蛋白質人工抗體微粒之製備及其特性分析
曾弘毅
1、林宏殷
2、袁菁
3、李玫樺
1,* 1義守大學材料科學與工程學系2國立高雄大學化學工程與材料工程學系 3國立高雄大學環境與土木工程學系 (NSC 95-2220-E-390-001-) 分子拓印高分子已被廣泛應用於親合分離、模仿抗體和受體結合、酵素催化及生物感測等。本研 究以白蛋白(Albumin)為目標分子，使用不同的交聯劑（cross-linker）種類，以紫外光照射後即可 得白蛋白分子拓印高分子微粒。在電子顯微鏡照片中發現分子拓印高分子微粒，如以 EGDMA （Ethylene glycol dimethacrylate）製備的微粒之平均粒徑為 56.7±11.1 nm 比 TEGDMA（Tetra ethylene glycol dimethacrylate）的平均粒徑小，約為 157.9±40.9 nm。測試高分子微粒的再吸附性 時，發現以 EGDMA 或 TEGDMA 為交聯劑時，所得到的分子拓印和非分子拓印高分子微粒，其 吸附白蛋白的量分別為 1.2 及 2.7 倍。 關鍵字：蛋白質拓印高分子、白蛋白、交聯性單體(1) 前言
抗體是免疫系統用來鑒別和抑制外源物質(例如細菌和 病毒)的一種蛋白質複合體，每種抗體只識別特定的目標抗 原[1]。而分子模印技術(Molecular imprinting technique)是依 照 Pauling 與 Campbell 所提出的抗體形成理論，該理論描 述在抗原分子與周圍產生自組性(self-assembly)圍繞的抗體 分子之間的關係，可以視為與抗原分子本身之特異性互補的 結合[2]。分子模版高分子(molecular imprinting polymer, MIP)即 是專為特定的抗原分子所設計出來的辨識系統，其製備過程 包括使用功能性單體、交聯性單體和目標分子以自組性的親 合組裝，在進行聚合反應後形成可辨識形狀及官能基的辨識 孔洞[3, 4]。 白蛋白(Albumin)在人體中可維持血液滲透壓，白蛋白佔 全部血漿蛋白的 50%以上，可保持血液系統內的血漿膠體滲 透壓，調節組織與血管間水的動力平衡，是維持滲透壓的主 要因素。白蛋白能結合陽離子，也能結合陰離子，能輸送許 多性能不同的物質，如脂肪酸、維生素和藥物等，故白蛋白 做為一示範性目標分子。 本研究採用白蛋白為目標分子，以製備出具有高辨識性 的分子拓印高分子粉體。然而先前的研究顯示，交聯劑的選 擇亦為製備高選擇性拓印高分子的重要因素[5]，本研究以 不同的交聯劑，以乳化聚合的方式對白蛋白進行分子拓印， 並利用高分子微粒進行再吸附實驗。
(2) 實驗方法
2.1 實驗藥品與儀器
牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum, minium 98%) 購自Sigma-aldrich。2,2-Azobisisobutyronitile (AIBN)生產於 Tokyo Chemical Industry (Tokyo, Japan)。不同的交聯劑包括 乙 二 醇 二 甲 基丙 烯 酸 酯（ Ethylene glycol dimethacrylate, EGDMA）；聚四乙二醇二甲基丙烯酸酯（Tetra ethylene glycol dimethacrylate, TEGDMA）是訂購於Fluka（Seelze, Germany)；聚乙二醇400二甲基丙烯酸酯（polyethylene glycol 400 dimethacrylate, PEG400DMA)和聚乙二醇600二甲基丙 烯 酸 酯 （ polyethylene glycol 600 dimethacrylate, PEG600 DMA)是從Aldrich Chemical Co.所取得。另外，實驗中所使 用之去離子水(DI water)電阻為18ΩM-cm以上。
2.2 人工抗體粉體製備
3 mg 的白蛋白溶於 60 ml 的去離子水中，配置成 0.1 mg/ml 濃度白蛋白溶液。在含有 0.4 mmol 的 EGDMA、
TEGDMA、PEG400DMA、PEG600DMA 和起始劑 0.82mg 混合液體樣本瓶中，分別加入蛋白質溶液 15 ml，而對照組 為加入等量去離子水。 在紫外光室下照射 3 小時後將樣本移至離心管中，並以 離心機中(KUBOTA 3400)，以 8500rpm 離心 30 分鐘後取 出。去除上層液後，加入 5ml SDS 均勻混合並靜置 30 分鐘， 再置入離心機中以 8500rpm 離心 10 分鐘，重複此步驟兩次 後。再把上層液取出加入 5ml DI water，震盪混合靜置 10 分鐘，放入離心機中以 8500rpm 離心 10 分鐘，此步驟重複 兩次，可將殘留的 SDS 清洗乾淨。再把上層液取出並置入 冷凍乾燥機(PANCHUM FD-5030，-80℃，5.0×10-2Torr)過 夜，以乾燥實驗樣本。
2.3 人工抗體粉體對於蛋白質的吸附性
取 2mg 乾燥之後的人工抗體粉體，放入 20ml 濃度為 0.1mg/ml 的白蛋白水溶液中，均勻攪拌兩小時後，再將溶 液取出 1.5ml 經由薄膜過濾，並以 UV 可見光光譜儀(UV-Vis Spectrometer EPP2000C)進行濃度檢測，並由檢量線計算得 知拓印和非拓印高分子對於白蛋白的再吸附能力。2.4 粒徑分析
利用雷射光與粉體的作用來分析粉體粒徑，主要測量在 濕式量測上最為常見。利用雷射光照射奈米級的粉體，使產 生散射光藉由運用米氏散射理論〈Mie Scattering theory〉討 論散射情形，其散射的雷射光會隨時間改變，再由散射光起 伏的變化，配合愛因斯坦方程式(Stokes-Einstein equation)由 電腦統計出粒徑大小。本實驗使用雷射粒徑分析儀 Particle Size Analyzer 90Plus (Brookheaven Instrument Co., NY, USA.) 量測所合成高分子微粒，過程如下，取 1.5ml 樣本，並將溫 度設定為 25℃，檢測時間設定為 3 分鐘並取 3 次平均值和 誤差值。分別對於高分子微粒在清洗前和清洗後分別進行檢 測。此外，掃描式電子顯微鏡(HITACHI S-2700)被使用來檢 視乾燥過後的高分子微粒表面結構。2.5 表面電性分析
表面電性分析儀是用來量測粉體表面的荷電性，Zeta 電位是吸附層外側的電位，其大小會影響顆粒之間的靜電作 用力，因而影響顆粒之間的凝聚和分散特性以及其他物質在 顆粒表面的吸附作用。本實驗使用表面分析儀為 Zeta Plus (Brookheaven Instrument Co., NY, USA.)實驗中樣本取 1.5ml，將溫度設定為 25℃，並取 5 次平均值和誤差值，清洗 前後樣本測定取用方式與粒徑分析相同。
(3) 結果討論
如圖(一)所示，比較 EGDMA 拓印高分子在製備後的粉 體粒徑和清洗後的粒徑，清洗前粒徑大小約為 1756.4 nm， 而清洗之後粒徑大小降低變為 343.3nm，可能在清洗過程 中 ， 集 結 成 塊 的 粉 體 經 過 攪 拌 分 散 成 更 小 的 分 佈 。 而 PEG400DMA 和 PEG600DMA 的高分子微粒無法以離心方 式將粉體沈澱。 分析表面電性如圖(二)所示可觀察到，以 EGDMA 製備 的拓印高分子粉體清洗前其電位值為-2.36±0.70mv，非拓印 高分子粉體電位值為-16.11±4.61mv。清洗後拓印高分子粉 體 為 -48.05±7.29mv ， 非 拓 印 高 分 子 粉 體 粉 體 電 位 值 為 -49.77±1.91mv，相較之下帶有 Albumin 粉體電位要比無添 加 Albumin 粉體電位偏向正電位的趨勢，其電位差異亦有可 能為清洗前後溶劑不同與粉體顆粒表面所造成。 利用電子顯微鏡檢測高分子微粒之表面形狀及結構，發 現粉體形狀為球型粒子並以網狀結構接連在一起，如圖三所 示 ， 以 EGDMA 之 拓 印 高 分 子 粉 體 圖 (三 )A 其 粒 徑 為 56.7±11.0 nm 。 TEGDMA 之 拓 印 高 分 子 粉 體 約 為 157.9±40.9nm，如圖(三)C。所以利用 EGDMA 製備出的粒 徑比用 TEGDMA 製備出來的粒徑較為小。 如於室溫狀態下進行蛋白質的再吸附實驗，如圖（四） 所示。EGDMA 之拓印高分子粉體其每克的高分子微粒可吸 附 467.9±9.9mg，非拓印高分子粉體則吸附 392.9± 9.6mg， 而以 TEGDMA 為材質的拓印高分子粉體，每克拓印高分子 可吸附 212.0±3.3mg，非拓印高分子僅吸附 79.5±10.4mg。 其他的交連劑則維持相對較低的吸附量，同時拓印高分子微 粒對於目標分子吸附能力比非分子拓印高分子微粒效果佳。(4) 結論
本 研 究 探 討 不 同 交 聯 劑 （ EGDMA 、 TGDMA 、 PEG400EGDMA、PEG600DMA）製備高分子拓印微粒的可 行性，並比較何者較適合拓印白蛋白。由電子顯微鏡的結果 顯示，以 EGDMA 製備出拓印及非拓印高分子的粒徑分別 為 56.7±11.1 及 67.2±10.3 nm，而以 TEGDMA 製備出拓印 及非拓印高分子的粒徑分別為 157.9± 40.9 及 174.6± 34.2 nm，所以清楚顯示 EGDMA 的高分子微粒粒徑比 TEGDMA 較小，亦可發現拓印及非拓印高分子的粒徑差異約在 20％以內。在對白蛋白進行吸附的實驗中，發現 EGDMA 製備 的 拓 印 高 分 子 的 吸 附 量 是 非 拓 印 高 分 子 的 1.2 倍 ， 而 TEGDMA 為主成分的高分子微粒可達 2.7 倍，顯示其模印 成效較高。
誌謝
本研究感謝行政院國科會提供研究經費，計畫編號 (NSC95-2220-E-390-001-)及義守大學材料精密分析實驗室 在儀器使用上的協助。參考文獻
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2003.
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Biosensors and Bioelectronics, vol. 22, pp. 355-363, 2006.
[5] H.-Y. Lin, C.-Y. Hsu, J. L. Thomas, S.-E. Wang, H.-C. Chen, and T.-C. Chou, "The microcontact imprinting of proteins: The effect of cross-linking monomers for lysozyme, ribonuclease A and myoglobin," Biosensors and
Bioelectronics, vol. 22, pp. 534-543, 2006. 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 A v er a g e p a rt ic le si ze (n m )
EGDMA TEGDMA PEG400DMA PEG600DMA Cross-linkers MIP NIP (A) 1000 800 600 400 200 0 A v er a g e p a rt ic le si ze (n m )
EGDMA TEGDMA PEG400DMA PEG600DMA Cross-linkers MIP NIP (B) 圖（一）高分子粉體粒徑分佈在粉體(A)清洗前及(B)清洗 後，其中符號※表示無法收集到粉體。 -60 -40 -20 0 20 Z et a P o te n ti a l (m v )
EGDMA TEGDMA PEG400DMA PEG600DMA Cross-linkers MIP NIP (A) -60 -40 -20 0 20 Z et a P o te n ti a l (m v )
EGDMA TEGDMA PEG400DMA PEG600DMA Cross-linkers MIP NIP (B) 圖（二）高分子粉體表面電性在粉體(A)清洗前及(B)清洗 後，其中符號※表示無法收集到粉體。 ※ ※ ※ ※
圖（三） SEM 表面結構圖，其中(A)拓印及(B)非拓印 EGDMA 高分子微粒，(C)拓印及(D)非拓印 TEGDMA 高分 子微粒。 500 400 300 200 100 0 A b so r p ti o n a m o u n t (m g /g )
EGDMA TEGDMA PEG400DMA PEG600DMA Cross-linkers MIP NIP 圖（四）以不同交聯劑製備之拓印及非拓印高分子微粒的再 吸附能力。 （A） （B） （C） （D） ※ ※
