行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
臺灣地區臨床分離之酵母菌 Saccharomyces cerevisiae 致
病性之研究
研究成果報告(精簡版)
計 畫 類 別 ： 個別型 計 畫 編 號 ： NSC 96-2320-B-002-033- 執 行 期 間 ： 96 年 02 月 01 日至 96 年 07 月 31 日 執 行 單 位 ： 國立臺灣大學醫學院醫學檢驗暨生物技術學系 計 畫 主 持 人 ： 張雅雯 計畫參與人員： 碩士班研究生-兼任助理：吳玉珊、李承光 處 理 方 式 ： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 96 年 10 月 31 日
報告內容
前言 / 研究目的 / 文獻探討 酵母菌Saccharomyces cerevisiae 長久以來被廣泛地應用於烘焙、發酵、釀酒等食品相 關工業上，另外，因其為簡單的單細胞真核生物，且具遺傳學及分子生物學上操作的便利 性，S. cerevisiae 也常被科學家當成研究真核細胞的一種工具。 一般來說，在正常的個體身上Saccharomyces cerevisiae是不會導致疾病的，但是在免疫 力較差的病人身上，如: 進行移植手術的病人、愛滋病人、化療病人、骨髓移植病人等卻 是一個重要的伺機致病原，發現有表皮性或是全身性的感染。過去有研究指出，從這些病 人身上分離出來的臨床菌種經分析後，發現溫度的抗性及假菌絲的分化是臨床分離菌株的 兩個重要毒性特質[1, 2]，在42℃下生長及37℃下形成假菌絲和毒性是最有相關性的，因為 這些菌株能在CD-1小鼠的腦中持續增殖大於或等於28天[1]。至於這樣的表現型和毒性之間 的詳細機轉，目前仍不清楚。根據[3]報告指出 high temperature growth 的基因調控屬於 quantitative trait locus
(QTL)，Steinmets 等人利用 genome wide mapping 和 microarray 的方法找出位於 chromosome XIV 上的 MKT1、RHO2、END3 為 quantitative trait genes，調控高溫生長的表現型。另外在 [4]發現 RHO2 的 3’UTR polymorphism 似乎也跟此表現型有關。
Saccharomyces cerevisiae在缺乏氮源的情況下，會由酵母菌型轉變成假菌絲型，假菌絲
的鑑別可藉由以下方式判別：細胞拉長、細胞的黏附力增加、單極方向的出芽生殖[5]。目 前已經知道有三個訊息傳導路徑會調節假菌絲的生成，第一個是MAPK pathway
(mitogen-activated protein kinase)，第二個是cyclic AMP-dependent protein kinase A pathway [2]，第三個是TOR (target of rapamycin) pathway [6]。MAPK訊息傳遞路徑是一連串磷酸激 酶的活化，其中包括:Ste11、Ste7及Kss1。活化型Kss1再去活化轉錄因子Ste12及Tec1，使Ste12 及Tec1共同結合到filamentation gene即FLO11的promoter區，幫助filamentation gene轉錄。在 cAMP/PKA 訊息傳遞路徑主要先由G-protein coupled receptor活化，進一步活化了cAMP， cAMP再去活化protein kinase A，protein kinase A的catalytic subunits有Tpk1、Tpk2及Tpk3， Tpk2再去活化轉錄因子Flo8，而活化型的Flo8可結合到FLO11的promoter區，幫助FLO11轉 錄。在TOR pathway中，Tap42–Sit4此複合物可以藉由調控與假菌絲形成的相關基因達到調 節假菌絲生成的能力。對於這三個路徑和假菌絲形成之間的關係若更加清楚的話，未來是 有機會可以當成抗黴菌藥物的標的物。 因此，為了了解在台灣臨床分離的 Saccharomyces cerevisiae 是否也具有高溫生長及假 菌絲分化的能力，我們和台大醫院合作收集了好幾個臨床的分離株，分別命名為YYC1、 YYC2 及 YYC3，並分別測試這些分離株是否具有在 42℃下生長及 37℃下形成假菌絲的能 力，並針對影響此表現型相關之基因進行定序，觀察在這些基因中是否具有單一核苷酸的 多型性(single nucleotide polymorphism, SNP)，來分析其 SNP 和高溫生長或假菌絲生成之間 的關係為何，以進一步了解這些臨床分離株的致病性。
研究方法
菌株、培養基、及培養方法：
我們和台大醫院合作收集了三株臨床的分離株，分別命名為YYC1、YYC2 及 YYC3。本實 驗所使用之菌株，已列於表一。培養基YPAD 成分如下：1% [wt/vol] yeast extract, 2% [wt/vol]
Bacto Peptone, 2% [wt/vol] glucose, 2% [wt/vol] agar, 1%Adenine。菌株若無特別註明，皆在
30℃下培養48 小時。誘導假菌絲生成之培養基 PSH plate 成分如下：0.17% yeast nitrogen base without amino acids and (NH4)2SO4, 2μM HCl, 2% [wt/vol] glucose, 0.5% casein, 2% [wt/vol]
agar。另一誘導假菌絲生成之培養基 SLAD plate 成分如下：0.17% yeast nitrogen base, 50 µM
(NH4)2SO4, 2% Bacto-agar, 2% glucose。
表一. 本實驗所使用之 Saccharomyces cerevisiae 菌株
Strain Origin Strain typea
YYC1 NTU SC-1b C
YYC2 NTU SC-2b C
YYC3 NTU SC-3b C
YYC5 BY4741 L
YYC29 BY4741 x BY4742 L
YYC32 YJM145/YL23c, YJM145 is segregant of YJM128 C
a C, 臨床分離株；L, 實驗室常用之菌株 b 台大醫院之臨床分離株 c 由Dr. McCusker所提供之美國臨床分離株 DNA 萃取： DNA 萃取方法如[7]所示，純化後由臺大醫學院第二共同研究室進行定序。 結果與討論（含結論與建議） 一、臺灣地區臨床分離的菌株，具高溫生長之能力 台大醫院的三株臨床分離株，與YYC5 和 YYC32 在 30，37，39，42°C 的環境下，培 養在YPAD 培養基中 48 小時，發現在 42°C 的環境下，YYC1 及 YYC3 長的較好，colony size 與YYC32 相似，而 YYC2 與 YYC5 則無 single colony 長出(見表二)，此結果顯示臨床分離 株YYC1 及 YYC3 與美國之臨床分離株 YYC32 同具有 thermotolerance 的能力。
表二 臺灣地區臨床分離的菌株，在不同溫度下的生長情形
30°C 37°C 39°C 42°C
YYC1 +++++ YYC1 +++++ YYC1 ++++ YYC1 +++
YYC2 ++++ YYC2 +++++ YYC2 +++ YYC2 +
YYC3 +++++ YYC3 +++++ YYC3 ++++ YYC3 +++
YYC5 +++ YYC5 +++ YYC5 ++ YYC5 +
YYC32 ++++ YYC32 +++ YYC32 +++ YYC32 +++
(-) = no growth of the dense streak of cells +/- = poorly of the dense streak of cells
(+) = growth of the dense streak of cells but no colony formation (+ +) = formation of microcolonies
二、臺灣地區臨床分離的菌株，在 37℃培養下能形成假菌絲
台大醫院的三株臨床分離株，與YYC29 和 YYC32 在 30 及 37°C 的環境下，培養在 PSH plate 中14 天，或 SLAD 培養基中 6 天，以測試假菌絲的生成。發現在 37°C 的環境下，YYC1 及YYC3 與 YYC32 相似，皆會誘發假菌絲的生成，而 YYC2 與 YYC29 則無假菌絲長出(圖 一)。此結果顯示臨床分離株 YYC1 及 YYC3 與美國之臨床分離株 YYC32 經適當的培養， 同樣可誘發假菌絲的生成。
圖一 臺灣地區臨床分離的菌株，可在SLAD 培養基中誘發假菌絲的生成
YYC1-30℃ YYC1-37℃ YYC2-30℃ YYC2-37℃
YYC3-30℃ YYC3-37℃ YYC29-30℃ YYC29-37℃
YYC32-30℃ YYC32-37℃
三、由 DNA 的定序分析，得知在臨床分離菌株中，基因 RHO2， END3，及 FLO8 上均 有發現 SNP 存在，可能與上述兩項表現型相關，進而影響菌株之致病性。
由上述的結果發現，臨床分離株YYC1 及 YYC3 同樣具有 42℃下生長及 37℃下形成 假菌絲兩個重要毒性特質，於是針對影響此二表現型之基因進行定序，希望可找出特定之 突變或SNP site，並進一步探討其功能，以了解這些基因如何影響菌株之致病性。針對基因
RHO2 的定序結果發現，在 YYC2 中 3’ untranslated region (UTR) 有一 SNP 位點出現
(C→T)，而在 YYC1 及 YYC3 中並沒有發現。過去曾有研究指出，RHO2 3’ UTR 可能與菌 株的高溫生長能力密切相關[4]，值得對此臨床分離株進行更深入的探討。
針對基因 END3 的定序結果發現，在 YYC2 中第 631 核苷酸有一 SNP 位點出現(C→T)， 使胺基酸序列發生改變，而在YYC1 及 YYC3 中並沒有發現。由於此 SNP 位在 End3 蛋白 的 EH-domain 上，是否因此而影響其功能，仍有待進一步的研究。
針對基因 FLO8 的定序結果發現，在 YYC1 及 YYC3 中第 2263 核苷酸有一 SNP 位點 出現(A→T)，而在 YYC2 中並沒有發現。曾有研究指出，在 Candida albicans 其 Flo8 蛋白 的C 端是有幫助於轉錄活性的進行[8]，因此我們高度認為或許這個位置和 37℃假菌絲的生 成具有密切關係，值得進一步探討。
參考文獻
1.McCusker, J. H., Clemons, K. V., Stevens, D. A. & Davis, R. W.Saccharomyces cerevisiae virulence phenotype as determined with CD-1 mice is associated with the ability to grow at 42 ℃ and form pseudohyphae. Infect. Immun. 62, 5447-5455 (1994).
2.McCusker, J. H., Clemons, K. V., Stevens, D. A. & Davis, R.W. Genetic characterization of pathogenic Saccharomyces cerevisiae isolates. Genetics .136, 1261-1269 (1994).
3. Steinmetz LM, Sinha H, Richards DR, Spiegelman JI, Oefner PJ (2002) Dissecting the architecture of a quantitative trait locus in yeast. Nature 416: 326–330.
4. Himanshu Sinha,Bradly P. Nicholson,Lars M. Steinmetz,John H. McCusker Complex genetic interactions in a quantitative trait locus. PLoS Genet. 2006 Feb;2(2):e13. Epub 2006 Feb 3 5.Xuewen Pan, Toshiaki Harashima and Joseph Heitman. Signal transduction cascades regulating pseudohyphal dfferentiation of Saccharomyces cerevisiae.
Current Opinion in Microbiology, 3:567–572 (2000)
6.N. Shane Cutler, Xuewen Pan, Joseph Heitman, and Maria E. Cardenas. The TOR Signal Transduction Cascade Controls Cellular Differentiation in Response to Nutrients. Molecular Biology of the Cell, 12, 4103–4113 (2001)
7. Methods in Yeast Genetics (2000) Cold Spring Harbor Laboratory Press
8. Fang Cao, Shelley Lane, Prashna Pala Raniga, Yang Lu,Zhou Zhou,Karalyn Ramon,Jiangye Chen, and Haoping Liu. The Flo8 Transcription Factor Is Essential for Hyphal Development and Virulence in Candida albicans. Molecular Biology of the Cell.17, 295–307 ( 2006)
計畫成果自評 一般來說，Saccharomyces cerevisiae 在正常的個體身上是不會導致疾病的，但是在免疫 力較差的病人身上，如: 進行移植手術的病人、愛滋病人、化療病人、骨髓移植病人等卻 是一個重要的伺機致病原，發現有表皮性或是全身性的感染。本計畫利用與台大醫院合作 收集的好幾個臨床分離株，分別測試這些分離株具有在42℃下生長及 37℃下形成假菌絲的 能力，並針對影響此表現型相關之基因進行定序，已發現數個SNP 位點，可能與菌株的致 病性相關，未來若進一步對致病機轉的研究，將有助於臨床上對此菌株致病性的瞭解，且 機轉中的主要調控基因，也可能成為未來抗黴菌藥物的標的物，有助於抗黴菌藥物的開發。 有關此計畫成果，已進行論文撰寫，準備發表。
