氣喘及免疫調節的藥效評估及開發

行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告

氣喘及免疫調節的藥效評估及開發

研究成果報告(精簡版)

計 畫 類 別 ： 個別型 計 畫 編 號 ： NSC 95-2323-B-002-008- 執 行 期 間 ： 95 年 08 月 01 日至 96 年 07 月 31 日 執 行 單 位 ： 國立臺灣大學醫學院臨床醫學研究所 計 畫 主 持 人 ： 江伯倫 計畫參與人員： 碩士級-專任助理：蔡幸娟 處 理 方 式 ： 本計畫可公開查詢

中 華 民 國 96 年 11 月 07 日

行政院國家科學委員會補助專題研究計畫

■ 成 果 報 告

□期中進度報告

氣喘及免疫調節的藥效評估及開發

計畫類別：■ 個別型計畫 □ 整合型計畫

計畫編號：NSC95－2323－B－002 －008

執行期間： 95 年 8 月 1 日至 96 年 7 月 31 日

計畫主持人：江伯倫教授

共同主持人：

計畫參與人員：蔡幸娟

成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：■精簡報告 □完整報告

本成果報告包括以下應繳交之附件：

□赴國外出差或研習心得報告一份

□赴大陸地區出差或研習心得報告一份

□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份

□國際合作研究計畫國外研究報告書一份

處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、

列管計畫及下列情形者外，得立即公開查詢

□涉及專利或其他智慧財產權，□一年□二年後可公開查詢

執行單位：台大醫學院臨床醫學研究所

中 華 民 國 96 年 10 月 31 日

報告內容: 一、 前言 這幾年過敏疾病有逐年增加的趨勢，所以如何來開發過敏性氣喘的新藥物已經是個刻 不容緩的問題。這幾年來生物藥劑的開發逐漸受到重視，所以如何來開發包括如中藥、民 間藥或是海洋生物在內的天然藥物，甚或者目前已經使用中的藥物，能夠應用在過敏性氣 喘的治療上，對整個藥物及生物製劑的開發其實應該具有舉足輕重的地位。本研究計畫的 主要目的便是要利用樹突細胞建立一個試管內的藥物活性評估的平台，再加上體內的氣喘 功能改善的功能測定，來開發能夠應用在過敏性氣喘治療的藥物。 二、 研究目的 過敏性氣喘主要是由第二型 T 輔助細胞(Th2)及相關的細胞激素如介白質-4、介白質-5 和介白質-13 等，會幫助 B 細胞製造 IgE 過敏抗體，遇到過敏原時便會刺激肥大細胞而釋 放出來發炎物質。這些發炎性物質會造成氣管的收縮、黏液的分泌和血管的擴張，而導致 症狀的發生。目前的研究證據顯示如果藥物能夠有效地將過敏免疫反應調節成第一型 T 輔 助細胞，這些的藥物或是生物製劑便可能應用到氣喘疾病的治療上。最近幾年最明顯的例 子便是 BCG 和 CpG motif，這兩類跟結核桿菌(mycobacteria)相關的生物製劑，便發現可 以誘發良好的第一型 T 輔助細胞的活性，所以已經被許多生物科技公司認為是用在氣喘治 療上的下一波藥物。 而在抗原呈現細胞中，樹突細胞(dendritic cells, DC)又被稱為專業的抗原呈現細 胞，且被認為是控制免疫反應極為關鍵的細胞。這幾年由於樹突細胞的培養愈來愈方便， 所以有相當的研究及治療可以利用培養的樹突細胞來達到。近年來的研究顯示，樹突細胞 在誘發與調控免疫反應上扮演重要角色。而且，來源不同的兩種樹突細胞 - myeloid 樹突 細胞和 lymphoid 樹突細胞，對於 T 細胞的的發育會導致完全不同的影響。樹突細胞被認 為是體內負責加工並呈獻抗原最重要的抗原呈獻細胞。目前已證明樹突細胞加入 GM-CSF、 TNF-　和 IL-4 等細胞激素後便可成功的在活體外培養。有許多實驗已驗證活體外培養的樹 突細胞在許多模式中都可以誘發第一類和第二類 MHC 分子限制的免疫反應。以往的觀念 中，將 T 細胞的活化分成兩訊息傳導。最近的研究顯示樹突細胞在 T 細胞的活化上更扮演 了一個主導 T 細胞發育的角色，所以抗原在與樹突細胞接觸時便已經決定了 T 細胞的功能。 舉例來說，CpG motif 會刺激第一型 T 輔助細胞的發生，主要是因為 CpG motif 會刺激樹 突細胞分泌較高的 IL-12 而幫助 T 細胞的發育。所以如果能夠在試管內將生物製劑或是天 然藥材與樹突細胞一道培養，來測定樹突細胞的表面標記和細胞激素的分泌，能夠來找出 更有效的藥物來誘發較高的第一型 T 輔助細胞活性。我們在生技製藥計畫中提出一個建立 篩選可能應用在過敏性氣喘治療的藥物平台，先利用一個試管內樹突細胞篩選的方法來大 量篩選藥物，再進一步找出一些特定的藥物來進行動物模式的研究。未來甚至可以利用這 些找出來的基因和分子來更快地來找出能夠應用在過敏疾病治療上的藥物。 也因此，我們能夠利用這些培養的樹突細胞來進行相關的研究。利用樹突細胞當成一 個技術平台來篩選可能的佐劑，能夠應用在促進免疫功能，進而可以用在腫瘤的免疫治療 上。舉例而言，一個特定的製劑可刺激樹突細胞分泌細胞激素如跟第一型 T 輔助細胞相關 的 IL-12，或是增加與免疫反應相關的輔助分子(accessory molecules)，如第二型 MHC 分 子和 B7.1 分子，也可能會將增進免疫反應，而達到治療過敏疾病的效果。如此，可以利用 目前已經相當成熟的樹突細胞培養，來檢視一些特定的製劑是否在未來可能應用在過敏疾 病的免疫療法上的應用。

三、研究方法

樹突細胞(dendritic cells, DCs)的培養方式的建立 1. 分離並培養源自骨髓之樹突細胞

老鼠犧牲後，將骨髓細胞加入 GM-CSF(500U/ml) 和 IL-4 (1000U/ml) 培養便可得樹突 細胞以供後續實驗使用。

2. 分析所培養的樹突細胞之細胞表面標記

為了進一步確定樹突細胞的表面標記，我們利用可辨識第二類 MHC 分子、B7-1 和 B7-2 的各種抗體來分析我們所培養的樹突細胞表面上所帶的表面標記分子。染色後的細胞清洗 後將其置於含有 0.1% sodium azide 的 PBS 中成為 0.5ml 的細胞懸浮液，再以 FMF 分析。 以適當的分析軟體 (FACScan, Becton Dickinson, Mountain View, CA) 計算 10,000 顆細 胞中，每顆細胞所帶細胞表面分子的頻率與密度。以沒有染色的細胞置於培養基中當作對 照組。 同源異個體混合淋巴球反應 為了確定所培養的樹突細胞可以刺激同源異個體之 T 細胞，我們將來自 Balb/c 品 系老鼠之樹突細胞與來自 B6 品系老鼠之 T 細胞一起培養。細胞在 37°C、5% CO2 的狀態 下培養 5 天後，在收細胞前 18 小時加入 1µCi 的 [3H] TdR。 再以液體閃爍計數器計 算嵌入細胞內的 TdR 含量，並且用刺激指數 (stimulation index；S.I.)來表示實驗結 果。 選定的藥物對 DC 表面抗原呈現的影響 為了進一步了解這些特定的佐劑是否會影響樹突細胞的表面標記表現，我們將用不同 濃度的試劑對 DC 表面抗原呈現的影響；用特定濃度的佐劑來分析其對不同時間培養的 DC 表面抗原呈現的影響。利用可辨識第一及二類 MHC 分子、CD40、B7-1 和 B7-2 的各種抗體 來分析我們所培養的樹突細胞表面上所帶的表面標記分子。染色後的細胞清洗後將其置於 含有 0.1% sodium azide 的 PBS 中成為 0.5ml 的細胞懸浮液，再以 FMF 分析。以適當的 分析軟體 (FACScan, Becton Dickinson, Mountain View, CA) 計算 10,000 顆細胞中，每 顆細胞所帶細胞表面分子的頻率與密度。以沒有染色的細胞置於培養基中當作對照組。 選定的藥物對 DC 分泌細胞激素的影響 為了進一步研究想要開發的佐劑是否會影響到樹突細胞的細胞激素分泌，用不同濃度 的試劑對樹突細胞分泌細胞激素的影響；試劑來分析其對不同時間培養的樹突細胞分泌細 胞激素的影響。我們將與試劑一道培養的樹突細胞的上清液分離出，樹突細胞分泌細胞激 素的含量以三明治型 ELISA 來測定。簡單的說，先將抗細胞激素抗體以 NaHCO3 緩衝液 (pH9.6) 稀釋後加入 96 孔微量培養盤於 4°C 靜置過夜。第二天將培養盤清洗 3 次後，以 含 3% BSA 之 PBS 在室溫下反應 1 小時以阻斷 96 孔培養盤。加入待測樣本可於 37°C 反應 2 小時或置於 4°C 反應過夜。培養盤在反應過後清洗乾淨，然後加入以 1% BSA-PBS 緩衝 液稀釋之 biotin-conjugated 抗細胞激素抗體於室溫反應 1 小時。接著加入

streptavidin - conjugated peroxidase 再反應 1 小時。最後在清洗後每孔加入 0.2 ml 的 酵素受質溶液 (以 4mg 的 O-phenylenediamine 溶於 20 ml 含有 0.001% H2O2 之 0.1M phosphate- citrate 緩衝液)，避光置於室溫約 30 分鐘。 然後以 microplate autoreader 讀取波長 450 nm 的吸光值。

老鼠致敏步驟與過去實驗所述相似 (Lee et al)。先以 10g 卵白蛋白 (OVA) 與 2 mg Alum 加上 400ng 百日咳毒素 ( List Biological lab. Inc., CA, USA) 當作佐劑後，腹腔注 射置老鼠體內。再分別於第 0、14、28 和 42 天，以相同劑量之 OVA 和 PT 佐劑重複注射 老鼠。將 6 到 8 隻老鼠同時置於密閉容器中，以霧化器(DeVilbiss, Somerset, PA) 將 OVA 抗原化成可吸入粒子後，讓老鼠在此密閉容器內吸入抗原超過 20 分鐘。霧化器會以 0.3 ml/min 的速率送出 0.5-5 m 的抗原顆粒分子。 支氣管肺泡沖洗液與組織病理學研究 最後一次吸入抗原 24 小時後，將所有的老鼠眼窩採血後犧牲。然後立即將自支氣管插管以 1 ml 不含鈣鎂離子之 HBSS 灌洗三次至老鼠肺部後收集起來。將所收集的肺泡沖洗液以 400 xg 的轉速在 4oC 下離心 10 分鐘。離心後所得之細胞懸浮於 1 ml HBSS 中，然後以 hemocytometer 計算細胞總數。 接著以 Cytocentrifuged preparations 將細胞固定於玻 片上後再進行劉氏染色(Liu's stain) 以計算各類細胞之數目。各類細胞數目以 200 顆細 胞中巨噬細胞、淋巴球、嗜中性球與嗜伊紅性白血球各自所佔之數目來計算，並且根據其 標準型態來分類。組織病理分析實驗的部分，取得肺泡沖洗液後就立即將其肺臟取下以 3% v/v formalin 溶液 (以 0.01M phosphate buffer 配製；pH 7.2 ) 固定。組織以 paraffin 包埋後切成 5 m 後的切片。此組織切片以 hematoxylin-eosin 染色，然後以顯微鏡觀察 其病理變化。

測定支氣管肺泡沖洗液中 serotonin 和 eotaxin 的含量

支氣管肺泡沖洗液 (BAL) 中 serotonin 的含量以 serotonin ELISA kit (IBL, Hamburg, Germany) 來測定，其操作步驟則依 ELISA kit 製造商所指示。 BAL 中 serotonin 的濃度 以波長 405nm 所讀取之吸光值帶入標準曲線則可換算得其濃度。此測試之靈敏度可達 0.03 ng/ml。

測定 OVA 專一性抗體的 ELISA

將 0.5mg 抗原溶於 100ml carbonate coating buffer 加入微量培養盤於 4C 靜置過夜。第 2 天以含有 0.05% Tween 20 之 1X PBS 緩衝液清洗微量培養盤。然後以 blocking solution (含有 1% BSA-0.05% Tween 20 之 1X PBS 緩衝液) 阻斷微量培養盤，再清洗 3 次。接著加 入 100 l 待測樣本(若待測物是血清或腹水則以 blocking solution 稀釋) 反應，反應後 再清洗 6 次。然後加入 100ml 抗老鼠 IgG 或 IgM 抗體進行反應再清洗 6 次。上述反應皆 在 37C 進行 45 分鐘，在移至室溫反應 15 分鐘。最後，再加入 100 l ABTS ( 2.2'-Azino- bis-3- Ethylbenzthiazoline -6-Sulfonic Acid)受質溶液於室溫呈色約 30 分鐘後，以 100ml 之 5% SDS 終止反應，並以 microplate reader 讀取吸光值。 OVA 專一性增生反應測試 為了測試抗原刺激，老鼠接種抗原刺激後 28 天將其犧牲，取其脾臟細胞製成單一細胞懸浮 液以 2x106/ml 的細胞濃度分別加入與不同濃度抗原一起培養。細胞在 37C、5% CO2 的狀 態下培養 5 天後，在收細胞前 18 小時加入 1Ci 的 [3H] TdR。 再以液體閃爍計數器計算 嵌入細胞內的 TdR 含量，並且用刺激指數 (stimulation index；S.I.)來表示實驗結果。 細胞激素的測定

脾臟細胞分泌細胞激素的含量以三明治型 ELISA 來測定。簡單的說，先將抗細胞激素抗體 以 NaHCO3 緩衝液 (pH9.6) 稀釋後加入 96 孔微量培養盤於 4C 靜置過夜。第二天將培養盤 清洗 3 次後，以含 3% BSA 之 PBS 在室溫下反應 1 小時以阻斷 96 孔培養盤。加入待測樣本 可於 37C 反應 2 小時或置於 4C 反應過夜。培養盤在反應過後清洗乾淨，然後加入以 1% BSA-PBS 緩衝液稀釋之 biotin-conjugated 抗細胞激素抗體於室溫反應 1 小時。接著加入 streptavidin - conjugated peroxidase 再反應 1 小時。最後在清洗後每孔加入 0.2 ml 的 酵素受質溶液 (以 4mg 的 O-phenylenediamine 溶於 20 ml 含有 0.001% H2O2 之 0.1M phosphate- citrate 緩衝液)，避光置於室溫約 30 分鐘。 然後以 microplate autoreader 讀取波長 450 nm 的吸光值。此三明治型 ELISA 的靈敏度，IL-4 為 15 pg/ml，而 IFN-g 是 20 pg/ml。 小鼠呼吸道阻力 我們將利用 plethymography 的方法來測定小鼠的呼吸道阻力，以了解小鼠的呼吸道阻力是 否受到改善。 建立生物晶片來評估樹突細胞的功能 在未來如果有更多的藥物需要篩選，可能需要更多而且更快地篩選方法。為了能夠更 大規模地來篩選能夠調節免疫功能的新藥物，如果能將一些主要的相關基因或蛋白利用生 物晶片的方式建立起來。未來可以利用更少數的樹突細胞和藥物來進行更大規模的篩檢， 來找出有效的成份。所以我們考慮將一些相關的基因或是蛋白如 IL-12、IL-18 或是 IFN-a 等利用生物晶片的方式來大量篩選藥物。 結果與討論 1) 目前已經篩選到六個 pure compounds，進一步已經在進行動物實驗中，預計今年度 便可以完成所有的實驗。而且初步的動物體內研究已經證實其中幾個 compounds 具 有促進免疫功能的效果，而且可以在動物的氣喘模式達到改善呼吸道發炎的目的。 這些成果計畫在完成所有實驗後，便可以展開申請專利的步驟。 2) 建立試管內培養樹突細胞的方法來篩選可能促進免疫功能和改善過敏免疫機能的藥 物和保健食品的方法，將可以進一步在未來用來篩選更多的藥物。有關這方面的技 術轉移，我們已經在上次的成果報告中跟業界報告，也有相關方面有意願，與研究 室在洽談中。 四、具有後續研究發展潛力之成果簡述：(未來可進行招商技轉或專利申請之案件)[如涉及 研發成果之機密性，可以代號呈現之] 目前有兩個藥物已經可以即將完成所有的試管和動物實驗，其中包括 600023 和 nstp1400041 等兩種純化物都即將完成所有完整的動物實驗，可望將這個純化物進行到藥 物的開發。 五、其他成果 本研究計畫在執行的過程中也已經發表兩篇論文：

Ganoderma lucidum induced activation and maturation of human monocyte-derived dendritic cells by the NF-kB and p38 mitogen-activated protein kinase pathways. J Leuko Biol 2005; 78:533-543.

2)

Lin, Y.-L., Lee, S.-S., Hou, S.-M. and Chiang, B.-L. Polysaccharide Purified from

Ganoderma Lucidum Induce Gene Expression Changes in Human Dendritic Cells and Promote Th1 Immune Response in BALB/c Mice. Mol Pharmacol 2006; 70:637-644.

同時，我們也利用這些建立好的試管內和動物實驗來繼續篩選可能應用到過敏疾病治療的 保健食品和藥物。經由此一研究計畫，也培養了不少對這方面有專精的年輕研究人員。 六、計畫成果自評部份 我們在過去三年間已經建立了試管內和動物模式來篩選具有免疫調節的藥物，而且已經有 不錯的成果。但是未來如果希望能夠有更好的成果，可能需要要在下列幾點再加以改進： 1)由於未來要開發成藥物，還是需要以 pure compound 為主，所以需要再與提供藥物來進 行篩選，以期能夠有更多的藥物可以開發出來。 2)目前有許多中草藥的萃取物，似乎有相當不錯的試管內和體內的功效，這些中草藥的萃 取物將進一步與提供藥物的研究室來連絡，以期是否可以能夠提供其中的 pure compound 來進行下一步的實驗，所以能夠開發成藥物。 3)對有些無法提供 pure compound 的萃取藥物，可以建議其開發成過敏免疫調節的健康食 品。至少也可以對這些實驗室提供一個可能的出路。 4)最近的研究發現，如果在試管內能夠刺激樹突細胞分泌較高量的 IL-10 者，有機會達到 免疫調節的功能。這些免疫調節功能的藥物將對一些特定的疾病如器官移植有所助益。 此一國家型計畫的確讓我們有機會來建立這些相關的研究方法，不論是在藥物的開發和論 文的發表上都有著相當不錯的研究成果。