行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告
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臭氧及 PM1/PM2.5/PM10 氣懸微粒之暴露及健康風險評估
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─子計畫五：
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臭氧及氣懸微粒健康影響效應之評估 (Ⅱ)
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計畫類別： 個別型計畫
√ 整合型計畫
計畫編號：NSC 89－2621－Z－002－029－
執行期間：88 年 08 月 01 日至 89 年 7 月 31 日
計畫主持人：鄭尊仁
共同主持人：
本成果報告包括以下應繳交之附件：
□赴國外出差或研習心得報告一份
□赴大陸地區出差或研習心得報告一份
□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份
□國際合作研究計畫國外研究報告書一份
執行單位：國立台灣大學公共衛生學院職業醫學及工業衛生研究所
中 華 民 國 89 年 10 月 13 日
臭氧及 PM1/PM2.5/PM10 氣懸微粒之暴露及健康風險評估─子計畫五：
臭氧及氣懸微粒健康影響效應之評估(Ⅱ)
計畫編號：NSC 89-2621-Z-002-029-執行期限：88 年 08 月 01 日至 89 年 07 月 31 日 主持人：鄭尊仁 執行機構及單位名稱：國立台灣大學公共衛生學院職業醫學及工業衛生研究所中文摘要： 氣懸微粒與臭氧是大氣中常見的污染物，先前流行病學研究顯示單獨暴露於氣懸 微粒及臭氧中可增加致病率及致死率，但是氣懸微粒及臭氧共同造成的健康危害則不 清楚。並且目前尚未有針對細微粒 (PM1/PM2.5) 以及臭氧之共同暴露所引發的健康 效應以及機轉進行評估。空氣污染物引起呼吸道傷害的過程非常複雜，研究顯示微粒 及臭氧暴露皆可造成發炎反應的產生，發炎則與 neutrophil，eosinophils 和 monocyte 聚集有關，這些細胞的產生與累積，則是接受到細胞內的 cytokine proteins 的訊息傳 遞，例如 IL-8；因此探討肺部上皮細胞之 cytokine proteins 數量，可進一步對氣懸微 粒及臭氧暴露所產生的細胞毒性機轉有所助益。本研究以 in-vitro 方式來進行，受測 的細胞株為 A549 細胞。並且以 trichotomous 採樣器來進行微粒採樣，採得 PM 1、PM1 - 2.5 及 2.5 - 10 µm 之氣懸微粒；臭氧暴露則以暴露箱進行，測試的暴露條件為 0.06、 0.08 及 0.12 ppm 一小時。結果顯示，A549 細胞暴露於等質量濃度下 (50 µg/ml) 的微 粒，粒徑愈小的微粒 (PM1，PM1 - 2.5 ) 較較粗粒徑微粒 (PM2.5 - 10) 可導致較多的 IL-8 蛋白表現；暴露於愈高濃度的臭氧 (0.12 ppm) 相較於低濃度 (0.08，0.06 ppm)， 也可導致較多的 IL-8 蛋白表現；並且同時暴露臭氧後，細胞若再暴露於等質量濃度的 微粒下，較小粒徑的微粒也可導致較多量的 IL-8 蛋白表現，此表現也比單一臭氧或微 粒暴露增加。 關鍵詞：氣懸微粒、臭氧、IL-8
Abstract:
Ambient particulate matter (PM) and ozone are abundant in our air. Previous epidemiological studies have observed positive associations of particulate matter exposure or ozone exposure alone with mortality and morbidity. However, there are no combined health effects between PM10 and other co-pollutants, including ozone. Further, data are limited to evaluate the health effects and related mechanisms of fine PM (PM1/PM2.5) combined with ozone. The mechanisms of air pollutants related toxicity are very complex. Studies have shown that PM or ozone exposure could induce inflammation reaction. Inflammation is a result of recruitment and accumulation of neutrophils, eosinophils, and monocytes into the airway, a response that depends on an elaborate signaling network in which cytokines are the key signaling molecules. These cellular products such as IL-8 are chemotactic for inflammation cells. Therefore, with investigation of cytokine protein level of airway epithelium cells exposed to size-fractionated PM and different levels of ozone will assist to understand the basic mechanisms. In this study, we performed an in-vitro experiment, and selected the A549 cell line to investigate. PM1, PM 1 – 2.5 and PM2.5 - 10 µm were collected by the trichotomous sampler. Ozone exposure was conducted in an exposure chamber, and the exposed conditions were 0.06, 0.08, and 0.12 ppm for one hour. The results showed that A549 cells exposed to equal mass concentration of PM, the finer PM (PM1, PM1 - 2.5) induced more IL-8 protein expression, compared to PM2.5 - 10. Similarly, those exposed to higher level of ozone (0.12 ppm), induced more IL-8 expression, compared to lower level of ozone (0.08, 0.06 ppm). Also, an additional IL-8 expression was detected for PM exposure after A549 cells have been exposed to ozone first, particularly finer PM, compared to ozone or PM exposure alone.
前言：
目前台灣都會區的空氣污染以氣懸微粒 (Particulate Matter，PM)及臭氧最為嚴重。 歐美各國相繼依據研究結果檢討及公佈新的氣懸微粒及臭氧大氣環境空氣品質標準，因 此瞭解大氣氣懸微粒及臭氧之毒性，是保護人民健康及空氣品質的重要工作。 近年來的一些外國研究結果指出，氣動直徑小於 10 µm (PM10)、2.5 µm (PM2.5) 及 1 µm (PM1)，是可能引起呼吸道各種病變的最主要污染。從 1993 年至今天，台灣地區 氣懸微粒的濃度經常超過國家大氣品質標準，年平均值可達 67 - 87 µg/m3；而 PM10 日 平均值大於 125 µg/m3標準的日數可以達到 134 天。再以 1997 年之人口資料來看，台灣 地區目前約有 1044 萬人居住在 PM10 濃度高於國家大氣品質標準的地區，再加上老幼 人口以及易感受性族群，所以可以預測我國人民此刻受到氣懸微粒暴露所導致的潛在健 康風險可能相當大。 根據不同的產生源，不同的粒徑大小，不同的化學成份，使得氣懸微粒呈現為相 當複雜的化合物。氣懸微粒粒徑大小對於人體健康的影響是近年來受到重視的課題，理 論上，愈多數的微粒沈降在肺部，就愈容易造成毒性的產生，根據 Hattis 等人 [1] 所提 出的 ”irritation signal model” 指出，當微粒粒徑愈大時，在單位面積上所沈降的微粒數 目愈少，所以微粒粒徑愈小，所產生的訊息就愈大，相對地所產生的毒性就愈強。流行 病學的研究也指出 PM2.5 可能比 PM10 更能造成死亡率的上升以及心肺疾病率的增加 [2]，然而對於 PM1/PM2.5 與人體健康的相關研究目前仍是相當缺乏。臭氧也是大氣中常見的污染物，根據美國環保署 1997 年針對臭氧濃度制定的新標 準:「每年第四高的每日最高 8 小時臭氧濃度平均值，取其三年平均值必須符合 0.08 ppm」，而台灣地區具有臭氧監測的 61 處空氣品質監測站，從 1994 - 1997 年連續三年平 均值均大於 0.08 ppm 的監測站則共有 51 處。動物試驗以及人類臨床研究也顯示臭氧暴 露可以引起肺功能的減退，增加肺部上皮細胞的通透性，以及促使發炎反應的產生 [3-5]。 空氣污染物引起呼吸道傷害的過程是非常複雜的，而多重污染物同時暴露更可能 使呼吸道傷害加重，特別台灣夏天地處高溫，環境中臭氧濃度常常大於國家大氣品質標 準，過去研究也指出單獨暴露於臭氧之中，可導致呼吸道傷害，而流行病學研究亦顯示 臭氧與其他空氣污染物如 NO2、HNO3、peroxyacetyl nitrate、H2SO4、和 SO2則未具有明
顯的健康加成作用 [6-9]；此外，共同暴露於 PM10 以及臭氧之中也未具有使死亡率增 加的加成作用存在 [10-12]，但是目前尚未有針對共同暴露於細粒徑微粒 (PM1/PM2.5) 以及臭氧之中的健康效應及機轉進行評估。
吞噬細胞 (macrophage) 在肺部提供對微粒的第一道防禦，從呼吸道表面一直到肺 部氣體交換區域都有吞噬細胞的存在，所以吞噬細胞特別容易與吸入的物質作用，而釋 放出 hydrogen peroxide (H2O2) 及 superoxide anion radical (O2
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-)，這些反應性氧化產物
(ROS) 就可進一步地活化轉錄因數 NF-κB 和 AP-1，接續引發細胞激素 interleukin 的增 加 [13]，造成明顯的 neutrophil、esophils 和 monocyte 聚集反應，引起發炎。這些細胞
的產生與累積，則是接受到細胞內的 cytokine protein 的訊息傳遞，例如 interleukin-8 (IL-8)，而 IL-8 的功能為可促使白血球聚集與活化。而氣管上皮細胞 (airway epithelial
cell，AEC) 位於組織外部區域 [13]，直接與空氣污染物接觸，容易引起氣管上皮細胞 內的 cytokine protein 的增加，進一步引起急性發炎反應，因此測量氣管上皮細胞內的 cytokine protein 的數量，即可當作氣懸微粒及臭氧暴露引起氣管上皮細胞發炎反應的效 應指標。 因此本子計畫嘗試探討氣懸微粒與臭氧暴露對於人體健康危害的機轉未知的問 題，並且探討臭氧及 PM1/PM2.5/PM10 氣懸微粒之健康加成效應。本年度計畫著眼在 大氣微粒之不同特性，包括粒徑大小與共同暴露與臭氧中對於免疫發炎反應標記之相關 探討，預期結果如下： 1. 等質量濃度的 PM1/PM2.5，比 PM10 微粒暴露易導致肺部發炎標記數量增加。 2. 暴露於較高濃度的臭氧，比較低濃度臭氧暴露易導致肺部發炎標記數量增加。 3. 同時暴露於 PM1/PM2.5 及臭氧之中，比微粒及臭氧單獨暴露時易導致肺部發炎標記 數量增加。
材料與方法
本子計畫以 in-vitro 方式來進行，並且配合子計畫一與二進行微粒採樣。採樣地點與方法 本子計畫配合子計畫一，在臺北市中山國小測站進行氣懸微粒採樣，此測站為都會 區市中心型測站。以 trichotomous 採樣器來進行採樣，採樣流量設定為 40 cfm，採得小 於 1 µm 粒徑之氣懸微粒 (PM1)、1 - 2.5 µm 之氣懸微粒 (PM1 – 2.5) 以及 2.5 - 10 µm 之氣懸微粒 (PM2.5 - 10)。採樣介質是 47 mm 之 polycarbonate 濾紙 (Nucleopore，孔徑 0.45 µm)，這些濾紙是 endotoxin-free 的材質，並以鐵弗龍濾紙為墊片 (37 mm，孔徑 2 µm)；採樣前後以敏感度 1 µg 之天平測量質量，濾紙需在秤重前至乾燥箱內調整
(condition) 24 小時，濕度控制在 50 ± 2 %，並以 Po-210 放射源 (Staticmaster Cahn
Instruments Inc. Cerritos USA) 消除靜電幹擾；每張濾紙以連續秤三次的算術平均為代 表，但秤重值相差不超過 8 µg，且每秤完三張濾紙，需以標準片秤重一次，以防飄移。 所採集的氣懸微粒以超音波震盪於二次水溶液中，再調整所需的微粒濃度，保存於
4 ℃。
細胞培養
本研究選用 A549 細胞株，其形態為 mutilamellar cytoplasmic organelle，是一種能 產生表面活性劑的細胞，以單層形式生長，48 小時後即增長一倍 (log phase growth)， 是來自於人類肺部腫瘤組織，類似人類第二型肺泡上皮細胞，該細胞株購自新竹食品工 業發展研究所 (細胞編號 CCRC 60074)。
將保存於-70 ℃的細胞株放到 37 ℃水浴解凍後，將細胞移至離心管，並加入 10 ml 1 倍磷酸鹽溶液 (1X Phosphate Buffered Saline，PBS)，以 300 g (1,000 rmp) 離心 5 分鐘，
用以去除冷凍保存劑 (Dimethyl Sulfoxide，DMSO) 。移去上清液加入含 F-12K、胎牛 血清、盤尼西林/鏈黴素 (比例為 100 : 10 : 1) 的細胞培養基，均勻混合後移至 T75 培養 瓶，培養細胞在 37 ℃、5% CO2、100%濕度培養箱內，解凍培養細胞在 24 小時內更換 培養基。每天觀察細胞生長情形，每三天更換培養基以供應足夠養分，細胞長滿培養瓶 時要進行繼代培養，取出舊的培養基加入 10 ml 磷酸鹽緩衝溶液，清洗細胞二次後移去 PBS，再加入 0.5% Trypsin-EDTA 使其完全浸潤細胞，靜置二分鐘使其溶解細胞和培養 瓶之間的蛋白質，然後拍打培養瓶壁使細胞自培養瓶瓶壁脫落，再加入新的培養基均勻 混合，平均分配至新的培養瓶中。 微粒暴露 培養細胞到實驗所需數目後，將其從培養瓶打下，並加入新的培養基混合均勻，取 出 10 µl 計數細胞濃度，最後再稀釋到 3 × 105 cells/ml。在無菌狀態將轉移盤 (transwell，
Costar Cat. No. 3412) 的每一個 well 中加入 1 ml vitrogen solution，培養 2 小時後抽掉
vitrogen solution，再於轉移盤下層加入 1 ml F-12K 溶液，上層加入 1 ml 細胞懸浮液 (3 ×
105
cells/ml /well) 培養 2 天，使細胞數長至約 1.8 × 106
cells。細胞培養完後，再將上下 層培養基抽掉，以進行細胞暴露。
將等質量濃度下不同之粒徑分佈的微粒溶液，取 1 ml 加至已經以 vitrogen 處理過 的轉移盤上，在 37 ℃、5% CO2、100%濕度培養箱內，暴露微粒四小時馬上收集培養
基，收集上、下層培養基進行細胞激素測定；上層細胞則利用 trypan blue exclusion 進行 細胞存活性分析，並以 1 ml F12 medium 為陰性對照。
臭氧暴露
由於臭氧是活潑氣體，容易與接觸物質反應而產生濃度衰減，為使暴露進行期間臭 氧濃度變異不至於太大，因此臭氧暴露箱及管件是選擇不銹鋼、鐵弗龍和玻璃為材質。 使用鐵氟龍和不銹鋼材質管件，將臭氧產生器 (Thermo Environmental Instrument Inc， Model 165) 所產生的氣體導入氣體混合槽，同時藉由流量閥 (flow meter) 控制導入適 量的二氧化碳和空氣，以混合調配出各種不同臭氧暴露濃度。另外，為使細胞暴露條件 能符合其最適的細胞生長環境，以減少對結果的幹擾，因此將暴露箱置於培養箱中，維 持暴露箱內溫度在 37 ℃下。通入暴露箱氣體則先經由鐵弗龍管 (0.635 cm 管徑) 導入 一內含消毒過的去離子水混化瓶 (1000 ml，bubbling bottle)，使暴露箱內相對溼度達 95 ± 5% 。 暴 露 期 間 臭 氧 濃 度 監 測 則 使 用 臭 氧 連 續 性 分 析 儀 (Thermo Environmental Instrument Inc，Model 49) 監測濃度，臭氧連續性分析儀的校正則使用臭氧標準氣體產 生器 (Thermo Environmental Instrument Inc，Model 146)。臭氧暴露濃度定為 0.06、0.08 及 0.12 ppm，以檢驗現今美國環保署所修訂之新標準﹔暴露完臭氧後馬上收集下層培養
基，分別在下層加入新的 F-12K 培養基和上層加入事前泡置好的微粒溶液，再放置培養 箱培養四小時後，收集上、下層培養基進行細胞激素測定；上層細胞則利用 trypan blue exclusion 進行細胞存活性分析，並以 1 ml F12 medium 為陰性對照。 臭氧及微粒暴露 由於臭氧為易溶性氣體，若先在暴露於臭氧的細胞上層加入培養基，臭氧氣體則不 易與細胞接觸，因此將採前後暴露的方式進行本研究實驗，又考量實驗的進行如先以暴 露完微粒後再暴露臭氧，則可能因無法確認加入的微粒是否已移去，而無法掌握實際作 用來源，加入考量真實環境中氣體進入呼吸道較微粒容易，因此最後實驗進行方式先將 細胞在下層加入培養基後暴露完臭氧後，再繼續在上層加入微粒懸浮液進行暴露實驗。 將細胞培養到實驗所需數目後，將其轉移到轉移盤上，培養二天使細胞長為約 1.8 ×106 cells/ ml / well，暴露臭氧前將培養的上、下層培養基吸掉，在下層加入新的 F-12K 培養基，上層則不加入任何培養基；然後將其放至臭氧暴露箱內進行暴露實驗，暴露完 臭氧後馬上收集下層培養基，分別在下層加入新的 F-12K 培養基和上層加入事前泡置好 的微粒溶液，再放置培養箱培養 4 小時後，收集上、下層培養基進行細胞激素測定；上 層細胞則利用 trypan blue exclusion 進行細胞存活性分析。
所欲分析的 cytokines 為 IL-8 蛋白。protein 濃度分析是以酵素連結免疫吸附分析試 劑 (Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA；Endogen) 分析。加入 50 µl 欲測樣 本或標準品 (需重複兩次)，蓋上蓋子，於室溫下 (25 ℃) 培養 1 小時。然後清洗分析 盤 3 次，清洗時洗液需充滿整個分析盤，清洗完成後將分析盤反轉，於吸水紙上拍打， 清除殘餘之洗液。再加入 50 µl biotinylated antibody reagent，蓋上蓋子，於室溫下 (25 ℃) 培養 1 小時。之後清洗分析盤 3 次，再加入 100 µl 稀釋過的 streptavidin-HRP，蓋上蓋 子，於室溫下 (25 ℃) 培養 30 分鐘。清洗分析盤 3 次後，再加入 100 µl premixed TMB substrate solution。置於暗處，室溫 (25 ℃) 培養 30 分鐘。然後加入 100 µl 停止溶液， 以停止其反應。放入 ELISA reader 內，讀取 450 nm 之吸收值，並以 550 nm 為參考光 譜，並利用標準曲線及統計軟體求出結果。重複之樣本吸收值需介於平均值的±10 % 內，否則需重新測量，試劑之敏感度需 (最低偵測極限 0 ±2 SD) 小於 2 pg/ml，再現 性之要求為變異係數 (CV) 需小於 10%。 統計分析 所以資料以 SAS 6.12 版統計軟體進行統計分析，所有細胞實驗結果以平均值和標 準誤表示，各粒徑樣本和各組 IL-8 濃度比較以無母數的 Mann Whitney Rank Sum test， 細胞存活性比較以 one-way ANOVA 執行，顯著水準設為 p = 0.05。並根據 Rothman [14] 所提之 S-index (S = (c11 - c00) / (c10 - c00) + (c01 - c00))，分析共同暴露臭氧與不同粒徑
微粒對 A549 細胞產生 IL-8 蛋白之表現，是否具有交互作用存在。
結果
實驗條件選擇 根據本研究室先前觀察 [15]，將採集之微粒從濾紙以超音波震盪下來，配製成 5、 20、50、100 µg/ml 之微粒懸浮液，分別暴露 2、4、12、24 小時，結果發現 IL-8 的表 現具有劑量-效應、及時間-效應的關係存在。隨著暴露時間的增加，IL-8 的濃度不斷的 增加，並且以暴露 4 小時之 IL-8 濃度變化較大，約為暴露 24 小時 IL-8 濃度的 70 - 73%。 在 4 小時的暴露下，50 µg/ml 之微粒濃度所產生 IL-8 的量可產生足夠的表現，因此選 擇以該條件來微粒暴露實驗 (見圖一)。 微粒暴露 進一步將 A549 細胞暴露於 50 µg/ml 之微粒濃度，比較不同粒徑所產生的 IL-8 數 量。結果顯示暴露於不同的 PM1、PM 1 - 2.5 及 PM2.5 - 10 粒徑暴露組之間 (見表一)， 以 PM1 粒徑微粒可產生叫大量的 IL-8 蛋白表現 (657.7 ± 27.0 pg/ml)，然後隨粒徑的增 加，IL-8 的表現有隨之減少的趨勢，並且 PM1 產生之 IL-8 濃度與 PM1 - 2.5 (557.8 ± 14.5 pg/ml，p = 0.03)、PM2.5 - 10 (507.5 ± 18.4 pg/ml，p = 0.010) 或空白對照組 (512.7 ± 6.7暴露於 50 µg/ml 之微粒濃度，不同的 PM1、PM 1 - 2.5 及 PM2.5 - 10 粒徑一小時，並未 造成統計上顯著的存活率變化。 臭氧暴露 為避免細胞在單一臭氧暴露時造成不可還原傷害，在進行研究前先設計以 0.06 ppm 先進行不同暴露時間對細胞存活性的影響，結果觀察到 A549 細胞暴露完 0.06 ppm 臭氧 4 小時後之細胞存活率平均為 65.3%，比較同樣暴露 1 (78.5%) 和 2 小時 (80.6%) 後之
A549 細胞存活性顯著減少 (p = 0.03，one-way ANOVA)，為避免後續加入微粒暴露造
成更多細胞死亡，因此選擇暴露臭氧實驗條件為 1 小時。將 A549 細胞於臭氧暴露箱內 進行暴露實驗，臭氧暴露條件定為 0.06、0.08 及 0.12 ppm 1 小時，之後在 37 ℃下繼續 培養 4 小時，並以空氣暴露為對照。結果顯示 A549 細胞暴露於臭氧 0.12 ppm，其導致 的 IL-8 蛋白表現 (1691.0 ± 30.9 pg/ml；見圖二)，相較於其他暴露條件具有統計上顯著 差異 (vs. 0.08 ppm，1040.0 ± 87.2 pg/ml，p = 0.002；Mann Whitney Rank Sum test)。當
A549 細胞暴露於臭氧 0.08 ppm，其導致的 IL-8 蛋白表現，相較於暴露於 0.06 ppm 下
(936.7 ± 57.8 pg/ml)，則未具有統計上顯著差異 (p = 0.38)。然而 A549 細胞暴露於臭氧
0.06 ppm，其導致的 IL-8 蛋白表現，相較於暴露於空氣下 (535.0 ± 8.7 pg/ml)，則具有 統計上顯著差異 (p = 0.002；Mann Whitney Rank Sum test)。而暴露於 0.06 (0.79；平均 存活率)、0.08 (0.84) 以及 0.12 ppm (0.80) 臭氧一小時之 A549 細胞，存活率並未具有
統計差異。 臭氧及微粒暴露 將 A549 細胞暴露於臭氧 0.06 ppm 一小時後，再持續暴露 50 µg/ml 之微粒濃度 4 小時，空白對照為細胞暴露臭氧一小時後，加入培養基繼續培養四小時。結果顯示暴露 臭氧 0.06 ppm 一小時後，再暴露於不同的 PM1、PM 1 - 2.5 及 PM2.5 - 10 粒徑暴露組之 間，以 PM1 產生最大量的 IL-8 濃度 (1325.7 ± 51.0 pg/ml，平均值 ± 標準誤)，然後隨 粒徑的增加，IL-8 的表現有隨之減少的趨勢，並且 PM1 產生之 IL-8 濃度與僅暴露臭氧 一小時之空白對照組 (936.7 ± 57.8 pg/ml) 比較，具有統計上顯著差異 (p = 0.007，Mann
Whitney Rank Sum test)。同樣地，PM1 - 2.5 產生之 IL-8 濃度 (1259.3 ± 34.8 pg/ml) 與 空白對照組比較，也具有統計上顯著差異 (p = 0.009，Mann Whitney Rank Sum test)。雖 然 PM2.5 - 10 (1034.7 ± 71.2 pg/ml) 與 PM1 - 2.5 粒徑微粒產生的 IL-8 比較，顯著較少 (p
= 0.051，Mann Whitney Rank Sum test)，但與空白對照比較，未達統計上顯著差異 (p =
0.304，Mann Whitney Rank Sum test)。而 A549 細胞暴露於臭氧一小時後，繼續暴露於
PM1 (0.76；平均存活率)、PM1 - 2.5 (0.78) 以及 PM2.5 - 10 (0.75) 之等質量微粒，其存 活率未具有統計差異。
此外，而 A549 細胞暴露於臭氧一小時後，繼續暴露於 PM1、PM1 - 2.5 以及 PM2.5
Whitney Rank Sum test)。根據 Rothman [14] 所提之 S-index，分析共同暴露臭氧與不同 粒徑微粒對 A549 細胞產生 IL-8 蛋白之表現 (見表 3)，結果顯示 0.06 ppm 之臭氧合併 與不同粒徑之微粒暴露，對 A549 細胞產生 IL-8 蛋白，其 S-index 範圍從 1.32 - 1.67， 顯示皆具有協同性的交互作用存在 (S-index > 1)。
討論
本研究結果顯示 A549 細胞暴露於等質量濃度下的微粒，粒徑愈小的微粒 (PM1) 可 導致較多的 IL-8 蛋白表現；暴露於愈高濃度的臭氧 (0.12 ppm)，也可導致較多的 IL-8 蛋白表現；並且同時暴露臭氧後，細胞若再暴露於等質量濃度的微粒下，較小粒徑的微 粒也可導致較多量的 IL-8 蛋白表現。 國外流行病學研究已指出大氣懸浮微粒和呼吸道疾病相關性 [2]，由於各地微粒上 特性差異相當大，因此目前還無法明確指出其引起不良健康效應機制。氣懸微粒所引起 的健康危害可能與其物化特性有關，包括其酸度 (acidity) [16-17]、微粒粒徑大小、微 粒 濃 度 ， 以 及 其 表 面 所 吸 附 的 多 樣 性 的 物 種 ， 包 括 有 機 性 物 質 ， 如 多 環 芳 香 烴 (polyaromatic hydrocarbons，PAHs)，以及無機性物質如過渡元素 (transition metal)，過 渡元素具有提供電子交換的能力，容易造成自由基 (free radical) 或者是反應性氧化產 物 (reactive oxygen species，ROS) 的產生，進而增加細胞內的氧化壓力，加強細胞間訊 息傳遞，因而產生與發炎反應 [18]。在 Li 等人 [19] 研究中，指出相同成分的微粒其在細小粒徑上對細胞有著更強的細胞毒性，本研究結果也發現粒徑效應趨勢存在，但是 微粒可能引起呼吸道細胞傷害的因素包括有表面所吸附的過渡金屬、微粒粒徑、生物性 病媒、酸性氣膠和多環芳香烴等等，因此若要釐清確實引起細胞發炎反應的因數，則需 在更進一步研究探討。 本研究也發現臭氧暴露具有濃度效應關係存在。臭氧會引起呼吸道表皮細胞傷害， Chen 等人 [20] 以天竺鼠呼吸道表皮細胞進行臭氧暴露，來瞭解臭氧氧化細胞後產生的 反應性氧化物種，發現反應性氧化物種生成和臭氧濃度有劑量效應關係，在分別加入不 同反應性氧化物種抑制劑後，結果指出加入氧化氫自由基抑制劑有顯著減少反應性氧化 物種生成，因此推論臭氧的暴露會使得表皮細胞產生氧化氫自由基。 大氣中混存中許多物質，目前台灣都會區中主要空氣污染物為懸浮微粒和臭氧，因 此對於多種污染物對呼吸道的危害考量也是刻不容緩。研究指出臭氧暴露也會引起細胞 產生細胞激素，且暴露在 0.1 ppm 濃度下 1 小時就有顯著增加 IL-8 釋放 [13,21]；此外， 從流行病學研究結果指出，空氣污染物所引起的呼吸道影響主要是事先就存在有肺部疾 病的個體，根據如此理論基礎，本研究嘗試以活化 (primed) 方式來探討臭氧和微粒引 起發炎反應的交互作用，並且利用 Rothman [14] 所提的 S-index 來加以評估。結果發現 同暴露臭氧與不同粒徑微粒對 A549 細胞產生 IL-8 蛋白之表現，具有協同性的交互作用 存在 (S-index > 1)。研究已指出臭氧的暴露會引起細胞內氧化性物種產生造成細胞膜傷 害，進而活化細胞內調控 IL-8 mRNA 的因數 NF-κB [13]，最近 Mondal 等人也發現大氣
微粒也可能導致 NF-κB 的活化 [22]。在細胞處於這樣的狀況下可以視為一些肺部疾病 的一種狀態，如氣喘、支氣管炎和是呼吸道感染，再投以微粒的暴露應可增加 IL-8 產 生。在本研究結果中發現，在暴露完臭氧在持續暴露於微粒中，可所引起的較多量的 IL-8 蛋白表現；而過去 Vincent 等人 [23] 研究也指出，共同暴露臭氧和微粒則有增加細胞 內 DNA 的合成修復。 本研究以 50 µg/ml 之微粒濃度來進行實驗，此實驗設計條件比實際人體在環境中 之可能暴露量來得高。此外，目前我國環境法規所規範的臭氧空氣品質標準，一小時 120 ppb，與 80 ppb 及 60 ppb 暴露標準比較，可產生較高的 IL-8 蛋白表現，這些也與本 土的流行病學研究結果符合 [24]；此外，現今的環保法規多著重在單一空氣污染物暴 露的規範，並未加以討論多重污染物對人體健康同時暴露的影響，本研究初步結果顯 示，A549 細胞同時暴露於臭氧及氣懸微粒中，比單一濃度的臭氧暴露或同粒徑的微粒 暴露，可產生較多量的發炎蛋白指標。因此，本研究結果應可提供本土空氣品質標準制 訂的參考，並建議應著眼於多重暴露污染物的健康評估。 參考文獻
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2.每一個樣本重覆三次試驗，統計檢定為 Mann Whitney Rank Sum test
蛋白表現 微粒粒徑 IL-8 蛋白表現 (平均值 ± 標準誤) p 值 (vs. 對照組) 平均存活率 PM1 1325.7 ± 51.0 0.022 0.76 PM1 – 2.5 1259.3 ± 34.8 0.034 0.78 PM2.5 - 10 1034.7 ± 71.2 0.304 0.75 對照組 936.7 ± 57.8 註 1. 對照組為暴露完臭氧後加入培養基繼續培養 4 小時 2. IL-8 單位：pg/ml
3. 每個樣本重覆三次試驗，統計檢定為 Mann Whitney Rank Sum test
表 3：暴露 0.06 ppm 臭氧 1 小時後，加入 50 µg/ml 之不同粒徑微粒對 A549 細胞產生 IL-8 蛋白之交互作用分析 IL-8 蛋白表現 單一暴露 淨效應 合併暴露之 理論淨效應 臭氧與微粒暴露 之實際淨效應 RothmanS-index Ozone + PM1 1325.7 813.0 1.49 Ozone + PM1- 2.5 1259.3 746.6 1.67 Ozone + PM10 1034.7 522.0 1.32 Ozone 936.7 401.7 PM1 657.6 144.9 546.6 PM1 - 2.5 556.8 44.1 445.8 PM10 507.5 - 5.2 396.5 Air 535.0 F12K 溶液 512.7 註： 1. 單一暴露淨效應定義為：臭氧暴露誘導 A549 細胞所產生的 IL-8 蛋白表現，扣除空 氣暴露誘導 A549 細胞所產生的 IL-8 蛋白表現，或是微粒暴露誘導 A549 細胞所產 生的 IL-8 蛋白表現，扣除 F12K 溶液誘導 A549 細胞所產生的 IL-8 蛋白表現。 2. 合併暴露之理論淨效應定義為：單一臭氧暴露與單一微粒暴露淨效應之和
3. 臭氧與微粒暴露之實際淨效應定義為：臭氧及微粒共同暴露誘導 A549 細胞所產生 的 IL-8 蛋白表現，扣除 F12K 溶液誘導 A549 細胞所產生的 IL-8 蛋白表現。
4. Rothman S-index: (c11 - c00)/(c10 - c00) + (c01 - c00)，亦為臭氧與微粒暴露之實際淨 效應除以合併暴露之理論淨效應
