豬胸膜肺炎放線桿菌ApfA蛋白之抗原決定位分析及免疫學研究

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豬胸膜肺炎放線桿菌

ApfA 蛋白之抗原決定位分析及免疫學研究

黃瑋芳、黃炯中、楊文仁＊國立高雄大學生物科技研究所 E-mail: slw68824@ms46.hinet.net (黃炯中) 豬胸膜肺炎放桿線菌(A. pleuropneumoniae)是一種革蘭氏陰性細菌，造成豬胸膜肺炎 與肺部出血性壞死，引起豬呼吸方面之嚴重疾病，造成經濟上重大損失。本菌在感染宿主時，首先靠著纖毛黏附於宿主呼吸道細胞或黏膜上，ApfA 蛋白是構成豬胸膜肺炎放桿線菌纖毛的結構蛋白。許多革藍氏陰性病原菌會經由纖毛分泌致病因子而造成宿主的疾病，推測纖毛應當與A. pleuropneumoniae 之致病性有密切關係。 本實驗從ApfA 蛋白抗原決定位之分析著手，藉由合成胜肽及重組蛋白來探討以 ApfA 蛋白開發為豬胸膜肺炎放線桿菌次單位疫苗之可行性。首先將 apfA 之基因片段選 殖到表現載體pQE30-UA 中，以 IPTG 誘導 E. coli M15 大量表現並純化 ApfA 蛋白。此 外，經由Hopp-Woods 的方法分析 ApfA 蛋白的 hydrophilicity，發現此蛋白之抗原決定位可能位於aa55-62，aa68-75，aa77-85 及 aa131-138。因此，選取其中最可能之抗原決定位aa131-138 共 8 個胺基酸合成短鏈 peptide，並於 peptide 接上攜帶蛋白 mutiple antigen peptides(MAP)，進行免疫分析測試。以 ApfA 蛋白與合成之 peptide 做為抗原，並以豬胸膜肺炎放線桿菌市售死菌疫苗及 PBS 作為對照組，進行小鼠免疫。經過二次免疫後除 PBS 組以外，各組血清抗體效價皆有顯著上升。免疫後第28 天以 5x108_{cfu 之豬胸膜肺炎放線桿菌第一血清型進行攻毒試} 驗，經過72 小時後 10μg ApfA 與市售死菌疫苗組存活率為 25%，其餘皆死亡。以攻毒後存活之注射ApfA 小鼠的抗血清進行抑菌測試，發現能有效抑制豬胸膜肺炎放線桿菌的生長。綜合實驗結果，證明以ApfA 蛋白為目標抗原能誘發小鼠產生不錯的抗體效價，產生之抗體能抑制豬胸膜放線桿菌之生長，並可達到一定程度之保護效果，具有開發成為次單位疫苗之潛力。合成的peptide-MAP並無法具有保護效果，對於ApfA蛋白的重要抗原決定位仍有待進一步研究。因此，本實驗室正製備ApfA蛋白之單株抗體以及利用定位突變的方法將ApfA基因上的兩個cysteine置換成glycine，來建構突變的ApfA蛋白，以單株抗體進行西方點墨法來探討cysteine對ApfA 蛋白之立體構形及抗原決定位所產生的影響。關鍵字：豬胸膜肺炎放線桿菌、ApfA 蛋白、抗原決定位、纖毛蛋白