雙叉桿菌及其胞外多醣的抗致突變機制與活性之研究

行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告

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※ 計畫中文名稱：雙叉桿菌及其胞外多醣的抗致突變 ※

※ 機制與活性之研究 ※

※ 計畫英文名稱：Study on the antimutagenic mechanism ※

※ and activity of bifidobacteria and their exopolysaccharide ※

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計畫類別：個別型計畫

計畫編號：NSC91-2313-B-002-306-執行期限：91 年 8 月 1 日至 92 年 7 月 31 日

計畫主持人：游 若 萩 教 授

計畫參與人員：羅 培 仁 博士班研究生

執行單位：國立臺灣大學食品科技研究所

中 華 民 國 九十二 年 十一 月

ii

行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告

雙叉桿菌及其胞外多醣的抗致突變機制與活性之研究

Study on the antimutagenic mechanism and activity of bifidobacteria and their

exopolysaccharide

計畫編號：NSC91-2313-B-002-306-執行期限：91 年 8 月 1 日至 92 年 7 月 31 日

主持人：游若萩 教 授 國立臺灣大學食品科技研究所

電子信箱：

yurc@ntu.edu.tw

使用安氏法（Ames test）之 Salmonella

typhimurium TA100 突變株，檢測數株益生 性 雙 叉 桿 菌 的 MRS 培 養 物 對 致 突 變 劑 benzo[a]pyrene（B[a]P）之抗致突變活性。 雙叉桿菌的 MRS 培養物對 S. typhimurium TA100 並不具有毒性與致突變性。大部分雙 叉桿菌的培養物顯示對 B[a]P 致突變性具有 50%以上的抑制效果。B. bifidum, B. lactis 與 B. longum 的抗致突變效果顯著地高於 B. adolescentis、B. breve 與 B. infantis。然而，

生物抗致突變活性較低。培養物與致突變因 子例如 B[a]P 及 S9 mix 預反應後的培養物 表現出特殊的抗致突變活性，在這些預反應 培養物之中，B. lactis 的抗致突變活性最 大。B. lactis 與 B. longum 細胞的抗致突變活 性較其細胞上層液大。當 B. lactis 細胞經過 pH 2.0（3 小時）或 1%膽汁（6 小時）處理 後，相較於控制組（pH 7.0，0 小時）顯示 其抗致突變活性增加。在連續酸性 pH 值與 膽汁處理後，雖然 B. lactis 活菌數低於 2.0 log cfu/ml，卻表現最高的抗致突變活性。 B[a]P 的致突變性隨著菌細胞與 B[a]P、S9 mix 及 B[a]P 代謝物的反應時間延長而降 低。依據反應時間的抑制作用結果顯示，細 胞對於 B[a]P 的抗致突變活性主要歸因於細 胞與 B[a]P 及其代謝物之間的交互作用。B. lactis 與 B. longum 的粗細胞壁顯示的抗致突 變活性大於熱處理之細胞與細胞萃出物。研 究顯示抗致突變性的主要機制是去致突變作 用，涉及雙叉桿菌、B[a]P 與 B[a]P 代謝物 之間化學複合物的形成，以及抑制 P450 的 代謝活化作用。 關鍵詞：雙叉桿菌、苯駢芘、安氏法、抗致 突變性 Abstract

Antimutagenic activities of MRS cultures of several probiotic bifidobacteria against a potent mutagen, benzo[a]pyrene (B[a]P), were examined by the Ames test using Salmonella

typhimurium TA100. MRS cultures of

bifidobacteria were neither toxic nor mutagenic. Most bifidobacterial cultures showed more than 50% inhibitory effect on B[a]P. B. bifidum, B.

lactis and B. longum showed significantly

higher antimutagenicity than B. adolescentis, B.

breve, and B. infantis against B[a]P; however,

the bioantimutagenic activities were lower. The cultures preincubated with mutagenic factors such as B[a]P and S9 mix displayed characteristic antimutagenic activities. Among these cultures, B. lactis exhibited the highest antimutagenicity. The cells of B. lactis and B.

longum showed higher antimutagenic activities

than their supernatants. When B. lactis cells were treated at pH 2.0 for 3 h or 1% bile for 6 h, its antimutagenic activities against B[a]P were increased as compared to controls at pH 7.0 for 0 h. After sequential acidic pH and bile treatments, B. lactis displayed the highest antimutagenic activity although its viable cells number was less than 2.0 log cfu/ml. The mutagenicity of B[a]P decreased as the reaction time of cells with B[a]P, S9 mix and B[a]P metabolites increased. According to this time-dependent inhibition study, the antimutagenicity of cells toward B[a]P was

2 chiefly attributed to an interaction of cells with B[a]P and B[a]P metabolites. Crude cell walls of B. lactis and B. longum showed higher antimutagenic activities than heat-treated cells and cell extracts. Sequential preincubation studies showed that the main mechanism of antimutagenicity is action of desmutagenicity, involving the formation of chemical complexes between bifidobacteria, B[a]P, and B[a]P metabolites, and the inactivation of P450-mediated metabolism.

Keywords ： bifidobacteria, benzo[a]pyrene,

Ames test, antimutagenicity 二、緣由與目的

雙叉桿菌是腸道內的正常棲息者，可發 揮多種有益於腸道健康的功效[1,2]。目前， 雙叉桿菌經常被做為益生菌相關製品的活性 成分[3]。Morotomi 與 Mutaip[4]及 Orrhage 等[5]探討腸道細菌，對致突變性雜環胺的結 合能力，發現活的細胞顯示的抗致突變活性 大於死的細胞。益生性雙叉桿菌與乳酸菌亦 顯示對雜環胺、亞硝基化合物與黃麴毒素等 的致突變活性具有抑制效果[6,7]。雖然雙叉 桿菌細胞對致突變劑的結合作用被認為是可 能的機制，雙叉桿菌的抗致突變機制仍未清 楚瞭解。 依據抗致突變作用的機制，可將抗致突 變劑歸類為去致突變劑或者生物抗致突變劑 兩類[8]。去致突變劑是以化學性或酵素不活 化作用直接地抑制致突變劑或致突變劑先 質，其可預防致突變活性物質與 DNA 的交 互作用。當 DNA 遭受致突變活性物質損傷 後，生物抗致突變劑則是作用在細胞內致突 變過程的參與因子或修復受損的 DNA，藉 以調節細胞內的改變而減低致突變活性物質 的 有 害 作 用 與 突 變 機 率 。 Benzo[a]pyrene （B[a]P）是產生自有機物質的不完全燃燒 或食物在高溫製備的過程，為廣泛存在的環 境與膳食的污染物，特別是在燒烤或煙燻的 肉類與魚類製品中的含量非常高[9]。在動物 餵與實驗結果顯示，B[a]P 是強的多環芳香 烴致癌劑，而其濃度的檢測值是環境或膳食 中致癌性多環芳香烴含量的指標[10]。 本研究的目的是利用安氏法以設計分段 式預反應試驗，檢測雙叉桿菌對 B[a]P 致突 變活性的抑制效果，藉以分析雙叉桿菌之可 能的抗致突變機制。此外，利用加熱法與超 音波破碎法，製備熱致死細胞與粗細胞壁及 細胞萃出物，並分別檢測其抗致突變活性與 反應後的 B[a]P 殘餘量，探討在不同的細胞 狀態與細胞部分對於抗致突變活性的貢獻。 三、結果與討論 一、雙叉桿菌 MRS 培養物對 B[a]P 致突變 性的抑制效果 測 試 的 雙 叉 桿 菌 MRS 培 養 物 （ 108 cfu/100 µl）對 B[a]P（0.3 µg/plate）致突變 性 的 抑 制 率 在 48.9-87.8% 。 其 中 以 B.

bifidum、B. lactis 與 B. longum 表現的抗致

突變性較佳，顯著地高於 B. adolescentis、B.

breve 與 B. infantis 的效果。再者，將 S. typhimurium TA100（3 ml）與 B[a]P（0.5 ml,

5 µg/ml）及 S9 mix（0.5 ml）預反應，顯示

B. breve、B. lactis 與 B. longum 之 MRS 培養

物對 DNA 損傷的 S. typhimurium TA100 細 胞之生物抗致突變活性表現較佳，但是其效 果 低 於 抗 致 突 變 性 。 Cassand 等 [11] 檢 測

Bifidobacterium sp. Bio Danone 173010 與 Bifidobacterium sp. CIRDC Danone 163040 製

備的發酵乳對 B[a]P（1 µg/plate）的抗致突 變效果，顯示的抑制率分別為 55.1 %與 59.0 %。 二、雙叉桿菌 MRS 培養物與 B[a]P 及 S9 mix 預反應的效果 評 估 雙 叉 桿 菌 MRS 培 養 物 對 B[a]P （0.5 µg/plate）被 S9 mix 代謝活化的影響。 首先將 MRS 培養物與 B[a]P 及 S9 mix 在 37 ℃下反應 20 分鐘，然後加入 S. typhimurium TA100 繼續反應 20 分鐘後測定其抗致突變 性。顯示 B. lactis 對 B[a]P 的代謝活化作用 具有顯著的抑制率（81.4 %）。Zhang 與 Ohta [12]研究發現 S. cremoris Z-25 對致突變 性熱解物（Trp-P-2）的結合效果主要歸因於 細胞壁骨架的胜太聚醣成分。此外，Zhang 與 Ohta [13] 亦發現 L. acidophilus IFO13951 的細胞壁骨架對 Trp-P-1 的結合作用是貢獻 出 菌 體 的 抗 致 突 變 性 之 重 要 原 因 。

3 Sreekumar 與 Hosono [14]探討 L. gasseri 與 B.

longum SBT 菌株的結合性質與抗致突變的

關係，發現細胞對 Trp-P-1（100 µg）的結合 率與抗致突變的抑制率亦呈現正的相關性， 並顯示結合型 Trp-P-1 並不具有活性與經過 純化的細胞壁（purified cell wall; PCW）的 結 合 率 大 於 粗 的 細 胞 壁 （ crude cell wall; CCW）與胜太聚醣，這些結果顯示致突變 性 熱 解 物 的 結 合 主 要 歸 因 於 細 胞 壁 。 Sreekumar 與 Hosono[14] 在鑑定 L. gasseri SBT 10239 與 10241 的 Trp-P-1 結合位研究 結果發現，細胞對 Trp-P-1 的結合能力降 低，與碳水化合物成分的含量呈現高度的正 相關性，並顯示葡萄糖在細胞壁與 Trp-P-1 的結合上扮演重要的角色。 三、雙叉桿菌 MRS 培養物與 S9 mix 及 S. typhimurium TA100 預反應的效果 MRS 發酵物與 S9 mix 及 S. typhimurium TA100 在 37℃下反應 20 分鐘，然後加入 B[a]P（0.5 µg/plate）繼續反應 20 分鐘後檢 測其抗致突變性，藉以探討雙叉桿菌 MRS 培 養 物 對 S9 mix 的 代 謝 活 性 與 S. typhimurium TA100 的 致 突 變 敏 感 性 之 影 響。顯示 B. lactis 培養物對 B[a]P 致突變性 的抑制率（90.3 %）最高，而其他雙叉桿菌 的抗致突變性普遍降低而僅有 21.0∼45.7 %。 Lankaputhra 與 Shah [6] 將多株的雙叉 桿菌在 MRS broth 培養 18 小時（37℃） 後，分析有機酸的產量與其抗致突變性效 果，結果發現丁酸與醋酸對多種的致突變劑 與致突變劑先質具有強的抗致突變活性。 Smith [15] 指出丁酸能夠誘發基因表現上的 改變而防止 DNA 的致突變與致癌效應，例 如轉錄速率（transcription rate）的影響、藉 由 DNA 合成的抑制進而阻止細胞的增殖作 用與改變細胞型態使癌細胞回復正常的細胞 特性，由於這方面的證據甚少，故仍須進一 步探討。因此，乳酸菌的抗致突變活性部分 可能是來自於有機酸代謝產物的貢獻。 Sreekumar 與 Hosono [16] 探 討 B. longum PS＋對 Trp-P-1 致突變性的抑制效 果，發現未純化的多醣可能藉由結合或阻礙 致突變劑及其活化代謝物與細胞之間的交互 作用，進而影響雙叉桿菌與致突變劑的活 性。因此，雙叉桿菌的胞外多醣顯然在抗致 突變作用上扮演著重要的角色。Challa 等 [17] 發現 B. longum 可刺激結腸黏膜的麩胱 甘 太 轉 移 鋂 （ glutathione S-transferase; GST）活性的上升。GST 是參與 PhaseⅡ酵 素的成員之一，催化親電子性基因毒物或其 代 謝 物 （ 例 如 B[a]P 代 謝 活 化 型 態 的 BPDE ） 與 氫 硫 基 化 合 物 （ 例 如 glutathione 、 cysteine ） 結 合 ，然後以 GSH 結合物（conjugates）的形式分泌於膽汁中 或進一步被代謝形成 mercapturic acid，使致 突變/致癌劑的基因毒性與細胞毒性的能力 喪 失 [18] 。 因 此 ， 推 測 雙 叉 桿 菌 可 能 在 MRS broth 培養的過程中產生多種的代謝產 物，然而對致突變劑的抑制效果則隨著菌種 活 性 的 差 異 而 不 同 ， 並 且 可 能 影 響 S. typhimurium TA100 對 致 突 變 作 用 的 敏 感 性，進而表現出不同的抗致突變活性。 四、雙叉桿菌 MRS 培養物中的細胞與上層 液對 B[a]P 致突變的抑制效果 為了進一步瞭解雙叉桿菌 MRS 培養物 對 B[a]P 的 抗 致 突 變 效 果 ，因此選取 B. lactis 與 B. longum 的 MRS 培養物，以離心 區分細胞與上層液後分別測定對 B[a]P（0.5 µg/plate）的抗致突變效果。顯示 B. lactis 與 B. longum 的菌細胞對 B[a]P 致突變性的抑 制率分別為 75.9%與 61.2%，而上層液部分 則為 10.3%與 7.8%，細胞的抗致突變效果約 為培養上層液的 7∼8 倍。因此，細胞為 MRS 培養物抑制 B[a]P 致突變活性的重要 因 子 。 B. lactis 細 胞 經 過 pH 7.0 （ 0 h, control）與 pH 2.0（3 小時）的 PBS 溶液或 含 1%膽汁的 MRS 培養基（pH 6.5，6 小 時 ） 的 處 理 後 ， 可 提 高 B. lactis 表 現 對 B[a]P 的抗致突變活性。El-Nezami 等[19] 發現酸處理可能改變細菌的細胞壁結構而使 致突變劑較容易與細胞壁或細胞膜成分接觸 而結合所致。Tanaka 等[20] 發現雙叉桿菌 具有結合型膽鹽水解鋂（conjugated bile salt hydrolase）活性，催化結合型膽鹽水解而轉 變 成 胺 基 酸 殘 基 與 去 結 合 型 膽 鹽 。 而

4 Yamada 等[21] 與 Hayatsu 等[22] 發現部分 的膽汁鹽分解產物具有抗致突變活性。再 者，連續的酸性 pH 值與膽汁處理後，雖然

B. lactis 存活菌數降低至 2.0 log cfu/ml 以

下，然此菌株顯現對 B[a]P 的抗致突變活性 最高，抑制率為 71.5%。 五、雙叉桿菌的細胞對 B[a]P、S9 mix 與 B[a]P 活化代謝物的抗致突變效果 B. lactis 與 B. longum 的 PBS 細胞懸浮 液分別與（1）B[a]P（0.1 ml, 3 µg/ml）、 （2）、S9 mix 及（3）B[a]P（0.1 ml, 3 µg/ml）＋S9 mix 預反應 0, 20, 40 分鐘後， 測定雙叉桿菌的細胞之抗致突變性。藉以探 討細胞抑制 B[a]P 致突變性的作用機制與反 應時間對抗致突變性的影響。顯示（1）細 胞對致突變劑先質 B[a]P 的抑制效果隨著菌 細胞與 B[a]P 預反應的時間延長而增加。B. lactis 的抑制效果大於 B. longum，在無預反 應時間的情況下顯示的抑制率為 81.4 %，並 且在 40 分鐘預反應後的抗致突變活性顯著 地增加（91.1 %）。B. longum 則需要在 40 分鐘預反應後，對 B[a]P 致突變性的抑制效 果才能達到 85.2 %。（2）細胞對於 S9 mix 代謝活性的影響結果顯示，B. lactis 的細胞 對 B[a]P 的抗致突變性隨著菌細胞與 S9 mix 的 預 反 應 時 間 的 延 長 而 增 加 。 例 如 ， B. lactis 細胞與 S9 mix 預反應 40 分鐘後，對 B[a]P 致突變性的抑制率可達到 69.8%。B. longum 的細胞與 S9 mix 預反應 0 與 20 分鐘 後，對 B[a]P 致突變性的抑制效果並無改變 （64.0∼64.1%），延長至 40 分鐘後則抑制 B[a]P 致 突 變 性 的 效 果 顯 著 地 降 低 （52.1%）。（3）細胞對代謝 B[a]P 活化物 致突變性的影響，結果顯示在預反應 20 分 鐘後，B. lactis 與 B. longum 的細胞之抑制效 果顯著地提高。在 40 分鐘預反應顯示，B. longum 的細胞對 B[a]P 活化代謝物的致突變 性 之 抑 制 率 （ 89.6% ） 則 較 大 於 B. lactis （81.8%）。基於上述結果顯示，B. lactis 與 B. longum 的細胞對 B[a]P 致突變性的抑制 效果主要是歸因於細胞與 B[a]P 及 B[a]P 活 化代謝物之間的交互作用，而細胞可能影響 S9 mix 的代謝活化作用，隨著菌株種類的不 同而異，通常需要較長的反應時間才具有顯 著的抑制效果。然而，不能排除 B[a]P 代謝 物彼此間的交互作用與抑制 S9 mix 酵素的 活性。 六、雙叉桿菌的活細胞、熱處理細胞、未純 化的細胞壁與細胞萃出物對 B[a]P 的抑制作 用 B. lactis 與 B. longum 的活細胞、熱處理 細 胞 、 未 純 化 的 細 胞 壁 與 細 胞 萃 出 物 與 B[a]P（5 µg/ml）預反應後，以離心收集反 應上層液，然後測定反應上層液中剩餘的致 突變性與 B[a]P 量。顯示 B. lactis 活細胞（8 ∼9 log cfu/plate）對 B[a]P 致突變性的抑制 率為 81.7%，經過熱處理（100℃, 20 min） 後的死細胞之抗致突變性則顯著地降低至 31.7%，而未純化的細胞壁部分對 B[a]P 的 抗致突變性（61.0%）顯著地大於細胞萃出 物（22.0%）。在反應上層液中的 B[a]P 殘 餘量檢測結果顯示，B[a]P 的初始濃度為 0.5 µg/0.1 ml，經過與 B. lactis 的活細胞預反應 後的殘餘量為 0.043 µg，而熱致死細胞僅將 反應上層液中的 B[a]P 量降低至 0.32 µg，表 示活細胞的移除效果大於熱致死細胞。同樣 地，未純化的細胞壁對反應上層液中 B[a]P 的降低能力則高於細胞萃出物，B[a]P 殘餘 量分別為 0.16 µg 與 0.38 µg。類似的結果亦 出現在 B. longum 的試驗。因此，活細胞對 B[a]P 致突變性的抑制效果與降低殘餘量的 能力大於熱致死細胞，且其抑制作用主要來 自未純化的細胞壁部分，其次是細胞萃出 物。表示活細胞抑制 B[a]P 致突變性的作用 機制，主要是藉由細胞壁部分與 B[a]P 或 B[a]P 活化代謝物之間的交互作用，藉由結 合 或 其 它 化 學 及 酵 素 的 作 用 將 B[a]P 與 B[a]P 活化代謝物移除或不活化。 四、計畫成果自評 本研究計畫成果報告內容與原申請研究 計畫書內容相符，並達成預期目標。 研究成果具學術及應用價值，適合在學 術期刊發表。 五、參考文獻

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