行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
鹽品中殘存環境荷爾蒙之生物感測系統
研究成果報告(精簡版)
計 畫 類 別 ： 個別型 計 畫 編 號 ： NSC 95-2313-B-002-109- 執 行 期 間 ： 95 年 08 月 01 日至 96 年 07 月 31 日 執 行 單 位 ： 國立臺灣大學生物產業機電工程學系暨研究所 計 畫 主 持 人 ： 陳力騏 計畫參與人員： 博士班研究生-兼任助理：陳柏中 報 告 附 件 ： 出席國際會議研究心得報告及發表論文 處 理 方 式 ： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 96 年 10 月 24 日
行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告
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鹽品中殘存環境荷爾蒙之生物感測系統
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計畫類別：■個別型計畫 □整合型計畫
計畫編號：
執行期間：95 年 08 月 01 日至 96 年 07 月 31 日
計畫主持人： 陳力騏
共同主持人： 鄭宗記
本成果報告包括以下應繳交之附件：
5赴國外出差或研習心得報告一份
□赴大陸地區出差或研習心得報告一份
□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份
□國際合作研究計畫國外研究報告書一份
執行單位：台大生物機電系
中 華 民 國
96 年 10 月 15 日
行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
國科會專題研究計畫成果報告撰寫格式說明
Preparation of NSC Project Reports
計畫編號：
執行期限：95 年 8 月 1 日至 96 年 7 月 31 日
主持人：陳力騏 國立臺灣大學生物產業機電工程學系暨研究所
共同主持人：鄭宗記 台大生物機電系
計畫參與人員：陳柏中 台大生物機電系
一、中文摘要 本研究計畫利用基質循環增伏法以黃 血鹽作為檢測及訊號增幅媒介，開發利用固 定化酪胺酸酶(EC 1.14.18.1)催化酚類氧化 的酵素反應器，並裝設於電化學流動分析系 統中，成功訊號增幅檢測酚類及環境荷爾蒙 雙酚A。本系統對於酚、鄰苯二酚、雙酚 A 標準品之檢量範圍分別為 10-4 M-10-8 M (R2=0.9998)、10-4 M-10-7 M (R2=1.0000)、 2.5×10-5 M-2.5×10-7 M (R2=0.9997)。(n = 3)。 關鍵詞：環境赫爾蒙、檢測媒介、定電位法、 流動注射分析系統(FIA) AbstractA sensitive analytical system for phenols is proposed, which is based on the oxidation reaction catalyzed by tyrosinase (EC 1.14.18.1). The enzyme was immobilized as a packed-bed reactor installed in the flow stream of an amperometric FIA system. For signal amplication, the oxidized phenols (the quinones) were recycled by reacting with suitable electrochemical mediators supplied from the side stream of the flow system. By carefully controlling the stopped-flow sequence and the reaction conditions, the
signal can be amplified hundreds-fold by substrate recycling process. The resulting high sensitive phenolic biosensor may be very suitable as a screening tool for possible
contamination of endocrine disruptor..
Keywords: amplification; biosensor; endocrine disruptor; mediator; substrate recycling. 二、緣由與目的 由於化工塑膠聚合反應反應物難以完 全反應，以至於有殘留反應物於產品的固體 塑膠及副產品的「化工再生鹽」之可能。美 國 FDA 針對此類化工產品規定殘餘量限 制，而未經純化的氯化鈉，則直接當工業廢 棄物處理，不准他用。然而國內目前在市面 上則有流通的不明鹽品，若含殘存的內分泌 干擾物如雙酚A(Bisphenol A)將對這塊土地 的子子孫孫有極深遠的影響。 而 目 前 分 析 內 分 泌 干 擾 化 學 物 質 (endocrine disrupting chemicals)的方法，主 要分為體外試驗(in vitro)，包含 competitive ligand binding [1] 和 cell proliferation techniques [2] 以 及 recombinant receptor-assays [3]，和體內試驗(in vitro)的 rodent uterotrophic assay [4]。體外試驗主要 作為初級篩選，需在經由體內試驗，才能確 定該化學物質是否為內分泌干擾物質[5]。
確定為內分泌干擾物質後，則是利用傳統的 氣相層析(gas chromatography) [6] 和液相 層析(liquid chromatography) [7]來作樣品的 定量分析。 生物感測器為近年來發展檢驗內分泌 干擾物的分析方法之ㄧ，可應用於體外試 驗，其特點為利用酵素的特異性，不需經過 複雜的分離程序，即可篩選某類特定結構的 化學物質，並易與流動分析系統結合，適合 現場即時檢測可疑的內分泌干擾物質，但某 些低溶解度的疏水性內分泌干擾物質，由於 在樣品中濃度極低，應而檢測不易。 本計畫主要研究目的，是希望改善目前 生物感測器於環境荷爾蒙檢測上感度不佳 的困境。 Andreescu 和 Sadik 在 2004 年於 Analytical Chemistry 期 刊 上 發 表 amperometric tyrosinase-based biosensor [8]，該裝置雖能針對酚類的環境荷爾蒙進 行定量分析，但是其偵測極限(detection limit) 僅達µM 級，與一般存在於廢水中的環境荷 爾蒙相比，其濃度差2-3 order，無法檢測一 般樣品。本研究利用基質循環增幅法[9]， 將其檢測極限下降至一般殘留酚類樣品的 檢測濃度( 10 nM 級)，並設計適合直接應用 於鹽品中殘存環境荷爾蒙檢測的流動分析 系統，以利可疑樣品的初步篩選。 三、結果與討論 3.1 Mediator 選擇 圖一為系統架構示意圖。本研究利用蠕 動幫浦將carrier 推送，樣品注射後，沿著流 路經固定化酪酸酵素反應器(immobilized tyrosinase reactor)反應，至三極式電化學流 動槽(flow cell)，利用定電位計施加工作電 壓，以量測其反應物與產物濃度變化之法拉 第電流。檢測原理如圖二所示。本研究先利 用鄰苯二酚(catechol)作為標準品，5×10-3 M 維他命C 作為 mediator 及氧電流作為評估 指標，其典型響應如圖三所示，維他命C 雖可以有效的增加氧電流訊號，但氧電流本 身背景訊號雜訊過大，且溶氧濃度較不易控 制，容易受到溫度影響造成背景訊號的漂 移，不利於低濃度檢測，因而改利用10-2 M 的黃血鹽作為mediator，並以產物赤血鹽生 成的還原電流變化作為檢出訊號，其原理如 圖四所示，典型響應則如圖五所示，catechol 濃度於 10-3 M-10-8 M，可得 does-dependant 響應。 3.2 工作電壓之影響 圖六為工作電壓對氧化還原電流訊號 之影響情形。當施加的工作電壓越正，對過 量的黃血鹽及酚類氧化情形越嚴重，造成訊 號overlaping 分析困難。而當所施加的電壓 越負，醌類的還原電流也逐漸增加，將影響 生成赤血鹽的還原電流檢測，為避免溶液中 反應物的干擾，故選擇0 V 作為之後檢測時 的工作電位。 3.3 流速之影響： 圖七為流動分析系統流速對訊號增幅 倍率之影響。流速越快，catechol 與 tyrosinase 的反應時間越短，quinone 的生成量愈少， 與黃血鹽反應時間亦愈少，而造成substrate recycle 的次數有限，應而增幅倍率較小。考 量增幅倍率與取樣時間，故選擇1ml / min 作為系統流速，檢測3 次相同樣品點之所需 時間為15 min.。 3.4 標準品之檢量 3.4.1 鄰苯二酚之檢量 圖八為鄰苯二酚之檢量線。利用黃血鹽 媒介物可使得鄰苯二酚之檢量範圍從 10-4M-10-6M 增加為 10-4 M-10-8 M ，R2分 別為0.9998 和 0.9784，n = 3。 3.4.2 酚之檢量 圖九為酚之檢量線。酚可經由 tyrosinase 催化轉變為鄰苯二酚，鄰苯二酚 則可繼續催化轉變為鄰苯二醌，並與黃血鹽 形成substrate recycling，達到增加檢測下限
的目的，其檢測極限由10-5 M 可降低至 10-7 M，n = 3。
3.4.3 雙酚 A 之檢量
圖十為雙酚 A 之檢量線。由於
tyrosinase 具有 broad enzyme activity，雙酚 A 亦可被催化檢測於此流動分析系統中，檢 量範圍為2.5×10-5 M-2.5×10-7 M，n = 3。 四、計畫自評 本研究成功檢測鄰苯二酚、酚與雙酚 A ，如表一所示，藉由與 mediator 黃血鹽 所構成的substrate recycling，可達到系統訊 號增幅與增加檢測下限。但壬基苯酚 (nonylphenol)於此系統無法被有效檢出，未 來將利用organic phase enzyme electrode 進 一步研究。另外，本研究系統所使用的溶劑 為高濃度0.1 M, pH 7.0 的磷酸緩衝溶液，可 成功檢出訊號，本系統應可直接使用在鹽品 殘存環境荷爾蒙的檢驗上。
五、參考文獻
1. White R., Jobling S., Hoare S.A., Sumpter J.P., and Parker M.G. (1994) Endocrinology. 135, 175-182.
2. Korner W., Hanf V., Schuller W., Kempter C., Metzger J., and Hagenamier H. (1999) Sci. total environ. 225, 33-48. 3. Gaido K.W., Leonard L.S., Lovell S.,
Gould J.C., Babai D., Portier C.J., and Mcdonnell D.P. (1996) Toxicol. appl. pharmacol. 143, 205-212.
4. Shelby M. D., Newbold R. R., Tully D. B., Chae K., and DavisV. L. (1996) Environ. health perspect.104, 1296-1300.
5. Odum J., Lefever P.A., Tittensor S., Paton D., Routledge E.J., Beresford N.A., Sumpter J. P., and Ashby J. (1997) Regul.
toxicol. pharmacol. 25, 176-188.
6. Larsson D.G.J., Adolfsson-Erici M., Parkkonen J., Berg A.H., Olsson P.-E., Forlin L. (1999) Aquat. toxicol. 45, 91-97 7. Petrovic M.,and Barcelo D. (2000) Anal.
Chem. 72, 4560-4567.
8. Andreescu S. and Sadik O. A. (2004) Anal. Chem. 76, 552-560.
9. Hasebe Y., Takamori K., and Uchiyama S. (1993) Anal. Chim. Acta. 282, 363-367. 六、圖表
圖一 系統架構圖
圖八 鄰苯二酚之檢量線。○:使用 1×10-2 M 黃血鹽，●:未使用 10-2 M 黃血鹽。樣 品與黃血鹽皆溶於0.1 M, pH 7.0 的磷酸 緩衝溶液中，系統流速為 1.0 ml /min。 圖 五 利 用 1×10-2 M 黃 血 鹽 作 為 mediator，檢測鄰苯二酚的系統典型響應 圖，鄰苯二酚與黃血鹽皆溶於0.1 M, pH 7.0 的磷酸緩衝溶液中，系統流速為 1.0 ml /min。 圖三 利用維他命 C 作為 mediator 的系 統 典 型 響 應 圖 。Amplified (A) and un-amplified (B) signals of injected sample solutions containing (a) 5 uM catechol with 5 mM ascorbic acid (b) 0.5 uM catechol with 5 mM ascorbic acid (c) 10 uM catechol (d) 1 uM catechol. Carrier: 0.1M, pH 7.0 phosophate buffer. Flow rate: 0.8 ml /min 圖六 工作電壓之影響。○:1×10-2 M 黃 血鹽，●:1×10-4 M 鄰苯二酚，分別溶於 0.1 M, pH 7.0 的磷酸緩衝溶液中。 圖七 流動分析系統流速之影響。樣品 為1×10-4 M 鄰苯二酚，溶於 0.1 M, pH 7.0 的磷酸緩衝溶液中。 圖四 利用黃血鹽作為mediator，檢測酚 類的原理示意圖
表一 酚類檢量範圍表 圖九 雙酚 A 之檢量線。使用 10-2 M 黃 血鹽，樣品與黃血鹽皆溶於0.1 M, pH 7.0 的磷酸緩衝溶液中。系統流速為 1.0 ml /min。 圖九 酚之檢量線。○:使用 1×10-2 M 黃血 鹽，●:未使用 10-2 M 黃血鹽。樣品與黃 血鹽皆溶於0.1 M, pH 7.0 的磷酸緩衝溶 液中，系統流速為 1.0 ml /min。
