株在外表型態上具有一定程度的相似性，如：植株矮小，幾乎看不到莖的存在； 葉片硬挺，葉長約10 ~ 20 公分，葉寬約 2 ~ 4 公分，呈現多肉質的葉片；葉面具條斑，葉緣具硬直針 刺等等外表型態特徵。至於 Neoregelia 屬的觀賞鳳梨，雖然不較 Cryptanthus 及 Dyckia 這兩屬觀賞鳳 梨般的矮小，但相較於其它屬種的觀賞鳳梨，株型仍算矮小，且葉緣亦疏佈著細小針刺。而在本試驗 聚類分析當中，乃以控制生物外表性狀的遺傳物質DNA 為出發點，亦證實 Cryptanthus 和 Dyckia 這兩 屬確實具有較近的親緣關係。由圖2 顯示，在 Cryptanthus、Dyckia 及 Neoregelia 這三屬當中，乃是以
Cryptanthus 屬和 Dyckia 屬具有較大遺傳相似性(節點 6) ，而與 Neoregelia 屬之相似性較小，故和 Neoregelia 屬叢聚在節點 7(圖 2)。
回溯這些觀賞鳳梨的原產地，在 Aechmea、Tillandsia、Guzmania 及 Vriesea 這一群當中，Aechmea 屬觀賞鳳梨大致是分佈於中美洲至南緯30 度以北的南美洲地區；Tillandsia 屬觀賞鳳梨大致是分佈在 美國東南、中美洲及南美洲西部沿海地區，呈現一個S 型分佈；Guzmania 屬觀賞鳳梨大致上分佈是介 於中美洲哥斯大黎加和南美洲的厄瓜多爾及哥倫比亞之間的地區；Vriesea 屬觀賞鳳梨大致是分佈在巴 西。也就是說這一大群觀賞鳳梨的分佈涵蓋美國東南、中美洲、南美洲西部沿海及南緯30 度以北的南 美洲地區。而在 Cryptanthus、Dyckia 及 Neoregelia 這一群當中，Cryptanthus 屬觀賞鳳梨大致是分佈於 巴西；Dyckia 屬觀賞鳳梨大致是分佈在巴西及阿根廷；Neoregelia 屬觀賞鳳梨大致上分佈在巴西、哥 倫比亞及秘魯等地。也就是說這一大群觀賞鳳梨的分佈乃是侷限於南美洲，並沒有延伸到中美洲及北 美洲。
B
A
赤道
圖 3. 利用 RAPD 分子標誌相似性分群所得之觀賞鳳梨在中南美洲地理分佈圖。 Fig. 3. Geographic distribution of Bromeliaceae according to RAPD-based genetic similarity.A 範圍為 Aechmea、Tillandsia、Guzmania 及 Vriesea 此四屬主要分佈地。 B 範圍為 Cryptanthus、Dickia 及 Neoregelia 此三屬主要分佈地。
根據本研究這兩群觀賞鳳梨的地理分佈，顯示在赤道以南至南回歸線以北及西經40 至 65 度之間 為主要重疊的區域(圖 3)，推測此地區為鳳梨植物的遺傳變異中心。蘇俄學者 Vavilow 氏曾提出世界上 作物有八大原始中心，其中包括南墨西哥及中南美洲中心和南美洲中心。該學者將南美洲中心細分為 智利亞中心和巴西 – 巴拉圭亞中心，並指出巴西 – 巴拉圭亞中心為木薯、落花生、可可、橡膠、鳳 梨及百香果等等植物的種源地。而本研究最後結果符合蘇俄學者Vavilow 之理論，亦可提供一有利之 佐證。 RAPD 技術在 20 世紀初期建立後，立刻引起科學家的注意並且廣泛地被應用在品種鑑定、遺傳圖 譜建立、抗病基因篩選、親緣關係鑑定及演化學上。而本研究以較具市場潛力的觀賞鳳梨屬種為出發 點，藉由RAPD 技術非但可區分不同屬之觀賞鳳梨，並且由本研究所得聚類分析之結果，將有助於瞭 解中南美洲觀賞鳳梨屬種之間的親緣關係及地理上的演化。而所得到的屬或種特有標誌，亦可提供日 後雜交育種的F1 商業品種鑑定之用，或有助於保護 F1 商業品種的專利權。
誌 謝
本文承蒙國立台灣大學農藝系研究生與助理簡禎佑與陶光恆先生、霧峰農業試驗所園藝系戴廷恩 先生、熱帶園藝試驗所果樹系李文立先生協助試驗進行，特此表示最誠摯的謝意。參考文獻
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Abstract
The RAPD markers were used to analyze the genetic similarity among eighteen collected accessions and cultivars attributed to seven genera of Bromeliaceae. A total of 119 markers were obtained from 20 RAPD primers. In genus identification, there are four, three, two, twelve, one, and one markers specific to Cryptanthus, Dyckia, Guzmznia, Neoregelia, Tillandsia, and Vriesea, respectively. Besides, all the eighteen tested accessions could be identified with thirty proposed markers. The result suggests that these thirty markers are useful tools for genera and species or cultivars discrimination, especially for species with high morphological similarity. The dendrogram established by Jaccard and UPGMA methods is coincident with the taxonomy. Moreover, our studies suggest a potential molecular marker to identify the cultivars of Bromeliaceae.
