探討水果表面酵母菌菌株的分布及對抗真菌藥物的感
受性
Species distribution and antifungal drug susceptibility of yeasts isolated
from fruit surface
研 究 生：蔡昇樺 Student：Sheng-Hua Tsai
指導教授：楊昀良 Advisor：Dr. Yun-Liang Yang
羅秀容 Dr. Hsiu-Jung Lo
國 立 交 通 大 學
生物科技學系
碩 士 論 文
A Thesis
Submitted to Institute of Biological Science and Technology
National Chiao Tung University
in partial Fulfillment of the Requirements
for the Degree of Master of Science
in
Biological Science and Technology
August 2013
Hsinchu, Taiwan, Republic of China
國立交通大學
生物科技學系碩士班
碩士論文
探討水果表面酵母菌菌株的分布及對抗真菌藥物的感
受性
Species distribution and antifungal drug susceptibility of yeasts isolated
from fruit surface
研究生：蔡昇樺
學號：0057002
指導教授：楊昀良 博士
羅秀容 博士
I
摘要
為了解酵母菌在環境中的分佈，本論文針對 68 個水果檢體，分
離出 584 株菌株，探討其菌種的分布以及對藥物的感受性。根據每個
水果檢體從每種菌株各挑選出一株代表菌株，一共挑選了 292 株菌株。
其中以 Candida pulcherrima 佔最多數，佔全體的 6.5% (19/292)、其
次依序為 5.5% Candida guilliermondii (16/292)、5.5% Hanseniaspora
uvarum (16/292)、5.1% Candida famata (15/292)、4.4% Hanseniaspora
opuntiae (13/292)，以及其他 59 種菌種 55.5% (162/292)和未知菌種之
菌株 17.5% (51/292)。接著，根據美國臨床實驗室國家標準委員會
(CLSI) 各菌株的最小抑制濃度 (MIC) 判定標準，測試了 233 株菌株
的藥物感受性，其中有 72 株水果菌株對 fluconazole 有抗藥性，佔了
30.9% (72/233)；有 8 株水果菌株對 triadimenol 有抗藥性，佔了 3.4%
(8/233)；有 3 株水果菌株對 penconazole 有抗藥性，佔了 1.3% (3/233)
；有 4 株水果菌株對 amphotericin B 有抗藥性，佔了 1.7% (4/233)。其
中 Pichia kluyveri、Pichia fermentans 以及 Rhodotorula mucilaginosa
菌種的菌株全部對於 fluconazole 皆具抗藥性。而同時對 fluconazole
以及 triadimenol 具有抗藥性的菌株共 6 株，包括 Candida pulcherrima、
Candida railenensis、Rhodotorula mucilaginosa、Rhodotorula glutinis、
Candida tropicalis 各 1 株以及 1 株無法確定菌種的菌株。而同時對
fluconazole 以及 penconazole 具有抗藥性的菌株則有 Rhodosporidium
paludigenum。此外，對 fluconazole、triadimenol 以及 penconazole 皆
II
Abstract
To study yeasts from the environment, a collection of 584 isolates from
68 fruit samples. Then, I determined the distribution of their species and
drug susceptibility. From each of the fruit sample, one isolate from every
species was collected. Totally, there were 292 representative isolates in
this study. Candida pulcherrima were the most frequently isolated species
in this study, accounting for 6.5% of the total isolates (19/292), followed
by 5.5% Candida guilliermondii (16/292), 5.5% Hanseniaspora uvarum
(16/292), 5.1% Candida famata (15/292), 4.4% Hanseniaspora
opuntiae
(13/292). There were 55.5% other species (162/292) consisting
of 57 species, and 17.5% non-determined isolates (51/292). Follwing the
determination of the minimal inhibition concentration (MIC) according to
the breakpoint of Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), I
studied 233 isolates further. Seventy-two (30.9%) of the fruit isolates
were resistant to fluconazole, 8 (3.4%) of them were resistant to
triadimenol, 3 (1.1%) of them were resistant to penconazole, and 4 (1.7%)
of them were resistant to amphotericin B. All Pichia kluyveri、Pichia
fermentans and Rhodotorula mucilaginosa isolates were resistant to
fluconazole. There were 6 isolates cross-resistant to fluconazole and
triadimenol, including C. tropicalis, C. pulcherrima, C. railenensis,
Rhodotorula mucilaginosa, R. glutinis and 1 un-identified isolate. One R.
paludigenum was cross-resistant to fluconazole and penconazole. And 1
un-identified isolate was cross-resistant to fluconazole, triadimenol and
penconazole.
III
致謝
終於，碩班兩年劃下了句點。這兩年體驗到了和過去不一樣的生
活，學習了很多事。首先很謝謝楊昀良老師以及羅秀容老師願意收沒
有實驗經驗的我，以及在這兩年內教導了我實驗以及報告的方法，讓
我比以前進步許多。還有謝謝梁美智老師以及李清福老師來當我的口
試委員，提供我寶貴的意見，讓我的論文內容有所改進。
很謝謝在國衛院帶我實驗的琬立，這兩年真的很謝謝妳的幫忙，
還有謝謝提供我實驗意見的啟宏。謝謝當初收留我的思璇讓我有宿舍
住，很喜歡以前回宿舍和妳聊天的日子。感謝德斌、志兆在各方面提
供了我寶貴的意見以及帶我到處。還有盈之、宜臻、春華、冠中，謝
謝你們參與了我的碩班生活。晚上很晚回宿舍時，感謝憲哥、偉峰的
陪伴，還有假日或是在實驗室待很晚的時候，感謝宛庭陪我聊天。感
染症組很溫馨，真的謝謝大家這兩年來的照顧！
小楊家的各位，雖然我遠在國衛院做實驗，但回去時總可以感受
到你們的溫暖。謝謝小善姐姐給我實驗的建議；很健談的小氣常常聽
我抱怨，哈哈；春榮電腦超強，等我回台南我們再出去玩；游青超喜
歡妳的，這兩年感謝妳好幾次聽我大哭聊心事，明年要一起出國玩！
克威超貼心可是我真的不是苗栗人啦；子喬很愛嗆我，但我知道你也
很關心我的；郁琳是實驗室的開心果，小楊家不能沒有你啊～瑋德超
好欺負的，每次你的反應都超好笑的；生日跟我差三天的琉璃牡羊座
超優秀的你說是不是？還有包子、達達、小徽，歡迎你們加入小楊家，
大家實驗加油喔！
還有謝謝我的十年好友澄澄，適時的督促我論文進度還有聽我吐
苦水。最後謝謝我的家人，謝謝你們一路支持我到現在，也謝謝你們
從來沒讓我苦過，也很開心我終於可以回饋你們了！
IV 目錄 頁數 中文摘要...I 英文摘要...II 致謝...III 目錄...IV 表目錄...VIII 一、 緒論...1 1. 念珠菌及環境的真菌介紹...1 2. 臨床以及環境常使用的抗真菌藥劑物介紹...2 2.1 Fluconazole、Triadimenol 和 Penconazole...2 2.2 Amphoterici B...3 3. 實驗目的...3 二、 材料與方法...5 (一) 材料...5 1. 菌株...5 2. 引子...5 3. 藥品試劑...5 4. 培養基...6 5. 儀器設備...6 (二) 方法與步驟...7 1. 水果菌株的收集，培養和鑑定...7 1.1 水果菌株的收集及初步鑑定...7 1.2 聚合酶連鎖酵素反應...8 1.3 TA cloning...9 1.3.1 DNA 黏合反應...9 1.3.2 E. coli 轉形反應─熱休克法...9 2. 製備藥盤...9 3. 肉湯微稀釋法測定菌株的最小抑制濃度...10 三、 結果
V 1. 水果菌株的菌種分布...13 2. 現有的環境菌株之序列比對...15 2.1 D1/D2 序列比對...15 2.1.1 Candida guilliermondii...15 2.1.2 Candida sorboxylosa...15 2.1.3 Hanseniaspora opuntiae...15 2.1.4 Hanseniaspora thailandica...16 2.1.5 Hanseniaspora uvarum...16 2.1.6 Issatchenkia terricola...16 2.1.7 Lodderomyces elongisporus...16 2.1.8 Sporidiobolus pararoseus...16 2.2 ITS 序列比對...17 2.2.1 Candida famata...17 2.2.2 Candida oleophila...17 2.2.3 Candida quercitrusa...17 2.2.4 Candida railenensis...17 2.2.5 Hanseniaspora opuntiae...18 2.2.6 Hanseniaspora thailandica...18 2.2.7 Lodderomyces elongisporu...18 3. 水果菌株對抗真菌藥劑的感受性試驗結果...18 3.1 水果菌株對 azole 類抗真菌藥劑的感受性...18 3.1.1 在 35℃生長的水果菌株培養 24 小時後對 fluconazole 的感受性...19 3.1.2 在 35℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 fluconazole 的感受性...20
3.1.3 在 35℃生長的水果菌株對 fluconazole 的 Trailing growth 現象...21
3.1.4 在 25℃生長的水果菌株培養 24 小時後對 fluconazole 的感受性...21
3.1.5 在 25℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 fluconazole 的感受性...22
3.1.6 在 25℃生長的水果菌株對 fluconazole 的 Trailing growth 現象...22
3.1.7 在 35℃生長的水果菌株培養 24 小時後對 triadimenol 的感受性...22
3.1.8 在 35℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 triadimenol 的感受性...23
3.1.9 在 35℃生長的水果菌株對 triadimenol 的 Trailing growth 現象...24
VI
3.1.11 在 25℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 triadimenol 的感受性...24
3.1.12 在 25℃生長的水果菌株對 triadimenol 的 Trailing growth 現象...25
3.1.13 在 35℃生長的水果菌株培養 24 小時後對 penconazole 的感受性...25
3.1.14 在 35℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 penconazole 的感受性...26
3.1.15 在 35℃生長的水果菌株對 penconazole 的 Trailing growth 現象...26
3.1.16 在 25℃生長的水果菌株培養 24 小時後對 penconazole 的感受性...27
3.1.17 在 25℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 penconazole 的感受性...27
3.1.18 在 25℃生長的水果菌株對 penconazole 的 Trailing growth 現象...28
3.2 水果菌株對 Amphotericin B (polyene 類抗真菌藥劑) 的感受性...28
3.2.1 在 35℃生長的水果菌株培養 24 小時後對 Amphotericin B 的感受性...28
3.2.2 在 35℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 Amphotericin B 的感受性...29
3.2.3 在 35℃生長的水果菌株對 Amphotericin B 的感 Trailing growth 現象...29
3.2.4 在 25℃生長的水果菌株培養 24 小時後對 Amphotericin B 的感受性...29 3.2.5 在 25℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 Amphotericin B 的感受性...30 3.3 需生長 72 小時才可判斷其 MIC 數值之菌株...30 3.3.1 在 35℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 fluconazole 的感受性...30 3.3.2 在 35℃生長的水果菌株培養 72 小時後對 fluconazole 的感受性...31 3.3.3 在 25℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 fluconazole 的感受性...31 3.3.4 在 25℃生長的水果菌株培養 72 小時後對 fluconazole 的感受性...31 3.3.5 在 35℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 triadimenol 的感受性...32 3.3.6 在 35℃生長的水果菌株培養 72 小時後對 triadimenol 的感受性...32 3.3.7 在 35℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 triadimenol 的感受性...33 3.3.8 在 35℃生長的水果菌株培養 72 小時後對 triadimenol 的感受性...33 3.3.9 在 35℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 penconazole 的感受性...34 3.3.10 在 35℃生長的水果菌株培養 72 小時後對 penconazole 的感受性...34
3.3.11 在 35℃生長的水果菌株對 penconazole 的 Trailing growth 現象...35
3.3.12 在 25℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 penconazole 的感受性...35
3.3.13 在 25℃生長的水果菌株培養 72 小時後對 penconazole 的感受性...35
3.3.14 在 35℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 Amphotericin B 的感受性...36
VII 3.3.16 在 25℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 Amphotericin B 的感受性...36 3.3.17 在 25℃生長的水果菌株培養 72 小時後對 Amphotericin B 的感受性...37 3.4 在 35℃生長對 fluconazole 有抗藥性的水果菌株之來源...37 3.5 在 35℃生長對 triadimenol 有抗藥性的水果菌株之來源...38 3.6 在 35℃生長對 penconazole 有抗藥性的水果菌株之來源...38 3.7 在 35℃生長對 Amphotericin B 有抗藥性的水果菌株之來源...38 3.8 在 25℃生長對 fluconazole 有抗藥性的水果菌株之來源...38 3.9 在 25℃生長對 triadimenol 有抗藥性的水果菌株之來源...39 3.10 在 25℃生長對 penconazole 有抗藥性的水果菌株之來源...39 3.11 共同抗藥性 (Cross-resistance)...39 四、討論...40 五、結論...44 六、未來展望...44 參考文獻...122
VIII 表目錄 頁數 表一、水果菌株的鑑定方法、觀察其致病性以及 MIC 的生長條件...45 表二、各種水果的代表菌株及其數量...49 表三、未知菌種之菌株序列比對後其菌屬分類...51 表四、各水果的菌種分佈以及其來源...52
表五、Candida guilliermondii 的 D1/D2 做序列比對後，與 NCBI 符合的序列結果 整理...61
表六、Candida sorboxylosa 的 D1/D2 做序列比對後，與 NCBI 符合的序列結果整 理...61
表七、Hanseniaspora opuntiae 的 D1/D2 序列與 NCBI database 做比對後，點突變 的 base 整理...61
表八、Hanseniaspora thailandica 的 D1/D2 做序列比對後，與 NCBI 符合的序列 結果整理...61
表九、Hanseniaspora uvarum 的 D1/D2 做序列比對後，與 NCBI 符合的序列結果 整理...62
表十、Issatchenkia terricola 的 D1/D2 做序列比對後，與 NCBI 符合的序列結果 整理...62
表十一、Lodderomyces elongisporus 的 D1/D2 序列與 NCBI database 做比對後， 點突變的 base 整理...62
表十二、Candida famata 的 ITS 做序列比對後，與 NCBI 符合的序列結果整理...63
表十三、Candida railenensis 的 ITS 序列與 NCBI database 做比對後，點突變的 base 整理...63
表十四、Hanseniaspora opuntiae 的 ITS 序列與 NCBI database 做比對後，點突變 的 base 整理...63
表十五、Hanseniaspora thailandica 的 ITS 做序列比對後，與 NCBI 符合的序列 結果整理...63
表十六、在 35℃生長的水果菌株培養 24 小時後對 fluconazole 的感受性...64
表十七、未知 breakpoints 菌種之水果菌株在 35℃培養 24 小時後對 fluconazole 的感受性...66
IX
表十八、在 35℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 fluconazole 的感受性...67
表十九、在 35℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 fluconazole 的感受性...69
表二十、在 35℃生長的水果菌株對 fluconazole 的 Trailing growth 現象...70
表二十一、在 25℃生長的水果菌株培養 24 小時後對 fluconazole 的感受性...70
表二十二、在 25℃生長的水果菌株培養 24 小時後對 fluconazole 的感受性...71
表二十三、在 25℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 fluconazole 的感受性...72
表二十四、在 25℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 fluconazole 的感受性...73
表二十五、在 25℃生長的水果菌株對 fluconazole 的 Trailing growth 現象...73
表二十六、在 35℃生長的水果菌株培養 24 小時後對 triadimenol 的感受性...74
表二十七、未知 breakpoints 菌種之水果菌株在 35℃培養 24 小時後對 triadimenol 的感受性...76
表二十八、在 35℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 triadimenol 的感受性...77
表二十九、在 35℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 triadimenol 的感受性...79
表三十、在 35℃生長的水果菌株對 triadimenol 的 Trailing growth 現象...80
表三十一、在 25℃生長的水果菌株培養 24 小時後對 triadimenol 的感受性...81
表三十二、在 25℃生長的水果菌株培養 24 小時後對 triadimenol 的感受性...82
表三十三、在 25℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 triadimenol 的感受性...82
表三十四、在 25℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 triadimenol 的感受性...83
表三十五、在 25℃生長的水果菌株對 triadimenol 的 Trailing growth 現象...83
表三十六、在 35℃生長的水果菌株培養 24 小時後對 penconazole 的感受性...84
表三十七、未知 breakpoints 菌種之水果菌株在 35℃培養 24 小時後對 penconazole 的感受性...86
表三十八、在 35℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 penconazole 的感受性...87
表三十九、在 35℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 penconazole 的感受性...89
表四十、在 35℃生長的水果菌株對 penconazole 的 Trailing growth 現象…...90
表四十一、在 25℃生長的水果菌株培養 24 小時後對 penconazole 的感受性...91
表四十二、在 25℃生長的水果菌株培養 24 小時後對 penconazole 的感受性...92
表四十三、在 25℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 penconazole 的感受性...92
表四十四、在 25℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 penconazole 的感受性...93
X 表四十六、在 35℃生長的水果菌株培養 24 小時後對 Amphotericin B 的感受性....94 表四十七、未知 breakpoints 菌種之水果菌株在 35℃培養 24 小時後對 Amphotericin B 的感受性...96 表四十八、在 35℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 Amphotericin B 的感受性....97 表四十九、在 35℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 Amphotericin B 的感受性....99
表五十、在 35℃生長的水果菌株對 Amphotericin B 的感 Trailing growth 現象....100
表五十一、在 25℃生長的水果菌株培養 24 小時後對 Amphotericin B 的感受性..100 表五十二、在 25℃生長的水果菌株培養 24 小時後對 Amphotericin B 的感受性..101 表五十三、在 25℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 Amphotericin B 的感受性..102 表五十四、在 25℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 Amphotericin B 的感受性..103 表五十五、在 35℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 fluconazole 的感受性...104 表五十六、未知 breakpoints 菌種之水果菌株在 35℃培養 48 小時後對 fluconazole 的感受性...104 表五十七、在 35℃生長的水果菌株培養 72 小時後對 fluconazole 的感受性...105 表五十八、在 35℃生長的水果菌株培養 72 小時後對 fluconazole 的感受性...105 表五十九、在 25℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 fluconazole 的感受性...106 表六十、在 25℃生長的水果菌株培養 72 小時後對 fluconazole 的感受性…...106 表六十一、在 35℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 triadimenol 的感受性...107 表六十二、未知 breakpoints 菌種之水果菌株在 35℃培養 48 小時後對 triadimenol 的感受性...107 表六十三、在 35℃生長的水果菌株培養 72 小時後對 triadimenol 的感受性...108 表六十四、在 35℃生長的水果菌株培養 72 小時後對 triadimenol 的感受性...108 表六十五、在 25℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 triadimenol 的感受性...109 表六十六、在 25℃生長的水果菌株培養 72 小時後對 triadimenol 的感受性...109 表六十七、在 35℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 penconazole 的感受性...110 表六十八、未知 breakpoints 菌種之水果菌株在 35℃培養 48 小時後對 penconazole 的感受性...110 表六十九、在 35℃生長的水果菌株培養 72 小時後對 penconazole 的感受性...111 表七十、在 35℃生長的水果菌株培養 72 小時後對 penconazole 的感受性…...111 表七十一、在 25℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 penconazole 的感受性...112
XI 表七十二、在 25℃生長的水果菌株培養 72 小時後對 penconazole 的感受性...112 表七十三、在 35℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 Amphotericin B 的感受性..113 表七十四、未知 breakpoints 菌種之水果菌株在 35℃培養 48 小時後對 Amphotericin B 的感受性...113 表七十五、在 35℃生長的水果菌株培養 72 小時後對 Amphotericin B 的感受性..114 表七十六、在 35℃生長的水果菌株培養 72 小時後對 Amphotericin B 的感受性..114 表七十七、在 25℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 Amphotericin B 的感受性..115 表七十八、在 25℃生長的水果菌株培養 72 小時後對 Amphotericin B 的感受性..115 表七十九、在 35℃生長對 fluconazole 有抗藥性的水果菌株之來源...116 表八十、在 35℃生長對 triadimenol 有抗藥性的水果菌株之來源...119 表八十一、在 35℃生長對 penconazole 有抗藥性的水果菌株之來源...119 表八十二、在 35℃生長對 Amphotericin B 有抗藥性的水果菌株之來源...119 表八十三、在 25℃生長對 fluconazole 有抗藥性的水果菌株之來源...120 表八十四、在 25℃生長對 triadimenol 有抗藥性的水果菌株之來源...120 表八十五、在 25℃生長對 penconazole 有抗藥性的水果菌株之來源...121
1
一、緒論
1. 念珠菌及環境的真菌介紹
念珠菌 (Candida species) 的感染在過去二十年內有日益嚴重的
現象。念珠菌是人體常見的共生菌種，屬於伺機性病原。在健康人體
中，其免疫系統可防止念珠菌的侵犯，而當宿主身體免疫力下降時，
如 AIDS、器官移植、服用抗生素、癌症化療時等，會使得念珠菌有
機會變成致病原。在美國，念珠菌感染是第四常見的致病菌 (Lockhart
et al., 2009)。一般常見的感染部位有皮膚、口腔、腸胃道、婦女生殖
道等，若嚴重將會造成全身的系統性感染 (Calderone and Forzi, 2001;
Yang, 2003; Yang et al., 2004; Yang et al., 2005)。
臨床上常見的念珠菌感染主要為 Candida albicans，但近來也發
現 non-albicans 菌種的感染有逐漸增加的趨勢，其中 Candida tropicalis
為亞洲地區較常見的 non-albicans 菌種。而目前在臨床上分離出的 C.
tropicalis，其對於常用的抗真菌藥物 fluconazole 具有抗藥性的菌株有
日漸增加的現象，這對於臨床上治療真菌感染是一項很大的挑戰。另
外，在土壤當中亦分離出同樣對 fluconazole 具有感受性較低的 C.
tropicalis。而經過 MLST (Multi Locus Sequence Typing) 實驗後，發現
來自臨床以及土壤的 C. tropicalis，其在基因上有高度的相似性 (Yang
et al., 2004; Yang et. al, 2012)。
而在其他環境的菌種方面，過去有研究指出，在廣泛使用農業用
的 azole 類藥物下，使得這些環境菌株對於農業用 azole 類藥物的最
小抑制濃度數值提高，且比較值得注意的是，這些菌株對於臨床使用
的 azole 類藥物亦具有抗藥性 (Müller et. al, 2007 )。而部分常見的環
境菌種，例如：Candida guilliermondii、Candida famata、Candida
2
致病性。所以了解環境菌株的抗藥性現況以及其與臨床用藥的相關性，
是一個很重要的議題。
2. 臨床以及環境常使用的抗真菌藥劑物介紹
由於念珠菌與人類皆屬於真核生物，因此在使用抗真菌藥物時也
經常造成人體的副作用。且這些藥物一般是具有抑菌功能而非殺菌，
所以在藥物的使用下常常使得抗藥性菌株佔有優勢。因此了解藥物在
細胞中的標的 (target)，以及其抗藥機制，是一項很重要的課題。在
選定實驗的藥物當中，本研究挑選了臨床上常使用的 fluconazole 以及
amphotericin B 當臨床藥物的代表。而在農業用的抗真菌藥物方面，
目前以作用機制為抑制麥角固醇合成的藥物佔最大宗。此類藥物包括
piperazines 類 (例：triforine)、pyridines 類 (例：pyrifenox)、pyrimidines
類 (例：nuarimol、fenarimol)、imidazoles 類 (例：imazalil、pefurazoate、
prochloraz、triflumizole)以及 triazoles 類 (例：triadimefon、triadimenol
等共 19 種藥物)等共五大類 (行政院農業委員會動植物防疫檢疫局)。
本研究則挑選了比較常見的農業抗真菌藥物 triadimenol 以及相同分
類裡的另一種藥物 penconazole 當控制組來進行實驗 (Müller et. al,
2007)。
2.1 Fluconazole、Triadimenol 和 Penconazole
這三種藥物皆屬於 triazole 類抗真菌藥物，fluconazole 廣泛的運
用在臨床治療念珠菌感染上，而 triadimenol 以及 penconazole 則為農
業上常使用的抗真菌藥物。Triazole 類藥物主要作用在 lanosterol 14
α-dimethylase 上，此酵素為合成細胞膜麥角固醇 (ergosterol) 的途徑
上的一份子，屬於 cytochrome P450 的酵素。此類藥物作用後，使得
lanosterol 14α-dimethylase 無法生成最終產物 ergosterol，當 ergosterol
消耗殆盡且累積了 lanosterol 以及有毒性的 14-methyl-3,6-diol，將造
3
成細胞膜的壓力增加 (Cowen and Steinbach, 2008; Carrillo-Muñoz et
al., 2006)。目前已知其抗藥機制產生途徑主要有以下幾種方式，例
如：
(1) 幫浦蛋白 major facilitator superfamily 或 ATP-binding cassette (ABC)
transporter 的過度表現，將攝入的藥物不斷排出細胞外。以 Candida
albicans 為例，major facilitator superfamily 為 MDR1 基因轉譯而來，
此 pump 為 fluconazole 專用，而 ABC transporter 為 CDR 1 及 CDR
2 兩種基因轉譯而來，此 pump 則為其他 triazole 類藥物所使用。
(2) 合成 lanosterol 14α-dimethylase 的 ERG11p 發生突變或過度表現，
其會減少 target 與藥物的結合力。
(3) ERG3 基因的突變，造成無法在細胞內累積具毒性的 14α
-methyl-3,6-diol，進而生成終產物 ergosterol。 (Kontoyiannis and
Lewis, 2002;
Lee et al., 2003; Carrillo-Muñoz et al., 2006;
Cowen and
Steinbach, 2008
;Klepser, 2006;
Cowen, 2008)。
2.2 Amphotericin B
此藥物屬於 polyene 類抗真菌藥物之一。此類藥物主要作用在真
菌細胞膜的麥角固醇(ergosterol)上，ergosterol 的功能為維持細胞完整
性與流動性，當 amphotericin B 與 ergosterol 結合時，會形成管狀通
道使得細胞內容物流失及內外離子不平衡而使細胞死亡。但其對人體
的副作用也很大，例如會造成腎臟功能的損害等 (Cowen and
Steinbach, 2008; Carrillo-Muñoz et al., 2006)。
3. 實驗目的：
由於在之前的研究中發現，臨床菌株與土壤菌株在基因上有相似
性，為了解環境菌株與人體分離出菌株的相關性。本研究利用較容易
分離菌株也容易取得的水果來進行實驗，觀察在水果表面是否存在對
於人體可能有致病性的菌株，以及其對於農業以及臨床上常使用的藥
4
物之感受性。而實驗的方法為：
(1) 收集水果表面的菌株，鑑定其物種，並觀察各菌種的分布情況。
(2) 比對部分常見的環境菌株之 ITS 或 D1/D2 序列，以了解其序列在
相同物種當中是否具有差異，並建立資料庫。
(3) 以肉湯微稀釋法 (broth microdilution) 測定環境菌株對於臨床以
及農業上常使用的抗真菌藥物的抗藥性情形，並比較環境菌株在
這兩類藥物當中的抗藥性差異。
5
二、材料與方法
(一) 材料：
1. 菌株 (strains)
Escherichia coli：DH5α
2. 引子 (primers)
Name
Sequence (5’→3’)
position
HJL 735 (ITS1)
TCCGTAGGTGAACCTGCGG
18S
HJL 775 (ITS4)
TCCTCCGCTTATTGATATGC
26S
HJL 1178 (NL1) GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG
26S
HJL 1179 (NL4) GGTCCGTGTTTCAAGACGG
26S
3. 藥品試劑 (chemicals and reagents)
Bio-RAD
50 x TAE (Cat. No, 161-0773)
Difco Laboratories
CHROMagar Candida (Cat. No. 254093), LB agar (Cat. No. 244520),
LB broth (Cat. No. 244620), Sabouraud dextrose agar (SDA) (Cat.
No. 210950), 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) (Cat.
No. BCBD 0884V)
EPICEMTRE
MasterPure™ Yeast DNA Purification Kit (Cat. No. MPT80200)
Fermentas
DreamTaq™ DNA polymerase (5 unit/μL, Cat. No. EP0701)
Gibco BRL
RPMI 1640 pH7.0 (Cat, No, 31800022)
Invitrogen
6
12308-011)
Merck
Dimethyl sulfoxide (DMSO) (Cat. No. S26740), Ethanol (Cat. No.
K33534874), Ethidium bromide (Cat. No. K27928515), Isopropanol
(Cat. No. K32632434), Sodium carbonate (NaHCO3) (Cat. No.
A375692), Sodium hydroxide (NaOH) (Cat. No. B886298), Sodium
chloride (NaCl) (Cat. No. K29779304)
Promega
T4 DNA ligase (Cat. No. M-1801)
Sigma Chemical Co.
Glassbeads (425~600 μm) (Cat. No. G9268-500G)
USB
Glycerol (Cat. No. US16374)
4. 培養基 (medium)
CHROMagar
1% peptone, 2% glucose, 1.5% agar, 0.5% Chloramphenicol
DYT
1.6 g tryptone, 1 g yeast extract, 0.5 g NaCl 加無菌二次水至體積
100 mL
LB broth
1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl
LB/ ampicillin agar
1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 100 μg/mL ampicillin
SDA
5. 儀器設備
試管震盪器 Vortex-2 gene (Scientific Industry)
程式溫度控制儀 PTC-200 (MJ Research)
7
電子天平 AT261 DeltaRange (METTLER TOLEDO)
單槽乾浴器 (Violet Bio Sciences, Inc.)
恆溫水浴器 (CHERNG HUEI Co.)
傳統比色計
迴轉式震盪培養箱 (TKS)
加熱攪拌器 S101 (FIRSTEK SCIENTIFIC)
酸鹼值檢測計 (BECKMAN)
微量高速離心機 DENVILLE 260D (DENVILLE SCIENTIFIC
INC.)
4℃三門冷藏櫃 (MINI KINGKON)
-30℃直立式雙門冷凍櫃 (WHITE-WESTINGHOUSE)
-80℃超低溫冷凍櫃 (FIRSTEK SCIENTIFIC)
(二) 方法與步驟：
1. 水果菌株的收集，培養和鑑定
1.1 水果菌株的收集及初步鑑定
由內湖 A 店、汐止 B 店、頭份 C 店以及頭份 D 店所購買的水果，
一共有柳丁、椪柑、新世紀梨、蜜梨、西洋梨、哈密瓜、橘子、香蕉、
蓮霧、楊桃、牛番茄、筆柿、番茄、蜜世界、小玉西瓜、狀元瓜、木
瓜、美濃瓜、進口新高接梨、金煌芒果、愛文芒果、土芒果、茂谷柑、
胭脂李、棗子、甜蜜桃、珍珠芭樂、鳳梨釋迦、牛番茄、聖女番茄、
枇杷、巨峰葡萄、無子檸檬、聯珠番茄、智利紅地球葡萄、智利青無
子葡萄、台灣甜桃、金桔、南非紅無子葡萄、黃金聖女番茄、檸檬、
西瓜、椰子、紐西蘭黃金奇異果、漬薑李、醃橄欖、台灣蜜柑等 47
種水果共 68 個檢體。將水果置於 10 L 裝無菌塑膠袋內，倒入 200 mL
清洗液 (1% peptone, 0.5% NaCl)，用手在袋外輕輕搓揉，再將液體倒
8
入消毒過的 50 mL 離心管內離心，移除上清液，再以 0.2 mL YPD broth
將在離心管底部可能有的微生物懸浮後，將其塗佈到 CHROMagar 培
養基 48 小時後，從每個培養基中的各種顏色各挑選數株單一菌株，
存放在含 50%甘油的冷凍小管於-80℃冰箱以供日後實驗用。
CHROMagr 是一種選擇性培養基，其中的 chloramphenicol 成分可抑
制大部分細菌的生長；此外，其內含可產色的受質，可利用不同的顏
色篩選出菌落。常用於檢測混合的酵母菌培養鑑定 (Odds and
Bernaerts, 1994)。
挑選出的單一菌落再以 VITEK2 酵母菌鑑定卡進行部分菌株的
鑑定，菌種鑑定結果大於百分之八十五以上則代表為可信賴的，若小
於百分之八十五，則表示菌種為鑑定率低 (low discrimination) 或不
可鑑定 (unidentified)。之後再把未鑑定出菌種的菌株，以 ITS 引子或
D1/D2 引子對黴菌的核醣體 DNA (ribosomal DNA) 進行 PCR，再將
片段進行序列分析鑑定菌種。
1.2 聚合酶連鎖酵素反應 (Polymerase chain reaction, PCR)
從水果分離出的檢體依 MastePure
TMYeast DNA Purification Kit
中的說明書純化 DNA，再利用引子 ITS1 和 ITS4 或 NL1 和 NL4 夾出
真菌的 RNA 核醣體 internal transcribed spacer (ITS) 和 D1/D2 區域等
所想要的片段進行放大。在鑑定物種方面，ITS 主要是鑑定具致病性
的黴菌菌種，而 D1/D2 則可以鑑定所有的黴菌，包括了非致病性的
菌種，以上兩種方式皆適用於鑑定不同菌種間的差異 (Leaw et al,
2006)。總體積 50 μL 的反應物當中，含有 5 μL 的 10X DreamTaqTM
buffer、1.25 unit DreamTaq
TMDNA polymerase (5 unit/μL, Fermentas,
Cat. No. EP0701)、4 μL 的 2.5 mM dNTP、50 μM 的 Forward primer
和 Reverse primer 各 2.5 μL，0.1~1 μg 的 genomic DNA 模板，最後補
9
無菌二次水到 50 μL。反應步驟為：94℃ 3 分鐘→94℃ 30 秒、60℃ 30
秒、72℃ 30 秒 (重複此步驟 35 次)→72℃ 3 分鐘→20℃靜置。接著
DNA 純化的步驟依照 FavorPrep
TMPCR Purification Mini Kit 說明書使
用，將序列送至 NCBI 做比對。
1.3 TA cloning
部分菌株用 ITS 以及 D1/D2 兩組引子定序出的結果為混亂的，
推論可能在原本想夾出的 PCR 產物之外，亦有類似的區域片段會被
這兩組引子夾出。所以將 PCR 產物植入 plasmid 中，以得到較單純的
片段。步驟如下：
1.3.1 DNA 黏合反應 (DNA Ligation)
依照 Promega 的 pGEM-T Easy Vector System (Cat. No. A1360)的
說明書，將 PCR 產物進行實驗，在 4℃環境下進行黏合反應至隔天。
1.3.2 E. coli 轉形反應 (transformation)─熱休克法 (heat-shock)
將 10 μL DNA 黏合反應的產物加入 50 μL 的 DH5α (competent
cell)，在冰上靜置 20 分鐘後，移到 42℃水浴槽熱休克 2 分鐘，快速
移到冰上 5 分鐘，再加入 800 mL DYT 以 37℃震盪培養 1 小時。之後
將菌液以玻璃珠均勻塗到含有 ampicillin 以及 X-gal 的 LB 培養基上，
放到 37℃培養箱至隔天觀察結果。
將培養隔天的培養基，挑選單一個白色菌落，加到 3 mL 含有 100
μg/mL ampicillin 的 LB broth 中，再培養到 37℃至隔天，再依據
FavorPrep
TMPlasmid Extraction Mini Kit 說明書萃取質體後送定序。
2. 製備藥盤
將實驗所需的藥物 amphotericin B、fluconazole、triadimenol、
penconazole 溶於有機溶劑 dimethy sulfoxide (DMSO) 後、用 RPMI
1640 broth 配成所需的最高濃度兩倍濃度：amphotericin B (32 mg/L)、
10
fluconazole (128 mg/L)、triadimenol (128 mg/L)、penconazole (128
mg/L)，每個藥物在進行兩倍的序列稀釋，最後總共十個濃度。藥物
的濃度範圍分別為 amphotericin B (0.0625~32 mg/L)、fluconazole
(0.25~128 mg/L)、triadimenol (0.25~128 mg/L)、penconazole (0.25~128
mg/L)，分別於 96 孔中的第一到第十個孔盤間各加入 100 μL 的藥物，
最後第十一個孔盤加入 100 μL RPMI 1640 (此為控制組)，第十二個孔
盤加入 200 μL RPMI 1640 (此為背景值)。
3. 肉湯微稀釋法 (broth microdilution) 測定菌株的最小抑制濃度
根據美國臨床實驗室國家標準委員會 (Clinical and Laboratory
Standards Institute) 建議的 M27-A3 版本進行實驗 (CLSI, 2008)。實驗
前須先配置 RPMI 1640 broth、已滅菌的 0.85% NaCl，放置於 1 L
的血清瓶中，並裝上分注器至於 4℃冰箱備用，4 種藥物濃度梯度之
抗藥性實驗藥盤，置於-80℃冰箱備用。
第一天
1. 從-80℃取出實驗所需的編號菌株以及標準菌株 YLO 6 (ATCC
®6258)、YLO 7 (ATCC
®22019)、YLO 12 (ATCC
®90028)，用竹棒
取少量菌液，劃在 SDA 培養基上，並放在 30℃培養箱培養 18~24
小時。
2. 取出所需數量的 12x75 mm 玻璃管，並在管壁標示菌株編號放在
鐵架上，以鋁箔紙覆蓋，利用高壓滅菌鍋滅菌，之後取出備用。
3. 取出無菌離心管，標示菌株編號後，置於鐵架上備用。
第二天
1. 從-80℃冰箱中取出實驗所需的 2 倍濃度梯度之抗藥性試驗藥盤數
量，放在室溫下回溫備用並在藥盤上標示待測菌株之編號。
2. 取出在 30℃培養箱培養 18~24 小時的 SDA 培養基，以竹棒挖取適
11
量的菌落，加到含有 2 mL 0.85% NaCl 的玻璃管中，充分混勻後在
530 nm 波長下用比色計測其波長，將菌液以 0.85% NaCl 調整到濃
度約 0.5 McFarland，此時菌液濃度大約是 1~5 x 10
6cells/mL。
3. 將菌液震盪均勻後取 0.2 mL 加在 1.8 mL 0.85% NaCl 完成 10 倍稀
釋，再從上述菌液中取 0.4 mL 加在 3.6 mL 0.85% NaCl 完成 10 倍
稀釋，最後再把上述菌液取 0.8 mL 加到 7.2 mL 到 RPMI 1640 中
完成 10 倍稀釋，總共稀釋 1000 倍，加稀釋好的 RPMI 1640 broth
菌液的離心管混和均勻後，倒在無菌藥品槽內，利用 12 爪 pipet
裝上 11 隻 tips，吸取 100 μL 菌液，同時加入 96 孔盤 A 列 1~11
行的兩倍藥物濃度序列稀釋藥盤中，第 12 行不加菌液。此時藥盤
濃度稀釋一倍，更換 tips，依序將菌液分別放入 B~H 列中，而菌
液稀釋倍率為 2000 倍，最終細胞數量約為 0.5 ~2.5 x 10
3cells/mL。
4. 添加完畢後，蓋上抗藥性試驗培養盤蓋子，放到 35℃ (或 25℃) 培
養箱中分別培養 24 和 48 小時後測其吸光值，而如果 48 小時後未
加藥的吸光值未達 0.2，則需培養 72 小時再測結果。
第三天
1. 開啟 iMark Microplate Reader 後並啟動電腦，在桌面上點選
Microplate Manager 程式捷徑，開啟視窗後，設定讀取的 OD 值為
595。
2. 將藥盤從 35℃ (或 25℃) 培養箱取出，置於室溫約 10~20 分鐘放
涼。
3. 放涼後的藥盤置於具有 96 孔盤專用承載盤的震盪器上，調整震盪
速度於 2~3 間，震盪時間約為 1 分鐘。震盪均勻後，將培養盤蓋
子打開至於 iMark Microplate Reader 的讀取槽內，接著選點 read。
讀取完畢後將 OD 數值匯出到 Excel 並存檔。
12
4. 將培養盤取出，並將培養盤蓋子蓋上，重複操作步驟 3 直到全部
培養盤讀取完畢。再把培養盤放回 35℃ (或 25℃) 培養箱繼續培
養 24hrs。
第四天
讀取 48 小時 (部分菌株則需測 72 小時) 培養盤黴菌生長濃度，
重複第三天的操作方式，利用 Excel 中 If 函數功能
[if(value>5,”R”,mic conc.)]，在 AmB 若百分比數值>5 則顯示 R，
若百分比數值<5 則顯示該孔盤的藥物濃度；
[if(value<=50,”R”,mic conc.)]，在 Flu、Tri、Pen 若比分比數值>50
則顯示 R，若百分比數值<=50 則顯示該孔盤的藥物濃度。讀取
MIC 數值，並將結果輸入資料庫內。
13
三、結果
1. 水果菌株的菌種分布
從超級市場購買的 68 種水果當中，一共蒐集了 584 株菌株 (由
羅秀容博士完成)，再以 VITEK 2 (由實驗室同仁朱琬立完成) 和序列
分析做菌種的鑑定，結果一共成功鑑定了 479 株菌株。如表一，在所
有確定物種的菌株中，一共有 297 株菌株使用 VITEK2 來鑑定物種，
其中成功鑑定出菌種的菌株比例約 50.8% (151/297)。由於本研究的菌
株使用 VITEK2 成功鑑定出物種的比例遠低於臨床菌株，所以其餘
433 株菌株則利用 D1/D2 或 ITS 引子來鑑定物種。其中以 D1/D2 引
子對序列鑑定菌種的菌株一共有 165 株，ITS 引子對序列鑑定菌種的
菌株則有 163 株，而利用目前的物種鑑定方式皆無法鑑定菌種的菌株
一共有 105 株。
而為了觀察菌株在各種水果的分布，本研究在每個水果檢體各挑
每種菌一株做代表，總共得到了 292 株代表菌株 (表二)，分別是：
19 株 Candida pulcherrima，16 株 Candida guilliermondii，16 株
Hanseniaspora uvarum，15 株 Candida famata，13 株 Hanseniaspora
opuntiae，11 株 Pichia kluyveri，9 株 Pichia fermentans，8 株
Hanseniaspora thailandica，7 株 Candida quercitrusa，7 株
Sporidiobolus pararoseus，6 株 Lodderomyces elongisporus，5 株
Candida catenulata，5 株 Candida fermentati，5 株 Candida intermedia，
5 株 Candida oleophila，5 株 Candida sphaerica，4 株 Aureobasidium
pullulans，4 株 Candida railenensis，4 株 Candida sorboxylosa，4 株
Kodamaea ohmeri，4 株 Rhodotorula mucilaginosa，4 株 Stephanoascus
ciferrii，3 株 Candida krusei，3 株 Candida parapsilosis，3 株 Candida
14
tropicalis，3 株 Rhodosporidium paludigenum，3 株 Rhodotorula glutinis，
2 株 Candida conglobata，2 株 Candida haemulonii，2 株 Candida
inconspicua，2 株 Candida lipolytica，2 株 Candida lusitaniae，2 株
Candida orthopsilosis，2 株 Candida valida，2 株 Candida zeylanoides，
2 株 Cryptococcus albidus，2 株 Cryptococcus flavescens，2 株
Cryptococcus rajasthanensis，2 株 Issatchenkia occidentalis，2 株
Issatchenkia terricola，2 株 Pichia aff. Fermentans Y153，2 株
Trichosporon asahii，1 株 Candida akabanensis，1 株 Candida azyma，
1 株 Candida freyschussii，1 株 Candida insectorum，1 株 Candida
magnoliae，1 株 Candida norvegensis，1 株 Candida pelliculosa，1 株
Candida rugosa，1 株 Candida stellimalicola，1 株 Candida xylopsoci，
1 株 Hanseniaspora guilliermondii，1 株 Pichia pijperi，1 株
Pseudozyma fusiformata，1 株 Pseudozyma hubeiensis，1 株
Saccharomyces bulderi，1 株 Saccharomyces cerevisiae，1 株
Sporobolomyces poonsookiae，1 株 Torulaspora delbrueckii，1 株
Trichosporon jirovecii，1 株 Zygosaccharomyces bailii 以及無法鑑定出
菌種的 51 株代表菌株 (表三)。
如前所述，在 584 株菌中，無法鑑定出物種的一共有 105 株菌株，
其中有 30 株菌株雖然鑑定出單一結果，但由於序列與 NCBI 資料庫
作比對時，其百分比低於 99.5%，所以仍列為無法鑑定。另外，一共
有 73 株菌株，在用 ITS 以及 D1/D2 兩種鑑定方法鑑定物種後，皆有
兩種以上的結果。此外，比較值得注意的是，No. 372、373 利用 ITS1、
ITS4 以及 NL1、NL4 兩組引子皆無法夾出所需的片段，其以目前本
研究所使用的技術皆無法確定物種。而有 8 株菌株，用兩組引子皆會
夾出各兩種序列，其亦無法判定物種。
15
在無法鑑定出物種的菌株在挑選代表菌株時，本研究會以其序列
的相似度來做挑選，結果一共篩選出 51 株代表菌株。
2. 現有的環境菌株之序列比對
將現有的定序結果利用 SeqMan 軟體以及 NCBI 上的 database 做
序列比對，以了解相同物種間 base 之差異。而在判斷序列上 base 的
差異位置時，本研究是以使用的 primer 最後一個 base，當作為-1，而
下一個 base 則為+1 來判斷起始位置。
2.1 D1/D2 序列比對
2.1.1 Candida guilliermondii
此菌種在本研究中一共收集了 20 個 D1/D2 序列，片段大小約在
500~600 bps 之間。在和 NCBI 的序列做比較後，發現這些菌株符合
兩組 database 的序列。其在第 66 個 base 上，有 A/G 兩種可能，在第
182 個 base 上，有 C/T 兩種可能，而在第 476 個 base 上，則有 G/A
兩種可能 (表五)。值得注意的是，No.462-2、468 兩株菌株在第 425
個 base 上，發生 C 變成 T 的點突變，以及 No.469 的菌株，在第 478
個 base 上，則發生由 T 變成 C 的點突變。
2.1.2 Candida sorboxylosa
此菌種在本研究中一共收集了 9 個定序結果，片段大小約在 310
bps 左右。在和 NCBI 的序列做比較後，發現這些菌株符合兩組
database 的序列。其在第 90 個 base 上，有 A/G 兩種可能，在第 91
個 base 上，有 T/C 兩種可能，而在第 92 個 base 上，則有 T/A 兩種
可能 (表六)。此外，No. 501 在第 287~288 個 base 之間，有多一個 T。
2.1.3 Hanseniaspora opuntiae
此菌種在本研究中一共收集了 6 個 D1/D2 序列，片段大小約在
500~600 bps 之間。在和 NCBI 的序列做比較後，雖然這些菌株只符
合一種 database 的序列，但在實驗的結果發現，在第 117 個 base 上，
16
部分菌株的 base 有 deletion 的現象發生，其歸類於此菌種 (表七)。
2.1.4 Hanseniaspora thailandica
此菌種在本研究中一共收集了 9 個 D1/D2 序列，片段大小約在
500~600 bps 左右。在和 NCBI 的序列做比較後，發現這些菌株符合
兩種 database 的序列。其在第 184 個 base 上，有 T/C 兩種可能 (表八)。
2.1.5 Hanseniaspora uvarum
此菌種在本研究中一共收集了 31 個 D1/D2 序列，片段大小約在
500~600 bps 左右。在和 NCBI 的序列做比較後，發現這些菌株符合
四組 database 的序列。其在第 184 個 base 上，有 C/T 兩種可能，在
第 448 個 base 上，也有 C/T 兩種可能 (表九)。此外，有部分序列在
第 117 個 base 上有 deletion 的現象發生，亦歸類於此菌種。
2.1.6 Issatchenkia terricola
此菌種在本研究中一共收集了 13 個 D1/D2 序列，片段大小約在
500~600 bps 左右。在和 NCBI 的序列做比較後，發現這些菌株符合
三組 database 的序列。其在第 166 個 base 上，有 C/T 兩種可能，而
在第 167 個 base 上，也有 C/T 兩種可能 (表十)。
2.1.7 Lodderomyces elongisporus
此菌種在本研究中一共收集了 12 個 D1/D2 序列，片段大小約在
500~600 bps 左右。在和 NCBI 的序列做比較後，雖然這些菌株只符
合一種 database 的序列，但在實驗的結果發現，在第 118 個 base 上，
部分菌株的 base 上有 deletion 的現象發生，亦歸類於此菌種 (表十
一)。
2.1.8 Sporidiobolus pararoseus
此菌種在本研究中一共收集了 7 個 D1/D2 序列，片段大小約在
500~600 bps 左右。在和 NCBI 的序列做比較後，這些菌株都只符合
一種 database 的序列，且所有的 base 皆沒有差異 (一共有 No. 355、
17
397、483、486、510、511、534 等七株菌株)。
2.2 ITS 序列比對
2.2.1 Candida famata
此菌種在本研究中一共收集了 10 個 ITS 序列，片段大小約在
500~600 bps 之間。在和 NCBI 的序列做比較後，發現這些菌株符合
兩組 database 的序列。其在第 88 個 base 上，有 C/T 兩種可能，在第
133 個 base 上，有 A/G 兩種可能，在第 170 個 base 上，除符合原本
的 T 外，亦有 deletion 現象的可能，在第 331 個 base 上，有 T/C 兩
種可能，而在第 342 個 base 上，則有 A/G 兩種可能 (表十二)。
2.2.2 Candida oleophila
此菌種在本研究中一共收集了 14 個 ITS 序列，片段大小約在
500~600 bps 之間，和 NCBI 的序列做比較後，這些菌株都只符合一
種 database 的序列，且所有的 base 皆沒有差異 (一共有 No. 341、404、
405、406、407、408、409、410、411、433、435、566、567、574
等十四株菌株)。
2.2.3 Candida quercitrusa
此菌種在本研究中一共收集了 12 個 ITS 序列，片段大小約在
500~600 bps 之間，和 NCBI 的序列做比較後，這些菌株都只符合一
種 database 的序列，且所有的 base 皆沒有差異 (一共有 No. 294、296、
331、342、473、474、478、479、481、519、520、560 等十二株菌
株)。
2.2.4 Candida railenensis
此菌種在本研究中一共收集了 8 個 ITS 序列，片段大小約在
500~600 bps 之間，和 NCBI 的序列做比較後，這些菌株都只符合一
種 database 的序列，但在實驗的結果發現，在第 498~499 個 base 上
之間，部分菌株多了一個 C，所以當其出現時，則歸類為此菌種 (表
18
十三)。
2.2.5 Hanseniaspora opuntiae
此菌種在本研究中一共收集了 9 個 ITS 序列，片段大小約在
600~700 bps 之間。在和 NCBI 的序列做比較後，這些菌株只符合一
種 database 的序列。但在實驗的結果發現，流水編號 No. 295 以及 488
在第 75 個 base 上有 deletion 的現象發生，亦歸類於此菌種。此外值
得注意的是，流水編號 No.173 的菌株，在第 140 個 base 上，有發生
由 C 變成 T 的點突變 (表十四)。
2.2.6 Hanseniaspora thailandica
此菌種在本研究中一共收集了 8 個 D1/D2 序列，片段大小約在
600~700 bps 左右。在和 NCBI 的序列做比較後，發現這些菌株有符
合兩種 database 的序列。其在第 256 個 base 上，有 T/C 兩種可能。
而這 8 株菌株當中，除了 No. 167 菌株以外，其餘的菌株與兩種可能
的 database 相比之下，在原先序列的第 174~175 之間皆多了一個 T，
但在結果的判定上，皆屬於此菌種。而 No. 166-1、491、502 在第 77
個 base 上有 delection 的現象。No. 165、166-1、502 這三株菌株，在
第 206 個 base 上皆為 G，不是原本 database 的 A。此外，No. 466 在
第 633 個 base 上為 T，非原本的 C (表十五)。
2.2.7 Lodderomyces elongisporus
此菌種在本研究中一共收集了 8 個 ITS 序列，片段大小約在
500~600 bps 之間，和 NCBI 的序列做比較後，這些菌株都只符合一
種 database 的序列，且所有的 base 皆沒有差異 (一共有 No. 160、161、
192、193、194、196、282、536 等八隻菌株)。
3. 水果表面菌株對抗真菌藥劑的感受性試驗結果
本研究依照 CLSI 的實驗流程，將所有 584 株菌株針對 fluconazole、
triadimenol、penconazole 以及 amphotericin B 進行藥物性感受試驗，
19
而在所有的菌株當中，有 142 株菌株在 RPMI 1640 medium 內無法生
長抑或是控制組的 O.D.595 的數值低於 0.2，而這些就不在本研究的
探討範圍內，故結果則以 442 株菌株來進行菌株代表的挑選。
之後從各種水果中的每個物種挑選代表性菌株。其依據的標準為
觀察其在 48 小時 (部分菌株則為 72 小時) 對 fluconazole 的最小抑制
濃度 (MIC) 數值，每個物種當中挑選 MIC 值高的當代表菌株，而如
果相同物種當中對 fluconazole 的 MIC 數值相同，再比較其對其他
azole 類藥物的 MIC 數值做判定。而本實驗一共挑選了 233 株菌株當
作代表菌株。
3.1 水果菌株對 azole 類抗真菌藥劑的感受性
最小抑制濃度 (Minimal Inhibition Concentration, MIC) 的定義為：
針對 azole 類而言，相對於無藥物的控制組，藥物濃度可抑制百分之
五十以上的黴菌生長情形，稱作「最小抑制濃度」
。
3.1.1 在 35℃生長的水果菌株培養 24 小時後對 fluconazole 的感受性
根據最新的 species-specific breakpoints 的判定標準，Candida
albicans、C. tropicalis 以及 C. parapsilosis 在培養 24 小時後，其判定
的 breakpoints 為 MIC ≧ 8 mg/L 視為有抗藥性 (Resistance)，MIC 為
4 mg/L 視為劑量依賴型感受性 (susceptible dose-dependent, SDD)，
MIC ≦ 2 mg/L 視為具有感受性 (Susceptible)。而其他在本研究有出
現的菌種，其 breakpoints 分別為 C. lusitaniae 的 MIC ≧ 4 mg/L 視為
Resistance，MIC ≦ 2 mg/L 視為 Susceptible；C. guilliermondii 的 MIC
≧ 16 mg/L 視為 Resistance，MIC ≦ 8 mg/L 視為 Susceptible；C.
orthopsilosis 的 MIC ≧ 4 mg/L 視為 Resistance，MIC ≦ 2 mg/L 視
為 Susceptible；C. pelliculosa 的 MIC ≧ 8 mg/L 視為 Resistance，MIC
≦ 4 mg/L 視為 Susceptible。而其他的菌種的則根據 C. albicans 培養
20
24 小時後判定標準，其 MIC ≧ 8 mg/L、MIC = 4 mg/L 以及 MIC ≦
2 mg/L 來分類 (Pfaller et al., 2012; Yang et al., 2013; CLSI M27-S4)。
本研究在 35℃培養 48 小時後其 O.D.595 的數值大於 0.2 的一共
有 187 株代表菌株。而在這些菌株當中，有 22 株菌株在培養 24 小時
後其生長情況不如預期，所以在 24 小時 MIC 值的判定則以其餘的 165
株菌株來作探討。而在確定其 breakpoints 的物種當中，C. parapsilosis、
C. lusitaniae、C. guilliermondii、C. orthopsilosis 以及 C. pelliculosa 菌
種的菌株在培養 24 小時後皆視為具有感受性的 (Susceptible)，只有
C. tropicalis 菌種有 1 株菌株為劑量依賴型感受性 (susceptible
dose-dependent, SDD)，比例為 25% (1/4) (表十六)。
其他未知 breakpoints 的菌種，一共有 138 株菌株。在培養 24 小
時後的 MIC ≧ 8 mg/L 的共有 58 株菌株，MIC = 4 mg/L 共有 7 株菌
株，而 MIC ≦ 2 mg/L 的菌株則有 73 株 (表十七)。
3.1.2 在 35℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 fluconazole 的感受性
根據美國臨床實驗室國家標準委員會 (CLSI) 的判定標準評估，
MIC ≧ 64 mg/L 視為有抗藥性 (Resistance)，MIC 介於 16~32 mg/L
間視為劑量依賴型感受性 (susceptible dose-dependent, SDD)，MIC ≦
8 mg/L 視為具有感受性 (susceptible)。而本研究在 35℃培養 48 小時
後其 O.D.595 的數值大於 0.2 的代表菌株一共有 187 株，從表十八、
十九的結果發現，所有代表菌株對 fluconazole 具有抗藥性的比例為
29.4% (55/187)；具有劑量依賴型感受性的比例為 5.3% (10/187)；具
有感受性的比例為 65.2% (122/187) (CLSI M27-A3)。
如表十八、十九所示，在 35℃生長的菌株對 fluconazole 具有抗
藥性 (MIC ≧ 64 mg/L) 的菌株分別有：1 株 Candida pulcherrima，
比例為 8% (1/13)；11 株 Pichia kluyveri，比例為 100% (11/11)；9 株
21
Pichia fermentans，比例為 100% (9/9)；1 株 Candida fermentati，比例
為 20% (1/5)；1 株 Candida sphaerica，比例為 20% (1/5)；1 株 Candida
tropicalis，比例為 25% (1/4)；3 株 Rhodotorula mucilaginosa，比例為
100% (3/3)；2 株 Stephanoascus ciferrii，比例為 50% (2/4)；1 株
Candida railenensis，比例為 33.3% (1/3)；以及其他未知菌種之菌株共
25 株。
3.1.3 在 35℃生長的水果菌株對 fluconazole 的 Trailing growth 現象
Trailing growth 是指在 48 小時的 MIC 數值比在 24 小時的 MIC
數值大於或等於 8 倍以上的現象。其在 24 小時生長情況受到抑制的，
而 24 到 48 小時持續生長而改變對藥物的感受性，此現在會影響 MIC
值的判斷，尤其是對 azole 類藥物。而目前最新的 CLSI 標準的判讀
是依據 24 小時所測得對黴菌抗藥性測驗的結果，則可以避免 trailing
growth 所造成的菌株抗藥性錯誤判斷。所有在 35℃生長的 187 株代
表菌株當中，一共有 7 株菌株對 fluconazole 出現 trailing growth 的現
象，分別為 2 株 Candida tropicalis，比例為 50% (2/4)；1 株 Candida
pulcherrima，比例為 8% (1/13)；1 株 Candida fermentati，比例為 20%
(1/5)；1 株 Candida haemulonii，比例為 100% (1/1)；1 株 Candida
rugosa，比例為 100% (1/1)；以及 1 株未知菌種之菌株 (表二十)。
3.1.4 在 25℃生長的水果菌株培養 24 小時後對 fluconazole 的感受性
部分菌株在原先 CLSI 標準的 35℃無法生長，所以將其培養在
25℃的環境下以觀察結果。而在 25℃培養 48 小時後其 O.D.595 的數
值大於 0.2 的菌株一共有 21 株代表菌株，其中有 13 株在培養 24 小
時後其生長情況不如預期，故只以其他的 8 株菌株進行討論。而這些
代表菌株的菌種 breakpoints 尚未被定義，所以目前只依照其 MIC 數
值，以 C. albicans 的標準做分類。從表二十一、二十二的結果發現，
22
所有在 25℃生長的代表菌株在培養 24 小時後的 MIC ≧ 8 mg/L 的共
有 2 株菌株，MIC = 4 mg/L 共有 2 株菌株，而 MIC ≦ 2 mg/L 的菌
株則有 4 株。
3.1.5 在 25℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 fluconazole 的感受性
根據美國臨床實驗室國家標準委員會 (CLSI) 的判定標準評估，
MIC ≧ 64 mg/L 視為有抗藥性 (Resistance)，MIC 介於 16~32 mg/L
間視為劑量依賴型感受性 (susceptible dose-dependent, SDD)，MIC ≦
8 mg/L 視為具有感受性 (susceptible)。而本研究在 35℃培養 48 小時
後其 O.D.595 的數值大於 0.2 的代表菌株一共有 21 株，從表二十三、
二十四的結果發現，所有代表菌株當中對 fluconazole 具有抗藥性的比
例為 36% (6/21)；具有劑量依賴型感受性的比例為 8% (2/21)；具有感
受性的比例為 56% (13/21)。
如表二十三、二十四所示，在 25℃生長的菌株對 fluconazole 具
有抗藥性 (MIC ≧ 64 mg/L) 的菌株分別有：2 株 Rhodosporidium
paludigenum，比例為 50% (2/4)；1 株 Rhodotorula glutinis，比例為
100% (1/1)；2 株 Cryptococcus albidus，比例為 100% (2/2)；以及其
他未知菌種之菌株一共 1 株。
3.1.6 在 25℃生長的水果菌株對 fluconazole 的 Trailing growth 現象
Trailing growth 是指在 48 小時的 MIC 數值比在 24 小時的 MIC
數值大於或等於 8 倍以上的現象。所有在 25℃生長的 21 株代表菌株
當中，一共有 2 株菌株對 fluconazole 有出現 trailing growth 的現象，
分別為 1 株 Candida railenensis，比例為 100% (1/1)；以及 1 株
Candida oleophila，比例為 20% (1/5) (表二十五)。
3.1.7 在 35℃生長的水果菌株培養 24 小時後對 triadimenol 的感受性
23
到目前尚未被定義出來，所以本研究依照同是 azole 類的 fluconazole
的 breakpoints 標準來判斷。
本研究在 35℃培養 48 小時後其 O.D.595 的數值大於 0.2 的一共
有 187 株代表菌株。而在這些菌株當中，有 22 株菌株在培養 24 小時
後其生長情況不如預期，所以在 24 小時 MIC 值的判定則以其餘的 165
株菌株來作探討。而在確定其 breakpoints 的物種當中，C. parapsilosis、
C. lusitaniae、C. orthopsilosis 以及 C. pelliculosa 菌種的菌株在培養 24
小時後皆視為具有感受性的 (Susceptible)。而 C. tropicalis 則有 1 株
為有抗藥性 (Resistance) 的，比例為 25% (1/4)；C. guilliermondii 則
有 1 株為有抗藥性 (Resistance) 的，比例為 6.3% (1/16) (表二十六)。
其他未知 breakpoints 的菌種，一共有 138 株菌株。在培養 24 小
時後的 MIC ≧ 8 mg/L 的共有 31 株菌株，MIC = 4 mg/L 共有 19 株
菌株，而 MIC ≦ 2 mg/L 的菌株則有 88 株 (表二十七)。
3.1.8 在 35℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 triadimenol 的感受性
由於對於農業上常用的 azole 類藥物並沒有定義出其判定的標準，
所以本研究依據 fluconazole 的標準來做抗藥性標準的評估，其 MIC
≧ 64 mg/L 視為有抗藥性 (Resistance)，MIC 介於 16~32 mg/L 間視
為劑量依賴型感受性 (susceptible dose-dependent, SDD)，MIC ≦ 8
mg/L 視為具有感受性 (susceptible)。而本研究在 35℃培養 48 小時後
其 O.D.595 的數值大於 0.2 的代表菌株一共有 187 株，從表二十八、
二十九的結果發現，所有在 35℃生長的代表菌株在培養 48 小時後，
對 triadimenol 具有抗藥性的比例為 2.1% (4/187)；具有劑量依賴型感
受性的比例為 33.2% (62/187)；具有感受性的比例為 64.7%
(121/187)。
如表二十八、二十九所示，在 35℃生長的菌株對 triadimenol 具
24
有抗藥性 (MIC ≧ 64 mg/L) 的菌株分別有：1 株 Candida
pulcherrima
，
比例為 8% (1/13)；1 株 Candida guilliermondii，比例為
6.3% (1/16)； 1 株 Candida tropicalis，比例為 25% (1/4)；1 株 Candida
railenensis，比例為 33.3% (1/3)。
3.1.9 在 35℃生長的水果菌株對 triadimenol 的 Trailing growth 現象
Trailing growth 是指在 48 小時的 MIC 數值比在 24 小時的 MIC
數值大於或等於 8 倍以上的現象。所有在 35℃生長的 187 株代表菌
株當中，一共有 25 株菌株對 triadimenol 有出現 trailing growth 的現象，
分別為 2 株 Candida intermedia，比例為 40% (2/5)；2 株 Candida
quercitrusa，比例為 28.6% (2/7)；2 株 Candida tropicalis，比例為 50%
(2/4)；2 株 Candida guilliermondii，比例為 12.5% (2/16)；2 株 Candida
krusei，比例為 66.6% (2/3)；1 株 Candida pelliculosa，比例為 100%
(1/1)；1 株 Stephanoascus ciferrii，比例為 25% (1/4)；1 株 Candida
orthopsilosis，比例為 50% (1/2)；1 株 Candida pulcherrima，比例為
8% (1/13)；1 株 Pichia kluyveri，比例為 9.1% (1/11)；1 株 Pichia
fermentans，比例為 11.1% (1/9)；以及其他未知菌種之菌株一共 9 株
(表三十)。
3.1.10 在 25℃生長的水果菌株培養 24 小時後對 triadimenol 的感受性
本研究在 25℃培養 48 小時後其 O.D.595 的數值大於 0.2 的 21 株
代表菌株當中，其中有 13 株在培養 24 小時後其生長情況不如預期，
故只以其他的 8 株菌株進行討論。而這些代表菌株的菌種 breakpoints
尚未被定義，所以目前只依照其 MIC 數值，以 C. albicans 的標準做
分類。從表三十一、三十二的結果發現，所有在 25℃生長的代表菌
株在培養 24 小時後的 MIC ≧ 8 mg/L 的共有 1 株菌株，而 MIC ≦ 2
mg/L 的菌株則有 7 株。
25
3.1.11 在 25℃生長的水果菌株培養 48 小時後對 triadimenol 的感受性
由於對於農業上常用的 azole 類藥物並沒有定義出其判定的標準，
所以本研究依據 fluconazole 的標準來做抗藥性標準的評估，其 MIC
≧ 64 mg/L 視為有抗藥性 (Resistance)，MIC 介於 16~32 mg/L 間視
為劑量依賴型感受性 (susceptible dose-dependent, SDD)，MIC ≦ 8
mg/L 視為具有感受性 (susceptible)。本研究在 25℃培養 48 小時後其
O.D.595 的數值大於 0.2 的菌株一共有 21 株，從表三十三、三十四的
結果發現，所有在 25℃生長的代表菌株當中對 triadimenol 具有劑量
依賴型感受性的比例為 23.8% (5/25)；具有感受性的比例為 76.2%
(16/25)。
3.1.12 在 25℃生長的水果菌株對 triadimenol 的 Trailing growth 現象
Trailing growth 是指在 48 小時的 MIC 數值比在 24 小時的 MIC
數值大於或等於 8 倍以上的現象。所有在 25℃生長的 21 株代表菌株
當中，一共有 3 株菌株對 triadimenol 有出現 trailing growth 的現象，
分別為 1 株 Candida oleophila，比例為 20% (1/5)；1 株 Candida
railenensis，比例為 100% (1/1)；以及 1 株 Rhodosporidium paludigenum，
比例為 25% (1/4) (表三十五)。
3.1.13 在 35℃生長的水果菌株培養 24 小時後對 penconazole 的感受性
農業上使用的 azole 類藥物其在菌株培養 24 小時後的 breakpoints
到目前尚未被定義出來，所以本研究依照同是 azole 類的 fluconazole
的 breakpoints 標準來判斷。
本研究在 35℃培養 48 小時後其 O.D.595 的數值大於 0.2 的一共
有 187 株代表菌株。而在這些菌株當中，有 22 株菌株在培養 24 小時
後其生長情況不如預期，所以在 24 小時 MIC 值的判定則以其餘的 165
株菌株來作探討。而在確定其 breakpoints 的物種當中，C. parapsilosis、
26
