多巴胺第二型受器在高血壓老鼠以及非高血壓老鼠膽道結紮模型中在膽管上皮細胞的表現; The Expression of Dopamine Type Two Receptor in Cholangiocyte Between Spontaneously Hypertensive Rat and Wistar-Kyoto Rats After Bile Duct Ligation
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(2) 內文目錄 英文摘要. 1. 中文摘要. 3. 第一章 前言. 6. 第二章 文獻探討. 9. 第一節 肝臟的文獻探討. 9. 第二節 膽汁鬱積所形成的肝損傷-肝纖維化. 13. 第三節 膽汁鬱積性肝損傷之實驗動物模型. 20. 第四節 6-hydroxydopamine(6-OHDA)與兒茶酚胺(catecholamine)的關係 第五節 膽道(膽管上皮細胞)增生調控. 26 28. 第六節 多巴胺第二型受器(D2R)與膽道增生的關係. 30. 第三章 材料與方法. 32. 第一節 材料. 32. 第二節 方法. 39. 第四章 結果. 51. 第一節 動物觀察及生存率. 51. 第二節 血清生化值檢測. 53. 第三節 肝臟組織病理觀察. 58. 第四節 Dopamine beta-hydroxylase(DBH)及Dopamine type 62 two receptor(D2R)mRNA之RT-PCR 表現分析 第五節 免疫組織化學染色分析Dopamine type two receptor 65 (D2R)之表現 第五章 討論. 66. 圖表. 71. 參考文獻. 83 I.
(3) 圖表目錄. 頁數. 表一 膽道結紮後各組肝臟重與體重的比值 表二 血清生化值(Serum Biochemistry data) 表三 膽道結紮後及施予藥物6-OHDA後各組膽道增生量化圖 圖一 肝小葉及門脈區解剖圖. 71 72 78 12. 圖二 肝損傷到肝纖維化路徑. 23. 圖三 兒茶酚胺生合成路徑. 27. 圖四 BDL(Common bile duct ligation)總膽管結紮手術示意圖 圖五 實驗設計法及分組. 49 50. 圖六 膽道結紮後各組肝臟組織病理變化 ( H/E stain) 圖七 膽道結紮後各組肝臟組織膠原蛋白的表現 (Masson-Trichome stain) 圖八 膽道結紮後各組肝臟組織纖維化的表現(α-SMA IHC stain) 圖九 SHR及WKY膽道結紮後及施予藥物6-OHDA後各組膽道增生及纖維 化比較圖 (一) 圖十 SHR及WKY膽道結紮後及施予藥物6-OHDA後各組膽道增生 比較圖(二) 圖十一 膽道結紮後SHR及WKY各組別 D2R 之RT-PCR產物 agarrose gel圖 圖十二 膽道結紮後SHR及WKY各組別 DBH 之RT-PCR產物 agarrose gel圖 圖十三 膽道結紮後免疫組織化學染色分析Dopamine type two receptor(D2R)之表現. II. 73 74 75 76 77 79 80 81.
(4) Abstract The Expression of Dopamine Type Two Receptor in Cholangiocyte Between Spontaneously Hypertensive Rat and Wistar-Kyoto Rats After Bile Duct Ligation 1Jeng-Shou. Chang, 2Ruei-chen Hung , Chao-Tian Hsu 1,2# , Ting-Ting Yang2 Graduate Institute of Basic Medical Science,China Medical University,Taiwan,R.O.C Neurotransmitters and cytokines can modulate the bile duct proliferation through c-AMP /PKA/ERK pathway. Dopamine may bind with dopamine type two receptor(D2R) to increase PKC-γ expression and decrease PKA activity, them, it could inhibit bile duct proliferation. We used 6-hydroxyldopamine(6-OHDA) as bioaminergic depletor to lower dopamine level and evaluated that whether reduced endogenous dopamine level may influence the bile duct proliferation in rat bile duct ligated animal model. Previously, our laboratory found bile duct proliferation of Wistar-Kyoto rats(WKY) rats was much higher than Spontaneously hypertensive rat(SHR) rats after 3 weeks bile duct ligation (BDL) . Cholangiocyte expressed D2R and its expression was markedly upregulated after BDL. Our goal in this study was to find out that D2R regulate the cholangiocyte proliferation between SHR and WKY rats after BDL. Our results in immunohistochemistry(IHC), expression of D2R was upregulated after BDL and much higher after BDL + 6-ODDA (sympathetic inhibitor) and its expression of SHR rats was more than WKY rats. In Masson trichrome stain for collagen, the expression of bile duct proliferation in WKY was much more than SHR after BDL . Bile duct proliferation was ugregulated 1.
(5) after 6-OHDA used. D2R would combine with dopamine to inhibit bile duct proliferation .After 6-OHDA injection , the D2R with decreased dopamine could not inhibit bile duct proliferation .So bile duct proliferation upregulated . Our finding suggested that D2R play a critical role in modulated bile duct proliferation after BDL, especially in hypertensive rats (SHR).. Key Word: Common bile duct ligation(BDL),Dopamine type two receptor(D2R), 6-hydroxyldopamine(6-OHDA), immunohistochemistry(IHC), bile duct proliferation,Spontaneously hypertensive rat(SHR),Wistar-Kyoto rats(WKY). 2.
(6) 中文摘要 膽道結紮後會造成膽道增生已被大眾所認知，也是臨床上原發性 膽道硬化(PBC)的動物實驗模式。許多神經傳導物質可以透過 c-AMP/ PKA/ERK pathway 來調控膽道增生或抑制。dopamine 可以透過活化 PKC-γ/Ca. 2+. pathway 且抑制 PKA pathway 來抑制膽道增生的表現。. 我們使用交感神經抑制劑 6-hydroxyldopamine(6-OHDA)來抑制 dopamine，預期是否 dopamine 下降將會影響膽管結紮老鼠之膽道增 生。 我們發現本態性高血壓老鼠(SHR)在膽道結紮三週後的膽道增生 表現小於對照組非高血壓老鼠(WKY)。而在本態性高血壓老鼠中發現 以 dopamine 量會高於非高血壓(WKY)老鼠。而膽道上皮細胞(cholan giocyte)只表現 dopamine type two receptor(D2R)。所以想探討 dopamine 跟 D2R 在膽道結紮後老鼠中扮演的角色。 材料及方法 探討(一)SHR 及 WKY 膽道增生比較 (二)6-OHDA 注射後，D2R 的調控角色。 使用本態性高血壓老鼠以及非高血壓老鼠各分為三組，各分為正常組 及膽道結紮三週組 BDL(N=6)，以及膽道結紮三週+6-OHDA(交感神經 抑制劑) (N=6)。 3.
(7) 藉由觀察期血清生化值、型態學、免疫組織化學染色法(IHC)、聚合 脢連鎖反應(PCR)觀察期 D2R 表現量差異及其中扮演之角色。 結果 經由 Masson trichrome stain 染膠原纖維，發現非高血壓老鼠 (WKY)膽道增生量及纖維化程度均大於本態性高血壓老鼠(SHR)，膽道 增生表現量是 WKY+ 6-OHDA 膽道結紮 3 週+6-OHDA 組大於 WKY 膽道結 紮 3 週表現，再大於 SHR 膽道結紮 3 週+6-OHDA 組，最後是 SHR 膽道 結紮 3 周的表現。 在血清生化值裡也發現膽道酵素如 ALP 及γ-GT 值在非高血壓老 鼠(WKY)中表現均大於本態性高血壓老鼠(SHR)，打 6-OHDA(交感神經 抑制劑)後表現亦是非高血壓老鼠(WKY) 膽道結紮 3 周+6-OHDA 大於 本態性高血壓老鼠(SHR)膽道結紮 3 周+6-OHDA。 在 RT-PCR 方面發現 D2R 表現，SHR 膽道結紮 3 週表現會大於對 照組，SHR 膽道結紮 3 週+6-OHDA 組別 D2R 表現也大於 SHR 膽道結紮 3 週表現。在非高血壓老鼠 WKY 組亦是相同情形，WKY+6-OHDA 膽道結 紮 3 週+6-OHDA 組別 D2R 表現也大於 WKY 膽道結紮 3 週表現，WKY 膽 道結紮 3 周表現會大於正常組。免疫組織化學染色(IHC)中發現，D2R 會表現在肝細胞(hepatocyte)、纖維母細胞(fibroblast)及膽管上皮 細胞(cholangiovyte)。 4.
(8) 討論 Dopamine 會結合 D2R 達到抑制膽道增生效果，如果抑制 dopamine， D2R 將會代償性增加，但是還是不能與 dopamine 結合，所以將無法 抑制膽道增生，最後造成膽道增生量增加。我們實驗發現 D2R 在本態 性高血壓老鼠 SHR 及非高血壓老鼠 WKY 膽管結紮 3 週後調控膽道增生 確實扮演一種要角色，特別是在本態性高血壓老鼠 SHR 中。本態性高 血壓老鼠(SHR)膽道纖維化情形低於非高血壓老鼠(WKY)；如應用於臨 床肝膽疾病中，推測可以使病人服用 D2R 促效劑(agonist)去減緩膽 道病程的惡化。. 5.
(9) 第一章 前言 肝硬化是國人常見的慢性肝臟疾病，每年約有一萬多人因此而 死亡； 96年的國人主要癌症死因中，慢性肝臟疾病及肝硬化排名第2 位；在男性癌症主要死因中排名第1位，女性則為第2位，男性十大死 因中排名第7位；女性十大死因中排名第8位1。肝硬化乃是指肝臟的 瀰漫性纖維化及伴隨無數的肝實質再生結節，在後期肝硬化會併發有 門脈高壓、食道靜脈曲張、上胃腸道出血、脾臟腫大、腹水、肝衰竭、 肝昏等；肝硬化末期最可能導致肝癌的發生。因此，如何早期預防肝 纖維化產生，以及如何在肝纖維化初期予以積極治療，來減少肝細胞 外基質堆積與促進肝纖維降解，已成為研究肝硬化之主要課題。 近年來，伴隨肝纖維化分子機制被闡明13，加上現今醫學分生 之純熟，人們對這樣疾病的癒後前景有較客觀態度，而在美國著名肝 臟學家Dr. Friedman提出進行中的肝纖維化是可以逆轉(reverse)的 觀念後，世界各國肝臟學者便開始致力於逆轉以及治療肝纖維化的機 制及病程上。 一般誘發肝損傷的物質有八類，分別為toxic、nutritional、 immunologic、cholestatic、alcoholic、genetic、metabolic、 和transgenic，不同的誘發方式各有其獨特的特徵83。 肝硬化是一種非常複雜的病理組織反應，其中肝實質細胞、非實質細 6.
(10) 胞及炎症細胞之相互作用，反覆性的肝細胞受損及修復使肝臟發生廣 泛性的纖維化，所以為了瞭解肝硬化的分子致病機轉，建立可靠且具 再現性的動物模式是必要的 19。而在基礎研究上，肝炎病毒的動物模 型不易建立，因此本研究選擇了在組織型態與病理變化上有許多近似 點的膽道結紮(Common bile duct ligation，BDL)動物模型，來模 擬次發性膽汁性肝硬化(Secondary biliary cirrhosis)。此模型會造成 漸進性門脈區纖維化，最後終將形成肝硬化，但卻沒有因為肝毒性造 成大量發炎、變性壞死，因此臨床上可用於直接評估藥物在對抗肝纖 維化方面之療效 14。 Dopamine receptor 皆屬於 Gi protein 的 superfamiliy，在體 內的作用是透過 5 種 dopamine 受器來調控生理反應的。有些如 D1 和 D5 receptor，其作用是活化 adenylyl cyclase(AC)為；而 D2、D3 2+. 和 D4 receptor，其作用是抑制 adenylyl cyclase(AC)、Ca 通道且 +. 活化 K 通道。而在膽管上皮細胞中只表現 Dopamine D2R。過去文獻. 3. 有提出，dopamine 可以抑制膽道增生，期透過途徑是藉由活化 PKCγ活性；及抑制 PKA 活性，來達到抑制膽道增生之目的。 許多文獻也提到在腦部的 Dopamine D2R 在高血壓老鼠(SHR)中 是比非高血壓老鼠(WKY)多的. 81,82. ，故本實驗推測在肝中，高血壓老. 鼠(SHR)的 D2R 含量是多於非高血壓老鼠 (WKY) 的。藉由總膽管結紮 7.
(11) 三週(BDL)來達到肝纖維化之目的，探討 D2R 在高血壓老鼠(SHR)以及 非高血壓老鼠(WKY)中期扮演之角色，以及預測其功能。. 8.
(12) 第二章 文獻探討 第一節 肝臟的文獻探討 肝臟位於腹腔上部右側，表面平滑呈暗紅色，其結構分為四葉， 右葉體積最大，約佔整個肝臟的五分之四，以鏈狀韌帶與左葉分隔； 左葉約佔肝臟的五分之ㄧ；其餘肝葉較小，尾葉位於肝臟背腹面，方 葉位於肝臟前下緣。肝臟是人體內最大的腺體器官，成人的肝臟約重 1400-1600克，為體內進行代謝的主要場所，在身體裡面扮演著去氧 化，儲存肝醣，分泌性蛋白質的合成等功能。 肝臟具有雙重血液供應系統 : 肝動脈與肝門靜脈，肝臟中約有 30%的血液來自肝動脈，提供氧氣充分的動脈血；70%的血液來自肝門 靜脈，匯集腸胃道靜脈血進入肝臟。膽管、肝動脈與肝門靜脈在肝細 胞之間形成門脈區 (portal area)，來自肝動脈與肝門靜脈的血混合 後，經由竇狀隙 (sinusoid) 流入中央靜脈 (central vein)，再匯 集至肝靜脈中。肝臟之組成是肝細胞、末端肝小靜脈、門脈三體及竇 狀隙以相當整齊的方式排列，形成所謂的『肝小葉』-肝藏的基本組 成單位，在肝小葉中可區分出不同區段之肝細胞，即中央靜脈區 （centrolobular zone）、門脈周圍帶（periportal zone）及中間 帶（mid zone）；中央靜脈區由圍繞著中央末端小肝靜脈的肝細胞所 組成，是離充氧動脈血供應最遠的地帶。 9.
(13) 肝臟內的細胞分為實質細胞(parenchymal cells)與非實質細胞 (non-parenchymal cells)，實質細胞主要為肝細胞(hepatocytes)， 約佔80%，肝細胞在外觀上呈現不規則的多面形體，細胞膜上具有微 絨毛 (microvilli)；肝臟中其餘的細胞則為非實質細胞，非實質細 胞為底下數種細胞的統稱，分別為： 1. 星狀細胞 (又稱hepatic stellate cell、fat-storing、 prisinusodial、或Ito cell)：位於肝細胞與孔狀內皮細 胞間的狄氏隙 (Disse，s space) 中，此細胞僅占整個肝細胞不到 4. 5%，但是儲存了整個身體的75%維生素A 。儲存脂肪和油溶性維生 素A，並且分泌細胞外基質 (extra-cellular matrix, ECM)，例 如：膠原纖維 (collagen)，膠原纖維負責維持肝臟的結構。 2. 膽管上皮細胞 (cholangiocytes)：參與部份膽汁的分泌，約1/3 的膽汁由膽管上皮細胞所分泌；膽管上皮細胞在水、電解質運輸 過程中起著重要的作用，同時也能分泌和表達與炎症有關的細胞 激素和黏附分子等。 3. 孔狀內皮細胞 (fenestrated endothelial cells)：位於竇狀隙 (sinusoid) 與肝細胞之間，相連的孔狀內皮細胞間具有孔隙 (sinusoidal fenestration)，可允許血液中的小分子通過，如： 乳糜微粒。肝臟受損時這些孔隙會消失。 10.
(14) 4. 庫氏細胞 (Kupffer cells)：為巨噬細胞的一種，能夠清除血液 中一些氧化蛋白或醣化蛋白與脂蛋白。 5. Pit 細胞：又稱自然殺手細胞 (natural killer cells)，同樣位 9. 於竇狀隙中 。. 11.
(15) (圖一) 肝小葉及門脈區解剖圖. 10. 12.
(16) 第二節 膽汁鬱積所形成的肝損傷-肝纖維化 肝纖維化是一對慢性肝損傷的修復反應，起初是發炎細胞、巨噬 細胞(kupffer cell)被激活，試圖除去造成肝損傷的外來刺激，其後 因免疫介質及肝生長因子調控，進而活化肝臟星狀細胞，轉變成肌纖 維母細胞，並分泌大量肝細胞外基質(ECM)造成膠原纖維樣物質沉積 5. 。當肝纖維化形成後，若未除去損傷刺激病因，或未加以治療，將. 進展成肝硬化、肝衰竭，甚至肝癌。 就肝纖維化病因而言，最常見盛行的致病因是病毒性肝炎、酗 酒、藥物濫用、原發性硬化性膽管炎(PSC)、原發性膽道性肝硬化(PBC) 、次發性膽道阻塞型肝硬化、先天性代謝疾病、基因缺陷(α-anti 5. trypsin deficiency)、囊泡性肝纖維化、肝血吸蟲感染等 。但就 兒童而言，常見病因包括肝外膽管狹窄、家族性膽汁鬱積症候群、原 發性硬化型膽管炎及新生兒原因不明性肝炎。而大白鼠膽道結紮動物 模式(BDL)，則類似於人類次發性膽道阻塞型肝硬化、肝外膽管狹窄、 家族性膽汁鬱積症候群、原發性硬化型膽管炎及新生兒原因不明性肝 6. 炎。 當膽汁滯留於肝臟時，膽汁會藉由產生 death-inducing signaling complex (DISC)，造成 Bid 的分解以及 caspase-8 / 9 / 34. 3 的活化，引起肝細胞的凋亡 (apoptosis) 。凋亡後的肝細胞會形 13.
(17) 成凋亡小體 (apoptotic body)，凋亡小體會透過細胞膜上的磷脂酸 絲胺酸 (phosphatidylserine, PS) 表現出 ＂eat me＂ 訊號，吸引 吞噬細胞 Kupffer cells 前來吞噬，促使肝臟星狀細胞 (hepatic stellate cell, HSC) 活化，導致肝纖維化的情況出現. 36、37. 。. 當肝臟受到傷害後，會引起肝細胞壞死及炎症反應，肝細胞破壞 之後會產生瘢痕（scarring），雖然肝細胞能夠再生而產生一群新的 細胞，但是它們與門脈系統與膽道洩流間的連結卻已被破壞，其特徵 有：（I）肝細胞的持續死亡；（II）肝臟正常架構崩潰；（III）膠 原纖維組織的產生增加，導致不規則的瘢痕；（IV）倖存肝細胞企圖 再生而形成不規則的結節（nodule）導致纖維化造成肝臟結構的改變。 纖維化是指纖維性組織生成過量，可在慢性發炎反應中發現到。 纖維化的產生有助於隔離包圍感染的區域，可說為保護作用；另外纖 維化能夠使組織癒合恢復具有嚴密的連續性；然而過度或不適當的刺 激所導致整個器官纖維化便被歸類於疾病，如肝臟、肺臟之纖維化會 造成功能上的缺損。纖維化的組織在肉眼下略微白色，因其富含膠原 成分，故組織亦較硬實，又稱為『硬化』。肝臟纖維主要由膠原纖維 (collagen)所組成，膠原是一種細胞質蛋白，其構成主要為氨基酸(約 30% glycine，20% proline + hydroxyproline)。纖維化的攣縮現象 是因為肝臟實質的流失被纖維化取代所致。在肝臟中負責產生大量纖 14.
(18) 維化的細胞為肝臟星狀細胞 (hepatic stellate cell, HSC). 37、38. 。. 發炎反應中期，HSCs 受到 Kupffer cells 所釋放出之細胞激素 (cytokine) 如 TGF−α（transforming growth factor−α）、TGF−β （transforming growth factor−β）、TNF−α（tumor necrosis factors−α）、PDGF（platelet-derived growth factor）、IL1 （interleukin-1）會使 HSCs 轉型為肌纖維母細胞 （myofibroblast），即進入發炎反應之後期。在發炎反應後期 HSCs 受刺激轉型為肌纖維母細胞時，會釋放出 TGF−β及其它之細胞激 素，肌纖維母細胞釋放出的TGF−β對於肝細胞有細胞凋亡(apoptosis) 作用，在組織修復過程之中則有促進纖維化的作用37-39。 當肝臟受損傷後在急性期的免疫反應中，當Toxin及cytokine刺 激，或細胞外基質斷裂時，都會使 HSCs 轉型為 myofibroblast-like cells，而產生膠原纖維，最後使得肝組織產生纖維化進而硬化。在 肝組織中會產生 cytokines 的細胞分別有來至膽管上皮細胞、靜脈 竇之內皮細胞（PDGF）、庫氏細胞（TNF-α , TGF-β）、肝細胞 （insulin-like growth factor , IGF-binding protein），他們所 釋放出之 cytokines 會影響 HSCs，另外 HSCs 亦會自行釋放 PDGF 做為自我調節（autocrine）37-39。 綜和以上言論，肝纖維化和下列因子相關： 15.
(19) I.細胞外基質 ECM 的代謝失衡 肝纖維化的發展最主要變化是肝臟 ECM 會有數量與特性的改 變，在單胺氧化酶作用下，膠原纖維共價形成不穩定的不溶性膠原， 參與細胞外基質形成 報外基質表現增加. 42,43. 44,45. ，肝纖維化造成間質膠原酶活性降低，而系. 。有證據顯示，引發肝纖維化細胞機轉很多，. 而肝臟星狀細胞活化(又稱 hepatic stellate cell、fat-storing、 prisinusodial、或 Ito cell)在慢性肝損傷中是最主要細胞之 matrix 51. components 的來源。研究指出 ，肝損傷結果將造成肝細胞壞死與細 胞凋亡的發生，進而造成細胞氧化壓力提升及內皮細胞(endothelial)活化，在此作用下造成星狀細胞活化，星狀細胞活化是發生 50. 肝纖維化的主要現象，活化結果將造成型態上改變 ，如星狀細胞本 身型態改變、肝細胞微絨毛消失及內皮細胞通透減少，進一步造成多 47. 重且緊密疤痕組織、透過在肝竇的收縮對血流行成阻力 。活化過程 並且在進一步的導致星狀細胞增生(proliferation)與變形 (transformation)而成為偽纖維母細胞(myofibroblast-like cells)，α- smooth muscle actin(α-SMA)形成，並產生廣泛 48. collagenous 與 non-collagenous ECM 的沉積 。 星狀細胞活化分為啟動期(initiation)與持續期(perpetuation) 若星狀持續暴露在刺激因子下(細胞組成之 fibronectin 之沉澱與 16.
(20) Kupffer cell 之釋放)的環境之下，其活化過程會朝向持續發生的階 49. 50. 段進行 。在肝損傷發生時，星狀細胞活化會有七種反應 ： i.增生(proliferation)：刺激因子如 PDGF，TGFα，IGF，thrombin。 ii.收縮(contractility)：刺激因子如 ET-1 iii.纖維化(fibrogenesis)：刺激因子如 TGFβ1，leptin iv.matrix 退化(metrix degradation)：刺激因子如 MMP-2，MTI-MMP v.驅化作用(chemotaxis):刺激因子如 PDGF， MCP-1 vi.維生素 A 丟失(retinoid loss): 刺激因子如 PDGF vii.發炎反應(inflammation)：刺激因子如 chemokines，CD8 T cell， NKT。 II.細胞激素(cytokine)的刺激 肝細胞纖維化發生和形成有關的細胞激素，主要有 transform ing growth factor-β1(TGFβ1)、tumor necrosis factor-α(TNF α)、interleukin-1(IL-1)以及 interferon(IFN)。其中以 TGFβ1 的主要生物學功能是調節細胞外基質形成，尤其是促進膠原物質形成 53,54. 。. III.自由基(free radical)與氧化性損傷(oxidative stress) 氧化性傷害肝疾病關係，是近年來一重要課題。如:(1)過量的 ROS 或 抑制細胞內抗氧化的系統會導致肝細胞損傷 17. 55,56. 。(2)粒線體電子傳遞.
(21) 鏈中的高能電子流失時，會導致超氧自由基(super oxide anion) 的 57. 產生，也會引發肝細胞凋亡 。 此外包含 oxygen-derived free radical 與脂質過氧化也是形成 58. 肝纖維化的主因之一 ，文獻指出，脂質過氧化的產生可調節 collagen gene 的表現，令人想到脂質過氧化肝組織傷害與肝纖維化 是有相當關係的。新進研究指出，經由氧化壓力導致的旁分泌作用 59. (paracrine)刺激會刺激星狀細胞的增生與膠原的形成 。 經由 Kupffer cell 產生之自由基，被認定是經由脂質過氧化的 61. 產生，與不可逆之細胞膜結構功能的變異而引起組織的傷害 。而發 炎細胞如 Kupffer cell 與 invading mononuclear cells 能釋放細胞 激素，TGFβ1 及 platelet-dericed growth factor(PDGF)，都跟肝 62. 傷害所造成的纖維化反應有相關 。而當肝細胞持續被傷害與增生， 遺傳學的變異頻率可能會上升，伴隨肝纖維化，導致星狀細胞的活化 63. 與肝硬化發展 。 活化的星狀細胞刺激 endothelin-1(ET-1)的分泌，加上肝內 endothelial nitric oxide synthase(eNOS)合成減少，除了使肝內 血管調控機制受損，引發肝纖維化病程外，也會導致門脈高壓的出現 64,66-68. 。各種原因引起的慢性肝炎都具有肝細胞發炎、壞死與肝纖維. 化特徵，肝纖維化是慢性肝炎發展為肝硬化的中間過程。因此阻止肝 18.
(22) 纖維化形成，對肝硬化的防治有著重要意義。. 19.
(23) 第三節 膽汁鬱積性肝損傷之實驗動物模型 如前言所述，大白鼠膽道結紮動物模式(BDL)，類似於人類次發 性膽道阻塞型肝硬化、肝外膽管狹窄、家族性膽汁鬱積症候群、原發 性硬化型膽管炎及新生兒原因不明性肝炎。而造成膽汁淤積性肝損傷 的原因可分為下列兩種： 1. 肝內性膽汁鬱積 (Intrahepatic cholestasis)： 肝細胞或是膽管細胞分泌膽汁的功能產生障礙，導致膽汁的生成 減少及流動停滯，使正常分泌到膽汁的物質堆積於肝內和血清 中，而流入十二指腸的膽汁減少或消失，主要引起的原因為藥物 作用和懷孕期間荷爾蒙的影響。19 2. 肝外性膽汁鬱積 (Extrahepatic cholestasis)： 膽汁排放的管道遭受阻斷，導致肝細胞或是膽管細胞所分泌膽汁 無法流入十二指腸，使膽汁的物質堆積於肝內和血清中，主要引 起的原因為先天性膽管閉鎖、結石、腫瘤及創傷等所引起肝外膽 管阻塞。19 此模型只造成極輕微的發炎細胞浸潤及肝細胞壞死，引起少許肝 功能生化指數上升，因此廣泛被應用於直接評估藥物，及在抗纖維化 2. 方面療效研究 。膽汁淤積性肝損傷的實驗動物模型建立上，通常使 用藥物、動情激素 (estrogen) 或是內毒素 (endotoxin) 誘發肝臟 20.
(24) 膽汁淤積，或是藉由總膽管結紮手術造成肝外膽管阻塞誘發肝臟膽汁 淤積，但是由於使用藥物等方式，在藥物代謝上的不同結果容易使得 膽汁淤積的層面上難有一致性，所以目前以藉由總膽管結紮手術造成 19. 肝外膽管阻塞誘發肝臟膽汁淤積的方式較廣為人使用 。 最初總膽管結紮的動物模型是由 Benjamin Brodie 於1823年在 貓的身上所建立的，立意在用於觀察缺乏膽汁的代謝情況下，貓的身 29. 體會產生何種影響 ，1932年 Cameron 和 Oakley 首次將總膽管結紮 30. 的大白鼠動物模型，應用在觀察肝臟組織的病理型態學研究上 。總 膽管結紮是將總膽管的兩端分別結紮後，中間予以截斷，造成肝外膽 31. 管阻塞，誘發肝臟膽汁淤積無法排出，造成肝臟纖維化的手術 。 在膽道結紮模式的初期，因為膽汁排出的受阻會造成膽汁的鬱 積(cholestasis)，而膽汁的聚積則會刺激氧化的壓力(oxidant stress)脂質過氧化(lipid peroxidation，LPO)，進一步引起肝細胞 71. 受損及肝纖維化的形成 。Parola等學者則進一步證實：脂質過氧化 的產物＂丙二醛＂(Malondialdehyde ，MDA)會刺激貯脂細胞而使得 肝膠原的合成增加。另外，鬱積的膽酸會刺激肝細胞的粒線體產生活 74. 性氧化質的自由基 ，刺激嗜中性球產生超氧化物，並刺激單核球生 76. 成免疫介質 。部分學者亦觀察到膽道結紮三天後，即會出現明顯的 71. 膽汁鬱積，七天後即會有脂質過氧化的顯著上升 。抗氧化的能力及 21.
(25) 77. glutathione(GSH)亦會下降 。因此，可以用脂質過氧化程度來評估 肝損傷及肝纖維化嚴重度。 手術後72小時內為急性肝損傷期 (acute liver damage). 32-33. ，. 此時可以看見門脈區有膽管上皮細胞有開始增生的情況出現，以及發 炎反應和發炎細胞的產生。手術後二週門脈區增生膽管週圍出現許多 肌纖維母細胞(myo- fibroblast)、纖維母細胞(fibroblast)形成架 橋連接 (cross- linking)。手術後四週後慢性肝損傷期 (chronic liver damage)，此時可以看見門脈區增生膽管週圍出現更多的纖維 細胞形成偽小葉 (pseudo-lobule)。手術後六週可形成肝硬化 (hepatocirrhosis)。. 22.
(26) (圖二) 肝損傷到肝纖維化路徑. 49. 23.
(27) 本態性高血壓老鼠 SHR-實驗動物簡介 11 1963 年於日本 Kyoto School of Medicine，Okamoto 經由選擇 具高血壓特性之 outbred Wistar stock 進行近親化交配，於 1966 年 至 NIH，於 1973 年至 Charles River，2000 年自 NIH 引進國家實驗 動物中心。 (SHR/NCrlNarl). 11. 成年雄鼠血壓 200mmHg，雌鼠為 175 mmHg，特徵為具高血壓，10 週齡以上公鼠的血壓可超過 200mmHg。血壓隨性別、年齡而有不同。 SHR 為試驗抗血壓藥劑之良好動物模式，可與 WKY/N 互為對照。此品 系最常見病理變化，是結節性周圍動脈炎，心肌梗塞及腎臟硬化，如 成鼠血壓超過 200mmHg，則大腦會呈現病變。 對照組為 Wistar Kyoto 大鼠(WKY)。相關之疾病模式如中風。部份 SHR 鼠會形成 SHRSP 品系鼠(stroke prone)，易形成中風.。併發症 為大腦病變（梗塞、出血），心肌病變（梗塞、纖維化）。在一般環 境下生長至 18 月齡，會發生併發症（對照組 WKY 為 24 月齡）。 與人類高血壓之相似處為具遺傳性，一般多基因遺傳(polygeneic) 發生率高於單基因遺傳。病程相似，隨年齡增加而增加（大鼠到第六 個月齡血壓達到一水平）。易發生心血管併發症如左心室肥大、腫脹 而導致中風，遺傳性心衰竭等症狀。 24.
(28) 如施以抗高血壓藥物，大鼠動脈管壁厚度會減低，使血管壁與孔徑比 例趨於正常，並減少腸繫膜心臟及腎病變的發生率及其嚴重性，但是 大鼠採石含鹽飼料且吸收超過 4%時，其血壓隨著鹽的吸收濃度比例 而增加應用。懷孕母鼠餵食高鹽分飼料時，出生後仔鼠再持續的餵食 高鹽分飼料，則會引起超高血壓(>230mmHg)。同時亦加速中風發生 率，並且在四月齡前，即有 36%死亡率。 WKY/NcrlNarl. 11. 1971 年由 Kyoto University School of Medicine 所引進之 Outbred Wistar stock，於 NIH 進行近親化培育，於 1974 年(F11) 至 Charles River。 2000 年自 Crl 引進國家實驗動物中心。 具正常血壓為 SHR 的控制組，WKY 證實具有心室間肥厚(biventricular cardiac hypertrophy,BVH)遺傳性狀，使用 WKY 作為 SHR 對 照實驗時，應排除帶有 BVH 之動物。供作為研究心臟容積導致肥大症 的動物模式。. 25.
(29) 第四節 6-hydroxydopamine(6-OHDA)與兒茶酚(catecholamine) 的關係 兒茶酚胺(catecholamine)合成路徑 兒茶酚胺(Catecholamine)合成路徑需要許多酵素參與， tyrosine hydroxylase 可以把 Tyrosine 轉變成 L-Dopa；Dopa Decarboxylase 可以把 L-Dopa 轉變成 dopamine；dopamine beta-hydroxylase(DBH)可以把 dopamine 轉變成 Norepinephrine； phenylethanolamine N-methyltrans -ferase(PNMT)可以把 Norepinephrine 轉變成 epinephrine。此過程便是兒茶酚胺合成系 統。. 6-hydroxydopamine(6-OHDA)介紹及用途 六-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)為兒茶酚胺神經元 的專一性神經毒素，長久以來被使用做為產生巴金森氏症及抑制血壓 8. (化學性交感神經阻斷劑)之動物模式 。6-OHDA 可以專一性阻斷 7. tyrosine hydroxylase 酵素 ，因此造成兒茶酚胺系統關閉以及阻斷 7. 血壓之目的。不同劑量之 6-OHDA 使用也將造成不同之抑制結果 。. 26.
(30) (圖三) 兒茶酚胺合成路徑. 16. ※6-OHDA 阻斷-tyrosine hydroxylase (http://james.pirruccello.us/index.php?title=Image:NESynth.jpg). 27.
(31) 第五節 膽道(膽管上皮細胞)增生調控 調控膽道增生有許多因子，下列將列出幾種調控膽道增生之路徑 18,21-23. 1.cAMP-realated pathway. 當總膽管結紮時，會造成體內cAMP活化，在啟動下游蛋白(PKA/ MEK/ERK)進而促使膽道增生。而許多神經傳導物質(Neurotransmitter)、神經內分泌因子(Neuroendocrine)以及其他因子皆能調控 膽道增生透過活化或抑制二級傳遞訊號cAMP。如secretin是和其受器 結合後，藉由增加cAMP/PKA來增加膽道增生；cholinergic nerves 可以和M3受器結合，藉由增加cAMP/PKA來增加膽道增生。 2+. 其他如Serotonin則可以活化5-HT 1A/1B受器造成增加IP3/Ca /PKC； 而相對抑制AC/cAMP/PKA/ERK1/2 pathway，而抑制膽道增生； Histamine則在BDL時會增加H3R、H4R，藉由抑制cAMP/PKA/ERK1/2 pathway，而抑制膽道增生；Gastrin則結合 CCK-B/gastrin receptor，藉由增加PKC達到抑制膽道增生；Dopaminergic nerves 可以和D2 receptor結合藉由增加PKC-γ和抑制cAMP/PKA，抑制膽道 3. 增生 。另外，增加膽道壓力(如BDL或膽道阻塞等疾病)也會增加膽道 增生；發炎反應如IL-6也會活化p44/p42 MAPK pathway而增加膽道增 生. 18,21-23. 。. 2.Phosphatidylinositol 3-Kinase(PI3K)/AKT pathway 28.
(32) PI3-K pathway在許多細胞類型中扮演調控生長和自殺的角色 24. 。可以調控細胞增生、細胞骨架的組織化、以及許多分泌過程的調 21. 控 。活化的PI3-K可以調控膽道增生和膽汁分泌，也可以調控膽管 20. 上皮細胞的ATP釋放 。磷酸化的Akt(PI3K的下游蛋白)在膽道阻塞 27. 25. 28. 或予以處理NGF 、IGF-I 時誘發的膽道增生時皆會大量表現。故 PI3K/AKT pathway在膽道阻塞時(BDL)亦可調控膽道增生. 28.33. 。. 已經有許多研究指出神經系統和調控膽管病理及生理學有許 多相關. 12,35,40,41. ，尚有其他途徑可以抑制膽道增生，如Protein kinase. c(PKC)、mitogen-activated preotein kinase(MAPK)等，皆可調控 膽道生理反應及增生，部分可以正向調控膽道增生；部分會造成逆 向調控。. 29.
(33) 第六節 多巴胺第二型受器(D2R)與膽道增生的關係 多巴胺(Dopamine)在體內的作用是透過5種多巴胺受器來調控生 理反應的:有D1、D2、D3、D4和D5。Dopamine receptor皆屬於Gi protein 的superfamiliy。而多巴胺受器又可分為兩個主要類型。一是 D1-like，另一則是D2-like dopamine receptor。D1-like receptor 包含D1和D5，其作用是活化adenylyl cyclase(AC)為cyclin-AMP(cAMP) 二級訊息傳遞者之前驅物。而D2-like receptor包含D2、D3和D4，其 2+. +. 作用是抑制adenylyl cyclase(AC)、Ca 通道且活化K 通道。而D2R與 Gi蛋白相互作用而造成抑制cAMP的產生. 22,69. 。. 多巴胺在腦部功能是為一神經傳導物質可以活化多巴胺受器，且 多巴胺是由下視丘(hypothalamus)分泌製造，所以也有神經荷爾蒙 (neurohormone)之功能，且在腦下垂體(pituitary)可造成許多功能 70. ,. 。而Dopamine已經被大量研究應用於探究臨床疾病如Parkinson s 72. disease. 73. 和schizophrenia 。 3. 而在膽管上皮細胞中只表現D2R，其餘受器皆不表現 。而在正常 情況下，D2R會表現在膽管上皮細胞，而且會在總膽管結紮後(BDL)大 量表現D2R。總膽管結紮後大量活化之D2R角色是為了達到抑制膽道增 3,22. 生的目的，避免膽到過度增生 。且許多文獻也提到在腦部Dopamine D2R在高血壓老鼠(SHR)中是比非高血壓老鼠(WKY)多的 30. 81,82. 。.
(34) 另外，在許多不同類型細胞中，D2 dopamine receptor也會經由 2+. 活化不同路徑如Ca ，ins(1,4,5)P3，和PKC蛋白. 17,52,60,65. 3. 。有文獻 指. 出使用D2R agonist(如quinelorane)會抑制膽道增生經由活化 2+. Ca -dependent PKC-γ的途徑；而且如果阻斷PKC-γ活性也會抑制D2R -. 活性。注射D2R agonist(如quinelorane)對於膽汁生成和重碳酸(HCO3 ) 濃度沒有很造成很大影響，但是；一同注射D2R agonist(如quine-. lorane)+secretin會造成抑制膽汁生成和重碳酸(HCO3 )濃度，也將抑 制膽道增生；而且此效果也會被D2R antagonist (如eticlopride)所 2+. 3,22. 終止 。D2R agonist(如quinelorane)會活化Ca -dependent PKC-γ 達到抑制膽道增生之目的；把PKC-γ活性抑制掉也會抑制D2 receptor 之活性. 3,22. 。. 有很多文獻已指出抑制由secretin刺激引起之bile flow也同樣 會抑制膽管上皮細胞活性. 75,77-80. 。此論點可以更加驗證D2 receptor在 3. 膽管結紮(BDL)後會增加，其目的是抑制膽道增生 。. 31.
(35) 第三章 材料與方法 第一節 材料 一. 實驗動物： 動物品系：SHR/NCrlNarl品系雄性大白鼠 WKY/NcrlNarl 品系雄性大白鼠 動物來源：國家實驗動物繁殖及研究中心 動物週齡：8週 動物體重：200~250 gm 飼養方式：中國醫藥大學動物中心，飼養溫度調控在22±3℃，相對濕 度維持在55 ±5%，半日照環境中(8AM-8PM)，飼料為實驗動物大鼠配 合飼料（福壽牌，福壽實業股份有限公司，台中縣），飲用水為RO 水，飲水不受限制任其飲用。 二. 化學藥品： 1. 動物實驗藥品 Chlorahydrate (Merck) Ancillina injection (中國化學製藥). 6-hydroxydopamine(6-OHDA 95%)(Sigma) 2. 血清生化值測量試劑 GOT、GPT、Total bilirubin、ALP、γ-GT、albumin (Roche 公 32.
(36) 司生化試劑) 3. 組織學染色 Hematoxylin - Eosin stain (H/E stain) Hematoxylin (Merck) Eosin (Merck) Xylene (Takaaki) Alcohol (Takaaki) Ethanol absolute (Panreac) Mounting medium (Merck) 4. 免疫組織化學染色 Immunohistochemistry (IHC) 0.1M PBS (10X; pH=7.4) DAB (Sigma) 30% H2O2 (Merck) Xylene (Takaaki) Alcohol (Takaaki) Ethanol absolute (Panreac) 0.1M Citrate acid buffer(pH 6.0) 5 % Skim milk (安佳脫脂奶粉) Mounting medium (Merck) 5. Masson-Trichome stain 33.
(37) Bouin＇s Fixative Saturated picric acid 1500.0 ml Formaldehyde 500.0 ml Glacial acetic acid 100.0 ml Biebrich Scarlet: Biebrich scarlet 2.7 gm Acid fuchsin 0.3 gm Distilled water 300.0 ml Glacial acetic acid 3.0 ml Weigert's Iron Hematoxylin Stock Solution A: Hematoxylin 5.0 gm 95% alcohol 500.0 ml Stock Solution B: 29% ferric chloride 20.0 ml Distilled water 475.0 ml Hydrochloric acid 5.0 ml Working Solution: Solution A 25.0 ml 34.
(38) Solution B 25.0 ml Phosphotungstic/Phosphomolybdic Acid Solution: Phosphotungstic acid 25.0 gm Phosphomolybdic acid 25.0 gm Distilled water 1000.0 ml Aniline Blue: Aniline blue 2.5 gm Distilled water 100.0 ml Glacial acetic acid 1.0 ml 1% Acetic Acid: Glacial acetic acid 10.0 ml Distilled water 1000.0 ml 6. RNA Extraction CHCl3 (Merck) Phenol (Merck) Isopropanol (Merck) Ethanol absolute (Panreac) 0.1 % DEPC (Sigma) Tri-solution Reagent（RNA Isolation Reagent）(GeneMark) 35.
(39) 7. Reverse Transcription PCR Nuclease free water (GeneMark) 6X DNA loading dye (GeneMark) 100 bp DNA Ladder (GeneMark) 5X TBE Buffer (GeneMark) Agarose (Life Technologies) Ethidium bromide；EtBr (Sigma) 8. Protein Extraction RIPA reagent 50ml 1X PBS. 49 ml. NP-40. 0.5 ml. Sodium deoxycholate (D-21). 0.25g. 10% SDS. 0.5ml. 試劑、抗體、引子： 1. 免疫組織化學染色 Primary antibody： 抗體. 來源. 稀釋倍數. D2R. Santa Cruz, sc-7523 MD Bio, MS-113. 1：50. SMA. 36. 1：200.
(40) Secondary antibody： 抗體. 來源. 稀釋倍數. Anti-goat biotin Anti-goat polymer HRP Anti-mouse biotin. VECTASTAIN, VECTOR N-histofine Invitrogen. 1：200 1：200 1：200. Avidin-Biotin Complex Kit, anti-goat (VECTASTAIN, VECTOR). 2. Reverse Transcription PCR Primer (Mission Biotech)： PRIMER GAPDH Sense GAPDH Antisense DBH Sense DBH Antisense D2R Sense. SEQUENCE 5＇- TAT 5＇- AGA 5＇- CAC 5＇- GGG 5＇- CAG. D2R Antisense. 5＇- ATG CAG CCT CAG ACA GGA AG -3＇. GAC TCC AAT TCG AAC. AAC ACA CCA GAG AGC. TCC ACG CGG ACT CAG. CTC GAT AAT AGC TGC. One-Step RT-PCR Kit (GeneMark). 器材 自動生化分析儀(Roche; COBAS MIRA Plus) 脫水滲蠟機(LIPSHOW) 包埋機 Tissue Block System TBS88 (Medite) 石蠟切片機(Shandon). 37. AAG ACA ATA TGT ATC. AT -3＇ TT -3＇ CAA GG -3＇ GTA -3＇ AG -3＇.
(41) 冷凍切片機(Shandon crytome cryostat series) 組織均質機(IKA LABORTECHNIK) 離心機 Microcentrifuge (Beckman) PCR SYSTEM 2400 SERIAL（GENEAMP®）(PERKIN ELMER) PH/mV/TEMP Meter (SUNTEX) Vortex Mixer Model VM-1000 (Digisystem Lab. Instruments INC) White/Ultraviolet Transilluminator (UVP) UVItec-UVIdoc 影像照相系統(GeneKu Biotech) 光學顯微鏡(Olympus BX50) 共軛焦螢光顯微鏡系統(Lecia TCS SP2) ELECTRONIC EYEPIECE 照相軟體(Young-Health Co.,Ltd.) 水浴槽 電泳槽. 38.
(42) 第二節 方法 本實驗以膽道結紮手術作為誘導大鼠慢性肝毒性的方法，除瞭解在其 慢性肝毒性中肝功能，另外分別就SHR及WKY品系老鼠之慢性期肝毒性 之纖維化程度作分析外，更利用免疫化學染色分析D2R之蛋白質表現 位置，以及使用 RT-PCR 來觀察核酸（mRNA）之表現量的差異。 一、實驗動物分組： 實驗前將各品系大鼠隨機分為3組 每組6隻 SHR組-Sham control group：對照組，施以剖腹手術，未做膽道結紮手術， 為期3週 BDL 3W group：施以膽道結紮手術，為期3週 BDL 3W group +6-OHDA : 施以藥物6-OHDA+膽道結紮手術，為期3週 WKY組-Sham control group：對照組，施以剖腹手術，未做膽道結紮手術， 為期3週 BDL 3W group：施以膽道結紮手術，為期3週 BDL 3W group +6-OHDA : 施以藥物6-OHDA+膽道結紮手術，為期3週. 二、膽道結紮手術： 39.
(43) 將大白鼠用乙醚迷昏後，以腹腔注射 (intra-peritoneal, I.P.) 的 方式打入 Chlorahydrat (36mg/ml, 每100g重的大白鼠打入1ml) 將 其麻醉，將大白鼠平置攤放固定於手術台上，剃除大白鼠的毛髮且予 以消毒，沿著腹部上中線將皮層與肌肉層剪開，打開其腹腔翻開其他 臟器，沿著肝臟的各肝葉向下找，於十二指腸上方可找到總膽管 (Common bile duct)，將總膽管上下兩端以手術用縫合線結紮綁緊， 總膽管中間以剪刀剪斷，將所有臟器歸位後，注入約2ml的生理食鹽 水，將肌肉層與皮層縫合，注射一劑抗生素 (Ancillina,約0.5ml) ， 於傷口處塗上碘酒，待大鼠回復活動力後在送回動物中心飼養，飼養 時間分別為期3週，以達到慢性肝損傷誘導肝纖維化之目的。 犧牲前先予以量體重，再將大白鼠用乙醚迷昏後，剖腹採下腔動脈 血，取下全部肝臟。予以秤重量其肝重。. 三、給予藥物. 8. 6-OHDA半衰期為一個禮拜，所以每個禮拜予以追加施打，為期三 週，每次劑量30mg/kg。第一次施打於膽道結紮手術後隔天予以施打。 再予第二禮拜跟第三個禮拜後分別追加施打，以維持血清中劑量。. 四、肝功能測定-血清生化值 40.
(44) 由下腔動脈採血所收集之血液於室溫靜置1小時使其凝固，再以 3000rpm，4℃離心10分鐘，來分離血清。取上清液以自動生化測定儀 測定GOT、GPT、Total bilirubin、ALP、γ-GT及Albumin level。. 五、組織脫水、包埋與切片 將肝臟組織浸泡於10％中性福馬林固定至少24小時後，再移至水 槽以流動的水沖洗約15分鐘。接著進行組織脫水，置入組織脫水機 Duplex process，依一定程序以漸增濃度之酒精70％ alcohol→80 ％ alcohol→80％ alcohol→95％ alcohol→95％ alcohol→100％ alcohol→100％ alcohol→二甲苯 (Xylene)→Xylene→軟蠟 (Paraffin)→Paraffin，此過程經1４小時後，再於蠟缸中取出組織 用Tissue block system進行包埋固定，最後進行組織切片，厚度5μ ｍ，置放玻片於室溫通風一天使其乾燥。. 六、組織染色 (Hematoxylin ＆ Eosin stain；H/E stain) 將各別含有肝臟組織切片的玻片置於 65℃烘箱30分鐘至溶蠟， 再用二甲苯 (Xylene) 浸泡5分鐘共3次使之脫蠟，接著浸泡於濃度漸 減之酒精 (100％ alcohol，5分鐘→100％ alcohol，5分鐘→95％ alcohol，5分鐘→95％ alcohol，3分鐘→75％ alcohol，3分鐘)水 41.
(45) 化後，以流動的水沖洗3分鐘，將玻片置於 Hematoxylin 染缸浸泡 30~90秒，使細胞核呈藍色，再以流動的水沖洗10分鐘，將玻片置於 Eosine 染缸浸泡30~60秒，使組織纖維與細胞質呈不等程度的粉紅 色。接著浸泡於濃度漸增之酒精 (75％ alcohol→95％ alcohol→95 ％ alcohol →100％ alcohol→100％ alcohol) 進行脫水，再經 Xylene 浸潤組織後，以封片膠封片放置於室溫下通風致乾燥，於光 學顯微鏡 (Olympus，BX50) 觀察並照相。. 七、免疫組織化學染色法 (Immunohistochemistry stain；IHC) 將含有肝臟組織切片的玻片置於 65℃烘箱30分鐘至溶蠟，再用 二甲苯浸泡5分鐘共3次使之脫蠟，接著浸泡於濃度漸減之酒精 (100 ％ alcohol，5分鐘→100％ alcohol，5分鐘→95％ alcohol，5分鐘 →95％ alcohol，3分鐘→75％ alcohol，3分鐘)水化後，以流動的 水沖洗3-5分鐘。將玻片放置於含 0.01M Citrate buffer (pH 6.0) 經 微波加熱 (750W) 5分鐘，再隔以流動的水隔水降溫10分鐘。接著將 玻片取出以 1X PBS 緩衝液浸泡震搖5分鐘，連續3次。再浸置於 3 ％H2O2 中反應10分鐘，以去除內生性過氧化氫酵素，再以 1X PBS 緩 衝液浸泡震搖5分鐘，連續3次。接著浸置於5％脫脂奶粉室溫下反應1 小時，作為阻斷劑以防止之後抗體的非特異性結合，降低偽陽性。以 42.
(46) 1X PBS 緩衝液沖洗潤濕，以洗去片子上殘存多餘的5％脫脂奶粉。隨 後於實驗組各別加入一級抗體 (Primary antibody)，而對照組則加 入 1X PBS 緩衝液作為 Negative control，皆於4 ℃下反應16小時 (overnight)，再以 1X PBS 緩衝液浸泡震搖5分鐘，連續3次。接著 加入含有 HRP polymer 之二級抗體 (Second antibody) ，於37℃下 反應30分鐘，再以1X PBS緩衝液浸泡震搖5分鐘，連續3次。再加入 DAB 呈色劑 (0.05g DAB + 100ml 1X PBS + 67μl H2O2) 反應3~5分鐘至 呈色，再以二次水浸泡震搖5分鐘，連續3次。接著浸泡於 Hematoxylin 中40-43秒作為背景染色，再以流動的水沖洗10分鐘。放置於烘箱中 使其乾燥，再浸泡於二甲苯，便可使用封片膠封片放置於室溫下通風 致乾燥後，於光學顯微鏡(Olympus，BX50) 觀察並照相。. 八、膠原纖維的特殊染色 (Masson-Trichome stain) 將切片脫臘，脫水處理，標本用 Bouin's 固定液固定﹐若用其 他固定液所固定者﹐在切片染色前﹐必須在用 Bouin's 重新固定一 晚﹐或在 56℃ 溫箱中泡浸一小時。涼後洗於流動自來水中﹐直到切 片表面上之黃色完全洗去為止。再用 DDW 沖洗一次，Weigert's iron hematoxylin 10分鐘，DDW 沖洗 10分鐘，染 Biebrich scarlet-acid fuchsin 6-15分鐘，DDW 沖洗 10分鐘，Phospomolydic /phosphor 43.
(47) tungstic acid 10-15分鐘，Aniline blue 5-10分鐘，1% acetic acid 3-5分鐘。利用95%酒精連續脫水二次，利用100%酒精連續脫水二次， 利用 Xylene 連續清洗3分鐘三次﹐然後封片。. 九、核糖核酸 (Ribonucleic acid；RNA)的萃取 將暫存放於-80℃的肝臟組織取出秤重分裝 (0.2g /管)，將其放 入2.0㏄滅菌平底離心管 (ependoff) 中，加入400μl Tri-solution reagent於4℃環境下以組織均質機進行均質，每10-15秒休息一次避 免過熱，再用 23G、26G 針頭反覆均質。接著加入600μl Tri-solu tion reagent進行震盪混勻後，於冰上靜置5分鐘。接著加入200μl 的 chloroform 進行震盪混勻，再放於冰上靜置5分鐘。接著於 4℃ 離心13000 rpm，45分鐘。離心後，抽取200μl上清液放於另一個1.5 ㏄滅菌離心管中，接著加入 200μl Isopropanol 和 200μl PS＆PG Removal solution 進行震盪混勻。接著於 4℃ 離心12000 rpm，1 小時。離心後，倒掉上清液，接著加入 400μl 70% Alcohol/DEPC 離 心 12000 rpm，5 分鐘。倒掉上清液，放置於室溫下約8分鐘使之自 然完全乾燥後。接著加入 30μl DEPC 水，放置於 4℃，至少1-2小 時以上，便可測量OD值。 十、觀測RNA的量與質 44.
(48) 抽取所得 Total RNA 1μl 加入 99μl DEPC 水混勻(稀釋100 倍)，根據測得的 A260 吸光值與 A260/A280 之比值(於1.8~2.0之間 最佳)，來進行RNA的定量。 公式： A260 吸光值 × 40 × 100(稀釋倍數) ＝ Total RNA (μg/ml) 將抽取所得的 Total RNA 取2 μg，利用電泳的方式 (1.0% agarose gel) ，根據 RNA 18S、28S 的表現情況來判定 RNA 質的好壞。. 十一、反轉錄聚合酶連鎖反應 (Reverse transcription- polymerase chain reaction；RT-PCR) 取0.2 ml之微量離心管，將含有1 μg之 RNA 萃取液及所要測之 primer 各0.5 μl與 one step RT-PCR 試劑充分混合，以聚合連鎖 反應之儀器進行反應， 將所得的 DNA 產物以電泳分析法來評估mRNA 含量的改變。配置1.0% agarose gel (0.5 g agarose + 50ml 0.5X TBE buffer + 2.5 μl EtBr)，用微波爐 (750W, 40sec) 加熱溶解後， 置於造膠台中靜置冷卻；將含有 7 μ1 RT-PCR 產物與 1 μ1 6X DNA loading dye 充分混合，加入膠的well中，以100V跑電泳25分鐘，以 數位UV照相裝置照相並存電腦檔，用密度分析軟體 Gel-Pro Analyzer V. 3.0 分析，以每組之 GAPDH 為基準值，比較各組之相 對變化。 45.
(49) One-Step RT-PCR試劑量 RNA (0.5μg/μl). 2μl. 5X Reaction Mix. 5μl. 5X Enhancer. 5μl. Enzyme. 0.5μl. Sense Primer(10 μM). 0.5μl. Anti-sense Primer(10μM). 0.5μl. Nuclease free water. to 25μl. RT-PCR反應條件 GAPDH、DBH 條件 cDNA synthesis. PCR cycle(35 cycles). Final extension Hold. 50℃. 30＇. 95℃. 2＇. 94℃. 1＇. 50℃. 1＇. 72℃. 1＇. 72℃. 4＇. 4℃. D2R條件 46. ∞.
(50) cDNA synthesis. PCR cycle(35 cycles). Final extension Hold. 50℃. 30＇. 95℃. 2＇. 94℃. 1＇. 45℃. 1＇. 72℃. 1＇. 72℃. 4＇. 4℃. ∞. 十二、肝臟組織冷凍切片的製作 將大白鼠犧牲之後，將其肝臟取下，取一小部分肝臟留作冷凍切 片之用，將此部分肝臟以鋁箔紙及 OCT 包埋液包埋，浸泡於已預先 用乾冰預冷的 -30℃ Isopenyenane 燒杯中靜置，使其凝固後，最後 以冷凍切片機，將肝臟組織切至厚度為 15μm 於 -80℃冰箱保存。. 十三、膽道增生計數 每組任選1-2隻老鼠Masson trichrome stain玻片，顯微鏡下隨 機選取5個明視野，再以手持計算器依膽道多寡予以計數，再把各明 視野計數之膽道數目結合之。再分別予以比較各組別膽道增生數量。. 47.
(51) 十四、統計分析方法 本研究實驗數據以平均值±標準差 (Mean±SD) 來表示。在比較各 組間差異時，採用變異數分析 (One-Way Analysis of Variance; One-Way ANOVA) 各組間的變異，當組間變異達統計上顯著差異，進 一步以LSD (Least Significant Difference) 進行事後檢定。. 48.
(52) (圖四)BDL(Common bile duct ligation)總膽管結紮手術示意圖. 49.
(53) (圖五)實驗設計法及分組 BDL. EXP design SHR. SHR(C). SHR(BDL). WKY. SHR(BDL+6). WKY(C). WKY(BDL). WKY(BDL+6). Result. LW/BW. Morphology. Serum biochemistry. Masson Trichrome. H/E. RT-PCR. IHC. SMA. D2R. SHR(C): SHR control(對照組) SHR(BDL): SHR BDL 3W (膽道結紮 3 週) SHR(BDL+6): SHR BDL3W+6‐OHDA (膽道結紮 3 週+6-OHDA 藥物) WKY(C): WKY control(對照組) WKY(BDL): WKY BDL 3W (膽道結紮3周) WKY(BDL+6): WKY BDL3W+6-OHDA(膽道結紮3週+6-OHDA藥物). 50.
(54) 第四章. 結果. 第一節 動物觀察及生存率 實驗動物外型觀察發現，SHR以及WKY實驗對照組毛色純白，觸感 平順，肝臟色澤紅潤，而總膽管結紮(BDL)組大致而言，毛色日益灰 黑，觸感粗糙，有明顯脫毛及黃疸現象出現，肝脾腫大 (hepatomegaly and splenomegaly) ，肝臟色澤偏黃，腹腔中有腹水的情況。而總膽 管結紮(BDL)+施予藥物組(6-OHDA)情形則比總膽管結紮(BDL)組較為 嚴重，毛色更粗更灰黑，脫毛情形更加嚴重，體重也更輕，進食情形 更加減少。黃疸現象更加嚴重，肝脾腫大 (hepatomegaly and splenomegaly) ，肝臟色澤偏黃，腹腔中有較多腹水的現象。而WKY 組別情況比起SHR則更加嚴重。 分別在總膽管結紮後的3週後犧牲，施予藥物組則每週施打一次 藥物並於3週後犧牲。發現大鼠的肝重與體重的比值，在總膽管結紮 後有日益升高的趨勢，在SHR組總膽管結紮3週為(5.6+0.5 %)，SHR 總膽管結紮3週+施予藥物6-OHDA組則為(6.9+0.4 %)的比值皆高於實 驗對照組為(3.9+0.1 %)約1.5-2倍，在統計學上達到顯著性差異 (p<0.05)。 而WKY組總膽管結紮3週為(6.2+0.5%)，WKY總膽管結紮3 週+施予藥物6-OHDA組則為(8.3+0.6 %)的比值皆高於實驗對照組為 (3.6+0.2 %)約2-2.5倍，顯示在WKY組別中肝重與體重的比值較SHR 51.
(55) 高，施予藥物6-OHDA後，肝重與體重的比值更為增高。 SHR實驗動物的生存率分別為：實驗對照組 100%，總膽管結紮3週 83.3%，總膽管結紮3週+施予藥物6-OHDA組 44.5%。 WKY實驗動物的生存率分別為：實驗對照組 100%，總膽管結紮3週 83.3%，總膽管結紮3週+施予藥物6-OHDA組 66.7%。. 52.
(56) 第二節 血清生化值檢測 在本研究中以血清中GOT、GPT的指數來檢測肝細胞受損的程 度。測血清中Albumin值來觀測肝功能製造白蛋白情形；而用血清中 的ALP、Bilirubin γ-GT的指數來檢測膽道阻塞造成的黃疸等疾病程 度指數。 (一) GOT： (大白鼠正常值為115-359 U/L) 高血壓老鼠SHR組在總膽管結紮3週為(681.8+69.3 U/L)，SHR總 膽管結紮3週+施予藥物6-OHDA組為(550.7+38.5 U/L)的比值皆高於 SHR實驗對照組為(119.3+31.6 U/L)，在統計學上達到非常顯著性差 異(分別為p<0.01及p<0.001)。 非高血壓老鼠WKY組在總膽管結紮3週為(487.4+47.2 U/L)，WKY 總膽管結紮3週+施予藥物6-OHDA組為(572.2+81.1 U/L)的比值皆高 於WKY實驗對照組為(101.3+8.9 U/L)，在統計學上均達到非常顯著性 差異(均為p<0.001)。 而非高血壓老鼠WKY組在總膽管結紮3週為(487.4+47.2 U/L)的 比值比起高血壓老鼠SHR總膽管結紮3週為(681.8+69.3 U/L)低 ，在 統計學上均達到顯著性差異(均為p<0.05)。. (二) GPT：(大白鼠正常值為8-42 U/L) 53.
(57) 高血壓老鼠SHR組在總膽管結紮3週為(187.8+71.3 U/L)，SHR 總膽管結紮3週+施予藥物6-OHDA組為(137.6+24.7 U/L)的比值皆高 於SHR實驗對照組為(56.6+9.5 U/L)，在統計學上達到非常顯著性差 異(分別為p<0.05及p<0.01)。 非高血壓老鼠WKY組在總膽管結紮3週為(101.0+15.3 U/L)，WKY 總膽管結紮3週+施予藥物6-OHDA組為(104.7+16.5 U/L)的比值皆高 於WKY實驗對照組為(45.3+5.7 U/L)，在統計學上均達到非常顯著性 差異(均為p<0.001) 而非高血壓老鼠WKY組在總膽管結紮3週為(101.0+15.3 U/L)的 比值比起高血壓老鼠SHR總膽管結紮3週組為(187.8+71.3 U/L)低 ， 在統計學上均達到顯著性差異(均為p<0.05)。. (三) Total Bilirubin： (大白鼠正常值為<1.5 mg/dl) 高血壓老鼠SHR組在總膽管結紮3週為(11.6+2.1 U/L)，SHR總膽 管結紮3週+施予藥物6-OHDA組為(10.5+1.4 U/L)的比值皆高於SHR實 驗對照組為(0.3+0.1 U/L)，在統計學上達到非常顯著性差異(分別為 p<0.01及p<0.001)。 非高血壓老鼠WKY組在總膽管結紮3週為(10.2+2.1 U/L)，WKY總 膽管結紮3週+施予藥物6-OHDA組為(10.4+2.4 U/L)的比值皆高於WKY 54.
(58) 實驗對照組為(0.2+0.1 U/L)，在統計學上均達到非常顯著性差異(均 為p<0.001). (四) ALP： (大白鼠正常值為 40-95 U/L) 高血壓老鼠SHR組在總膽管結紮3週為(470.3+45.5 U/L)，SHR總 膽管結紮3週+施予藥物6-OHDA組為(558.3+28.4 U/L)的比值皆高於 SHR實驗對照組為(153.0+32.5 U/L)，在統計學上達到非常顯著性差 異(分別為p<0.05及p<0.01)。 非高血壓老鼠WKY組在總膽管結紮3週為(598.7+102.8 U/L)，WKY 總膽管結紮3週+施予藥物6-OHDA組為(657.1+59.9 U/L)的比值皆高 於WKY實驗對照組為(97.7+9.5 U/L)，在統計學上均達到非常顯著性 差異(均為p<0.001) 。 而非高血壓老鼠WKY組在總膽管結紮3週為(598.7+102.8 U/L)的 比值比起高血壓老鼠SHR總膽管結紮3週組為(470.3+45.5 U/L)高 ， 在統計學上均達到顯著性差異(均為p<0.05)。. (五)γ-GT： (大白鼠正常值為 10-47 U/L) 高血壓老鼠SHR組在總膽管結紮3週為(142.5+19.3 U/L)，SHR總 膽管結紮3週+施予藥物6-OHDA組為(147.5+17.2 U/L)的比值皆高於 55.
(59) SHR實驗對照組為(11.3+0.6 U/L)，在統計學上達到非常顯著性差異 (均為p<0.01)。 非高血壓老鼠WKY組在總膽管結紮3週為(219.4+42.9 U/L)，WKY 總膽管結紮3週+施予藥物6-OHDA組為(232.9+21.5 U/L)的比值皆高 於WKY實驗對照組為(13.1+1.7 U/L)，在統計學上均達到非常顯著性 差異(分別為p<0.01及p<0.001) 而非高血壓老鼠WKY組在總膽管結紮3週為(219.4+42.9 U/L)的 比值比起高血壓老鼠SHR總膽管結紮3週組為(142.5+19.3 U/L)高，在 統計學上均達到顯著性差異(均為p<0.01)。. (六) ALBUMIN： (大白鼠正常值為 4.0-5.0 g/dl) 高血壓老鼠SHR組在總膽管結紮3週為(2.4+0.1 U/L)，SHR總膽管 結紮3週+施予藥物6-OHDA組為(2.2+0.2 U/L)的比值皆高於SHR實驗 對照組為(3.8+0.2 U/L)，在統計學上達到非常顯著性差異(均為 p<0.001)。 非高血壓老鼠WKY組在總膽管結紮3週為(2.3+0.4 U/L)，WKY總膽 管結紮3週+施予藥物6-OHDA組為(2.2+0.1 U/L)的比值皆高於WKY實 驗對照組為(4.1+0.1 U/L)，在統計學上均達到非常顯著性差異(均為 p<0.001) 56.
(60) 在本研究中根據以上血清中GOT、GPT、ALP、Bilirubin、γ-GT 的數值，不難發現在總膽管結紮組以及總膽管結紮3週+施予藥物 6-OHDA組所造成的肝損傷當中，GOT、GPT、ALP、Bilirubin、γ-GT 的指數皆會高於實驗對照組的正常老鼠，數值顯示非高血壓老鼠WKY 肝損傷程度是大於高血壓老鼠SHR。而ALBUMIN值總膽管結紮以及總膽 管結紮3週+施予藥物6-OHDA組均低於正常值而且分別都具有統計上 的意義。. 57.
(61) 第三節. 肝臟組織病理觀察. 一、Hematoxylin - Eosin (H/E)stain (圖七) 肝臟組織切片以 Hematoxylin-Eosin 染色後，結果顯示高血壓 老鼠SHR及非高血壓老鼠WKY組之正常實驗對照組的肝細胞結構完 整，肝臟組織的細胞板和竇狀隙由中央靜脈呈向心分布，肝細胞的細 胞核完整，門脈區沒有發現發炎細胞浸潤，門脈區沒有膽汁淤積或膽 管增生的情形。 相對於肝臟病變的總膽管結紮組，外觀上呈現染色不均，低倍鏡 觀察下，肝細胞有水腫發炎，故此排列方向失序。傳統肝細胞和竇狀 隙放射性排列凌亂。門脈區附近的肝細胞會因膽鹽積聚的毒害關係， 肝細胞凋亡且周圍有大量發炎細胞沉積產生組織發炎現象。門脈區附 近出現許多纖維細胞，是為肝纖維化的病理特徵，且隨著總膽管結紮 的時間增長，纖維化的情況越益嚴重。 在高血壓老鼠SHR組總膽管結紮3週時門脈區可見膽管增生及發 炎細胞浸潤，在膽管增生的門脈區出現許多纖維細胞。在SHR總膽管 結紮3週+施予藥物6-OHDA組時門脈區可見膽管增生及發炎細胞浸 潤，在膽管增生的門脈區彼此橋狀連接。隨著總膽管結紮的時間增 長，膽管增生、發炎細胞浸潤、肝細胞腫脹性壞死和肝纖維化的情況 越益嚴重。 58.
(62) 在非高血壓老鼠WKY組總膽管結紮3週時門脈區可見膽管增生及 發炎細胞浸潤，在膽管增生的門脈區出現許多纖維細胞，膽管增生及 發炎跟纖維化情形皆較高血壓老鼠SHR組多量及嚴重。在非高血壓老 鼠WKY總膽管結紮3週+施予藥物6-OHDA組時門脈區可見膽管增生及發 炎細胞浸潤，在膽管增生的門脈區彼此明顯橋狀連接，也出現明顯偽 小葉。隨著總膽管結紮的時間增長，膽管增生、發炎細胞浸潤、肝細 胞腫脹性壞死和肝纖維化的情況更較SHR組別嚴重。 二、膠原纖維的特殊染色 Masson-Trichome stain (圖八) 高血壓老鼠SHR及非高血壓老鼠WKY組正常實驗對照組的肝組織 具有完整細胞板，中央靜脈區及門脈區皆無膠原纖維增生，在高血壓 老鼠SHR組總膽管結紮3週時可見到因膠原纖維增生而呈藍色的結節 性纖維化分布在門脈區增生膽管的附近中，並形成纖維-架橋連接， 尤其SHR總膽管結紮3週+施予藥物6-OHDA組時進而橋連接更加嚴重。 非高血壓老鼠WKY組總膽管結紮3週時，可以看見纖維化程度較高 血壓老鼠SHR組嚴重，有明顯橋連接，以及快形成偽小葉(Pseudolobules)的形態學發生，而非高血壓老鼠WKY總膽管結紮3週+施予藥 物6-OHDA組時纖維化及橋連接情形更加嚴重，進而更有許多偽小葉形 成，亦即所謂肝纖維化 (Liver fibrosis)程度發生。 在Masson-Trichome stain中可以發現，總膽管結紮3週膽管增生 59.
(63) 及纖維化情形在非高血壓老鼠WKY組是比高血壓老鼠SHR組嚴重，而在 總膽管結紮3週+施予藥物6-OHDA組後，膽管增生及纖維化情形是更加 嚴重的。 三、免疫組織化學染色 α-Smooth muscle actin (α-SMA) (圖九) 高血壓老鼠SHR及非高血壓老鼠WKY組在正常實驗對照組的肝組 織，α-SMA的訊息幾乎只存在於血管壁的平滑肌細胞 (Smooth muscle cells) 中。在總膽管結紮3週時 α-SMA 存在於門脈區增生 膽管周圍的肌上皮細胞 (myoepithelium) 、纖維母細胞(fibroblast) 和血管壁的平滑肌細胞，並且形成架橋連接。在高血壓老鼠SHR總膽 管結紮3週+施予藥物6-OHDA組時α-SMA表現於門脈區增生膽管周圍 的肌上皮細胞和門脈區出現的許多纖維細胞，並且形成明顯架橋連 接，以及α-SMA 出現在血管壁的平滑肌細胞。 非高血壓老鼠WKY組總膽管結紮3週時，α-SMA 出現在血管壁的 平滑肌細胞、門脈區增生膽管周圍的肌上皮細胞和門脈區出現的許多 纖維細胞並且形成明顯架橋連接。而在WKY總膽管結紮3週+施予藥物 6-OHDA組時α-SMA表現於門脈區增生膽管周圍的肌上皮細胞和門脈 區出現的許多纖維細胞，並且形成明顯架橋連接及明顯偽小葉，以及 α-SMA 出現在許多血管壁的平滑肌細胞。 α-Smooth muscle actin 為肝纖維化的重要指標，隨著總膽管 60.
(64) 結紮的時間增長，α-SMA 表現量越多，肝纖維化的情況越嚴重。在 α-Smooth muscle actin IHC stain中可以發現，總膽管結紮3週膽 管增生及纖維化情形在非高血壓老鼠WKY組是比高血壓老鼠SHR組嚴 重，而在總膽管結紮3週+施予藥物6-OHDA組後，膽管增生及纖維化情 形是更加嚴重的。. 61.
(65) 第四節 Dopamine beta-hydroxylase(DBH)及Dopamine type two receptor(D2R)mRNA之RT-PCR 表現分析 Dopamine type two receptor(D2R)及Dopamine beta-hydroxy lase(DBH) 的 mRNA 經 RT-PCR 放大的產物在洋菜膠中以電泳方式 (Agarose Gel Electrophoresis) 作表現，再以影像分析軟體 (AlphaImager 2200) 分別讀取各組的 D2R、DBH 及 GAPDH 表現量， 並以 GAPDH 校正其相對吸光值的結果去做分析，分析結果如下： 一、Dopamine type two receptor(D2R) (圖十二) 依據 D2R 洋菜膠電泳圖上的表現來比較，高血壓老鼠 SHR 在正 常實驗對照組和 SHR 總膽管結紮 3 週組及 SHR 總膽管結紮+施予藥物 6-OHDA 組中 D2R mRNA 均有表現，以影像分析軟體來分析 D2R /GAPDH 的比值，發現總膽管結紮實驗組中 D2R mRNA 的表現量有明顯的上 升。總膽管結紮 3 週為(52.19±7.1)高於實驗對照組為(102.9±9.8)， 在統計學上達到顯著性差異(p<0.05)。總膽管結紮 3 週+施予藥物 6-OHDA 為(158.1±6.6)高於實驗對照組，在統計學上達到非常顯著性 差異(p<0.001)。 非高血壓老鼠 WKY 在正常實驗對照組和 WKY 總膽管結紮組及 WKY 總膽管結紮 3 週+施予藥物 6-OHDA 組中 D2R mRNA 均有表現，以影像 分析軟體來分析 D2R /GAPDH 的比值，發現總膽管結紮實驗組中 D2R 62.
(66) mRNA 的表現量有明顯的上升。總膽管結紮 3 週為(57.3±3.8)高於實 驗對照組為(35.8±3.1)，在統計學上達到顯著性差異(p<0.05)。總膽 管結紮 3 週+施予藥物 6-OHDA 組為(106.3±5.3)高於實驗對照組，在 統計學上達到顯著性差異(p<0.05)。. 二、Dopamine beta-hydroxylase(DBH)(圖十四) 依據 DBH洋菜膠電泳圖上的表現來比較，高血壓老鼠SHR在正常 實驗對照組和SHR總膽管結紮3週組及SHR總膽管結紮3週+施予藥物 6-OHDA組中 DBH mRNA 均有表現，以影像分析軟體來分析DBH / GAPDH 的比值，發現總膽管結紮實驗組中DBH mRNA的表現量有明顯的上升。 總膽管結紮3週為(158.1±12.5)高於實驗對照組為(104.4±7.2)，在統 計學上達到顯著性差異(p<0.05)。總膽管結紮3週+施予藥物6-OHDA 為(395.6±12.2)高於實驗對照組，在統計學上達到非常顯著性差異 (p<0.01)。 非高血壓老鼠WKY在正常實驗對照組和WKY總膽管結紮3週組及 WKY總膽管結紮3週+施予藥物6-OHDA組中DBH mRNA 均有表現，以影像 分析軟體來分析DBH /GAPDH的比值，發現總膽管結紮實驗組中DBH mRNA 的表現量有明顯的上升。總膽管結紮3週為(90.4±6.1)高於實驗 對照組為(41.2±6.2)，在統計學上達到顯著性差異(p<0.05)。總膽管 63.
(67) 結紮3週+施予藥物6-OHDA組為(133.9±9.3)高於實驗對照組，在統計 學上達到顯著性差異(p<0.05)。. 64.
(68) 第五節 免疫組織化學染色分析Dopamine type two receptor(D2R)之表現 免疫組織化學染色法 (Immunohistochemistry stain；IHC) 免疫組織化學染色法觀察 D2R所出現的位置，在負對照組 (Negative control) 均以 1X PBS 取代一級抗體處理之肝組織，其組織 不具任何呈色。 1. Dopamine type two receptor(D2R) (圖十六) 高血壓老鼠SHR及非高血壓老鼠WKY組 (A) Sham control group中，D2R 出現在中央靜脈附近的肝細胞。 (B) 總膽管結紮3週(BDL 3W)中， D2R出現在門脈膽管增生區的纖維 母細胞(fibroblast), 以及部分肝細胞。 (C) 總膽管結紮3週+施予藥物6-OHDA (BDL 3W+6-OHDA)中，D2R出現 在膽管上皮細胞，纖維母細胞、門脈區附近部分肝細胞。. 65.
(69) 第五章 討論 膽道增生是透過活化AC/cAMP/PKA/ERK1/2 pathway因而增加膽 道增生。而從文獻已知Dopamine會結合D2R(dopamine tye two receptor)藉由增加PKC-γ、抑制PKA protein而達到抑制膽道增生和 3. 抑制secretin刺激引起之膽汁淤積 。而今在型態學觀察下發現本態性 高血壓SHR纖維化及膽道增生程度少於正常血壓對照組WKY，推測是因 為本態性高血壓SHR dopamine含量較多之因故。許多文獻也提到在腦 部的Dopamine D2R在高血壓老鼠(SHR)中是比非高血壓老鼠(WKY)多的 81,82. ，故本實驗推測在肝中，高血壓老鼠(SHR)的D2R含量是多於非高. 血壓老鼠 (WKY) 的。為了證明dopamine與其受器D2R在膽道增生裡之 調控關係，本實驗使用化學性阻斷交感神經抑制劑6-OHDA來達到抑制 8. 血壓以及dopamine之目的 ，觀察D2R及膽道增生在本態性高血壓老鼠 SHR及正常血壓對照組WKY之調控關係。 本實驗結果發現，在膽道結紮後所引起的肝臟變化在外觀型態及 血清生化值方面 (GOT、GPT、Total bilirubin、ALP、γ-GT 上升及 Albumin 下降) 與正常肝臟實驗組相較，均有明顯的變化，可以證明 大鼠在膽道結紮後，大鼠的肝臟會因膽汁的淤積，而引起急慢性肝損 傷，且藉由血清生化值(Total bilirubin、ALP、γ-GT 上升)可觀察 發現非高血壓老鼠 WKY 肝損傷及纖維化程度大於高血壓老鼠 SHR。 66.
(70) 型態學方面，在 6-OHDA 使用後，抑制 dopamine 後，發現在高血 壓老鼠 SHR 及非高血壓老鼠 WKY 老鼠裡均發現膽道增生活化之現象。 為了進一步證實膽道增生現象，本實驗使用特殊染色 Masson trichrome stain 以及免疫組織化學染色(IHC)染α-SMA(alphasmooth muscle actin)進一步證實纖維化以及膽道增生程度是非高血 壓老鼠 WKY 總膽管結紮 3 週+施予藥物 6-OHDA 組膽道增生及纖維化程 度大於 WKY 組總膽管結紮 3 週，WKY 組總膽管結紮 3 週再大於 WKY 對 照組；另高血壓老鼠 SHR 亦同；SHR 總膽管結紮 3 週+施予藥物 6-OHDA 組膽道增生及纖維化程度大於 SHR 組總膽管結紮 3 週，SHR 組總膽管 結紮 3 週再大於 SHR 對照組。綜合以上結論，在膽管增生以及纖維化 程度上非高血壓老鼠 WKY 總膽管結紮 3 週+施予藥物 6-OHDA 組＞WKY 總膽管結紮 3 週組＞高血壓老鼠 SHR 總膽管結紮 3 週+施予藥物 6-OHDA 組＞SHR 總膽管結紮 3 週組。本實驗中透過 α-SMA (liver fibrosis maker) 和膠原纖維的特殊染色 (Masson-Trichome stain) 可以證實膽道結紮組與正常正常肝臟實驗組相較，膽道結紮時間越 長，纖維化情況越嚴重。 在免疫組織化學染色(IHC)發現 D2R 會表現在門靜脈附近肝細胞 (hepatocyte)、纖維母細胞(fibroblast)以及膽管上皮細胞(cholan giocyte)。有文獻. 3,22. ，指出 D2R 增加目的是抑制膽道過度增生，所 67.
(71) 以推論本實驗中 D2R 在膽管結紮誘導之肝損傷的修復過程中可能和 纖維化或抗纖維化以及調控膽管增生之膽管反應有相關聯。 在 RT-PCR D2R(Dopamine type two receptor) mRNA level 表現 中，D2R 在總膽管結紮 3 週後比起對照組有增加趨勢，且在總膽管結 紮 3 週+施予藥物 6-OHDA 後比起對照組有更增加之情形。而其中又以 高血壓老鼠 SHR D2R mRNA 表現量高於非高血壓老鼠 WKY。由上可知 高血壓老鼠 SHR D2R 表現量大於非高血壓老鼠 WKY，在總膽管結紮 3 週後，D2R mRNA 表現量增加，又高血壓老鼠 SHR D2R 表現量大於非 高血壓老鼠 WKY；而在總膽管結紮 3 週+施予藥物 6-OHDA 後，達到抑 制 dopamine 後，D2R 更代償性增加，且高血壓老鼠 SHR D2R 表現量 大於非高血壓老鼠 WKY。有文獻. 3,22. 指出 D2R 在膽管結紮後會代償性. 增加。由上推論在 6-OHDA 使用後 D2R 為代償性增加，其目的是以彌 補代償 Dopamine 量減少之結果。 而 RT-PCR DBH(Dopamine beta-hydroxylase) mRNA level 表現 中，DBH 在總膽管結紮 3 週後比起對照組有增加趨勢，且在總膽管結 紮 3 週+施予藥物 6-OHDA 後比起對照組及總膽管結紮 3 週組均有增加 之情形；此可代表 6-OHDA 達到成功化學性阻斷 dopamine 之目的。 同樣高血壓老鼠 SHR DBH 表現量大於非高血壓老鼠 WKY。在施予藥物 6-OHDA 後 DBH mRNA level 表現增加，推測是因為血壓(Norepineph 68.
(72) rine)降低造成體內負調控機制所導致。 另有文獻. 3,22. 指出使用 D2R agonist(如 quinelorane)會抑制膽道. 2+. 增生經由活化 ca -dependent PKC-γ的途徑；而且如果阻斷 PKC-γ 活性也會抑制 D2R 活性。注射 D2R agonist(如 quinelorane)對於膽 -. 汁生成和重碳酸(HCO3 )濃度沒有很造成很大影響，但是；一同注射 D2R agonist(如 quinelorane)+secretin 會造成抑制膽汁生成和重碳 -. 酸(HCO3 )濃度，也將抑制膽道增生；而且此效果也會被 D2R antagonist (如 eticlopride)所終止. 3,22. ，D2R agonist(如 quinelo rane). 2+. 會活化 Ca -dependent PKC-γ達到抑制膽道增生之目的；把 PKC-γ 活性抑制掉也會抑制 D2 receptor 之活性. 3,22. 。所以本實驗將來可以. 使用 D2R agonist 或 antagonist，觀察是否影響膽道增生或抑制以 及更進一步討論 D2R 在調控膽道增生裡扮演之角色。 本實驗設立一完整動物實驗模式探討高血壓老鼠 SHR 及非高血 壓老鼠 WKY 之 D2R(Dopamine type two receptor)調控膽道之增生角 色。也是第一篇發現在膽管結紮造成慢性肝損傷動物模式裡，高血壓 老鼠 SHR 纖維化程度及膽道增生程度是少於非高血壓老鼠 WKY 的。本 實驗發現 D2R 在本態性高血壓老鼠 SHR 及非高血壓老鼠 WKY 膽管結紮 3 週後調控膽道增生確實扮演一種要角色，特別是在本態性高血壓老 鼠 SHR 中。 69.
(73) 將來可進一步用 western 驗證 D2R 的蛋白表現，更進一步確定 D2R 在高血壓老鼠 SHR 及非高血壓老鼠 WKY 老鼠中的表現。也可以觀 察膽道增生上下游之蛋白表現(PKA、ERK 等蛋白)，進一步證實膽道 增生在 SHR 及 WKY 老鼠間之調控關係。未來也可以利用 HPLC 直接測 定 Dopamine 含量及測量老鼠血壓犧牲前後之表現以確定 6-OHDA 之功 效，方便更進一步探討 D2R 和 Dopamine 在抑制膽管增生裡之調控角 色。許多文獻提出有很多可以調控膽到增生之因子，如 cAMPrealated pathway. 18,21-23. 、PI3K/AKT pathway25，28，33、尚有其他途徑. 如 Protein kinase c(PKC)、mitogen-activated preotein kinase(MAPK)等皆可調控膽道生理反應及增生，部分可以正向調控膽 道增生；部分會造成逆向調控。而許多神經傳導物質或是神經內分泌 也都可以調控膽道生理功能，而本實驗是著重於探討 dopamine 引起 之膽道抑制作用，如未來要進一步實驗，亦可以把其它會調控膽道之 因素一併考量之。 本實驗推論，D2R 會結合 dopamine 達到抑制膽道增生效果，如果 抑制 dopamine，D2R 會代償性增加，但是，還是沒有 dopamine 可以 結合，所以將無法抑制膽道增生，最後造成膽道增生量增加。而 D2R 在高血壓老鼠 SHR 中又比非高血壓老鼠 WKY 多，所以造成膽道增生量 比非高血壓老鼠 WKY 少 70.
(74) 【圖表】 (表一) 膽道結紮後各組肝臟重與體重的比值 Exp Group. Body weight(BW) SHR(C) 258.7+ 9.3 SHR(BDL) 209.6+28.6 SHR(BDL+6) 176.3+26.1 WKY(C) 287.3+8.6 WKY (BDL) 199.7+23.8 WKY (BDL+6) 175.2+13.5 P<0.05*, P<0.01**, P<0.001*** BDL group v.s. Sham control group. Liver weight(LW) 10.2+0.6 11.8+1.6 12.1+1.2 10.3+0.9 12.4+1.9 14.5+0.6. LW/BW(%) 3.9+0.1 5.6+0.5*** 6.9+0.4*** 3.6+0.2 6.2+0.5*** 8.3+0.6***. . SHR(C): SHR control (對照組) SHR(BDL): SHR BDL 3W (膽道結紮 3 周) SHR(BDL+6): SHR BDL3W+6-OHDA (膽道結紮 3 周+6-OHDA 藥物) WKY(C): WKY control(對照組) WKY(BDL): WKY BDL 3W (膽道結紮3周) WKY(BDL+6): WKY BDL3W+6-OHDA(膽道結紮3周+6-OHDA藥物) 71.
(75) (表二)血清生化值(Serum Biochemistry data). *表 P 值＜0.05. **表 P 值＜0.01. ***表 P 值＜0.001 (V.S SHR(C)). #表. P 值＜0.05. ##表. P 值＜0.01. $表. P 值＜0.05. $$表. P 值＜0.01 (V.S WKY(BDL)). ###表. P 值＜0.001 (V.S WKY(C)). . SHR(C): SHR control (對照組) SHR(BDL): SHR BDL 3W (膽道結紮 3 周) SHR(BDL+6): SHR BDL3W+6-OHDA (膽道結紮 3 周+6-OHDA 藥物) WKY(C): WKY control(對照組) WKY(BDL): WKY BDL 3W (膽道結紮3周) WKY(BDL+6): WKY BDL3W+6-OHDA(膽道結紮3周+6-OHDA藥物). 72.
(76) (圖六) 膽道結紮後各組肝臟組織病理變化( H/E stain) A.. D.. B.. E.. C.. F.. (100X). . A. SHR(C): SHR control (對照組) B. SHR(BDL): SHR BDL 3W (膽道結紮 3 週) C. SHR(BDL+6): SHR BDL3W+6-OHDA (膽道結紮 3 週+6-OHDA 藥物) D. WKY(C): WKY control (對照組) E. WKY(BDL): WKY BDL 3W (膽道結紮3週) F. WKY(BDL+6): WKY BDL3W+6-OHDA(膽道結紮3周+6-OHDA藥物) 73.
(77) (圖七) 膽道結紮後各組肝臟組織膠原蛋白的表現 (Masson trichrome stain) (100X). A.. D.. B.. E.. C.. F.. . A. SHR(C): SHR control (對照組) B. SHR(BDL): SHR BDL 3W (膽道結紮 3 週) C. SHR(BDL+6): SHR BDL3W+6-OHDA (膽道結紮 3 週+6-OHDA 藥物) D. WKY(C): WKY control (對照組) E. WKY(BDL): WKY BDL 3W (膽道結紮3週) F. WKY(BDL+6): WKY BDL3W+6-OHDA(膽道結紮3周+6-OHDA藥物) 74.
(78) (圖八) 膽道結紮後各組肝臟組織纖維化的表現(α-SMA IHC stain) (100X) A.. D.. B.. E.. C.. F.. . A. SHR(C): SHR control (對照組) B. SHR(BDL): SHR BDL 3W (膽道結紮 3 週) C. SHR(BDL+6): SHR BDL3W+6-OHDA (膽道結紮 3 週+6-OHDA 藥物) D. WKY(C): WKY control (對照組) E. WKY(BDL): WKY BDL 3W (膽道結紮3週) F. WKY(BDL+6): WKY BDL3W+6-OHDA(膽道結紮3周+6-OHDA藥物) 75.
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