行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
超音波導入：超音波頻率、強度、聲場特性、傳輸效應與導
入機制間的相關性研究(2/2)
計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC94-2212-E-110-007- 執行期間： 94 年 08 月 01 日至 95 年 07 月 31 日 執行單位： 國立中山大學機械與機電工程學系(所) 計畫主持人： 楊旭光 共同主持人： 方嘉佑 計畫參與人員： 黃充仁 報告類型： 完整報告 報告附件： 出席國際會議研究心得報告及發表論文 處理方式： 本計畫可公開查詢 中 華 民 國 95 年 10 月 31 日可供推廣之研發成果資料表
□ 可申請專利 □ 可技術移轉 日期： 年 月 日 國科會補助計畫 計畫名稱： 計畫主持人： 計畫編號： 學門領域： 技術/創作名稱 發明人/創作人 中文： （100~500 字） 技術說明 英文： 可利用之產業 及 可開發之產品 技術特點 推廣及運用的價值 ※ 1.每項研發成果請填寫一式二份，一份隨成果報告送繳本會，一份送 貴單位 研發成果推廣單位（如技術移轉中心）。 ※ 2.本項研發成果若尚未申請專利，請勿揭露可申請專利之主要內容。 ※ 3.本表若不敷使用，請自行影印使用。摘要
超音波生物效應一般可分為：機械效應、對流效應、空孔效應與熱效 應等。本研究將從機械效應與空孔效應角度切入超音波導入法，以探討超 音波導入法對角質層通透性改變之機制研究。所謂超音波導入，乃是藉由 超音波之生物效應改變皮膚的通透性而將藥物或保養品傳至目標細胞。目 前市面上的超音波導入產品，其照射頻率、能量與作用時間均是直接利用 醫療用超音波儀器來調變，但對於整個超音波導入機制並不清楚，因此使 用醫療用超音波探頭進行導入的結果，無法於短時間內達到預期之成效。 針對上述問題，本研究即以超音波之空孔效應（Cavtitation Effect）做 為超音波導入之主要機制。以 Rayleigh-Plesset 所提之氣泡運動方程式，計 算附著於豬皮組織上氣泡之空孔共振頻率區，以引致空孔效應之氣體活作 用（Gas Body Activation）。該共振頻率區間為 15 到 36 kHz，選取該區域內 之頻率 20 kHz 以作為超音波導入之頻率，與非共振頻率區間之 10、60 kHz 進 行超音波導入 ，並以大於與小於引致空孔效應門檻值的聲強， 13.6 mW/cm2、1.9 mW/cm2進行頻率、聲強等參數變化下的導入維他命 C 量比 較。實驗結果可發現以空孔共振頻率 20 kHz，13.6 mW/cm2照射的組別維 他命 C 通透過豬皮組織的量最多；而在豬皮組織的維他命 C 殘留量比較 上，以 10 kHz，13.6 mW/cm2的組別為最多。與市面上所通用於超音波導入之頻率 1 MHz，2.22 W/cm2做比較，結果證實，以符合共振頻率區之頻 率（20 kHz）所進行之導入，與高頻（1 MHz）的導入條件相比，20 kHz 的維他命 C 導入結果相較於高頻超音波的導入結果，於聲強上只需高頻的 160 1 能量，以及 4 1 的導入時間，就有相同的結果。 此外本研究也嘗試從工程的角度，針對照射聲場的能量均勻性做一探 討，依波長及能量擴散的方式，設計一楔型塊，使超音波在此楔型塊中形 成擴散聲場（Diffused Field），並比較聲場均勻與否對於導入的影響。實驗 結果證實經過均勻聲場的照射會使得欲導入之藥物導入至皮膚組織間的 量，二倍於非均勻聲場照射的導入量。 以上之實驗結果，提供了超音波導入在頻率、聲強與聲場均勻程度等 參數的改變，可影響導入的量與目標，對於導入技術有著更上一層的提升， 可於未來提供更多可應用的範疇與新的發展。
Abstract
The study of the bioeffects of ultrasound and their etiology is of fundamental importance as a part of basic biophysics. In general, the most fruitful approach to the study of bioeffects of physical agents is the mechanistic one. The ultrasonic mechanisms include the mechanical effect, convective effect, cavitation effect, and thermal effect. In this research, the test skin was radiated the ultrasound using the medical equipment and analyzed the permeation of skin. However, it is not sufficiently to analyze the quantitative of the sonophoresis by the medical equipment setup.
To solve the above-mentioned problem, the oscillation of the stratum corneum in response to the ultrasound radiation is simulated using Rayleigh-Plesset’s bubble activation theory. To calculate the resonance frequency domain of bubbles attached of pig skin which is around 15 to 36 kHz that called low frequency and it caused gas body activation on test skin. We choose 20 kHz in the resonance frequency domain to compared with 10, 60 kHz as non-resonance frequency. 1.9 and 13.6 mW/cm2 of the sound intensity which are respectively lower and higher than cavitation threshold intensity are used. The result of low frequency sonophoresis presented that high permeation rate is caused by resonance frequency 20 kHz. And according to the experiment, it is also proved that the experiment of low frequency sonophoresis only took 1/160 of the sound intensity and 1/4 of the time for the high frequency sonophoresis.
Furthermore, the research examined the uniformity of the sound field, and a wedge is designed to make a diffused field to compare the effect between a uniform one and its contrast. The result presented that the permeating drug with uninformative field is twice the amount of the normal exposure ultrasound field.
Based on the above results, the changes of frequency, sound intensity and sound field uniformity, the enhancement effects of the sonophoresis will be achieved.
目錄
中文摘要--- Ⅰ 英文摘要--- Ⅲ 目錄 --- Ⅴ 表目錄 --- Ⅷ 圖目錄 --- Ⅸ 第一章 前言--- 1 1.1 研究主題--- 1 1.2 背景分析--- 3 1.3 文獻回顧--- 9 1.4 研究目的---13 第二章 基本理論---17 2.1 空孔氣泡動力學 ---17 2.2 空孔氣泡運動方程式---19 2.3 維他 C 命定量法---20 第三章 實驗方法與步驟 ---24 3.1 實驗目的---24 3.2 實驗方法---26 3.2.1 頻率計算---263.2.2 聲強選用---26 3.2.3 豬皮組織波速變化之量測 ---27 3.2.4 超音波探頭聲場的設定 ---28 3.3 實驗物品與儀器 ---30 3.4 實驗步驟---38 3.4.1 高頻超音波導入實驗步驟 ---38 3.4.2 低頻超音波導入實驗步驟 ---40 3.5 均勻聲場的設計 ---41 第四章 實驗結果與討論 ---57 4.1 共振頻率與導入量定義---57 4.1.1 氣泡與共振頻率計算 ---55 4.1.2 導入量定義---58 4.2 超音波熱療機導入評估---60 4.2.1 頻率與導入量比較---60 4.2.2 波速與導入量比較---61 4.3 空孔共振頻率之超音波導入評估 ---64 4.3.1 頻率與導入量比較---64 4.3.2 波速與導入量比較---63 4.4 楔型塊之聲場量測 ---68
4.5 均勻聲場照射下之超音波導入---70 第五章 結論與建議 ---96 5.1 結論---96 5.2 建議事項與未來展望---99 參考文獻--- 101 附錄 A --- 104
表目錄
表 4.1 氣泡尺寸與相對應共振頻率---72
表 4.2 超音波熱療機探頭在不同參數下導入量與波速變化---73
表 4.3 低頻超音波探頭在不同參數下導入量與波速變化---80
圖目錄
圖 1.1 豬皮組織氣泡圖，箭頭處即為附著於豬皮組織上的氣泡---15 圖 1.2 皮膚組織示意圖 ---15 圖 1.3 創新的導入技術-均勻聲場照射 ---16 圖 2.1 不可壓縮液體的氣泡運動模型---23 圖 3.1 引致空孔效應所需之門檻聲強與頻率的關係---43 圖 3.2 豬皮組織波速量測示意圖 ---43 圖 3.3 探頭聲場變化---44 圖 3.4 探頭聲場量測示意圖 ---44 圖 3.5 熱療機探頭聲場分布圖---45 圖 3.6 擴散聲場---45 圖 3.7 超音波熱療機---46 圖 3.8 聲博公司製超音波探頭---46 圖 3.9 三個低頻探頭之阻抗響應圖---47 圖 3.10 函數產生器/任意波形產生器 ---48圖 3.11 功率放大器 Amplifier Research 25A250A---48
圖 3.12 功率放大器的頻率與功率放大輸出圖---49
圖 3.13 利用解割刀截取豬皮組織圖 ---49
圖 3.15 單點式磁性攪拌機與攪拌子 ---50 圖 3.16 高效能液相層析儀---51 圖 3.17 數位示波器 LeCory 9410---51 圖 3.18 金相顯微鏡 ---52 圖 3.19 PVDF 針型水下麥克風---52 圖 3.20 PVDF 針型水下麥克風探針特性曲線圖---53 圖 3.21 AE 探頭 ---54 圖 3.22 AE 探頭之頻率響應圖---54 圖 3.23 改良式 Franz 擴散池 ---55 圖 3.24 超音波導入系統架構圖---55 圖 3.25 為達到均勻聲場所設計的楔型塊---56 圖 3.26 楔型塊之量測區域示意圖 ---56 圖 4.1 豬皮組織上之氣泡大小---86 圖 4.2 超音波熱療機導入量的比較---86 圖 4.3 不同參數下，超音波熱療機之下槽濃度與原濃度比較---87 圖 4.4 高頻超音波導入之豬皮組織殘留量---87 圖 4.5 經過超音波熱療機導入後之豬皮聲速比較 ---88 圖 4.6 維他命 C 濃度檢量線---88 圖 4.7 進行低頻超音波導入之導入量比較---89
圖 4.8 不同參數下，低頻超音波導入下槽濃度與原濃度比較---89 圖 4.9 經過 15 分鐘低頻超音波導入，維他命 C 濃度損失量---90 圖 4.10 經過低頻超音波導入後之豬皮聲速比較---90 圖 4.11 楔型塊不同面上之聲場量測圖 ---91 圖 4.12 以 230 kHz 頻率照射楔型塊後，不同點之聲場量測值 ---92 圖 4.13 以 250 kHz 頻率照射楔型塊後，不同點之聲場量測值 ---92 圖 4.14 以 250 kHz 頻率照射楔型塊後，不同點之聲場量測值 ---93 圖 4.15 照射面標準差值的比較---93 圖 4.16 搭配楔型塊進行超音波導入之實驗架構---94 圖 4.17 搭配楔型塊進行超音波導入之下槽導入量比較 ---94 圖 4.18 搭配楔型塊進行超音波導入之豬皮殘留量比較 ---95
第一章 前言
1.1 研究主題
本研究主要探討超音波導入時，各種超音波設定參數對豬皮角質層通 透的影響，以為提高超音波導入的參考。這些設定包括：頻率、聲強與超 音波聲場。此外，本研究以超音波之空孔效應作為影響豬皮組織通透性之 主要機制。所謂的空孔效應，其發生條件必須是在液體內才會發生。以水 為例，由於水中氣泡體積隨著超音波作用聲壓的改變，會產生週期且規則 的變化，甚至會出現劇烈的氣泡破裂。圖 1.1 所示，為實驗所用之豬皮組 織覆蓋水之後附著於表面的氣泡圖，該圖以金相顯微鏡 200:1 的比例放大 後攝得。在生物皮膚的作用上，這種變化會讓角質細胞與角質細胞的間隙 變大而提高滲透率及加速擴散作用。因此空孔效應發生時，所產生的震波 及微噴射流，將造成附近皮膚組織之表面塑性變形或破裂。在適當的能量 下，皮膚表面的塑性變形能使得藥物透過角質層進入體內，藉由這種物理 性的剌激加速生化反應，提高藥物對皮膚的通透性。 皮膚是人體的自然保護膜，它是我們最外層的防護，避免受到外在的 汙染、病菌攻擊。其中最外層的角質層是重要的防禦障壁，最先阻隔外來 物質的進入，是限制藥物從表皮吸收的主要原因。近來因科學的進步，發 展了許多促進藥物透過皮膚吸收的方法，超音波導入法即為其中的一種。除了可以促進藥劑高濃度、大量的進入皮膚中，且在治療中病人不用麻醉， 只有輕微刺痛感。故研究超音波導入法對角質層通透性之機制，將能更有 效率的輸送藥物進入皮膚組織，進而滲入身體的循環系統而讓人體吸收利 用。 目前坊間販售的超音波導入儀，宣稱每秒一百萬次的振動效果，能促 使美白藥劑將會有效率的進入皮膚裡。為了深入研究其實際效果是否有如 業者所言，真能達到導入的效果，本研究將以 1 MHz 與 3 MHz 的激振頻率 讓藥物滲入角質間隙，評估機械式的振動與導入間的關係。而本研究所探 討的超音波導入，主要是著重在以超音波空孔效應做為引致超音波導入的 根本，並非著重在振動次數的多寡。此外根據國內外相關之文獻，尚未探 討導入的均勻性，故本研究於此點作一探討：於超音波聲場的控制上。將 會從能量分佈的觀點，設計出一擴散聲場（Diffused Field），使得超音波的 能量可以均勻的分佈在一楔型塊內，再使該楔型塊接觸於豬皮組織，從能 量的角度來看，均勻的聲能從楔型塊內洩露出去，近似以平面波的能量來 進行導入，使得作用在同一個面上的能量均勻性提高。 經過本研究對於超音波導入參數設定的探討與實驗結果，相信能對國 內超音波導入技術，提供新的思維、技術與流程，並為非侵入式之投藥方 式帶來新的選擇。
1.2 背景分析
超音波生物效應即是超音波對生物組織產生的作用，亦是目前超音波 治療的基礎，而超音波導入亦為超音波生物效應的一種，故於研究超音波 導入機制時必須從最根本之超音波生物效應討論起。 超音波生物效應按其作用機制可大略分為：機械效應、對流效應、空 孔效應與熱效應[1]。茲分述如下： （一）機械效應：在生物組織所能承受的能量之下，組織間產生彈性 振動，其振幅的平方與聲強成正比。而且超音波的機械效應是超音波治療 之主要機制之一，它能引起細胞的改變及溶血過程，還有消腫、止痛、軟 化疤痕等，都與超音波機械效應所引致的微細作用密切相關。超音波對於 細胞振動造成物理按摩所產生的溫、熱等作用，都能在有機體裡增強滲透、 促進血液循環，刺激神經系統，軟化組織並改善局部血液和淋巴液的循環， 提高組織的新陳代謝和再生能力，並使皮膚富有光澤與彈性。 （二）對流效應：超音波入射於不同聲阻抗的介質界面時，動量發生 變化，產生輻射狀之聲壓，對於組織而言會產生撕裂和聲對流，即引起組 織分子的移動或轉動，當這種運動的振幅過大時，會引起組織的傷害。 （三）空孔效應：空孔效應的發生，是由於超音波是一種不傳遞振動 質點，只傳遞能量的物理形式。當超音波照射物體時，介質或物體體內之孔受到波之相對壓力差影響，而開始產生膨脹及收縮的動作，並與周圍的 結構發生碰撞，此現象即為空孔效應。而空孔與結構間的效應大致上可分 為以下三種[2]：
A. 氣體活化作用（Gas Body Activation）：早期被稱為穩態空孔（Stable Cavitation），在 1987 年時由 Miller 所提出。如果照射聲場中的介質中本來 就有氣體存在，當以低強度的超音波照射時，照射頻率與照射物體間的幾 何或空孔結構的共振頻率若相近，氣體的體積便會隨著作用聲壓的改變而 產生週期且規則的變化。在生物體中，這種效應會使得細胞與細胞的間隙 變大而提高滲透率及加速擴散作用，藉著這種物理性的刺激會加速生化反 應，細胞內也會產生微擾動、對流及渦流運動，提高細胞膜與細胞壁的通 透性，加速新陳代謝作用。這種作用是屬於暫時的，當超音波停止照射後， 細胞的通透性就會漸漸恢復。本研究所計算之空孔共振頻率即引致氣體活 化作用之頻率。
B. 內部空孔效應（Inertial Cavitation）：或稱為暫態空孔效應（Transient Cavitation），一般來說需要較大的聲強作用在微小的氣泡（又稱為空孔核； Cavitation Nucleus）上才會產生，該氣泡通常遠小於照射頻率的共振尺寸。 當內部空孔效應發生時，氣泡尺寸快速地膨脹，氣泡體積產生週期但卻與 作用的聲壓不一致的變化，呈現一個極不穩定的狀態之後向中心猛然萎 縮，當氣泡被壓縮至最小半徑時，氣泡內的溫度及壓力甚至會高到足以產
生光線（Onoluminescence）、水解（Hydrolysis）出 H+ 及 OH-離子甚至產生 其他自由基（Free Radical）及化學作用。而內部的空孔可能會反彈破裂成 更小的氣泡或消失不見，這些現象在超音波照射的生物試體均可發現。 C. 細胞共振效應：細胞本身以振動的方式傳遞音波，當細胞膜所能承受的 剪應力超出其極限時，細胞便宣告崩毀。 （四）熱效應：因為超音波作用而產生振動的質點除了傳遞能量之外， 相對的也會吸收能量。當振動質點吸收能量後，可以熱能的方式儲存，也 可以動能的方式表現。當以熱能的方式表現出來之後將會使周圍組織溫度 升高，使血液循環加速，增加皮膚細胞的養分，使神經興奮性降低，有鎮 痛的作用；使痙攣的肌纖維鬆弛，有降低痙攣的發生。一般超音波熱療機 以 1 MHz 頻率之超音波作用於皮膚時，熱能大約可以滲透至皮下六分公 處，使血液及淋巴夜流通順暢，並使深部組織的細胞活性化並再生。故此 微熱作用在治療疾病扮演著一重要的機制之一。 目前市面上所謂之超音波導入，常以超音波之機械效應與熱效應，作 為超音波導入之主要機制。其照射頻率、能量與作用時間均是直接利用醫 療用超音波熱療機來調變，較為普遍的超音波導入乃是利用高頻（一百萬 次/秒）機械振動，經超音波熱療機探頭激發超音波來執行超音波導入，雖 然有些微效果，但未達到令人滿意的結果。故於本研究裡，將重新定義超 音波之導入機制，以超音波空孔效應作為主要超音波導入機制，並探討各
種超音波參數之設定對通透性的影響，以作為提高超音波導入之參考。其 參數包括照射頻率、照射能量及超音波聲場控制。 了解基本的超音波生物效應之後，更進一步就要了解超音波應用在醫 療上的機制。該機制是利用超音波能量進入生物組織後產生的各種生理效 應，來達到治療的目的。在醫療界上的應用如使用超音波的機械效應進行 外科手術及超音波震碎結石手術；利用超音波熱效應，能使組織局部溫度 升高，用來增加肌腱和關節組織等復原，可加強組織的伸展性，減輕疼痛 和肌肉經攣，同時還能將傷疤組織、關節囊、肌肉等有選擇性的加熱至治 療溫度，而不傷及皮膚與皮下組織。而溫熱效應還能增進血液循環、促進 代謝率，加速化學反應過程、pH 值變化、酵素系統功能的影響等。這些變 化對於有機體局部組織的機能及狀態產生影響，進而達到治療效果。 除了以上超音波可用在治療外，更進一步探討治療的過程，是如何將 目的物（如：藥物、保養品）傳送至目標物（接收細胞）。以藥物而言，其 傳送的路徑一般經由口服、注射、塗抹（經由皮膚）來達成目的。然而皮 膚的角質層（Stratum Corneum）卻會阻礙塗抹的效果[3]，如圖 1.2 所示。 由於角質層是表皮層中最上、最厚、最平扁的一層，細胞至此已完全死亡， 依身體各部位不同，角質層即由 15 至 20 層不等的死細胞所構成，且其厚 度約為 15~20μm，依部位的不同而有不同的厚度。此層細胞中內含角質層 素，且緊密相連地排列在一起，其目的為完全護衛住皮膚及其以下的各層
細胞。而細胞與細胞間之所以能緊密相連，乃因其中含有脂肪，能使一個 個角質細胞連接在一起，而且還能使它柔軟，以防斷裂。除了連結細胞外， 脂肪也塞住所有細胞間的縫隙，因此角質層與其間隙得以如此整齊有秩序 的排列方式所組成，能有效地阻擋水及細菌的侵入，同時也阻止了藥物及 保養品的滲入[4]。因此探討增加經過皮膚的通透性，必須從扮演皮膚防衛 者角色的角質層開始著手。 一般用來增益皮膚通透性的方法，茲列如下： （一）化學藥品：由於導入藥品與皮膚間的化學反應，改變該區皮膚 的結構或增加藥物濃度，達成滲入的效果[5, 6]。 （二）離子導入：使用直流電將藥物離子通過皮膚、粘膜或傷口導入 體內進行治療的方法，稱為離子導入法。在藥物溶液中，一部分藥物解離 成離子，在直流電的作用下，陰離子和陽離子進行定向移動。如果陰極襯 墊中含有帶負電荷的藥物離子或者陽級襯墊中含有帶正電荷的藥物離子， 由於電極相斥的原理，藥物就會向人體方向移動而進入體內了。藉此原理， 離子導入儀器將會產生低能量脈衝式電流通過皮膚，利用電極相斥的原 理，將帶同樣電極成分之被導物，導進皮膚中，讓皮膚更能有效吸收。導 入時會有輕微刺痛感，尤其敏感膚質或有輕微傷口時，感受較明顯[7, 8]。 （三）超音波導入：以物理波的方式振動，由於超音波對生物體的熱
效應、機械效應與空孔效應，導致角質層部分產生了改變，使皮膚外層的 物質能順利通過角質層，進入真皮層而被進一步的作用[9]。 相較於化學導入與離子導入，超音波導入較為舒適和方便，且整個療 程幾乎是不會有任何的不適，導入後也不會有明顯的紅腫。相較之下接受 離子導入過程中，多半會有些微刺痛的感覺，導入後也可能會有一兩天輕 微的發紅，這也是本研究選擇超音波導入的原因。 此外，利用超音波工程可以將波的作用範圍大大提升。如圖 1.3 所示 為傳統超音波探頭與探頭經具備擴散聲場設計的楔型塊的聲能分佈比較 圖。一般波經由探頭激發後的能量分佈是以高斯分佈呈現，曲線下的面積 即照射所涵蓋範圍的能量，虛線即為照射聲強。左方照射面積大於照射聲 強的部份，明顯小於右方，乃是因為聲能在楔型塊內形成擴散聲場，能量 會以較勻稱的方式射出，如此一來即是均勻的超音波能量照射，有效的放 大照射面積，此乃本研究在超音波導入技術的一項新創舉。
1.3 文獻回顧
本研究乃利用超音波導入法，對於常用的美白、軟化角質之物質（包 括：藥物、化粧品、保養品…等）經由透過皮膚表層進入細胞之機制作為 主要的研究方向。使用超音波來提升角質層的通透性，以目前世界各國所 研究的資料看來，已經證實在不同的藥物上（如胰島素）的導入[10,11]， 確實具有其實用性。而最近也有使用“超音波導出” 的方式來監控糖尿病 患者的血糖濃度[12]。 其實超音波導入的發展並不算早，在 1995 年，Mitragotri [9]等人經由 實驗分析了熱作用、對流傳輸以及空孔效應三種機制對藥物經過皮膚吸收 所造成的影響。實驗? 果發現，空孔效應所引致的超音波導入表現最為明 顯。推測這種效應可源於皮膚組織內外的介質產生空孔，進而改變皮膚角 質層排列的順序，此一效應有助於藥物經過皮膚的? 透。特? 是在低頻（20 kHz）超音波的導入實驗中，空孔效應更為明顯，大量水分子進入角質層， 形成水溶性通道，皮膚有效擴散面積增加，因此促進了藥物經過皮膚的吸 收。 為了瞭解皮膚組織上之孔洞與擴散及對流的相對關係，Mitragotri 與 Tang [13]在進行相關超音波導入研究後，便以基本薄膜穿透的方程式與電 化學理論所發展出的理論，建立一超音波導入後所產生的水溶性通道模 型。研究結果發現超音波會改變表皮氣孔半徑或建立更多的氣孔來使通透性增加。如此一來，超音波導入似乎與氣孔孔洞的多寡有關聯性，因此 Tezel [14]等人尋求在低頻超音波導入時，研究超音波參數與傳輸路徑之關連性。 他們以實驗分析得知其導入增加的現象是因為增加了傳輸路徑上孔洞的數 目，而不是增加孔洞的尺寸。因此超音波導入在此被證實能增加傳輸路徑 上孔洞的數目。之後在 2003 年，Tezel [15]等人又利用理論模擬多孔性通透 模型解析低頻超音波導入水溶性物質。結果發現在低頻超音波導入的狀況 下，能產生大尺寸的孔洞，該大尺寸孔同樣能建立通道促使通透性增強。 接著從皮膚組織與藥物的化學特性，來切入超音波導入與通透性變化 的關係。有鑑於皮膚組織角質層是由脂肪填滿其角質細胞間隙，又發現水 溶性物質亦能被導入，因此對於脂溶性物質是否會有更佳的通透性又作了 一番研究。由 Mitragotri [16]的實驗中發現，脂溶性物質在超音波導入時的 效果，反而比水溶性物質差。Tezel [17]等人將原本所建立經皮傳輸的水溶 性通道，再合併另一新條件－脂溶性通道。如此一來更可以完整的描述在 有或無接受低頻超音波導入時的模型。 自此之後就有多位學者對於以上的實驗進行驗證。2001 年 Tezel [18] 等選擇在不同的頻率進行超音波導入，實驗結果發現不同的頻率均有相對 應之聲強門檻值，隨著頻率越高，門檻值也隨之越高。至此可清楚了解到， 當使用低頻（20 kHz）超音波導入時，由於低頻的空孔效應門檻能量低， 容易引致空孔效應，且由於通透效應的產生是在導入能量大於門檻能量後
才發生，故可推知空孔效應與超音波導入有著密不可分的關係。而為了進 一步確定空孔效應的產生是否真的對超音波導入更有效率，在 2002 年 Tang [19]等人也於實驗中發現，利用低頻（20 kHz）超音波導入所引致的皮膚組 織通透現象，是由於氣泡崩毀造成直接的機械式撞擊皮膚表面，因而導致 通透性的增加；此外，也發現低頻超音波導入時，均伴隨著明顯的空孔效 應。同年，Terahara [20]等人由實驗發現當超音波距離欲照射的皮膚組織越 遠，其皮膚的通透性也將越差，而聲強也必須超過某一特定門檻值，方能 產生通透的效應，然而使用的頻率越低，所需聲強的門檻能量就越低。除 了此一發現之外，Terahara[21]還利用兩種不同的樹脂做為空孔的核，以超 音波振動該空孔核以產生空孔，再將豬皮組織更換為鋁箔片，來計算經由 空孔崩毀所產出的凹痕數量與大小，觀察何類樹脂較能產生空孔。其成果 證實可引入此種額外的空孔核來引發空孔效應，使超音波導入更有效率。 2003 年，Merino [22]等人使用低頻（20 kHz）、高頻（10 MHz）的超音波 導入以進行比較，並比較熱效應對超音波導入之效果。實驗結果發現在使 用低頻超音波導入時，除了導入的作用比高頻的導入與熱效應明顯之外， 也會有導出的作用。 在經過了如此多的學者驗證之後，關於超音波導入的安全性仍無法有 完整的答案。所以在 2002 年，Tang [23]利用甘露糖，進行超音波在離體（in vitro）與活體（in vivo）的導入比較，結果發現角質層電阻改變與通透率的
改變有一相互關係，利用此關係可推知角質層通透率的改變；此外透過觀 察經照射過後的組織發現，肯定超音波導入的安全性。就整個超音波導入 法而言，國外的實驗是較國內完備且數量多。國內目前以方嘉佑博士執行 超音波導入法為先河。在 1998 年，方嘉佑[24]處理去毛的裸鼠皮作為通透 的介質，並激發 20 kHz 的超音波將 Clobetaso 17-propionate 導入至鼠皮， 分別探討在不同的波型、不同強度下超音波照射的結果。實驗後結果發現 空孔效應是讓角質層的排列呈非序狀，且為造成皮膚組織內流體對流的主 要原因。
1.4 研究目的
本研究的目的，主要在於利用空孔效應做為超音波導入之機制研究。 由於經過超音波導入法，造成角質層結構上的改變，使得角質層通透性也 隨之改變。一般超音波於照射人體時，會引起細胞的改變及溶血過程，還 有消腫、止痛、軟化疤痕等，這些都與超音波機械效應所引致的微細作用 密切相關。對於細胞振動造成物理按摩所產生的溫、熱等作用，都能在有 機體裡增強滲透、促進血液循環，並且刺激神經系統及軟化組織。因此一 般超音波導入技術均將機械效應做為主要的超音波導入機制。透過相關國 內外眾多學者的研究，可發現機械效應並非完全是超音波導入的主要機 制。如能找出產生超音波導入的主要機制，才能發揮將導入效率有效的提 升，如此一來可以節省藥物劑量、時間成本，若應用於現今美容業更是一 強力的助手。 目前美容業已利用超音波導入應用在美白上，提供了一種不需要每天 擦藥的快速美白法，只需要短時間內，就可以將藥劑送進皮膚內，快速達 到美白、除皺。以現今講求效率的年代，若能探究超音波導入法的主要機 制，將可以引入更完善的導入參數；此外藉由均勻的超音波聲場建立，將 能使所激發之能量勻稱，改善局部導入面積之缺點，進而讓現行之美白美 容、藥物超音波導入，更趨於快速、有效與完善。此外，之前的研究超音波生物效應時，即發現照射聲場的設計往往是 研究人員首先會遇上的難題[25]。超音波探頭的聲場一般可分為近場跟遠場 兩個區域。所謂的近場區域在超音波探頭正前方隨著距離的變化，聲壓會 有一連串的相對最大值與最小值的變動，直到產生聲壓最大值，此時，將 此位置相對於探頭的距離設為 L（近場距離）。當與探頭的距離超過 L 時聲 壓會隨距離下降直到聲壓值為零，此稱為遠場區域。在探頭表面的法線方 向 ， 近 場 區 域 的 聲 壓 值 是 不 均 勻 的， 並不是理想的聲場分 佈 。引 用 Panametrics 公司所提供之探頭近場公式：N= D2f/4C，其中 N 為近場距離； D 為探頭尺寸；f 為照射頻率；C 為波速的計算之下，近場距離為 2 mm， 故本研究所使用之照射聲場是屬於遠場照射。而遠場區域的照射能量會以 高斯分佈的方式呈現，對於超音波照射聲場的設計，將會在探頭前增加一 楔型塊，依據擴散場聲能分佈的原理，並搭配聲波頻率、波長之考量與計 算，設計出一匹配本研究換能器之楔型塊，使所激發的波會在該楔型塊內 形成擴散聲場，在照射至豬皮皮膚表面時，照射面的能量能以均勻的方式 進行超音波導入，改善導入的均勻性。
圖 1.1 豬皮組織氣泡圖，箭頭處即為附著於豬皮組織上的氣泡
圖 1.2 皮膚組織示意圖[3] 200:1
第二章 基本理論
本研究主要是以附著於豬皮組織上的氣泡大小，以 Rayleigh-Plesset 所 提出之氣泡運動方程式，計算出氣泡尺寸所對應的共振頻率以引致空孔效 應之氣體活化作用，再選擇共振頻率與非共振區頻率的超音波，以相同強 度，固定的超音波照射時間分別照在試片上，找出不同頻率下經過超音波 照射藥物（或保養品）之皮膚通透率，再與未經過超音波照射之皮膚通透 率相互比較，以瞭解生物超音波對於經皮通透率之增益。2.1 空孔氣泡動力學[26-28]
在物體上液體流可以定義為三種流：（a）無空孔流（ Noncavitating Flow）；（b）伴隨一些小空孔氣泡的空孔流（Cavitating Flow）；及（c）伴 隨單一大空孔氣泡的空孔流。在這個假設下，對於空孔流的流場會有不同 的壓力係數 K （Pressure Coefficient）。在液體流力學中液氣共存有一個特 殊的特性，這種特性稱之為空孔流，因為牽涉到液體的物理和化學特性， 空孔流已經有許多理論來描述。在實際應用方面，如研究潛艇通過液體流 所產生空孔現象、螺旋槳和渦輪葉的空孔破壞等。在討論特別流體問題中， 壓力係數 K 的運算式為 2 ) ( K 2 0 0 V p p v ρ − = （2.1）其中p0是液體靜水壓，pv是液體的蒸氣壓，ρ 是液體密度，V0是遠離物體
的均勻流速。當 K 很大時，液體則無空孔流產生，但會隨 K 漸漸變小則空 孔的數目變多。
2.2 空孔氣泡運動方程式[29]
在處理不可壓縮液體中球狀空孔塌陷的問題，目前以雷利（Rayleigh） 解最為完備。雷利認為在離氣泡一段距離的壓力值是為常數，根據這個假 設，氣泡半徑隨時間變動可以較簡化。假設氣泡通過一壓力急速變化的區 域時，此氣泡為一個理想的球狀氣泡。而在無限不可壓縮液體中，以球狀 氣泡中心為原點，圖 2.1 所示即為此氣泡之理論運動模型。模型中氣泡的 半徑 R 隨時間t變化，而 r 是R−R0的距離變化。Rayleigh-Plesset 在 1949 年所提出之氣泡運動方程式為 + − − + = + 1 2 2 4 ∞( ) 2 3 0 3 0 0 2 t P R R R R R R P R R R r & & & & σ σ η ρ （2.2） 其中 R0為平衡時的氣泡半徑、σ 是氣泡壁張量、η 是液體的黏性係數、ρ 是 液體密度。 空孔振動之氣體活化作用通常由氣體帶動周圍的組織一起振動，當氣 體與超音波達到共振範圍時，氣體的動能瞬間激增，並撞擊組織表面造成 傷害。細胞共振效應通常由細胞本身以震動的方式傳遞音波，當細胞膜所 承受的剪應力超出其極限時，細胞即產生崩解破壞，有關共振頻率ωr'的詳 細推導與相關參數，請參見附錄 A。其公式為 2 2 0 3 0 0 2 0 2 ' ) 2 ( 2 1 )] 2 ( 3 [ 1 ) ( R R R P R O r ρ η σ ρ σ γ ρ ω = + − − （2.3）2.3 維他命 C 定量法
本研究使用在維他命 C 定量技術，乃採用兼具有移動相與固定相，並 依分配率不同而檢測其濃度的高效能液相層析法（HPLC- High-Performance Liquid Chromatography）。高效能液相層析法的前身乃為層析法，故在此做 一介紹。 層析法是利用不同物質理化性質的差異而建立起來的技術。所有的層 析系統都由兩種相所組成，一是固定相，它或者是固體物質或者是固定於 固體物質上的成分；另一是流動相，即可以流動的物質，如水和各種溶媒。 當待分離的混合物隨溶媒（流動相）通過固定相時，由於各組成成分的理 化性質存在差異，與兩相發生相互作用（吸附、溶解、結合等）的能力不 同，在兩相中的分配（含量對比）不同，而且隨溶媒向前移動，各組成成 分不斷地在兩相中進行再分配。與固定相相互作用力越弱的組成成分，隨 流動相移動時受到的阻滯作用小，向前移動的速度快。反之，與固定相相 互作用越強的組成成分，向前移動速度越慢。分部收集流出液，可得到樣 品中所含的各單一組成成分，從而達到將各組分離的目的。 層析法是根據物質的理化性質不同而建立的分離分析方法。根據層析 峰的位置及峰高或峰面積，可以進行定性及定量。層析法與光學、電學或 電化學儀器配合使用，可檢測出層析後各組份的濃度或質量，同時繪出層 析圖。利用層析儀與電腦處理數據，可使操作及資料處理自動化，大大縮短分析時間。由於層析法具有解析度高、靈敏度高、選擇性好、速度快等 特點，因此適用於雜質多、含量少的複雜樣品分析，尤其適用於生物樣品 的分離分析。近年來，已成為生物化學及分子生物學常用的分析方法。在 醫藥衛生、環境化學、高分子材料、石油化工等方面也得到了廣泛的應用。 本研究所採用之高效液相層析法是近二十年來發展起來的一項新穎快 速的分離技術。它是在傳統液相層析法基礎上，引進了氣相層析的理論具 有氣相層析的全部優點。由於 HPLC 分離能力強、測定靈敏度高，可在室 溫下進行，應用範圍極廣，無論是極性還是非極性，小分子還是大分子， 熱穩定還是不穩定的化合物均可用此法測定，但在不同的檢測條件下，所 使用的設備也不盡相同。高效液相層析法的基本概念和分離理論，與經典 的液相色譜法及氣相色譜法一致，因而其塔板理論及動力學理論等都可用 於高效能液相層析法。而基本型的高效液相層析儀包括輸液系統、層析柱 與檢測系統三部分。流動相用一高壓泵輸入。這種高壓泵應滿足以下條件： 1. 流量恒定，無脈動，並有較大的調節範圍。 2. 能抗溶劑腐蝕。 3. 有較高的輸出壓力。 梯度洗脫裝置必須具備兩台高壓泵，一台輸送強溶劑，一台輸送弱溶 劑，兩泵運轉速度用電腦控制，並可按照一定的要求改變流動相的組成，
以改善分離效果。一般用微量注射器直接進樣，也可採用六通閥門進樣。 高效液相層析儀中所用的檢測器最多應用的是紫外吸收檢測，靈敏度可達 10-9克的精度。此外尚有其他如螢光檢測器、示差析光檢測器、電化學檢測 器等。而經過檢測後的結果，維他命 C 溶液的濃度將會以 mV 為縱軸單位 之數位式資料儲存於電腦中。 接著依例調製確定濃度的維他命 C 後，依濃度的低至高送進高效能液 相層析儀分析，可將分別所量測之 mV 值繪出一直線，一般稱為檢量線， 依據所繪出之直線可知道在不同 mV 值所代表的維他命 C 濃度，如此一來 即可知導入的濃度多寡了。
η
ρ
,
R
0R
γ
TP
)
t
(
p
σ
LIQUID (INCOMPRESSIBLE) 圖 2.1 不可壓縮液體的氣泡運動模型[29]第三章 實驗方法與步驟
3.1 實驗目的
使用與人皮組織特性相近的豬皮組織，以離體（in vitro）方式進行實 驗 。 從 金相顯微鏡量測 有液體覆蓋之 豬 皮 所 附 著之 氣 泡 大 小 ，佐 以 Rayleigh-Plesset 的振動理論，模擬試體在超音波照射聲場中可能產生的共 振現象，以空孔效應作為超音波導入之主要機制，推算相關之空孔振動頻 率。由於空孔效應發生時，會產生震波及微噴射流，造成附近材料之表面 塑性變形或破裂。在適當的能量下，豬皮組織表面的塑性變形能使得藥物 透過角質層，而進入體內。本超音波導入法之實驗，將探討不同參數下， 包括頻率、聲強與照射能量的均勻性的改變與導入效率的關連性。 在市面常見的超音波導入應用中，經常利用高頻率進行超音波激發， 並以超音波機械效應與熱效應作為導入之機制。但以此機制為出發點所研 發之導入效果上，並無法將超音波導入之效果完全呈現。為了重新定義超 音波導入的機制，本研究從空孔效應的角度切入，經由計算所得之超音波 共振頻率相較於時下超音波導入技術所用之頻率，更為低頻。相對於高頻 超音波而言，以低頻超音波引致空孔效應，所需的超音波聲強更低。 由於在過去的文獻中，若是針對高強度超音波生物效應中的空孔效應 與熱效應所作的研究，其結果大都會對於生物體的細胞組織中造成負面的影響。有鑑於此，在本論文的實驗設定中，必須將空孔效應所發生的最低 強度視為上限門檻值，同時嚴格控制熱效應的發生。其目的在於避開超音 波照射對生物體所產生破壞效應。期望在這樣的實驗設定下，能得到最佳 化的超音波導入結果。綜合上述，若能再結合活體（in vivo）研究，並配 合生物觀察技術，當有助於發展出更完備的超音波導入技術。 除了探究頻率上的變化與機制關係外，本研究也引入均勻照射聲場下 的超音波導入方式。若能將導入聲場在能量上的分佈變成均勻照射，如此 一來在執行導入時，可搭配大面積之裝置，將均勻之超音波聲場激發在欲 導入之部分，將可使得導入效果更為均勻。
3.2 實驗方法
本研究乃以工程的角度切入問題點，點出影響空孔振動的主要因素－ 頻率，以為研究之重點；此外，聲強的大小也直接影響空孔的形成及皮膚 的損害與否。因此如何藉由控制頻率與聲強的方式，掌握超音波對於皮膚 導入之機制，將是實驗過程可能遭遇的核心問題。 3.2.1 頻率計算 本研究係利用 Rayleigh-Plesset 所發表的不可壓縮液體中內部空孔振動 的運動數學模式，量測豬皮組織上所附著之氣泡大小，以計算氣泡的共振 頻率，再施予皮膚共振頻率與非共振頻率的超音波照射，做為實驗組，配 合未照射超音波的控制組來提供比較。實驗過程中，超音波探頭置於改良 式的 Franz 擴散池的上槽，於上槽的維他命 C 溶液，透過受到空孔效應而 產生改變的豬皮組織，而被導入至下槽。接著比對超音波經皮膚導入與無 導入之通透率差異。本實驗所設定的每組頻率為重複五次（n=5）。 3.2.2 聲強選用 在進行完不同頻率的導入後，再以調變聲強的方式，分別選擇二組不 同聲強，以進行豬皮組織通透性的實驗。藉以釐清聲強對於超音波導入法 的影響，並且評估超音波導入所需的門檻能量為何。 由於頻率越低，達到空孔效應所需的門檻聲強也會隨之降低[35]，如圖3.1 所示。本研究以鋁箔做為觀察空孔效應產生的依據，選擇以 20 kHz 的 頻率下，聲強為 1.9 mW/cm2 與 13.6 mW/cm2，前者為未達可引致空孔效應 門檻能量，後者則為大於門檻能量，以此兩者做為激發聲強。 3.2.3 豬皮組織波速變化之量測 由於超音波診斷技術的基本原理，是利用超音波在不同介質上傳遞 時，所產生傳輸特性的差異，來提供診斷影像。這些差異從波的角度來觀 察，即一物體結構發生改變之後，其波速將會隨之而變。以此思路為出發 點，倘若經過超音波照射之後的豬皮產生了結構上的改變，其波速會異於 正常豬皮組織。故於導入實驗前後，量測豬皮聲速之變化，觀察導入量與 豬皮波速變化的關係。 量測豬皮組織聲速之架設如圖 3.2 所示，以兩片壓克力板，夾住一片 豬皮組織，在夾住的同時，會以固定重量負載於壓克力板上。此舉之目的 是由於使用解剖刀割取豬皮組織時，會有部分的結締組織附著於豬皮組織 上，造成豬皮組織的面並非一均勻平面。為了使壓克力板平貼於豬皮組織 上，故施一均勻且適當的重量於壓克力板上。而在夾持豬皮組織的過程中， 為了之後能順利的擷取超音波訊號，以便於示波器上分析，故於壓克力板 與豬皮組織間，均滴入適量的水以作為耦合之用。所得之訊號於示波器上， 利用距離與時間的關係，求得相關之豬皮組織波速。
3.2.4 超音波探頭聲場的設定 超音波探頭的聲場一般可分為近場跟遠場兩個區域。圖 3.3 說明近場 區域在探頭正前方隨著距離的變化，聲壓會有一連串的相對最大值與最小 值的變動，直到產生聲壓最大值。此時，將此位置相對於探頭的距離設為 L（近場距離）。當與探頭的距離超過 L 時聲壓會隨距離下降直到聲壓值為 零，此稱為遠場區域。在探頭表面的法線方向，近場區域的聲壓值是不均 勻的，因此並不是理想的聲場分佈，於是本研究將照射聲場的焦點放在遠 場區域。 大於近場距離 L 的區域即為遠場區域，L 的大小可以用探頭壓電 材料的直徑 D、頻率 f 及介質的聲速 c 之間的函數關係式表示： c f D L 4 2 = （3.1） 上式為一個廣義的近場距離公式，而平面探頭點波源在水中的近場距離公 式則可簡單表示為下式： λ 4 2 D L = （3.2） 本實驗在高頻探頭部分，是使用超音波熱療機 ULS-1000A 的機型激發 超音波，透過 TUM-0154 的熱療機探頭進行高頻超音波導入。經過遠近場 之計算將探頭安裝於距離猪皮組織 15 mm 處進行導入。而使用該顆探頭之
前，仍需先評估該探頭之聲場是否穩定。如圖 3.4 所示，本研究利用水下 麥克風在量測水域內，在與探頭相同的高度下量測探頭所激發之波場。架 設與探頭量測之圖。如圖 3.5 所示，在距離 15~16 mm 處所測得之聲強為 最大之處，故進行高頻超音波導入部分，將探頭置音波熱療機 15 mm 處進 行實驗。 在進行低頻超音波導入時，為了評估在同一距離下，高低頻率對於導 入之影響，故於低頻超音波導入實驗時，探頭也是距離猪皮組織 15 mm。 但在低頻超音波導入時，20 kHz 的頻率在水中之波長為 75 mm，大於探頭 與猪皮組織間的距離，故可推測猪皮組織所受之聲場為混雜的近場。然而 對於照射聲場的基本要求，乃為單純而能量均勻的聲場。有鑑於此，本研 究依據過去文獻[30]上所提供的方式，改良設計出一種符合此照射聲場要求 的楔型塊。根據聲場擴散理論[31]，當聲波在此楔型塊內經過無數次反射與 透射之後，整個聲場達到能量均勻，空間中任何一點的能量密度都相等， 而且任一聲音向各方向傳遞的機率幾乎相同，這種聲場就稱為 “擴散聲 場＂，如圖 3.6 所示。因此這種理論基本上是從統計能量的觀點出發的， 因此聲場的特性與空間大小有關。而關於如何設計擴散聲場，在 3.5 節有 詳細的介紹。
3.3 實驗物品與儀器
A. 超音波熱療機 型號為 ULS-1000A 本超音波熱療機由傑邁電子提供，如圖 3.7 所示。本熱療機分成兩個 部分。第一部分為超音波控制主機：儀器上的液晶操作面板可以清楚的顯 示目前的實驗設定，透過兩個旋鈕的調變，可以設定超音波的功率與作用 時間。而頻率、週波數等變數，則是由按鈕來選擇；第二部分為醫用探頭， 為水浴式探頭，以不銹鋼製成，可提供 1 MHz 與 3 MHz 兩種不同的頻率。 由主機上的按鈕來選擇頻率，一次只能激發一種頻率。 B. 低頻超音波探頭 分別為 10、20 與 60 kHz 的低頻探頭，如圖 3.8 所示。由國內聲博公司 所製作。探頭外徑均為 33 mm，此一尺寸設計是為了搭配改良式擴散池上 槽的內徑所製；而連接探頭的接頭，是 UHF 型式的水浴式接頭。圖 3.9 為 這三顆低頻探頭的阻抗響應圖，響應區均包括該探頭之主要頻率 10、20 與 60 kHz。C. 函數產生器/任意波形產生器（Function/Arbitrary Waveform Generator）
圖 3.10 為函數產生器或稱任意波型產生器，於本研究中統稱為函數產 生器（Function Generator）。其功能是產生實驗所需之不同波型，用來激振 超音波探頭，除了內建波型之外，也可利用廠商所提供的任意波形產生軟 體 BenchLink，於電腦中建立所需波型後，可任意調整輸出的峰對峰值振幅 範圍為 50 mVpp至 10 Vpp，輸出頻率則隨任意長度的點數改變，以最大波 型長度 16000 點為例，其輸出頻率為 100μHz 至 200 kHz。 D. 功率放大器
型號：Amplifier Research 25A250A
圖 3.11 為功率放大器實體，它的功能是用來放大函數產生器/任意波形 產生器所產生的訊號，藉此控制被激發探頭的超音波強度，以利於參數控 制。此功率放大器對應的頻率響應範圍為 10 kHz~250 MHz，功率輸出大 於 25 W，提供 10 個可調變式檔位之旋鈕，最大檔位增益大於 44 dBm，其 功率輸出曲線如圖 3.12 所示 E. 導入溶質-維他命 C 目前本研究是使用維他命 C 做為導入溶液。調製 pH 3.5 的緩衝液加上 維他命 C 溶液做為欲導入液，該溶液是以 5.35 ml 的 0.1 M 檸檬酸（citric acid）、5 ml 的 0.2 M Na2HPO4、0.3 g 的維他命 C、90 ml 的水與 100 ml 的 甘油調製而成，如此一來所得之導入溶液為 pH 3.5 的緩衝液加上維他命
C，此溶液濃度為 8.5 mM 的維他命 C 溶液。 選擇維他命 C 做為導入溶質的原因，在於維他命 C 的醫療效用，是廣 為研究的項目，在 MEDLINE 的資料庫中，有 24000 篇關於維他命 C 的研 究報告。除了人類，靈長類和少數其他動物之外，都可以自行製造維他命 C，為了維持自身的健康。人類必須由食物中攝取維他命 C，不然就會出現 壞血病，以致死亡。所有哺乳動物都每天自己製造相當人體（70 公斤）2 克的維他命 C。當牠們受傷、患病、身體或精神緊張時，會加速製造高達 每天 20 克的維他命 C，來修護傷口，保護器官，及應付危機。此外，維他 命 C 能將已形成的黑色素加速逆向還原至最初型態，中和及抑制黑色素生 成，並預防日曬後老化、提高肌膚的自主防禦能力，因此被廣泛應用在一 般美白產品裡；另一方面，維他命 C 是使膠原蛋白穩定的酵素的必需成分 之一，維他命 C 是製造膠原蛋白的必需物，膠原蛋白是構成真皮的最主要 成分。 本研究選取維他命 C 這種在市面上已廣為使用之材料，做為實驗對 象，除了以上兩點之外，在先期研究中，可以得到經過超音波照射三小時 的維他命 C 溶液，其濃度並不會發生改變的物性，但實驗過程時，必須全 程避光，以免溶液變質；而選擇 8.5 mM 的維他命 C 是由於在該濃度下處 於常溫可維持穩定的狀態而保存更為長久，基於短時間內只要不接受高熱 及陽光，維他命 C 具有不易變質及穩定保存的緣故，又為一般常見之美白
藥品內必含之藥劑，故選之為導入溶質。吾人希冀在本實驗之下，能達成 超音波導入率能更為提升，減少維他命 C 之使用成本。 F. 樣品皮膚組織 雖然豬隻與豬隻個體間差異性大，但由於取得方便，且豬的皮膚組織 結構特性近似人類皮膚，其上表皮再生性、皮下脂肪層及燒傷後內分泌與 代謝等也相似，仍不失為初步研究的好樣本，故本研究將以豬皮做為通透 過程的皮膚[32]。本研究所使用的豬皮組織是利用手術刀割取豬耳至軟骨的 部分，並將肌肉與結締組織儘可能清除。由於此部分皮膚包含著豐富的角 質層與真皮層組織，故於切割時必須小心謹慎，如圖 3.13 所示。接著將豬 皮組織以流動的冷水清洗乾淨，切下大約 11 cm2面積的豬皮組織，隨後就 儲藏在-20 ℃之溫度下，直到使用時取出置於室溫一小時下回溫後再進行 實驗，而儲藏的時間最好不要超過一個月，以免豬皮組織變質，影響實驗 之準確性。 G. 改良式 Franz 擴散池 當豬皮組織從冰箱取出，等待一小時回復至室溫後，立刻固定在改良 式 Franz 擴散池（Franz Diffusion Cell）上。Franz 擴散池在生物或醫學領域 的研究上，主要是用來測量各種物質或分子通過中間測試膜難易程度的儀 器，它是一只由兩室結合的擴散裝置，中間夾了一區可供上下兩室滲透的
膜，如圖 3.14 所示。擴散池上層是放導入溶液，依本研究的設計，上層是 放維他命 C 之處；而下層則是接受導入的物質之處。於下層接受導入的溶 劑，則是 pH 7.4 的緩衝液，是由 1.55 ml 的 0.1 M 檸檬酸（Citric Acid）、9.1 ml 的 0.2 M Na2HPO4、89.35 ml 的水與 100 ml 的甘油混合而成。 H. 單點式磁性攪拌機與磁石攪拌子 為了能讓導入過後的溶液均勻混合，以模擬血液循環的樣子，故於擴 散池下方安裝一組單點攪拌器，並在擴散池下槽放入一顆攪拌子。如圖 3.15 所示。該攪拌器是利用磁力，透過旋轉的攪拌子，將下槽的溶液攪拌均勻， 以利於取樣時，樣本之濃度能代表整個下槽的濃度。 I. 高效能液相層析儀 一般來說量測通透物質濃度的方式很多，可以採用放射性標記法、酸 鹼滴定法，或是採用光密度測定法以及高效液相層析法。其中放射線標記 法量測通透物質的濃度，這是將原來的通透物以碳 14 或重氫的同位素，作 為標記，待其通透之後便以放射性衰減的特性去量測，但是會有受到放射 性污染的危險；酸鹼滴定法則是利用溶液中 H+及 OH-離子的變化，加入指 示劑去觀察顏色變化；光密度法則是利用分光光度計測量光密度的變化， 以求出溶液濃度；而本研究則採用高效液相層析技術去測試其濃度變化。 高效液相層析技術為分析技術中應用最廣泛的一種層析法。層析分離
過程，主要由不同物質，在兩個不相容的媒介（亦即固定相及移動相）之 間的平衡分佈差異而定。欲分離的成分需先溶於溶劑中，然後在高壓下注 入分離管柱，樣品中的各個成分藉由移動相的帶動，滲透通過分離管柱中 的固定相。各成分的移度依其平衡分佈狀態而定，有些成分和固定相之間 的作用力不大，很快地被沖堤出分離管柱，而有些成分與固定相作用力較 快，則較慢沖堤出來。 由於各成分與固定相的作用不同，造成移動速度的差異，因此產生分 離效果。由於不同特性的移動相及分離管柱的配合，HPLC 可有多種分離 模式，因此可廣泛的應用於不同型態的化合物分析，其領域可適用於化學、 化工、醫藥檢驗、農化、環境檢驗、生化、食品飲料等各類樣品分析及作 為學術研究與開發產品研究之應用工具。 圖 3.16 為本研究所使用之 HPLC 系統，係由林口長庚大學天然藥物研 究所提供，其單元如下： 1. 自動取樣器（Autosampler）：HITACHI L-7200
2. 幫浦（Pump）：HITACHI L-7110 流速:1 ml/min
3. 紫外線檢測器（UV Detector ）：HITACHI L-7400 波長設定在 255 nm
4. 移動相：MeOH 與 pH3.5 Citric Acid - Phosphate Buffer 以 70 比 30 的比 例調配而製。
5. 管柱（Column）：以不鏽鋼製，長 25 cm, 管內徑 4 mm 的 RP-18-NH2 管柱（Merck company, Darmstadt, Germany）。
J. 數位示波器（Digital Oscilloscope） 型號：LeCory 9410 Dual Channel
圖 3.17 為數位示波器，其功能包括： 1. 可讀取並顯示電壓訊號，得知發射及接收脈波之時間差；並可將時間 域中的訊號經傅利葉轉換至頻率域即可知頻率為何。 2. 用以量測訊號之電壓大小，以相對之尖峰伏特表示。 3. 利用 RS-232 介面輸出訊號至電腦繪製圖形。 K. 金相顯微鏡 圖 3.18 為金相顯微鏡，外接 CRT 螢幕與燈光。其主體為 OLYMPUS BH 型號之金相顯微鏡，1 號部分為外接之 TOSHIBA CCD Color Camera；2 號 部分為 10×/20 之接目鏡；3 號為五顆接物鏡，分別為 5 倍、10 倍、20 倍、 50 倍、80 倍；4 號為承載座，將欲觀察之豬皮組織置於其上，將燈光打開， 即可透過透鏡觀察豬皮組織之顯微結構。
L. 微型 PVDF 水下麥克風探針（Miniature PVDF Ultrasonic Hydrophone Probe）
圖 3.19 為 PVDF 水下麥克風探針，可以量測液體介質的超音波聲壓， 並將所量測之訊號傳回示波器加以分析，讓使用者能掌握照射聲場中的細 微聲壓變化，繪出聲場分佈圖。微型探針的設計，使得接受面積大大減小， 如此回波量也會減少，更能加以精確描繪出聲場特性。故選擇之。該 PVDF 水下麥克風探針的主要頻寬為 0.5~20 MHz，用之量測 1 與 3 MHz 之探頭聲 場，如圖 3.20 所示。 M. AE 超聲探頭 圖 3.21 為成對之 AE 超音波探頭。頻率為 250 kHz 的探頭主要用在音 洩法上。但在本研究裡是用於量測楔型塊所釋放出來的聲場上。圖 3.22 為 該探頭之頻率響應圖，其 3 dB 頻寬範圍包括 230 kHz 到 270 kHz 的頻率。 之後將使用 230、250 與 270 kHz 的頻率於檢驗楔型塊是否達到擴散聲場。
3.4 實驗步驟
3.4.1 高頻超音波導入實驗步驟 本研究之實驗步驟，首先由整個導入實驗架設建立起。包括豬皮組織 的取得、擴散槽與溶液之配置等，透過以下描述逐一介紹。 從市場取得新鮮豬耳朵，清洗之後觀察豬耳背部分，避開有明顯的受 傷部位，接著將豬耳朵背部，以 10 號與 20 號之解剖刀與解剖剪，謹慎的 將肌肉與結締組織去除後，取得豬耳背之表皮部分以作為實驗用。 選取改良式玻璃製擴散池，如圖 3.23 所示。上槽部分，高 38.5 mm， 通透孔徑之直徑為 22 mm；下槽部分，高 53.5 mm，通透孔徑之直徑為 22 mm，分內、外膽，內膽裝有經通透後之維他命 C 溶液，外膽則為冷卻水系 統，是為了維持整個導入系統能保持恒溫。其中內膽部分有一內插管，利 於不同時間點抽取下槽之維他命 C 之溶液。 將下槽（Receptor Cell）以 pH 7.4 緩衝液注入 20 ml，放入磁石攪拌子， 用以接受經過超音波導入後之維他命 C 溶液，同時可以均勻攪拌。接著將 豬皮角質層面向上，覆在下槽上方，再將上槽安裝上去之後，以燕尾夾固 定整組裝置。隨後將上槽注入 16 ml 的 8.5 mM 維他命 C，做為導入之藥品。 而維他命 C 溶液在 8.5 mM 的濃度下，是最穩定不易變質的濃度，因此本 實驗採用此濃度來進行導入溶液的濃度。但在實驗進行中，需注意光線照射問題，由於光線及熱容易讓維他命 C 變質，導致整組實驗不穩定，故必 須在暗室進行此實驗。 將冷卻系統之冷卻水、循環系統連接至改良式玻璃製擴散池，並啟動 冷卻水循環與單點磁石攪拌機。將超音波探頭置於上槽溶液處，使探頭表 面距豬皮耳背組織 15 mm，激發超音波，溫度控制在 18°C。接著將功率週 期設定為 1：9，分別以不同聲強分別激發超音波，至此超音波導入系統架 設完成。在不同時間點取樣，所得之樣本迅速送入-20°C 之溫度儲存，以 便之後送至 HPLC 進行濃度檢測。 評估超音波熱療機導入之流程，乃是將超音波熱療機探頭連接至超音 波熱療機，並將探頭置於上槽溶液處，使探頭表面距豬皮耳背組織 15 mm， 啟動超音波熱療機，溫度控制在 18°C。接著將超音波熱療機設定在 1 MHz，功率週期 1：9，分別以聲強為 2.22 W/cm2、1.48 W/cm2、0.76 W/cm2 激發超音波；再設定至 3 MHz，聲強設定為 1.53 W/cm2 、1.02 W/cm2 、0.51 W/cm2，至此超音波導入系統架設完成，如圖 3.24 所示。第 1 部分為激發 超音波之熱療機主體；第 2 部分為擴散池之上槽；第 3 部分為擴散池之下 槽；第 4 部分為磁性攪拌器；第 5 部分為水循環系統；第 6 部分為冷卻池， 是為了維持溶液恆定的溫度，以避免超音波熱效應干擾實驗結果。本實驗 之溫度維持在 20±1℃。一次完整實驗歷時 1 個小時，每 15 分鐘取擴散池 下槽之緩衝液 1 ml，並再補充 1 ml 之 pH 7.4 緩衝液，以之量測經超音波導
入豬皮後之維他命 C 濃度。將所取之緩衝液置於褐色之離心管，並置於-20 °C 下保存。之後將所得之下槽溶液，送入高效能液相層析儀進行維他命 C 濃度定性檢測。 3.4.2 低頻超音波導入實驗步驟 實驗流程與高頻超音波導入相同，只有在激發超音波聲源上，略有不 同。在低頻超音波導入實驗中，乃是將聲源改為 10、20 與 60 kHz 的探頭， 並經由函數產生器 HP 33120A 分別調制 10，20 與 60 kHz 產生的正弦波來 激發相對應頻率之探頭。其中 10 kHz 是低於本研究所計算之空孔共振頻率 區間之頻率；20 kHz 是符合空孔共振頻率區的頻率；60 kHz 則是高於空孔 共振頻率區的頻率。接下來使用 1.9 mW/cm2 與 13.6 mW/cm2做為激發的聲 強，照射 15 分鐘之後，取改良式擴散池之上槽與下槽溶液，送至高效能液 相層析儀進行維他命 C 濃度之定性分析。此一實驗乃是探討頻率與聲強這 兩個參數對於超音波導入之影響。
3.5 均勻聲場的設計
由於探頭的照射能量是以高斯分佈的方式呈現，造成照射區域部分能 量集中。為了使照射能量不只集中於單一區塊，而是能夠將能量均勻的分 佈於照射面上，參考前人之文獻[30]，設計一楔型塊，使探頭所照射的能量 在經過該楔型塊後，能在照射面上產生能量均勻的波。 本楔型塊的設計，採取讓楔型塊的外型上截除了一角，並從該截除面 安裝超音波探頭，如此一來使得聲波能夠在此楔型塊內不斷地進行反射， 在經過不斷地反射之後，整個聲場理論上會達到均勻，即空間中任一點的 能量都相等，且任一聲波在各方向傳遞的機率接近相同。此外考慮到楔型 塊的面與面間距，也必須非波長的整數倍，以避免駐波的產生使得能量只 駐留在該處。設計此一楔型塊的尺寸為 62 mm × 65 mm × 120 mm，並截 除每一邊長均為 75 mm 的正三角形，如圖 3.25 所示，即為本實驗所設計之 楔型塊。在楔型塊上，角與邊的部分均予以圓角圓邊處理，此一設計乃是 讓聲能在該楔型塊傳遞時，有更多可供反射的機會，使波的擴散更為均勻。 由於研究上的限制，無法取得成對之 10、20 與 60 kHz 探頭，以收發 分置的方式來了解超音波經由照射該楔型塊時，楔型塊中是否達到均勻聲 場。故以實驗室現有之最低頻成對探頭 250 kHz 做為激發聲源，藉由收發 分置來得知入射之超音波於各面是否達到均勻之聲場，根據此 250 kHz 探頭之頻率響應圖得知，230 kHz 與 270 kHz 也是在頻率響應之區間。一般為 了製造均勻的聲場，通常是使用變頻的方式來產生均勻的效果。但本研究 是以改變照射場的型狀，以一單頻來做激發源。為了解不同頻率在此一楔 型塊中，不同面上的聲能分佈情形，故以函數產生器分別激振 230 kHz、250 kHz 與 270 kHz 的頻率，檢驗在楔型塊上的那一個面能形成較均勻的聲場。 量測楔型塊上不同面之聲場分佈，如圖 3.26 所示，即為楔型塊各個面之示 意圖。每個面上量測五點之後，以 Matlab 繪出其聲場分佈圖。此部分於 4.5 節討論之。最後再以所製之楔型塊經由低頻超音波進行超音波導入，研究 均勻的超音波能量照射對於超音波導入的影響。
圖 3.1 引致空孔效應所需之門檻聲強與頻率的關係[33]
圖 3.3 探頭聲場變化
圖 3.5 熱療機探頭聲場分佈圖
圖 3.7 超音波熱療機
圖 3.10 函數產生器/任意波形產生器
圖 3.12 功率放大器的頻率與功率放大輸出圖
圖 3.14 改良式 Franz 擴散池架構示意圖
圖 3.16 高效能液相層析儀
圖 3.18 金相顯微鏡(1 為 CCD 數位攝影機；2 為目鏡；3 為物鏡；4 為載座)
圖 3.21 AE 探頭
圖 3.23 改良式 Franz 擴散池
圖 3.24 超音波導入系統架構圖(1 為超音波熱療機；2、3 分別為擴散池上 下槽；4 為磁性攪拌機；5 為冷卻水；6 為循環系統)
圖 3.25 為達到均勻聲場所設計的楔型塊
第四章 實驗結果與討論
本研究利用附著於豬皮組織上之氣泡尺寸，推算相對應之空孔共振頻 率，定義超音波導入之機制為空孔效應。實驗結果證實，超音波空孔效應 所造成豬皮組織樣本通透量更甚於超音波機械效應的影響。此外以工程角 度切進導入領域所提之均勻照射場之構想，本研究將會照射一楔型塊使之 內部產生擴散聲場後，照射至豬皮組織上，以探討超音波聲場均勻性對於 超音波導入的影響。4.1 共振頻率與導入量定義
4.1.1 氣泡與共振頻率計算 欲得知氣泡大小，首先將切割處理好的豬皮組織，滴上適量水後，載 於鏡座上，利用金相顯微鏡放大顯示於 CRT 螢幕，配合比例尺，便可量測 氣泡尺寸之大小。 而空孔共振頻率計算的方式，以圖 4.1 所量測之氣泡尺寸為例，該氣 泡 直 徑 為 350 μ m， 而由參考文獻[25]中得知水的表面張力 σ =72.75 dyn/cm，水的密度ρ =1 g/cm3，黏性係數η =1.002×10-2 g/cm．sec，比熱比 γ =1.4，溫度 T=18°C 及壓力Ρ0 =760 torr。溫度選取 18℃是為了在進行超 音波導入時，避免超音波熱效應影響實驗的準確性。將以上之參數代入式 2.3。即可求得共振頻率 18.7 kHz，其餘氣泡尺寸與相對共振頻率整理如表4.1 所示，由其中可知，當氣泡尺寸越小，所得之空孔共振頻率越高。經由 金相顯微鏡，觀測附著於豬皮組織上氣泡之尺寸，搭配空孔共振公式的計 算，可得知豬皮組織上氣泡共振頻率，介於 15~36 kHz 的頻率區間，故當 導入溶液為水溶液且覆蓋於豬皮組織時，選擇此一頻率區間的頻率進行超 音波導入。 4.1.2 導入量定義 欲得知超音波導入法之成效，可由導入量的多寡進行比較得知。在本 研究中所定義的導入量有兩種，依導入至何處做為界定。第一種是維他命 C 導入至豬皮組織的量來定義；第二種是導入至擴散池下槽的量來定義導 入量。如圖 3.14 上槽維他命 C 溶液的濃度，經過超音波作用所引致之空孔 效應會產生震波及微噴射流，造成附近豬皮組織之表面塑性變形或破裂。 在適當的能量下，皮膚表面的塑性變形能使得維他命 C 擴散至角質層或透 過角質層而到擴散池下槽，因此上槽的維他命 C 濃度就會減少。從擴散池 下槽所取得的維他命 C 量與上槽所減少的維命 C 量，可以分別得知兩種導 入量的結果。若導入的結果，只有將維他命 C 送至皮膚組織層卻未送至擴 散池下槽，代表超音波的作用只有到達皮膚組織層，換句話說這種導入的 方式，所引致的空孔效應影響皮膚角質層只有些微的變形或擾動，故導入 的作用只有在皮膚組織上，並無穿透角質層，適用於皮膚美白或皮膚組織 外層的醫療行為上；若維他命 C 透過了皮膚層而進入至擴散池下槽，代表
所引致之空孔效應可能造成角質層上的破裂或損壞，使得藥物可以輕易的 透過角質層而進入體內，這種的導入方式適合用在非侵入式投藥方法，例 如用在像糖尿病患者，於外部導入胰島素進入人體。所以在本實驗分為此 兩種方式來定義導入量，並區別用途。
