台灣族群帕金森氏症Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2)基因變異的分子遺傳及功能研究

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 台灣族群帕金森氏症Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) 基因變異的分子遺傳及功能研究 Molecular Genetic and Functional Studies of Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Gene Variations in Taiwanese Parkinson’s Disease. 研究生：江佩茹 Pei-Ru Jiang 指導教授：李桂楨博士 Guey-Jen Lee-Chen 中華民國一０一年八月.

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(3) 誌謝. 在師大四年（實驗室兩年、修習教育學程兩年）的求學生涯，真的是一段很開心的日子。一路走來，感謝師大提供的資源，感謝許多人的幫助，讓我在這段期間除了充實自我，也找到了人生的新方向。本論文的完成，首先要感謝我的指導教授李桂楨老師。老師雖然要求很嚴格、做事很嚴謹，但也因此而使我在研究過程中受益良多，也讓我抱持著一個信念：「只要能從這間實驗室畢業存活下來，一定就能成為一位很厲害的人！」這個信念讓我就算遇到挫折與不順，仍有繼續堅持下去及努力的勇氣。接著要感謝我的兩位口試委員，林口長庚紀念醫院神經內科吳逸如醫師與陳瓊美醫師，感謝您們適時給予的指導及建議，讓我的論文能順利地進行，以及使論文的修訂更臻完善。也感謝林口長庚紀念醫院神經內科助理與所有血液樣本提供者，使我們能順利地完成實驗。在研究生涯中，感謝許多人的指導與幫助。感謝實驗室麗卿、秀觀、怡辰、春嫺、品蓉學姊與志信、士寰、玄竺學長在實驗上對我耐心地指導；感謝實驗室助理雰茹、芷英、雅今、婷中、明慧、婉玲學姊和奕村、正杰學長的幫助；感謝我的同學詩涵、慈蓬、淑婷在生活中的陪伴、談心以及幫忙買便當；感謝文騰、允麟、修嘉學弟在我忙.

(4) 碌時無怨無悔地幫我的忙；感謝大學部的學弟妹亦鈞、謹霞、菀玲、維昕、奕勝、奕璇，和建中學弟奕辰等，謝謝你們平時在實驗室講笑話逗大家笑，讓實驗室增添不少活潑的氣氛；也感謝書宏、俞鈞、裔強同學在實驗上的建議與藥品器材的協助；感謝學樺、啟翔、亭潔、韻如、宗明同學給我一些關於生活與感情方面的建議。最後，謹將此篇論文獻給我最親愛的家人：爸爸、媽媽及弟弟，謝謝你們支持我，我才能夠無後顧之憂、全力以赴地完成碩士學業；以及感謝我的男友博凱，謝謝你一直在我身邊陪伴著我，聽我訴說心裡的話，與我分享喜怒哀樂。因為有您們大家，我才能夠完成此篇論文，謝謝您們！.

(5) 目錄目錄............................................................................................................. I 中文摘要 ................................................................................................... V Abstract................................................................................................... VI 圖表目錄 ................................................................................................VII 壹、緒論 .................................................................................................... 1 一、帕金森氏症.................................................................................. 1 (一)臨床病徵 ................................................................................ 1 (二)神經病理學 ............................................................................ 2 (三)致病原因 ................................................................................ 3 (四)致病途徑 ................................................................................ 4 二、帕金森氏症的遺傳分析 ............................................................. 4 三、LRRK2 基因 ................................................................................. 6 (一) LRRK2 的構造、表現與功能 .............................................. 6 (二) LRRK2 基因變異與帕金森氏症 .......................................... 7 貳、研究目的 ..........................................................................................10 參、研究材料與方法 ..............................................................................11 一、研究樣品....................................................................................11 二、細胞培養....................................................................................11 三、西方轉漬法(Western blot) ........................................................12 I.

(6) 四、LRRK2 cDNA 增幅及定序 .......................................................13 五、台灣族群 LRRK2 基因 R767H 及 S885N 突變檢測 ...............13 (一) R767H 的限制酶片段長度多型性(RFLP)分析 ................13 (二) S885N 的突變基因專一增幅聚合酶連鎖反應(ARMS-PCR) 分析 .............................................................................................14 六、LRRK2 基因 N551K、R1398H、R1628P、S1647T、G2385R、 M2397T 多型性與台灣族群帕金森氏症感受性分析 ............15 (一)聚合酶連鎖反應(PCR) ........................................................15 (二)限制酶片段長度多型性分析(RFLP)..................................15 (三)統計分析 ..............................................................................15 七、LRRK2 基因 R767H 及 S885N 突變的功能分析 ....................16 (一) pLRRK2- EGFP 與 pLRRK2-Myc-His 重組質體的建構. 16 (二)基因轉染及蛋白質表現分析 ..............................................18 (三)螢光顯微鏡觀察 ..................................................................19 (1)觀察 LRRK2- EGFP 融合蛋白於細胞中的表現…..…..….19 (2)觀察 LRRK2- EGFP 於細胞中與胞器位置重疊情形 .........20 (A)觀察 LRRK2- EGFP 與粒線體位置重疊情形... .................20 (B)觀察 LRRK2- EGFP 與內質網位置重疊情形 ....................20 (四)活細胞影像儀觀察 ..............................................................21. II.

(7) 肆、結果 ..................................................................................................22 一、cDNA 定序檢測帕金森氏症患者 LRRK2 基因變異 ..............22 (一) ANK、LRR、ROC domain 定序檢測 ..............................22 (二) COR、MAPKKK domain 定序檢測 .................................22 (三) WD40 domain 定序檢測 ....................................................23 二、台灣族群 LRRK2 基因 R767H 及 S885N 突變檢測 ...............23 (一) R767H G>A 突變 ...............................................................23 (二) S885N G>A 突變 ................................................................24 三、LRRK2 基因 N551K、R1398H、R1628P、S1647T、G2385R、 M2397T 多型性與台灣族群帕金森氏症感受性分析 ............24 (一) N551K、R1398H、R1628P、S1647T、G2385R、M2397T 多型性 .........................................................................................25 (二)聯鎖不平衡檢測 ..................................................................26 (三)多型性基因型及等位基因頻率 ..........................................28 (四)多型性配對分析 ..................................................................28 四、LRRK2 突變之功能分析 ...........................................................29 (一) EGFP 標記的 LRRK2 cDNA 選殖 .....................................29 (二) Myc-His 標記的 LRRK2 cDNA 選殖 ................................30 (三) EGFP、Myc-His 標記的 LRRK2 cDNA 表現 ..................31. III.

(8) (四) LRRK2-EGFP 融合蛋白的螢光顯微鏡觀察 ....................31 (五) LRRK2-EGFP 融合蛋白的活細胞影像儀觀察 ................32 五、突變及多型性的序列比對 .......................................................32 伍、討論...................................................................................... 33 一、LRRK2 基因突變 .......................................................................33 (一) R767H 突變 ........................................................................33 (二) S885N 突變 .........................................................................35 二、LRRK2 基因多型性 ...................................................................35 三、LRRK2 突變之功能分析 ...........................................................39 陸、參考文獻 ..........................................................................................42 柒、附錄圖表 ..........................................................................................53. IV.

(9) 中文摘要 LRRK2 基因，全名為 leucine-rich repeat kinase 2 (轉譯出 LRRK2 蛋白，又稱震顫素)，是目前引起體染色體顯性遺傳的帕金森氏症的重要基因。LRRK2 蛋白在體內各處皆有表現，包括中央神經系統、主要器官及淋巴球等。先前我們針對早發型帕金森氏症患者進行 LRRK2 cDNA 定序，找到兩個未被報導過的 R767H 與 S885N 突變，及六個改變胺基酸的多型性。本研究進一步探究 LRRK2 與台灣帕金森氏症的相關性。結果於 21 位早發性 PD 患者的 cDNA 定序發現一個未改變胺基酸的變異 N2047 T>C。PCR-RFLP 檢測 PD 患者的已知突變亦新發現一 S885N 突變。帕金森氏症患者的病例-對照組研究結果顯示，G2385R 的 GA 基因型及 A 等位基因與帕金森氏症顯著相關。另外，本研究亦建構 EGFP 及 Myc-His 標記的野生型及 R767H、S885N 突變型的 LRRK2 質體，送到 HEK-293T 細胞中表現，西方轉漬分析、螢光顯微鏡觀察、活細胞影像儀觀察結果顯示，野生型 LRRK2-EGFP 融合蛋白主要分佈在細胞質，且與粒線體及內質網等胞器位置重疊，突變型的 LRRK2 蛋白在細胞中的表現情況與野生型相似，並無明顯差異。關鍵字：帕金森氏症、Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2)、LRRK2 蛋白。. . V.

(10) Abstract Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2, encoding dardarin) is the most common cause of autosomal dominant PD. LRRK2 protein is expressed ubiquitously, particularly in the central nervous system, major organs and also in the lymphocytes. Previously we screened LRRK2 mutations in early-onset PD (EOPD) patients and identified two novel (R767H and S885N) mutations, in addition to 6 nonsynonymous amino acid substitutions. In this study, 21 newly recruited EOPD patients were screened using direct cDNA sequencing and one novel N2047 T>C variant was identified. PCR-RFLP analysis of the known mutation also identified a S885N mutation carrier. In addition, the results of a case-control study in a cohort of PD and ethnically matched controls revealed that G2385R GA genotype or A allele was significantly associated with the risk of PD. Finally, the EGFP- and Myc-tagged wild type, R767H and S885N LRRK2 constructs were transiently expressed in HEK-293T cells. Western blot analysis and immunofluorescence microscopy examination revealed that both wild type and mutant LRRK2 proteins exhibit similar cytoplasmic distribution and mitochondria and endoplasmic reticulum co-localization.. Key words: Parkinson's Disease 、 Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2)、LRRK2 protein.. . VI.

(11) 圖表目錄圖一、LRRK2 蛋白結構及基因突變。.................................................53 圖二、LRRK2 基因 N2047 異型合子變異定序圖。.............................54 圖三、LRRK2 基因 S885N 突變檢測。 ................................................55 圖四、LRRK2 基因多型性檢測。..........................................................56 圖五、野生型 LRRK2-EGFP 重組質體的構築。 ................................57 圖六、突變型 LRRK2-EGFP 重組質體的構築。 ................................58 圖七、LRRK2-EGFP 重組質體的限制酶圖譜分析。 .........................59 圖八、LRRK2-Myc-His 重組質體的構築。 .........................................60 圖九、LRRK2-Myc-His 重組質體的限制酶圖譜分析及定序圖。….61 圖十、LRRK2-EGFP、LRRK2-Myc-His 融合蛋白的西方轉漬分析。 ...................................................................................................................62 圖十一、共軛焦顯微鏡觀察 LRRK2-EGFP 融合基因在 HEK-293T 細胞內表現的情形。 ..................................................................................63 圖十二、共軛焦顯微鏡觀察 LRRK2-EGFP 融合基因在 HEK-293T 細胞內與粒線體及內質網重疊情形。 ......................................................64 圖十三、活細胞影像儀觀察 LRRK2-EGFP 融合基因在 HEK-293T 細胞內蛋白聚集情形。 ..............................................................................65 圖十四、LRRK2 突變及多型性的序列比對。 .....................................66 表一、帕金森氏症的遺傳因子 ..............................................................67 VII.

(12) 表二、增幅 LRRK2 cDNA 與 genomic DNA 的 PCR 引子對、條件、定序引子及檢測試驗 ..................................................................................68 表三、早發性帕金森氏症患者 LRRK2 cDNA 的定序結果 .................69 表四、LRRK2 多型性的 SNPSpD 聯鎖不平衡檢測 ................................. 70 表五、帕金森氏症患者(PD)與正常人族群(Control) LRRK2 基因的多型性基因型、等位基因頻率及與疾病相關性 ......................................71 表六、帕金森氏症患者(PD)與正常人族群(Control) LRRK2 基因的多型性配對分析...........................................................................................72. VIII.

(13) 壹、緒論. 一、帕金森氏症. 帕金森氏症(Parkinson's disease，簡稱 PD)，在西元 1817 年首度由 James Parkinson 醫師描述此疾病，最初敘述其臨床症狀為震顫性麻痺(shaking palsy)，當時尚不明瞭其病理變化。它是一種僅次於阿茲海默氏症(Alzerheimer's disease)，為第二常見的漸進性神經退化性疾病，大約對 1% 65 歲以上的人口造成影響，平均發病年齡為 60 歲。. (一)臨床病徵. PD 患者的主要臨床病徵包括靜止性震顫(resting tremor)、僵硬 (rigidity)、動作遲緩(bradykinesia)、步伐不穩(postural instability)等 (Conley and Kirchner, 1999)。靜止性震顫的頻率為每秒四到七次，多在休息時發生，常是症狀初期的表徵。肢體僵硬的情形常於肢體近端開始發展，動作當中所花費的力氣較一般正常人大，軀幹旋轉的能力變差。出現動作遲緩症狀的病患，自主動作的執行變慢且難以維持動作，動作的速度、範圍與振幅皆會減少。步伐不穩則是當病患在嘗試站立或轉身時，因為無法維持平衡而容易跌倒(Marjama-Lyons and. 1.

(14) Koller, 2001)。PD 會隨著病程的演進而症狀加重，臨床上患者的嚴重程度常用 Hoehn 與 Yahr 所發展出的分類系統來評估，可分為五期，隨著病情的進程，病患必須仰賴輪椅甚或無法行動而臥病在床，最終會導致行動能力完全喪失 (Hoehn and Yahr, 1967)。. (二)神經病理學. PD 病患主要的病理特徵是位於中腦的黑質緻密區(substantia nigra pars compacta，簡稱 SNpc)及其他腦幹神經核中的多巴胺神經元 (dopaminergic neuron)有退化或是死亡的現象，造成黑質紋狀體路徑 (nigrostriatal pathway)中的多巴胺(dopamine)分泌不足，因而引起臨床症狀(Dauer and Przedborski, 2003)。多巴胺神經元為基底核(basal ganglia)的重要組成份子，基底核位於大腦白質深處，在人體的微調及協調運動上扮演相當重要的功能。. 除了多巴胺神經元在 SNpc 有退化或死亡的病理特徵外，另在 SNpc 所殘存的多巴胺神經元中，發現有嗜伊紅性細胞質內蛋白質包涵體(proteinacious cytoplasmic inclusions)分佈。分佈在神經元突起處呈現鈁錘絲狀構造的，稱為 Lewy neuritis；有時則形成球狀出現在神經元細胞核周圍的，稱為 Lewy body (Gibb and Lees, 1991)。這些包涵 2.

(15) 體主要成分為 α-synuclein、ubiquitin 與 neurofilament (Conley and Kirchner, 1999)。α-Synuclein 變異會導致 Lewy body 的產生(Spillantini et al., 1997)，近年來研究證據認為 PD 的分子病理機制，可能是 α-synuclein 在患者體內不被分解造成腦內堆積，而引起神經細胞死亡所導致(Dawson and Dawson, 2003)。. (三)致病原因. 多數的 PD 患者屬於偶發型(sporadic)，確切的病因目前尚不明確；少數為家族性 PD (familial PD)的患者，則與基因突變有關(Farrer, 2006)。依據目前研究文獻顯示，PD 患者中約有 5~10%具有家族遺傳現象，遺傳方式有體染色體顯性(autosomal dominant)與體染色體隱性 (autosomal recessive)兩種。此外，黑質細胞的數量會隨著年齡的增加而減少(Gibb and Lees, 1991)，顯示年齡增加亦為 PD 的危險因子。目前以遺傳與環境交互作用所造成的「多因子理論」，為最被接受的 PD 病因理論：先天在遺傳上具有某些基因缺陷或多型性 (polymorphism)的個體，對於特定的環境因子感受性較大，較易引起 SNpc 的多巴胺神經元退化而導致 PD (Bertram et al., 2005; Schapira, 2006)。. 3.

(16) (四)致病途徑. 目前的研究發現可能的致病途徑為蛋白質品質控管改變、粒線體功能不良、kinase 的活性受到干擾與氧化壓力。Ubiquitin proteasome system 的功能不良與蛋白質的聚集，會導致蛋白質的品質控管受到干擾。許多研究文獻也指出粒線體功能不良會造成 SNpc 的多巴胺神經元退化，而粒線體 complex I 的活性受損與 PD 有極大關聯(Schapira et al., 1989)。活性異常的 kinase 被證實與 PD 的形成有關，而氧化壓力也與導致多巴胺神經元退化的一連串反應有關。在壓力狀態下，一些和 PD 相關的基因產物包括 SNCA、Parkin、PINK1、DJ-1、LRRK2 以及 HTRA2，被顯示會某種程度的出現在粒線體，因此粒線體功能受損以及氧化壓力增加，會使細胞更容易受到細胞外毒性及其他壓力的傷害(Henchcliffe and Beal, 2008; Schapira, 2008)。這些途徑可能藉由引起神經發炎反應，加速細胞自我吞噬、細胞凋亡、細胞內 Glutamate 所產生的細胞毒殺等作用，終致神經細胞死亡而引發 PD (Schulz, 2008)。. 二、帕金森氏症的遺傳分析. 近年來的研究證據顯示，遺傳因素在家族性 PD 上具有重要地 4.

(17) 位，家族性 PD 病患約佔所有 PD 患者的 5~10%，而這些家族性 PD 患者屬於早發型 PD (EOPD，發病年齡＜50) (Elbaz et al., 1999)，病程的進展較快且病理及臨床上的特徵都較不典型(Bertram et al., 2005)。在多個 PD 家族的研究中也顯示，相較於正常人，PD 病患的兄弟姐妹罹患 PD 的風險有顯著性的提升(Lazzarini et al., 1994; Payami et al., 1994)。另外，同卵雙胞胎罹患 PD 有較高的一致性(concordance rate) (Piccini and Brooks, 1999)。這些研究證據都指出，遺傳基因在 PD 的致病機轉上扮演重要的角色(Lev and Melamed, 2001)。. 與 PD 相關的基因座(loci)目前已有數個被發現，且已有部分的致病基因被確認(表一) (Belin and Westerlund, 2008)，包含 4q21-23 的 α-synuclein (亦稱 SNCA 或 PARK1) (Polymeropoulos et al., 1997)、 6q25.2-27 的 Parkin (亦稱 PRKN 或 PARK2) (Kitada et al., 1998)、4p14 的 ubiquitin carboxy-terminal esterase L1 (亦稱 UCHL1 或 PARK5) (Leroy et al., 1998)、1p35-p36 的 PTEN-induced putative kinase 1 (亦稱 PINK1 或 PARK6) (Hatano et al., 2004)、1p36 的 Parkinson disease protein 7 (亦稱 DJ-1 或 PARK7) (Bonifati et al., 2003)、12p11.2-q13.1 的 leucine-rich repeat kinase 2 (亦稱 LRRK2 或 PARK8) (Zimprich et al., 2004)、1p35-p36 的 ATPase type 13A2 (亦稱 ATP13A2 或 PARK9) (Di. 5.

(18) Fonzo et al., 2007)以及 2p12 的 HtrA serine peptidase 2 (亦稱 HTRA2 或 PARK13) (Strauss et al., 2005)。其中，體染色體顯性遺傳帕金森氏症 (autosomal dominant Parkinson's Disease，簡稱 ADPD)與 SNCA、 UCHL1、LRRK2 基因突變有關；而體染色體隱性遺傳青少年型帕金森氏症候群(autosomal recessive juvenile Parkinsonism，簡稱 ARJP)則與 Parkin 、 PINK1 及 DJ-1 基因突變有相關性 (reviewed by Wood-Kaczmar et al., 2006)。. 三、LRRK2 基因. 於 2002 年被報導的 PARK8 (亦稱 LRRK2)基因，位於第 12 號染色體 q12 上(Funayama et al., 2002)。接著，Paisan-Ruiz 選殖了此 LRRK2 基因並命名為 Dardarin (Paisan-Ruiz et al., 2004)，即「震顫」之意。 LRRK2 是目前引起 ADPD 的重要基因。. (一) LRRK2 的構造、表現與功能. LRRK2 基因長度約 144 kb，包含 51 個 exons，可以轉譯出由 2527 個胺基酸所組成的分子量為 286 kDa 的蛋白質 (Zimprich et al.,. 6.

(19) 2004)。前人研究顯示，哺乳類動物的腦部，在多巴胺受質區域有 LRRK2 蛋白高度表現(Melrose et al., 2006; Higashi et al., 2007b)。. LRRK2 蛋白為 ROCO protein superfamily 的成員之一，具有 ANK (Ankyrin repeat) 、 LRR (Leucine-rich repeat) 、 ROC (Ras of complex protein)、COR (C terminal of ROC)、MAPKKK (mitogen activated protein kinase kinase kinase)以及 WD40 等 6 個重要的功能區塊(domains)(圖一)。不同的區塊各別掌管多種功能，包括蛋白質與蛋白質之間的交互作用、蛋白質的磷酸化、與受質的結合等(Giasson and Van Deerlin, 2008)。目前已知 LRRK2 蛋白是個有功能的絲胺酸/ 蘇胺酸蛋白質激酶(serine/threonine kinase)，活化時會形成二聚體 (dimer)，且能進行自我磷酸化(autophosphorylation) (West et al., 2005; Greggio et al., 2008)。. (二) LRRK2 基因變異與帕金森氏症. 從 2004 年以來，已有多個在不同人種的 LRRK2 基因變異相繼被報導。根據統計，顯性遺傳 PD 患者具有 LRRK2 基因變異的佔 13%，而偶發型 PD 患者中則佔 5% (Berg et al., 2005; Mata et al., 2006)。目. 7.

(20) 前至少已有 20 個可能與 ADPD 相關的 LRRK2 基因變異被報導 (Giasson and Van Deerlin, 2008)。. 位於 LRRK2 基因上的 G2019S，在白種人、阿肯納西猶太人及阿拉伯裔美國人中，為常見的突變(Deng et al., 2006; Ozelius et al., 2006; Lesage et al., 2006)。但在新加坡、韓國以及台灣族群等亞洲人種的研究中，卻無發現此變異(Tan et al., 2005; Choi et al., 2008; Lin et al., 2008)。. 與亞洲族群相關聯的 LRRK2 變異點目前已有 4 個被報導：P755L (Wu et al., 2006)、R1441H (Mata et al., 2005)、R1628P (Ross et al., 2008)、G2385R (Mata et al., 2005)。目前 P775L 變異只在亞洲族群找到，不過 P775L 變異在 PD 患者與正常人之間並無達到顯著差異(Tan et al., 2008)，因此 P775L 變異是否為亞洲族群的危險因子(risk factor) 仍有待進一步研究。在全球出現頻率較少的 R1441H 變異，除了在台灣 PD 家族中發現之外，也有發現幾位美國、澳洲及希臘患者帶有此變異(Spanaki et al., 2006; Zabetian et al., 2005; Huang et al., 2007)。. R1628P 變異為華人所特有的罹患 PD 的危險因子，包括了台灣及新加坡族群，但在日本與印度族群中目前尚未發現此變異(Ross et 8.

(21) al., 2008)。亞洲族群罹患 PD 的危險因子為 G2385R 變異(Funayama et al., 2007; Li et al., 2007; Tan et al., 2007; An et al., 2008)，而在亞洲以外的人種中未找到此變異(Di Fonzo et al., 2006a)。這些結果顯示在不同人種的 PD 病患中，LRRK2 基因變異有很大的差異。. 9.

(22) 貳、研究目的. LRRK2 基因是引起顯性遺傳 PD 的重要基因。根據西方國家的統計，在顯性遺傳 PD 家族史的患者中，具有 LRRK2 基因變異者佔 13%。研究發現，在白種人中 LRRK2 基因最常見的突變為 G2019S，但在亞洲人種較為常見的則是 P755L、R1441H、R1628P、G2385R 變異，其中 R1628P 與 G2385R 變異已被證實分別為華人及亞洲人種罹患 PD 所特有的危險因子，顯示在不同人種中 LRRK2 基因變異有很大的差異。本研究延續先前本實驗室對 LRRK2 基因變異的探討(許, 2008)，對新蒐集的 EOPD 樣品進行 cDNA 定序，並對 6 個改變胺基酸的多型性點進行 PD 患者與其性別、年齡比率相當的正常人的病例-對照組研究。另外，本研究亦建構 EGFP 及 Myc-His 標記的野生型及突變型 (R767H、S885N) LRRK2 質體(皆含有 S1647T、M2397T 多型性)，送進 HEK-293T 細胞中表現。利用螢光顯微鏡觀察及西方轉漬分析等方式，來研究 R767H 及 S885N 突變對 LRRK2 蛋白在細胞內的位置與生成過程是否有影響。. 10.

(23) 參、研究材料與方法. 一、研究樣品. PD 患者及正常人血液的基因組 DNA (genomic DNA，簡稱 gDNA) 與 cDNA 樣品均由林口長庚紀念醫院神經內科吳逸如醫師與陳瓊美醫師所提供，所有樣品均徵求患者或家屬同意後始進行血液採樣。PD 樣品的選取標準為：需具有兩個以上 PD 典型症狀，包含靜止性震顫、僵硬、動作遲緩和姿態反射障礙；而具有家族病史及任何因腦炎、腦部外傷或服用抗精神性藥物等所引發的帕金森氏症候群病例則排除在外。同時並蒐集性別、年齡比率相當的正常人的血液樣品，以作為控制組供對照。. 二、細胞培養. 基因功能檢測採用HEK-293T細胞進行實驗。將細胞培養於含有 10% FBS、1.0 mM sodium pyruvate、1.5 g/l sodium bicarbonate、100 U/ml penicillin、100 U/ml streptomycin的DMEM培養液(Gibco)，置於 37℃、含5% CO2且溼度穩定的細胞培養箱中，待細胞生長至七、八分滿時，以1:5 ~ 1:10的比例稀釋進行細胞繼代培養。 11.

(24) 三、西方轉漬法(Western blot). 先經 Bio-Rad Protein Assay 將蛋白質定量後，取等量(50µg)的蛋白質加入適量的 sample buffer (50 mM Tris, pH6.8 - 2% SDS - 10% glycerol - 2.5% β-mercaptoethanol - 0.005% bromophenolblue)，放入沸水浴 5~10 分鐘之後取出置於冰上，接著使用 10% SDS-聚丙烯醯胺電泳(SDS-PAGE)，來分離蛋白質。待電泳完畢，以 XCell IITM Blot Module (Invitrogen)與 transfer buffer (25 mM Tris - 0.2 M glycine - 20% methanol) 使蛋白質轉漬至硝化纖維素膜 (nitrocellulose transfer membrane, Whatman)上。將轉漬完成的硝化纖維素膜浸泡於 blocking buffer (10% skim milk - PBS)中，置於 4℃緩慢搖晃至隔夜。Blocking 完後，用 wash buffer (10 mM Tris-HCl pH8.0 - 0.05% Tween 20)將硝化纖維素膜清洗三次，每次 15 分鐘。接著加入一級抗體置於室溫作用 2 小時後，用 wash buffer 清洗硝化纖維素膜三次，每次 15 分鐘。再加入 horseradish peroxidase (HRP) conjugated 二級抗體(稀釋比例 1:10000，GeneTex)，置於室溫作用 1.5 小時後，用 wash buffer 清洗硝化纖維素膜三次，每次 15 分鐘。加入冷光呈色試劑(Millipore)於硝化纖維素膜上之後，使用冷光儀與 ImagerReader LAS-3000 軟體偵測蛋白質的表現情形。上述的蛋白質萃取實驗需重複進行兩次，每次所 12.

(25) 萃取的蛋白液需重複兩次西方轉漬分析。. 四、LRRK2 cDNA 增幅及定序. 利用三對引子對 ( 表二 )( 許 , 2008) ，分別增幅 LRRK2 ANK/LRR/ROC domain、COR/MAPKKK domain、WD40 domain。取 100 ng 的 cDNA，置入 25 μl 的 PCR 反應溶液中，溶液包含 50 ng 的引子對、200 M dNTPs、2 mM MgCl2、0.5 U 的熱穩定性 DNA 聚合酶(Takara La Taq)。以熱循環儀(OmniGene, HYBRID)進行 PCR 反應，反應條件為：先以 95℃作用 3 分鐘使 DNA 雙股裂解後，再以循環式的裂解溫度 98℃作用 10 秒、煉合溫度(表二)作用 45 秒及延長溫度 72℃作用 4 分鐘進行 50 個循環，最後於 72℃作用 15 分鐘。PCR 反應完畢後，以 0.8%洋菜膠體進行電泳分離，再以 gel extraction kit (Viogene)純化，最後使用雷射螢光 DNA 自動定序儀來進行 cDNA 的定序分析(源資國際生物科技公司)，所用之定序引子亦列於表二。共完成 21 個 PD 患者樣品的 cDNA 定序。. 五、台灣族群 LRRK2 基因 R767H 及 S885N 突變檢測. (一) R767H 的限制酶片段長度多型性(RFLP)分析. 13.

(26) 取 100 ng 的 gDNA 樣品，置入 25 l 的 PCR 反應溶液中，放大包含 R767H 突變點的片段，突變點所使用的引子對與 PCR 的反應條件詳列於表二。PCR 的產物以 1.4%洋菜膠體進行電泳檢查：取 2 l 的 PCR 產物，加入針對 R767H 設計的限制酶 BspHI (表二)，與反應溶液混合均勻(10 l 的切割反應)，置於 37℃水浴槽中反應 20 小時之後，再以 1.4%洋菜膠體進行電泳檢查，判別各樣品的基因型(表二)。 R767H 突變共分析了 172 個 PD 患者樣品及 310 個正常人樣品。. (二) S885N 的突變基因專一增幅聚合酶連鎖反應(ARMS-PCR)分析. 利用表二之突變點 S885N 專一增幅的正向引子 F2，其 3’端與變異點互補，並與反向引子 R 配對，增幅含 S885N 突變點由正向引子 F2 到反向引子 R 的片段(增幅片段 308 bp)。而反向引子 R 亦與另一正向引子 F1 配對(增幅片段 540 bp)，作為 PCR 反應的正控制組；每次 PCR 反應皆需有正控制組(樣品 H35 經 gDNA 定序驗證為 S885N 異型合子變異)。表二詳列引子的序列、PCR 的反應條件及增幅片段的長度，PCR 的產物以 1.4%洋菜膠體進行電泳檢查。S885N 突變共分析了 152 個 PD 患者樣品及 300 個正常人樣品。. 14.

(27) 六、LRRK2 基因 N551K、R1398H、R1628P、S1647T、G2385R、M2397T 多型性與台灣族群帕金森氏症感受性分析. (一) 聚合酶連鎖反應(PCR). 取 100 ng 的 gDNA 樣品，置入 25 l 的 PCR 反應溶液中，放大包含 N551K、R1398H、R1628P、S1647T、G2385R、M2397T 多型性的片段。表二詳列各多型性點使用的引子對與 PCR 的反應條件，PCR 的產物以 1.4%洋菜膠體進行電泳檢查片段大小。. (二)限制酶片段長度多型性分析(RFLP). 取 2 μl 的 PCR 產物，加入針對各多型性點設計的限制酶(表二)，與反應溶液混合均勻(10 l 的切割反應)，置於水浴槽中反應 2 小時至隔夜，再以 1.6% ~ 2.2%洋菜膠體進行電泳檢查，判別各樣品的多型性基因型。. (三)統計分析. 本研究共分析了約 200 個 PD 患者樣品及 200 個正常人樣品，其餘樣品為本實驗室芷英、雰茹、雅今、明慧、玄竺、亦鈞、維昕等人 15.

(28) 共同完成，合計 573 位 PD 患者及 503 位正常人數據，進行以下統計分析：計算各樣品群的多型性基因型數目，各多型性點有否符合哈溫平衡(Hardy-Weinberg equilibrium)以 Chi-square test (χ2)來進行檢測，並比較在 PD 族群與正常人族群之間，多型性基因型分佈及等位基因頻率是否有顯著差異。此外，各個多型性點之間聯鎖不平衡(linkage disequilibrium ，簡稱 LD) 的關係利用線上軟體 SNPSpD (http://genepi.qimr.edu.au/general/daleN/SNPSpD/) (Nyholt, 2004) 分析，得到校正後顯著水準為 5%的第一型統計誤差，作為判別是否達到顯著性差異的 α 值。配合 LDMAX 軟體計算出 Lewontin's 標準化不平衡係數(Lewontin’s standardized disequilibrium coefficient) D'、表達各 pairwise SNP 關係的 Δ2 值與特徵值 λs，以判斷各 SNP 間的聯鎖關係強弱。最後使用 JMP 5.1 軟體計算出 Odds ratio 的相對危險程度。. 七、LRRK2 基因 R767H 及 S885N 突變的功能分析. (一) pLRRK2-EGFP 與 pLRRK2-Myc-His 重組質體的建構. 首先將接在 pCMV6-XL4 載體上的野生型 LRRK2 cDNA 序列(含有 S1647T、M2397T 多型性) (來自 E. K. Tan, Singapore General Hospital)，以 PCR 的方法移除 LRRK2 的終止密碼並引入 BamHI 限制 16.

(29) 酶切位，接著置入 pEGFP-N3 質體，再利用限制酶 NotI 將帶有 LRRK2-EGFP 序列插入 pcDNA3 載體中，完成野生型 LRRK2 重組質體的建構(pLRRK2-EGFP)。將已建構好的帶有 LRRK2-EGFP 質體，利用限制酶 PstI 及 ApaI 切下包含 R767 及 S885 位置的片段，選殖到 pGEM-T 質體中，進行定點突變，得到 H767 及 N885 突變型質體。最後再將突變的片段接回 pLRRK2-EGFP 質體，完成 pLRRK2/R767H-EGFP、pLRRK2/S885N-EGFP 突變型重組質體的建構。構築好的野生型及突變型質體以限制酶切割進行確認。. 為了探討 LRRK2 蛋白與其它蛋白間的交互作用，設計兩條互補的引子，這對引子中包含 Myc tag 及 His6 tag，並引入 BamHI 及 XhoI 限制酶切位。此兩條互補的引子煉合後，用來替代 pLRRK2-EGFP 質體上包含 EGFP 的片段，即完成野生型及 R767H、S885N 突變型的 pLRRK2-Myc-His 重組質體的建構。將接上 Myc-His tag 的質體，利用限制酶切割及 cDNA 定序進行確認。. 上述接合好的 pLRRK2-EGFP 與 pLRRK2-Myc-His 重組質體使用電穿孔 (electroporation) (BIO-RAD, GENE PULSERII) 方法轉形 (transformation)進 E. coli 轉形勝任細胞中。挑選單一菌落，使用鹼性溶菌法(Sambrook et al., 1989)抽取小量質體 DNA，進行限制酶切割圖 17.

(30) 譜分析與 cDNA 定序。待確認無誤後，將選殖成功的野生型及 R767H、S885N 突變型重組質體 DNA 以 Plasmid Midi Kit (Geneaid) 進行大量製備與保存。. (二) 基因轉染及蛋白質表現分析. 接種 7×105 HEK-293T 細胞至 6 孔細胞培養盤。第二天，轉染 pEGFP-N1 、 pcDNA3 、 pLRRK2-EGFP ( 野生型及突變型 ) 或 pLRRK2-Myc-His (野生型及突變型)：取 250 μl 去血清且不含抗生素的 OptiMEM 培養液(Gibco)，加入 4 μl Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 混合均勻，另取 250 μl OptiMEM 培養液加入 4 μg 質體 DNA 混勻。將質體 DNA - OptiMEM 混合液與作用 5 分鐘後的 Lipofectamine OptiMEM 混合液，充分混勻並作用 20 分鐘後，在上述的 6 孔細胞培養盤中加入此 Lipofectamine - 質體 DNA - OptiMEM 混合液(500 μl)，進行細胞培養 6 小時，之後以含篩選抗生素的培養液換掉含 Lipofectamine 的培養液。. 轉染 48 小時後離心收集細胞，使用 PBS 清洗兩次，收集細胞的 pellets。接著加入適量且不含清潔劑的 hypotonic lysis buffer，於冰上作用 30 分鐘後，先以超音波震盪 30 下，再使用 14,000 × g 離心 15 ~ 18.

(31) 20 分鐘。將所得的上清液經蛋白質定量後，分別取 50 µg 的等量蛋白質，利用西方轉漬法及 LRRK2 (稀釋比例 1:200，Abgent)、GFP (稀釋比例 1:500，Santa Cruz)、Myc (稀釋比例 1:500，Santa Cruz)、β-actin (稀釋比例 1:5000，Novus Biological)抗體，分析在細胞中野生型與突變型 LRRK2-EGFP、LRRK2-Myc-His 融合蛋白表現的情形。. (三) 螢光顯微鏡觀察. (1)觀察 LRRK2-EGFP 融合蛋白於細胞中的表現. 接種 3×104 HEK-293T 細胞於 12 孔細胞培養盤中已使用 poly-L-lysine (100 μg/ml, Sigma)處理過的 coverslips。第二天轉染 pcDNA3、pLRRK2-EGFP (野生型及突變型) (0.5 μl Lipofectamine 2000、0.5 μg 質體 DNA)。隔天加入細胞週期抑制劑 oxaliplatin (5 μM, Sigma) (Flis and Spłwiński, 2009)，以抑制細胞分裂，使細胞內累積 LRRK2-EGFP 融合蛋白。培養 2、4 和 6 天後，將 Hoechst33342 核染劑(1 μg/ml)加到培養液中，置於 37℃避光作用 20 分鐘。染色完成之後移除培養液，使用 PBS 潤洗細胞兩次後，利用 Leica TCS SP2 螢光顯微鏡來觀察細胞的形態，以及綠螢光融合蛋白表現的情形與位置。. 19.

(32) (2)觀察 LRRK2-EGFP 於細胞中與胞器位置重疊情形. 接種 1×105 HEK-293T 細胞於 12 孔細胞培養盤中已使用 poly-L-lysine (100 μg/ml, Sigma)處理過的 coverslips。第二天轉染 pcDNA3、pLRRK2-EGFP (野生型及突變型) (方法如上述)。轉染 48 小時後進行染色，方法如下：. (A)觀察 LRRK2-EGFP 與粒線體位置重疊情形. 先加入 400 nM 的粒線體染劑(MitoTracker Red, Invitrogen)到培養液中，置於 37℃避光作用 40 分鐘之後，再將 Hoechst33342 核染劑(1 μg/ml)加到培養液中，置於 37℃避光作用 20 分鐘。染色完成之後移除培養液，使用 PBS 潤洗細胞兩次後，利用 Leica TCS SP2 螢光顯微鏡來觀察細胞的形態，以及綠螢光融合蛋白表現的情形與位置，並觀察其是否與粒線體位置重疊。. (B)觀察 LRRK2- EGFP 與內質網位置重疊情形. 在轉染載體及各重組質體時，共轉染內質網定位螢光質體 pDsRed2-ER (0.1 μg, Clontech)。轉染 48 小時後，將 Hoechst33342 核. 20.

(33) 染劑(1 μg/ml)加到培養液中，置於 37℃避光作用 20 分鐘。染色完成之後移除培養液，使用 PBS 潤洗細胞兩次後，利用 Leica TCS SP2 螢光顯微鏡來觀察細胞的形態，以及綠螢光融合蛋白表現的情形與位置，並觀察其是否與內質網位置重疊。. (四) 活細胞影像儀觀察. 接種3×104 HEK-293T細胞於24孔細胞培養盤中。第二天轉染 pEGFP-N1、pLRRK2-EGFP (野生型及突變型) (方法如上述)。隔天加入細胞週期抑制劑oxaliplatin (5 μM)，以抑制細胞分裂，使細胞內累積LRRK2-EGFP融合蛋白。培養2、4和6天後，利用活細胞影像儀來觀察細胞的形態，以及綠螢光融合蛋白表現的情形、聚集表現的分佈情況與團塊大小等。. 21.

(34) 肆、結果. 一、cDNA 定序檢測帕金森氏症患者 LRRK2 基因變異. (一) ANK、LRR、ROC domain 定序檢測. 針對 21 位 PD 患者的 ANK、LRR、ROC domain (相對應的 cDNA 位置為表現子 18~31)進行 PCR 增幅，增幅後片段大小為 2663 bp，PCR 產物於純化後進行定序分析，定序結果顯示於表三，共發現改變胺基酸的變異 R1398H G>A (rs7133914)，以及未改變胺基酸的變異 L953 T>C (rs7966550)、K1423 G>A (rs11175964)。. (二) COR、MAPKKK domain 定序檢測. 針對 21 位 PD 患者的 COR、MAPKKK domain (相對應的 cDNA 位置為表現子 32~44)進行 PCR 增幅，增幅後片段大小為 2322 bp， PCR 產物於純化後進行定序分析，定序結果顯示於表三，共發現改變胺基酸的變異 R1628P G>C (rs33949390) 、 S1647T T>A (rs11564148)，以及未改變胺基酸的變異 G1624 C>A (rs1427263)、. 22.

(35) K1637 A>G (rs11176013)、G1819 T>C (rs10878371)、N2047 T>C (novel)、E2108 G>A (rs10878405)。. N2047 T>C 多型性：位於表現子 42 的 N2047 T>C (AAT>AAC) 多型性，其異型合子的定序結果顯示於圖二。此多型性雖為新穎，但未改變胺基酸，因此並未進一步做族群檢測。. (三) WD40 domain 定序檢測. 針對 21 位 PD 患者的 WD40 domain (相對應的 cDNA 位置為表現子 44~51)進行 PCR 增幅，增幅後片段大小為 1896 bp，PCR 產物於純化後進行定序分析，定序結果顯示於表三，共發現改變胺基酸的變異 G2385R G>A (rs34778348)、M2397T T>C (rs3761863)。. 二、台灣族群 LRRK2 基因 R767H 及 S885N 突變檢測. (一) R767H G>A 突變. 位於表現子 19 的 R767H (CGT>CAT)突變會新增限制酶 BspHI (TCATGA)的切位，因此包含 R767H 突變點的 PCR 產物，會被限制酶 BspHI 由 573 bp 的片段切割成 419 bp 與 154 bp 兩片段(表二)。先 23.

(36) 前本實驗室所發現的 PD 患者 H873 為 R767H 突變的異型合子，其 PCR 產物經限制酶 BspHI 切割後同時顯現 573、419、154 bp 三片段。本研究於檢測表現子 19 片段的 172 位 PD 患者與 310 位正常人中，並未再度發現此突變。. (二) S885N G>A 突變. 位於表現子 20 的 S885N (AGT>AAT)突變，其定序結果顯示於圖三 A。由於此突變並未新增任何限制酶切位，因此使用突變基因專一增幅的聚合酶連鎖反應(ARMS-PCR)，來進行突變的確認與族群分析。突變基因的專一增幅產物為 308 bp，而 PCR 反應的正控制組產物為 540 bp (表二)。先前本實驗室所發現的 PD 患者 H35 為 S885N 突變的異型合子，其 PCR 產物會同時顯現 540、308 bp 片段(圖三 B)。本研究於檢測表現子 20 片段的 152 位 PD 患者與 300 位正常人中，新發現另一位患者 H1909 有此突變。. 三、LRRK2 基因 N551K、R1398H、R1628P、S1647T、G2385R、M2397T 多型性與台灣族群帕金森氏症感受性分析. 24.

(37) 多型性分析的 PD 患者共有 573 位，其中女性佔 44.7%，患者年齡分佈在 19 ~ 93 歲，平均年齡為 67.1 歲，平均發病年齡為 62.1 歲。另外控制組共分析了 503 位正常人，其中 49.3%為女性，年齡分佈在 20 ~ 90 歲，平均年齡為 59.4 歲。. (一) N551K、R1398H、R1628P、S1647T、G2385R、M2397T 多型性. N551K C>G 多型性：位於表現子 14 的 N551K (AAC>AAG)多型性會新增限制酶 EarI (GAAGAG)的切位，其 PCR 產物會由 186 bp 的片段被限制酶 EarI 切割成 166 bp 與 20 bp 兩片段(圖四 A)。. R1398H G>A 多型性：位於表現子 30 的 R1398H (CGT>CAT)多型性會新增限制酶 BspHI (TCATGA)的切位，其 PCR 產物會由 509 bp 的片段被限制酶 BspHI 切割成 299 bp 與 210 bp 兩片段(圖四 B)。. R1628P G>C 多型性：位於表現子 34 的 R1628P (CGT>CCT)多型性會新增限制酶 FspBI (CTAG)的切位，其 PCR 產物會由 157 bp 的片段被限制酶 FspBI 切割成 83 bp 與 74 bp 兩片段(圖四 C)。. 25.

(38) S1647T T>A 多型性：位於表現子 34 的 S1647T (TCA>ACA)多型性會使限制酶 AflIII (ACATGT)的切位消失，其 PCR 產物經限制酶 AflIII 切割後，會由 267 bp 與 82 bp 兩片段轉變成 349 bp 的片段(圖四 D)。. G2385R G>A 多型性：位於表現子 48 的 G2385R (GGA>AGA)多型性會新增限制酶 AccI (GTAGAC)的切位，其 PCR 產物會由 265 bp 的片段被限制酶 AccI 切割成 186 bp 與 79 bp 兩片段(圖四 E)。. M2397T T>C 多型性：位於表現子 49 的 M2397T (ATG>ACG)多型性會新增限制酶 TaaI (ACNGT)的切位，其 PCR 產物會由 754 bp 的片段被限制酶 TaaI 切割成 553 bp 與 201 bp 兩片段(圖四 F)。. PD 患者及正常人族群的 LRRK2 基因 N551K、R1398H、R1628P、 S1647T、G2385R、M2397T 多型性，依等位基因頻率與樣品總數(觀察值)，計算出期望的基因數(預期值)，經由 chi-square 分析後，上述多型性遺傳的情形皆處於哈溫平衡。. (二)聯鎖不平衡檢測. 26.

(39) 利用線上軟體 SNPSpD 的聯鎖不平衡相關矩陣 (Linkage disequilibrium correlation matrix)，計算 N551K、R1398H、R1628P、 S1647T、G2385R、M2397T 各個多型性點的特徵值(eigenvalue, λs，表四對角線上的斜體、粗黑數字)。特徵值愈大顯示多型性點間具有高度的相關性(Cheverud, 2001)，若所分析的多型性點皆聯鎖，則第一特徵值與多型性點的數值會相同(Nyholt, 2004)。表四中對角線上的數值即為特徵值，六個特徵值皆介於 0.12~2.37 之間，且第一特徵值 2.37 小於多型性點的數目 6，顯示此六個多型性點並非完全聯鎖。進一步以 LDMAX 軟體分析各多型性點之間聯鎖不平衡的程度，得到位於對角線上方的 Lewontin’s 標準化不平衡係數 D'，以及位於對角線下方的 squared pairwise correlations Δ2 值。在遺傳的傳遞下，D'越接近 1 表示此兩個多型性點越不易發生重組，Δ2 值若趨近 1 則表示此兩個多型性點聯鎖不平衡的關係越強烈。以此二值同時檢測此六個多型性點之間的聯鎖關係，發現 N551K 和 R1398H 間( D' = 0.94，Δ2 = 0.77 )，以及 S1647T 和 M2397T 間( D' = 0.93，Δ2 = 0.59 )，D'值與 Δ2 值皆較趨近於 1，表示此兩兩多型性點間不易發生重組且聯鎖不平衡關係較強烈。依據 SNPSpD 聯鎖不平衡檢測的結果，校正後 P 值須小於 0.0092，差異才達到顯著性。. 27.

(40) (三)多型性基因型及等位基因頻率. PD 患者與正常人族群的 N551K、R1398H、R1628P、S1647T、 G2385R、M2397T 多型性基因型、等位基因頻率及與疾病相關性顯示於表五。以 chi-square 檢定後，N551K、R1398H、R1628P、S1647T、 M2397T 多型性點的基因型分佈及等位基因頻率 P 值皆大於 0.0092，即未達到顯著性差異。但在 PD 族群與正常人族群之間，G2385R 的基因型及等位基因頻率 P 值分別為 0.0010、0.0013，即患者與正常人族群之間，G2385R 的基因型(9.2% vs. 4.2%)及等位基因頻率(4.6% vs. 2.1%)有顯著性差異。罹患風險分析更進一步地顯示，帶有 G2385R 的 GA 基因型或 A 等位基因，具有較高疾病罹患風險(Odds ratio = 2.34, 95% CI: 1.41-4.02, P = 0.0014 或 2.27, 95% CI: 1.38-3.88, P = 0.0017)。. (四)多型性配對分析. 將 PD 患者及正常人族群的 G2385R 多型性與 N551K、R1398H、 S1647T、M2397T 多型性，進行多型性的配對分析。各個多型性的配對分析所得之 P 值皆大於 0.0017，即未達到顯著性差異。而罹患風險分析也顯示，N551K、R1398H、S1647T、M2397T 多型性與 G2385R. 28.

(41) 多型性配對分析時，並未增加 G2385R 的 GA 異型合子(Odds ratio < 2.34, P > 0.0017)的罹病風險(表六)。. 四、LRRK2 突變之功能分析. (一) EGFP 標記的 LRRK2 cDNA 選殖. 野生型的 LRRK2 cDNA (含有 S1647T、M2397T 多型性)，經移除終止密碼並引入 BamHI 限制酶切位後，先 in-frame 接在 pEGFP-N3 質體的 EGFP 前，再利用限制酶 NotI 將帶有 LRRK2-EGFP 的序列插入 pcDNA3 載體中，即完成野生型 pcDNA3-LRRK2-EGFP 重組質體的建構(圖五)。將已建構好的重組質體利用限制酶 PstI 及 ApaI 切下包含 R767 及 S885 位置的片段，選殖到 pGEM-T 質體上進行定點突變，得到包含 H767 及 N885 突變片段的質體(圖六)。最後再將突變好的片段接回到原本的 pcDNA3-LRRK2-EGFP 質體上，完成突變型 pcDNA3-LRRK2/R767H-EGFP 及 pcDNA3-LRRK2/S885N-EGFP 重組質體的建構。構築好的野生型與突變型重組質體以限制酶切割圖譜分析進行確認，結果如圖七：(1)限制酶 NotI 及 PstI 會將 13860 bp 的片段切割為 4061 bp、3547 bp、2907 bp、1876 bp、1367 bp、84 bp、18 bp 共七個片段，(2)限制酶 PstI 及 ApaI 會將 13860 bp 的片段切割為 29.

(42) 4061 bp、3575 bp、1894 bp、1875 bp、1339 bp、1032 bp、84 bp 共七個片段，(3)限制酶 ApaI 及 XhoI 會將 13860 bp 的片段切割為 8326 bp、 5512 bp、22 bp 共三個片段，(4)限制酶 NotI 及 XhoI 會將 13860 bp 的片段切割為 8414 bp、5440 bp、6 bp 共三個片段。. (二) Myc-His 標記的 LRRK2 cDNA 選殖. 設計包含 Myc tag 及 His6 tag 的兩條互補引子，並引入 BamHI 及 XhoI 限制酶切位。這兩條互補引子煉合後，替代 pcDNA3-LRRK2-EGFP 重組質體上的 EGFP 片段，即完成 Myc-His 標記的野生型與 R767H、S885N 突變型重組質體的建構(圖八)。接上 Myc-His tag 的 LRRK2 重組質體，以限制酶切割圖譜分析進行確認，結果如圖九 A：(1)限制酶 EcoRV 及 XhoI 會將 13210 bp 的片段切割為 5425 bp、3262 bp、2646 bp、1877 bp 共四個片段，(2)限制酶 NotI 及 BamHI 會將 13210 bp 的片段切割為 7677 bp、5475 bp、58 bp 共三個片段，(3)限制酶 BamHI 及 XhoI 會將 13210 bp 的片段切割為 7735 bp、5382 bp、93 bp 共三個片段，(4)限制酶 XhoI 及 NotI 會將 13210 bp 的片段切割為 7770 bp、5440 bp 共兩個片段。同時進行 cDNA 定序分析，確認 Myc-His Tag 序列之正確性(圖九 B)。. 30.

(43) (三) EGFP、Myc-His 標記的 LRRK2 cDNA 表現. 將野生型與突變型的. pcDNA3-LRRK2-EGFP 、. pcDNA3-LRRK2-Myc-His 重組質體轉染至 HEK-293T 細胞中表現。 48 小時後蒐集細胞液，利用西方轉漬法進行分析，結果顯示於圖十。 LRRK2、GFP 抗體偵測到約 305 與 180 kDa 的野生型與突變型 LRRK2-EGFP 融合蛋白(圖十 A)。LRRK2、Myc 抗體偵測到約 282 與 180 kDa 的野生型與突變型 LRRK2-Myc-His 融合蛋白(圖十 B)。. (四) LRRK2-EGFP 融合蛋白的螢光顯微鏡觀察. 將野生型與突變型 pcDNA3-LRRK2-EGFP 重組質體轉染至 HEK-293T 細胞中表現。48 小時後將細胞染色，再利用 Leica TCS SP2 螢光顯微鏡來觀察細胞的形態，以及綠螢光融合蛋白表現的情形與位置。結果顯示野生型與突變型(R767H、S885N)的 LRRK2-EGFP 融合蛋白主要的分佈位置在細胞質(圖十一)，且與粒線體及內質網等胞器的位置重疊(圖十二)，顯示 LRRK2-EGFP 融合蛋白會在此兩種胞器中出現。野生型與突變型 LRRK2-EGFP 融合蛋白在細胞內表現的情況相似，並無明顯差異。. 31.

(44) (五) LRRK2-EGFP 融合蛋白的活細胞影像儀觀察. 將pEGFP-N1質體與野生型、突變型pcDNA3-LRRK2-EGFP重組質體轉染至 HEK-293T 細胞中表現。隔天加入細胞週期抑制劑 oxaliplatin，以抑制細胞分裂，使細胞內累積LRRK2-EGFP融合蛋白。培養2、4和6天後，利用活細胞影像儀來觀察細胞的形態，以及綠螢光融合蛋白表現的情形、聚集表現的分佈情況與團塊大小等。結果顯示野生型與突變型(R767H、S885N)的LRRK2-EGFP融合蛋白在細胞內形成聚集(aggregation)的情況一致，突變型LRRK2-EGFP融合蛋白在細胞內的聚集並無增加或減少的趨勢(圖十三)。. 五、突變及多型性的序列比對. 由 NCBI 搜尋各類哺乳動物(Human、Pan troglodytes、Canis lupus familiaris、Bos taurus、Mus musculus、Rattus norvegicus)的 LRRK2 基因序列，進行 R767H、S885N 突變及 N551K、R1398H、R1628P、 S1647T、G2385R、M2397T 多型性的序列比對(圖十四)。結果顯示在各物種之間除了 S1647T、M2397T 多型性不具高度保留性之外， R767H、S885N 突變及 N551K、R1398H、R1628P、G2385R 多型性皆具有高度的保留性。 32.

(45) 伍、討論. 一、LRRK2 基因突變. 體染色體顯性遺傳帕金森氏症與 LRRK2 基因突變有關，根據西方國家的統計，在顯性遺傳 PD 家族史的患者中，具有 LRRK2 基因變異者佔 13%，而偶發型 PD 患者中則佔 5% (Berg et al., 2005; Mata et al., 2006)。近年來的研究指出，在不同人種中 LRRK2 基因變異有很大的差異，如 G2019S 為白種人 LRRK2 基因最常見的突變(Deng et al., 2006)，而 R1628P 與 G2385R 變異已被證實分別為華人及亞洲人種罹患 PD 所特有的危險因子(Ross et al., 2008; Farrer et al., 2007)。由於 LRRK2 基因是引起顯性遺傳 PD 的重要基因，因此本實驗針對林口長庚紀念醫院提供之 PD 患者的 cDNA 進行 LRRK2 基因定序，定序分析結果顯示於表三。. (一) R767H 突變. R767H 突變在檢測的 172 位 PD 患者與 310 位正常人中，僅見於先前本實驗室 cDNA 定序所發現的患者(H873)，本研究並未再度發現此突變。. 33.

(46) R767H 突變位於 ANK domain，ANK 位於 LRRK2 基因的 N-端，由七個 Ankyrin repeats 所組成，每個 repeat 以 β-hairpin 或 loop 形成兩個反向平行的螺旋構造，使得 ANK 形成一個稍微彎曲的結構 (Mosavi et al., 2004)。Ankyrin repeats 廣泛地存在細菌與真核生物的蛋白質，包括細胞骨架蛋白、轉錄因子、訊息傳遞蛋白以及細胞週期調控因子等(Mosavi et al., 2004)。ANK domain 除了參與蛋白質和蛋白質之間的交互作用之外，並與 LRKK2 蛋白的結構有關。而人體其他蛋白於 ANK domain 上的突變與疾病的相關例子包括 Notch3 (Joutel et al., 1996)，以及其他像是細胞週期抑制因子 p16INK4a 有許多變異產生在 ANK domain 上，使得其腫瘤抑制因子的功能被抑制而造成腫瘤的產生(Russo et al., 1998; Ruas et al., 1999)。這些結果顯示 ANK domain 對蛋白質結構的重要性。. 從胺基酸的觀點來看，蛋白質結構的穩定性取決於極性胺基酸的側鏈。在不同帶電側鏈之間所形成的離子鍵，可以穩定蛋白質的結構。蛋白質結構的內部如果有未配對的帶電側鏈，結構的穩定性則會大大地被減弱。帶電殘基具有很強的親水性，通常會位於蛋白質的表面。R767H 突變雖然精胺酸(Arginine)與組胺酸(Histidine)同為帶正電荷的極性胺基酸，但是精胺酸所帶的電荷強度較組胺酸強，因此 34.

(47) R767H 突變可能會使 LRRK2 蛋白結構的穩定性減弱。故推測 R767H 突變會對 LRRK2 蛋白結構有所影響。. (二) S885N 突變. S885N 突變在檢測的 152 位 PD 患者與 300 位正常人中，除了見於先前本實驗室 cDNA 定序所發現的患者(H35)外，本研究新發現另一位患者(H1909)也有此突變。. S885N 突變位於 ANK domain 與 LRR domain 之間，此突變對 LRRK2 蛋白功能所造成的影響，根據先前本實驗室的研究發現， S885N 突變型 LRRK2 蛋白與 ARHGEF7 蛋白的交互作用顯著低於野生型 LRRK2 蛋白(張, 2011)，而 ARHGEF7 蛋白會幫助 LRRK2 蛋白上所結合的 GDP 轉換為 GTP (Haebig et al., 2010)，與 ARHGEF7 蛋白的結合減弱會進一步導致 LRRK2 蛋白降低 GTP 結合與 GTP 水解酶活性(Haebig et al., 2010)，故推測 S885N 雖不在具有 GTP 水解酶活性使 GTP 水解成 GDP 的 ROC domain 上，還是可能會影響 LRRK2 蛋白水解 GTP 的活性(張, 2011)，此有待日後進一步的驗證。. 二、LRRK2 基因多型性. 35.

(48) LRRK2 基因是引起顯性遺傳 PD 的重要基因。近年來許多研究報導，LRRK2 基因上的不同多型性點為不同族群中的 PD 危險因子。本實驗對其中六個改變胺基酸的多型性點 N551K、R1398H、R1628P、 S1647T、G2385R、M2397T 進行 573 個病例-503 個對照組研究。. N551K、R1398H、R1628P、S1647T、G2385R、M2397T 多型性在 PD 患者和正常人族群的基因型、等位基因頻率及與疾病相關性分析中，G2385R 的 GA 基因型及 A 等位基因頻率在 PD 患者和正常人間有顯著差異(表五)。本實驗結果顯示，G2385R 的 GA 基因型及 A 等位基因頻率在 PD 患者中較正常人高；帶有 G2385R 的 GA 基因型或 A 等位基因者，有較高的疾病罹患風險。2006 年 Di Fonzo 研究發現，在台灣族群中，G2385R 變異在 PD 患者的頻率較正常人高，但此變異在高加索人種中無法找到(Di Fonzo et al., 2006b)。2007 年 Farrer 發現，在台灣族群中，G2385R 變異在 PD 患者的頻率約為 8%，高於正常人的 4%頻率(Odds ratio = 2.24) (Farrer et al., 2007)。而在台灣與新加坡族群中，G2385R 變異在 PD 患者的頻率為 7.3%，顯著高於正常人的 3.6%頻率(Odds ratio = 2.1) (Tan et al., 2007)。本實驗結果與前人的研究報導相似。. 36.

(49) G2385R 及 R1628P 多型性被發現在華人族群中會增加 PD 的罹病風險，但這兩個多型性點並不會出現在高加索人種及一些亞洲民族間 (Ross et al., 2008)。同時具有 G2385R 與 R1628P 變異是否會使臨床病理的多樣性與嚴重性加深，仍是目前科學家欲探索的主題之ㄧ(Ross et al., 2008)。有研究指出，N551K 及 R1398H 多型性會降低 PD 的罹病風險；而 S1647T、R1628P、G2385R 會增加 PD 的罹病風險(Tan et al., 2010)。故本實驗進一步對六個多型性點進行配對分析，結果顯示 N551K、R1398H、S1647T、M2397T 等多型性並未降低或增加 G2385R 的 GA 基因型的罹病風險(表六)。本實驗結果與前人的研究報導不同，有待進一步的探討。. G2385R 變異位於 WD40 domain，WD40 domain 的結構類似螺旋槳，由七個 repeats 所組成，每個 repeat 形成四個反向平行的 β-plated sheet。WD40 domain 普遍地存在於人類的蛋白質中，包括細胞骨架組裝蛋白、轉錄調控因子，以及參與 vesicle 之生成與運輸的蛋白等 (Yu et al., 2000)。WD40 domain 可調控蛋白質和蛋白質之間的交互作用，科學家發現，在酵母菌 Cdc4 某些蛋白的 WD40 domain 可與磷酸絲胺酸及磷酸酥胺酸接合，調控細胞週期檢查點與活化 DNA 的轉錄 (Yaffe and Smerdon, 2004)。. 37.

(50) G2385R 變異有可能會造成 WD40 domain 的結構改變，損害 LRRK2 蛋白形成二元體(dimer)與鷹架(scaffold)而影響蛋白質和蛋白質間的交互作用(Ross et al., 2008)。甘胺酸(Glycine)是蛋白質 N-端進行肉荳蔻酸化(myristoylation)的主要區域，當面臨環境壓力時，肉荳蔻酸化在膜定位(membrane targeting)與訊息傳遞等方面扮演著重要的角色。而 G2385R 變異使得胺基酸由甘胺酸改變為精胺酸，當疏水性的甘胺酸被親水性的精胺酸所取代，增加了 WD40 domain 的淨正電荷與親水性，可能導致 LRRK2 蛋白與其他蛋白之間的交互作用喪失，或者有新的交互作用產生(Mata et al., 2006)。. 針對 G2385R 變異的功能研究指出，在氧化壓力環境中，G2385R 變異具高度細胞毒性並會大幅提升細胞凋亡，顯示 G2385R 變異可能具有參與促細胞凋亡機制 (pro-apoptotic mechanisms) 的能力 (Tan, 2006)。G2385R 變異的 LRRK2 蛋白會堆積在細胞質，導致細胞對氧化壓力的耐受性減弱，因而造成細胞程式性死亡(Tan et al., 2007)。在 G2385R 變異的 PD 患者的淋巴細胞株加入 MG-132 之後，細胞死亡的數目會比控制組來得顯著性的高(Lin et al., 2008)。這些研究結果顯示，Gly2385 在 LRRK2 蛋白的功能上扮演著重要的角色。目前 G2385R. 38.

(51) 變異對於 LRRK2 蛋白所造成的影響與 PD 的致病原因，仍有待進一步的研究。. 除了以上六個改變胺基酸的變異點之外，本研究亦發現七個靜默多型性/突變，其中六個已被報導過(L953、K1423、G1624、K1637、 G1819、E2108)而一個尚未被報導(N2047)。這些變異點並無改變胺基酸，故推測對 LRRK2 基因表現的影響可能不大。. 三、LRRK2 突變之功能分析. LRRK2 基因在前腦的大部分區域與中腦黑質紋狀體的多巴胺神經元皆有表現，LRRK2 蛋白大多位於突觸小泡、高基氏體、溶酶體、粒線體外膜及原生質膜等區域(Biskup et al., 2006; Higashi et al., 2007a)。外生性 LRRK2 蛋白廣泛地表現在細胞質，也會在粒線體表現(West et al., 2005)，甚至發現 LRRK2 蛋白在內質網和高基氏體皆有部份共位(partial co-localization)的現象(Gloeckner et al., 2006)。相關的研究結果顯示，LRRK2 基因可調控突觸小泡再循環、神經元生長，以及高基氏體、溶酶體和粒線體的正常功能，LRRK2 基因功能失常可能會危害多巴胺神經元的存活(Li and Beal, 2005)。. 39.

(52) 本實驗嘗試將野生型與 R767H 、 S885N 突變型 pcDNA3-LRRK2-EGFP 重組質體轉染至 HEK-293T 細胞中表現，利用螢光顯微鏡來觀察野生型與突變型 LRRK2-EGFP 融合蛋白在細胞中的表現及與胞器位置重疊情形。結果發現野生型與突變型 LRRK2-EGFP 融合蛋白的 EGFP 綠螢光，與 Hoechst33342 核染劑的藍螢光皆無重疊(圖十一)，顯示 LRRK2-EGFP 融合蛋白主要的分佈位置在細胞質，且野生型與突變型 LRRK2-EGFP 融合蛋白在細胞內表現的情形一致。而進一步的胞器染色顯微影像觀察發現，野生型與突變型的 LRRK2-EGFP 融合蛋白皆與粒線體、內質網等胞器的位置重疊(圖十二)，顯示 LRRK2-EGFP 融合蛋白會在此兩種胞器中出現；且不論為野生型或突變型，LRRK2-EGFP 融合蛋白與胞器位置重疊情形及表現情況皆相似，並無明顯差異(圖十二)。由於內質網是蛋白質轉譯後的修飾場所，而在內質網染色的顯微影像發現，R767H、S885N 突變型的 LRRK2-EGFP 融合蛋白皆與內質網有重疊(圖十二)，顯示 R767H 和 S885N 突變對 LRRK2-EGFP 融合蛋白進入內質網作修飾並不會造成影響。. 有報導指出，野生型與 G2385R 變異的 LRRK2 蛋白主要分佈在細胞質且會形成聚集(Tan et al., 2007)。G2385R 變異的 LRRK2 蛋白. 40.

(53) 堆積在細胞質時，會導致細胞對氧化壓力的耐受性減弱，因而造成細胞程式性死亡(Tan et al., 2007)。在 G2385R 變異的 PD 患者的淋巴細胞株加入 MG-132 之後，細胞死亡的數目會比控制組來得顯著性的高 (Lin et al., 2008) 。本實驗將野生型與 R767H 、 S885N 突變型 pcDNA3-LRRK2-EGFP 重組質體轉染至 HEK-293T 細胞中表現，隔天加入細胞週期抑制劑 oxaliplatin，利用活細胞影像儀來觀察細胞於培養 2、4 和 6 天後，細胞的形態、綠螢光融合蛋白表現的情形、聚集表現的分佈情況與團塊大小等。結果顯示野生型與突變型的 LRRK2-EGFP 融合蛋白在細胞內形成聚集(aggregation)的情況一致，突變型 LRRK2-EGFP 融合蛋白在細胞內的聚集並無增加或減少的趨勢(圖十三)。雖然結果與 G2385R 變異的報導不同，但此種於胺基酸改變後所形成的聚集，推測與 PD 的致病機轉應有相當程度的關聯，仍有待進一步的研究與探討。. 41.

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