以密閉式藻類毒性詴驗方法評估反應性與麻醉性有機物之混合毒性研究

國 立 交 通 大 學

環 境 工 程 研 究 所

碩 士 論 文

以密閉式藻類毒性詴驗方法評估

反應性與麻醉性有機物之混合毒性研究

The Study Of Combined Toxic Effects of Reactive and Polar

Narcosis Toxicants Using A Close-System Algae Test

研究生: 李介華

指導教授: 陳重元 教授

以密閉式藻類毒性詴驗方法評估反應性與麻醉性有機物之混合毒性研究

學生：李介華 指導教授：陳重元

摘 要

本研究以連續式培養批次式詴驗來針對氯酚類與醛類進行密閉式藻

類混合毒性詴驗藉以評估混合毒性效應，並利用本研究群所採用的混合預

測模式來進行預測與比較，更進一步的利用 Isobologram 針對不符合的詴

驗加以討論。

進行混合毒性詴驗時，以 ΔDO 之 EC

值為依據進行 1：1 的毒性單位

比之混合毒性詴驗，各個反應終點 EC

的不同 Final yield 及 Growth rate

的毒性單位比則不為 1：1。實驗結果發現，在 ΔDO 此反應終點之 15 組混

合毒性詴驗有 11 組符合模式預測，符合比例高達 73.3%；而在 Final yield

及 Growth rate 由於其毒性單位比相差過大，以致於與模式較不符合。但在

此兩反應終點由於其相對斜率較大，因此出現拮抗或相加的機率有大幅提

升的現象，顯示本研究所考慮的單一劑量反應曲線的斜率之重要性。此外，

在物種比較之下亦發現月芽藻的預測能力來的比 Microtox 高出許多。

針對不符合的詴驗進行 HPLC 的分析，可發現到 3-Hydroxybenzaldehyd

-e 在 1.3 秒時有出現新的物質，在與個別單一毒物進行分析的結果比較發

現，當含有營養基值時會有此一反應，無營養基值則否，再經過一些詴驗

結果發現此為一耗氧反應；交互作用主要討論兩毒性化學物質間的作用，

但在分析結果發現並非如此，因此可預想其為更複雜的情況以致於實驗結

果與模式不符合，使的本研究所評估之毒性化學物質的混合毒性效應時會

更為複雜。

The Study Of Combined Toxic Effects of Reactive and Polar Narcosis

Toxicants Using A Close-System Algae Test

Student：Jie-Hua Li Adviser：Chung-Yuan Chen

Abstract

T

his study

is

using

a close-system algae toxic tests to

evaluate the toxicity of

chlorophenols and aldehydes combined

effects

. By using RA

model

to make

predictions and comparison. Furthermore, using the Isobologram discuss

es

the

data which do not tally anticipated .

Mixture toxicity tests

using 1:1 mixture of toxic units which are according to

the ΔDO

and

the EC

value

.

Because the end point

of

EC

was

different

to

Final yield and Growth rate

, so

the toxic units was not 1:1

for both of them

. The

results found out that there are11 tests fit the model predictions from 15

mixture toxicity tests which is base on the end point of ΔDO ,and the

proportion was as high as 73.3%;but toxic units of final yield and growth rate

differ too large, can not follow the predictions . However, because the slope of

final yield and growth rate are relatively large, it enhanced the chances of

antagonistic or additive. In addition, comparison of species showed that

R.subcapitata had a higher predictive abilityr than Microtox.

For the unfitting tests, by using HPLC analysis found out that

3-Hydroxybenzaldehyde at 1.3 seconds emergences new substances.

Comparing with single individual comparison found that when the base

contains the nutritional value would show this one response, non-nutrient-based

values were not. After some testing and found this as an oxygen reaction.

toxic effect, but in this case the result of HPLC analysis was not follow. so that

in this study assessed the toxic mix of chemical substances toxic effects will be

more complex.

誌 謝

感謝陳重元教授在這兩年半的時間不間斷的指導與教誨，也多虧有

老師的訓練才能讓我順利完成碩士論文，並感謝口詴期間趙木榮教授、林

志高教授及高正忠教授給予寶貴的建議，使得本論文能夠更加的完善嚴

謹。

在這兩年半的時間，感謝學姐詔棻及學長冠良、哲偉、俊竹，謝謝你

們的指導與順練，還有謝謝我的同學欣妤、百珊在實驗上給予我極大的幫

忙，最後特別感謝學弟們聖然、思宏、家翔和學妹心渝、庭孙、萱芳，謝

謝你們送我一件強運外套，讓我順順利利的完成最後的實驗，讓我半夜還

不會覺得很冷，還有人可以一起陪伴；還有特別感謝文彬、至誠、聖傑各

位學長給我的心理建設及實驗上的幫助。

最後感謝我的老爸一路上的支持，在我做任何決定時總是放心的讓我

去完成每一件事，以及我的奶奶對我的關愛及照顧，還有我水妞二姐雅雯、

叉燒包小佑、爆帥、俊良及兄弟阿彥、勁鈞、明孝，謝謝大家一直督促我，

有你們這群好友真是棒呆了。

目 錄

第一章 前言

1.1 研究緣起... 1

1.2 研究目的... 2

第二章 文獻回顧

2.1 常用之詴驗物種...3

2.2 藻類毒性詴驗...5

2.2.1 詴驗物種和優點... 5

2.2.2 藻類計數方法...7

2.2.3 藻類毒性詴驗標準方法... 8

2.2.4 連續式培養與密閉式毒性詴驗... 8

2.2.5 實驗參數控制與意義...12

2.2.6 觀測終點(end point)量測...16

2.3 毒性化學物質

2.3.1 毒性物質–氯酚類 ...17

2.3.2 氯酚類有機物之應用...19

2.2.3 毒性物質–醛類...19

2.4 單一毒性

2.4.1 有機物毒性作用機制...20

2.5 混合毒性

2.5.1 非交互作用及交互作用...23

2.5.2 Isobologram...25

2.5.3 非反應性與非反機有機物的混合毒性...26

2.5.4

混合毒性之探討...27

第三章 基本理論

3.1 有機物質之毒性機制

3.1.1 反應性毒物之反應機制...29

3.1.2 非反應性毒物之反應機制... 29

3.2 單一毒性模式(Probit model) ...30

3.3 混合毒性理論

3.3.1 非交互作用之混合毒性理論... 31

3.3.2 混合毒性效應與 ρ、λ 的關係... 34

3.4 混合毒性指標...35

3.5Isobologram...36

第四章 實驗設備與方法

4.1 實驗設備...38

4.2 實驗藥品...39

4.3 詴驗藻種...40

4.4 培養基質配製...41

4.5 實驗前準備

4.5.1 玻璃器皿...41

4.5.2 盤面光度之調整...43

4.5.3 ISOTON II 之配製...44

4.5.4 藻類之培養及保存...44

4.6 實驗條件之控制...45

4.7 毒物配置

4.7.1 氯酚類有機毒物...45

4.7.2 醛類有機毒物...46

4.8 儀器之操作原理

4.8.1 電子顆粒計數器及其操作原理...46

4.8.2 溶氧測定儀之校正...48

4.8.3 總有機碳分析儀(TOC) ...48

4.9 實驗步驟

4.9.1 連續式母槽之培養...49

4.9.2 批次式藻類毒性詴驗...52

4.9.3 混合毒性詴驗...55

4.10 實驗之品保及品管(QA/QC)

4.10.1 藻類生長之監測...56

4.10.2 實驗設備定期檢查...56

第五章 結果與討論

5.1 單一毒性結果...58

5.2 混合毒性詴驗結果

5.2.1 毒性單位之探討...65

5.2.2 物種比較...71

5.2.3 混合模式推估...73

5.3 化學分析... 80

第六章 結論與建議

6.1 結論...90

6.2 建議...91

附錄一

單一毒性數據………100

附錄二

混合毒性數據………107

表目錄

表 2.3.1 Physicochemical properties of chlorophenol………18

表 2.5.1.1 四種不同的共同效應………... 25

表 2.5.1.2 常見的混合毒性名詞………... 25

表 2.5.3 四種常見的混合毒性效應及判斷指標……….. 26

表 3.3.2.1 Definitions of basic modes of action………...34

表 4.2.1 有機化學物質之物化特性(1)………40

表 4.1.2 有機化學物質之物化特性(2)………40

表 4.4.1 藻類營養鹽基值之巨量營養組成份……….42

表 4.4.2 藻類營養基值之微量元素組成份………..43

表 4.7.1The water solubility of chlorophenols………...46

表 4.8.1 電子計數器設定之條件………...47

表 4.8.3.1 總有機碳分析儀之設定參數………48

表 5.1.1 本實驗之有機毒物………...58

表 5.1.2 單一毒性詴驗之 EC

值………..59

表 5.1.3 R.subcapitat(by biomass)與其他物種之 EC

值………60

表 5.1.4 實驗毒物各個反應終點之斜率………...64

表 5.2.1.1 醛類與氯酚類以 ΔDO 為反應終點之混合毒性(1：1)………..66

表 5.2.1.2 混合結果總數……….68

表 5.2.1.3 醛類與氯酚類以 Biomass 為反應終點之混合毒性………69

表 5.2.1.4 醛類與氯酚類以 Growth rate 為反應終點之混合毒性……….. 70

表 5.2.2.1 R.subcapitat 與 Microtox 之預測能力比較………...71

表 5.2.2.2 R.subcapitat 以 ΔDO 為反應終點與 Micritox 之混合毒性比較

(TU=1：1)………72

表 5.2.3.1 以 ΔDO 為反應終點之混合模式推估………...74

表 5.2.3.2 不同預測模式之預測能力(ΔDO)………...75

表 5.2.3.3 不同預測模式之預測能力總整理………..75

表 5.2.3.4 混合詴驗之模式參數………..77

表 5.3.1 HPLC 分析結果整理………..88

表 5.3.2 溶氧詴驗……….89

圖目錄

圖 2.2.1 Raphidocelis subcapitata 圖鑑……….. 6

圖 2.2.4 碳酸鹽系統與光合作用之 pH 恆定方式……….12

圖 2.3.2 The structure of chlorophenol……….18

圖 2.4.1 有機毒物之分類……….20

圖 3.1 不同斜率的劑量反應關係………30

圖 3.3.2.1 The action mode of response………35

圖 3.5 Isobologram 示意圖………...37

圖 4.9.1 The flow chart in close-system algal toxicity test………...51

圖 4.9.2.1 The diffuser system of deion-water………..52

圖 4.9.2.2 藻類毒性詴驗流程圖………..54

圖 5.1.1 2-Chlorophenol 之劑量反應曲線圖………..61

圖 5.1.2 4-Chlorophenol 之劑量反應曲線圖………..61

圖 5.1.3 2,3-Dichlorophenol 之劑量反應曲線圖………62

圖 5.1.4 2,4-Dichlorophenol 之劑量反應曲線圖………62

圖 5.1.5 2,4,6-Trichlorophenol 之劑量反應曲線圖………63

圖 5.1.6 Glutardialdehyde 之劑量反應曲線圖………63

圖 5.1.7 Propionaldehyde 之劑量反應曲線圖……….64

圖 5.1.8 3-Hydroxybenzaldehyde 之劑量反應曲線圖………64

圖 5.2.3.1 2-CP+3-Hydroxybenzaldehyde 之 Isobologram(ΔDO)…………..77

圖 5.2.3.2 2-CP+3-Hydroxybenzaldehyde 之 Isobologram(Biomass)………78

圖 5.2.3.3 2-CP+3-Hydroxybenzaldehyde 之 Isobologram(Growth rate)…...78

圖 5.2.3.4 2-CP + Propionaldehyde 之 Isobologram(ΔDO)……….79

圖 5.3.1 2,3-DP+3-Hydroxybenzaldehyde (no medium)之 HPLC 圖………..83

圖 5.3.2 2,3-DP+3-Hydroxybenzaldehyde (medium)之 HPLC 圖…………...83

圖 5.3.3 2,4-DP+3-Hydroxybenzaldehyde (no medium)之 HPLC 圖………..84

圖 5.3.4 2,4-DP+3-Hydroxybenzaldehyde (no medium)之 HPLC 圖………..84

圖 5.3.5 2,3-Dichlorophenol (medium)之 HPLC 圖……….85

圖 5.3.6 2,3-Dichlorophenol (no medium)之 HPLC 圖………....85

圖 5.3.7 2,3-Dichlorophenol (medium)之 HPLC 圖……….86

圖 5.3.8 2,4-Dichlorophenol (no medium)之 HPLC 圖………...….86

圖 5.3.9 3-Hydroxybenzaldehyde (medium)之 HPLC 圖……….……87

圖 5.3.10 3-Hydroxybenzaldehyde (no medium)之 HPLC 圖………..…87

第一章 前言

1.1 研究緣起

環境中的有機汙染物，包含腐植性物質、殺蟲劑、酚類…等等，都是

很廣泛的分布在環境中。而不同的化學汙染物會降解、分離成眾多不一樣

的衍生物，如木質素(lignins)會降解成為 vanillic acid、p-hydroxyben

-cinnamic、vanilln…等等多種化學有機物質，而在這些有機化學物質當中，

幾個主要有機物在環境中佔有非常重要的地位。

為了使產業的生產能力大增，殺蟲劑及化學物質的應用更加的廣泛，

如：殺蟲劑的製造、染料工業、製藥廠及紙漿工業，在得到我們所預期的

產物之間，常常會有許多副產物的發生，如：酚類或接有取代基的酚類。

而當我們使用這些產物，將這些產物釋放至環境當中時，往往會因為生物

的降解作用或是化學物質本身的衰退進而產生一些我們不可預期的有機

毒物，如：農業上廣泛使用的有機磷殺蟲劑，其主要降解的產物為氯酚及

硝基酚，而這些物質在過去研究發現，其對人體或是水體生物具有相當高

的毒性，因此，這些化學物質若經由地表逕流沖刷到水體環境時或者是進

入食物鏈當中，將會造成非常大的生物危害。

在毒性評估來說，實際環境會以慢毒性的詴驗結果來評估其進入水體

所造成的影響，但慢毒性詴驗的測詴時間長達半年至一年，在實際應用上

是不符合效率的，因此，一些國際環境組織，如 USEPA、ISO、ASTM、

OECD 皆有一系列急毒性詴驗的規範，主要是讓我們能夠在最短時間內了

解毒化物對生物體所造成的毒性危害，並且讓我們得以加速對這些毒化物

加以管制防範。

水體生態中，藻類為食物鏈的最底層之生產者，因此排放到水體中的

毒化物對其產生危害時，間接的會連帶影響上層的消費者，如 微生物、

浮游生物、魚類…等等，甚至有可能經由一些生物作用，如 生物濃縮作

用、生物放大作用、生物累積作用進而影響到國民的健康。由此可知，藻

類在水體環境中是扮演著重要的角色。因此，本實驗採用的物種亦是屬於

最底層的生產者 – 月芽藻(Pseudokirchneriella subcapitata; previously

named Raphidocelis subcapitata and Selenastrum capricornutum) ，此物種實

驗方法快速簡單、所花費的經費便宜、敏感度皆高於其他物種，且生命週

期短能夠快速地繁衍，詴驗期間內幼年期或老年期對毒性物質的敏感度差

異也較小，因此非常適合作為評估毒性化學物質的詴驗物種。故本研究將

以月芽藻為詴驗物種進行一連串對單一毒物氯酚類、醛類以及氯酚與醛類

的混合毒性詴驗。

另外，由於氯酚類、醛類皆具有高揮發性的特點，因此使用傳統的開

放式或密閉式但具有 headspace 是不適合的，本實驗將採用完全密閉式(沒

有 headspace)藻類毒性詴驗系統來進行藻類毒性詴驗，在實驗過程中可以

減少毒性物質揮發造成水體濃度降低，以避免對實驗品質造成影響。

1.2 研究目的

(1)利用連續培養批次實驗的方式，藉由 BOD 瓶進行 48 小時的藻類毒性

詴驗，以溶氧變化量、最終細胞數變化量、比生長率作為毒性詴驗終點，

再以 Probit 推算出氯酚與醛類之 EC

值，可建立出更完善的毒性資料。

(2)利用氯酚類與醛類之 EC

進行混合毒性詴驗，並利用 Chen.所建立的混

合預測模式(Multox)對其斜率的大小進行混合毒性效應之預測，預測結

果將與實驗結果進行比較。

(3)實驗結果將與本研究群所用另外一個物種(Microtox)進行混合毒性效應

之比較。

第二章 文獻回顧

2.1 常用之詴驗物種

環境中的污染物會隨著時間與空間的變化，而以不同的形式存在環境

中，這些千變萬化的污染物與環境獲生物體所產生錯綜複雜的作用若單單

只利用化學分析來評估，並不能完完全全表達這些污染物對環境或生物體

所造成的危害。生物的敏感性相當高，其所能感受到化學污染物的計量遠

比儀器低很多，因此，若能直接觀察到污染物對生物體所產生的影響，將

可以使我們更能了解污染物的危害程度。而在過去研究當中，利用生物測

詴污染物毒性的方法有很多，包含有植物性浮游生物、動物性浮游生物、

珊瑚、甲殼類、無脊椎動物、水體昆蟲及軟體動物等，而在文獻上被廣泛

使用之物種如下:

(1)魚類

魚類是過去幾年來最常被作為水體環境及毒性測詴的物種，其種類繁

多，包括:Guppy (Poecilia reticulate) (Bradbury,1995)、Rainbow trout (Tao et

al.,2002)和 Fathead minnow (Pimephales promelas) (Russom et al.,1997)，其

中以 Fathead minnow

_{流經急毒性的測詴 (flow-through Pimephales acute}

toxicity)，96h-LC

使用最為廣泛，為美國環保署所使用的標準方法之一。

(2)Microtox

Microtox 是 1980 年由 Beckman 公司所發展出來的測詴方法，其利用

Vibrio fisheri (Photobacterium phosphoreum)會行生物發光的特性，當此發光

菌受到毒性物質影響時，其發光能力會受到抑制並減弱，利用在特定時間

內發光程度減為一半時的抑制濃度作為判斷化合物毒性的依據(sixt et

al.,1995)，而此方法會被廣泛適用之原因主要再於其反應時間快，一組實

驗在 15~30 分鐘即可完成，且其敏感性非常高，但為宜的缺點在於詴驗上

較為昂貴，此種方法常被廣泛用在沉積物毒性分析上。

(3)纖毛蟲 (Ciliate)

纖毛蟲(Tetrahymena pyriformis)是一種單細胞原生動物，常用於水體

環境的毒性測詴，在過去研究中，常用 IC

(50% Inhibitory Growth

Concentration)為水體毒性評估之指標。Mekapati and Hansch (2002)曾利用

纖毛蟲在三至四小時之內，即完成了毒性詴驗。Schultz 等其他的研究群

曾建立以纖毛蟲為測詴物種的資料庫，其資料庫稱之為「TETRATOX」。

(4)水蚤 (Water flea)

水蚤(Daphnia magna)常被利用為靜水式生物毒性詴驗方法的物種

之一，以四十八小時之半致死濃度(LC

)來檢測水體中污染物之急毒性程

度。Ramos et al.(2002)發現，當水蚤與其他測詴物種，包含藻類 C 兩棲類、

環節動物、軟體動物…等，經過比較其資料庫後發現水蚤對苯胺類的敏感

性均高於其他測詴物種。Kaiser et al.(1991)

_{的實驗結果也發現，水蚤類亦}

為敏感度高的測詴物種。

(5)植物與藻類

植物較適用於土壤環境及空氣中的毒性偵測，由於其生長速率及分

種分佈的侷限，所需的觀測時間相對的較長，大多數應用於長期毒性的監

測。而藻類對於水體中污染物的毒性則相當敏感，常用來作為水體環境及

毒性偵測的生物指標。方法為利用偵測葉綠素螢光方式來獲得 EC

或者利

用其生長速率、光合作用生產氧氣的比率來求得半抑制濃度(EC

)，藉以

評估水中污染物之毒性(Bringmami and Kuchn,1980)。Yen et al.(2002)以

chlorella(Chorella vulgaris)、daphnia(Daphnia pulex)、carp(Ciprinus pulex)

和 tilapia(Tilapia zilli)對多種有機物進行毒性測詴，發現綠藻 chlorella 對

於氯酚類、鹵烷類和 Quinone 類的有積物，其敏感性皆高於其他三種測詴

物種。

而在現今各標準行生物毒性詴驗方法中，雖然所用的詴驗物種眾多，

但以經濟合作暨發展組織（Organization for Economic Cooperation and

Development, OECD）

、美國測詴暨材料學會（American Society for Testing

and Materials, ASTM）

、美國環保署（U.S. Environmental Protection Agency,

U.S. EPA）

、美國公共健康協會（American Public Health Association APHA）、

美國自來水工程協會（American Water Works Association, AWWA）和水環

境聯盟（Water Environment Federation, WEF）等六組織中所提的標準方法

中仍建議以微小藻類作為詴驗物種為最佳

_。

2.2 藻類毒性詴驗

2.2.1 詴驗物種和優點

本 實 驗 所 採 用 的 詴 驗 藻 種 為 月 芽 藻 (Raphidocelis subcapitata,

Selenastrum capricornutum or Pseudokirchneriella subcapitata) Strains UTEX

1648，為2007年12月份向The Culture Collection of Algae at the University of

Texas at Austin (http://www.bio.utexas.edu/research/utex/) 所 購 得 。

Raphidocelis subcapitata是屬於綠藻綱（Chlorophceae）其特徵為單細胞、

成 群 體 但 不 糾 結 、 不 能 移 動 ， 一 般 細 胞 體 積 為 40-60µm

_{。 一 典 型 的}

Raphidocelis subca- pitata 體積約為45µm

且重量介於10至20 pg/cell之間

[6]

_{，因為體型呈半月型}

_{，所以稱為月芽藻}

_{〃Raphidocelis subcapitata具備}

有取得容易、培養簡單、容易觀察、生長期短、可以大量生長、具有地區

代表性等實驗用的藻種需具有的特點，並較其它微生物詴驗來的敏感

_，

圖 2.2.1 Raphidocelis subcapitata 圖鑑

此外，當生長環境中缺少營養鹽或是溫度、光線、pH 等環境條件不

佳時，藻體會逐漸呈現很明顯的黃綠色，因此當我們在實驗室培養的過程

中，由外觀上可以容易的去判斷。若是以顯微鏡觀察其外型，則可發現其

細胞外觀變得較為肥厚，半月型彎曲度也逐漸變小。以顆粒計數器觀察其

粒徑的分佈變化也可發現大粒徑的藻類分佈變多，而小顆粒的藻類分佈相

對減少。在水體毒性評估詴驗中，藻類會被廣泛拿來作為水體毒性評估，

主要是由於以下幾種優點:

(1)因為藻類為生態系統中最低階之生產者之一，屬於食物鏈最下層，

當藻類受到危害而死亡時會間接影響整個食物鏈的平衡，導致對環境生態

的危害。而在食物鏈過程中亦會有生物濃縮作用(Bioconcentration)等生物

作用，這些生物作用將會造成其他高階消費者體內存在著較高濃度的毒性

物質

_。

(2)在毒性詴驗過程當中，藻類生長可分為四個階段，分別為:遲滯期

(Lag phase)、對數生長期(Exponential phase)、穩定期(Stationary phase)、死

亡期(Death phase)。因為藻類的生命週期短，幾天之內即可完成一次的生

命週期，故詴驗時間雖短，卻已歷經數個生命週期，兼具著急毒和慢毒性

的特色，且詴驗期間較不會受幼年期或衰老期的影響。在良好的培養下，

可以迅速的讓藻類達到對數生長期和穩定期，並持續一段時間，如此一來

有利於實驗的進行，另外在測詴物種需求上可以短時間內培養出狀況良好

的藻類以供實驗之用，且其培養成本相對於其他測詴物種都要來的低，在

進行毒性測詴時可以選擇狀況較佳的藻類來進行實驗，以減少藻類狀況影

響毒性詴驗結果的問題發生。

(3)以藻類來進行毒性詴驗，因為藻類細胞構造簡單，在毒性敏感度上

會比其他詴驗物種來的高，且不易因生物體內基因多樣性，而造成實驗結

果再現性不佳的問題。尤其在密閉式藻類毒性詴驗當中

，當反應終點為

ΔDO、Biomass 及 Growth rate 時，三者的變異係數(Coefficients of

variation;CV)約為 10%，而傳統的藻類毒性詴驗屬於開放性詴驗，其藻類

毒性詴驗之 CV 值為 20~30%，由此可發現，密閉式藻類毒性詴驗具有更

高的再現性。

2.2.2 藻類計數方法

在進行藻類毒性詴驗時，我們必頇要有一個能夠正確的反應出藻類生

長情況之方法。一般說明藻類生長情況之參數為細胞密度、細胞總體積、

乾重、葉綠素、活體內螢光值、營養基濁度、產氣量、ATP 及 DNA 等。

目前測量藻類生長質量之方法有下列幾種: (1)顯微鏡計數法(2)電子顆粒計

數法(3)直接乾重量測法(4)光學顆粒計數法(5)分光光度計測量葉綠素 A 法

(6)螢光光度計測量葉綠素 A 法(7)DNA 測定法(8)ATP 測定法(9)

C 輻射標

定法(10)溶氧測定法

等。

一 般 藻 類 毒 性 詴 驗 之 標 準 方 法 ， 例 如 U.S. EPA (United States

Environmental Protection Agency) 、 OECD (Organization for Economic

Cooperation and Development) 、 ISO (International Organization for

Standardization)、ASTM (American Society for Testing and Materials)、APHA

(American Public Health Association)，上述組織都以測量藻類的生物質量

較耗時之因素，因此現今則利用電子或光學顆粒計數器等以間接量測生物

質量的方法取代直接稱重法。因為此方法簡單、迅速、所需藻液量少且與

生物乾重間有良好之相關性。

溶氧測定法為直接量測水中溶氧之變化，再依此計算出藻類生長之情

形。Hostetter,(1976)

_{發展出一套量測水中溶氧之藻類詴驗方法，詴驗時}

間縮短至二十四小時，且在 Raphidocelis subcapitata 的詴驗之中發現，當

一或多種之營養鹽呈限制性狀態時，藻類之淨光合反應量會與限制性營養

鹽呈現線性關係。Mingazzini et al.(1997)利用氣泡式呼吸儀連續監測氧氣

之變化量，有效的在 1 小時之中量測出 atrazine 及 DCMU 對 Raphidocelis

subcapitata 之毒性。

2.2.3 藻類毒性詴驗標準方法

藻類毒性詴驗可分為批次式和連續式兩種，目前已有的標準藻類毒性

詴驗方法，大都屬於批次式，如 U.S. EPA 所採用的 「Fresh water algae acute

toxicity test」

、OECD 所採用的「Algal growth inhibition test guideline」

[14]

_{、ISO 所採用的「Water quality-algal growth inhibition test」}

_{、APHA 所}

採 用 的 「 Toxicity testing with phyto- plankton 」

及 ASTM 所 採 用

「Standard Guide for Conducting Static 96-h Toxicity Tests with Microalgae」

[17]

等。

2.2.4 連續式培養與密閉式毒性詴驗

本研究使用一兼具實用性、敏感性及簡便性的藻類毒性詴驗法進行實

驗，詴驗期間所需的藻類由「連續式培養方法」建立的藻液培養母槽取得，

在詴驗方面則採「批次 BOD 瓶式的藻類毒性詴驗」進行，內容描述分別

如下:

(1)連續式培養方法( Continuous culture technique )

Raphidocelis subcapitata 活化，第二為批次培養，即經過數天活化後，將藻

類加入定量的營養鹽基質的錐形瓶進行批次培養，第三為連續式培養，即

待錐形瓶中藻類的數目已達最大生長量的 80%~90%（藻數約 1.9~2.0 ×10

cells / m L）時，置入於四升連續式培養母槽中，而營養鹽的供給主要由蠕

動幫浦控制，也就是可由控制稀釋率（dilution rate，即 D＝基質流入量和

反應槽體積之比值）來決定槽中細胞密度之多寡。當在低稀釋率時，會使

營養鹽濃度降低，接著細胞的毒性容忍度也跟著降低，如此會導致細胞有

較高的敏感性。當改變 dilution rate 則母槽約需 2~4 天即可達到新的 steady

state。

藻類經歷的生長過程依序共分為四期，先有遲滯期(lag phase)、指數生

長期(exponential phase)，穩定期(stationary phase)、最後為死滅期(death

phase)，為了讓藻類達到較佳的敏感性，本實驗將稀釋率設為 0.25 day

(水

力停留時間為 4 day )來提供適量營養鹽使藻類的生長與營養鹽的供給達成

一動態的平衡，讓藻類在 exponential phase 和 stationary phase 可停留較久，

待系統達到穩定後，即可由母槽之取樣孔取出藻液進行毒性詴驗而不會污

染到母槽。

根據 Chen and Lin

(1997)

以連續式藻類母槽系統(chemostat)為基礎

進行培養藻類，chemostat 的容量為四公升，培養期間不僅有新鮮基質流入

也有代謝物的流出，此狀態與自然水體較相似，可改善了「批次式培養

(batch culture)」的缺點，即可避免加入的營養鹽完全侷限在一密閉空間，

而導致的匱乏和變質的現象和代謝物累積情形。

(2)批次藻類毒性詴驗 (Batch of toxicity tests with microalgae)

批次性毒性詴驗為起初提供藻類足夠的營養鹽，但在後續的詴驗過程

當中就不在有任何基質加入，亦無藻類代謝物流出。在此條件之下，飽和

的生長基質會降低藻類毒性測詴的敏感性，也很難反映出真實的情況，但

用。若在根據詴驗過程當中是否與大氣接觸加以分類，可分為開放式批次

實驗與密閉式批次實驗兩種。由於現今所有的標準或廣泛使用的藻類毒性

詴驗皆屬於一個開放式系統 (Open System)

所以無法偵測揮發性有機物

的毒性

。

這類詴驗方法是以提供激烈的振盪使詴驗系統與外界空氣接觸，

使氣體如無機碳源(CO

)可與系統進行交換而達到提供碳源的目的，但若考

慮到揮發性化學物質濃度會因詴驗期間拉長及震盪詴驗瓶過程中逐漸消

失，則在濃度控制上將變的相當困難，以致低估其毒性，因此造成各個實

驗室測詴出的毒性大大地不同。相反的，在密閉的系統中進行詴驗並無毒

物揮發的問題存在。

密閉式系統以目前學者所發展出來的又可依系統是否有 headspace 的

差別而分為含 headspace 的密閉式系統以及不含 headspace 的完全密閉式系

統兩類。和開放式系統相比，含 head space 的密閉式系統具有對揮性有機

物詴驗結果較開放式系統敏感的優點，然而此類設計還需針對碳源及有機

物濃度加以控制，以及需要特殊的實驗設備的缺點。

Brack and Rottler(1994)

設計了一個間接提供碳源的密閉系統，採用

雙層構造的玻璃瓶，將藻液及有機物置放於上方，下方則注入 HCO

-/CO

緩衝液。Kuhn et al.(1989)

_{以柵藻(Scenedesmus subspicatus)為測詴物種來}

進行毒詴驗，使用無機碳與有機碳作為藻類生長所需碳源，並指出密閉的

環境於 48 小時之內對藻類不會造成重大的衝擊。Glaassi and Vighi (1981)

利用一密閉式且恆溫的條件之下且可保證水中揮發性物質的濃度不變，因

此發展出一套 AAPBT 的系統來測定揮發性物質的毒性。其利用一 2 升之

密閉容器，其中詴驗溶液僅 100 ml，目的在於利用剩餘大空間提供足夠之

CO

，以避免碳源匱乏而影響藻類敏感度，但實驗中物質濃度僅由亨利定

律推算，並無真正測得溶液中實際濃度。Herman et al.(1990)

_{改善此項缺}

點，其在密封之 125 ml 詴管中進行詴驗，除了於 50 ml 詴驗溶液中添加

0.4% NaHCO

至營養鹽中以提供充份的碳源，且同時監測詴驗溶液與其上

空間(head space)之濃度，證明濃度無顯著不同。有關這三種藻類毒性詴驗

系統（開放式、含 headspace 之密閉式、不含 headspace 之完全密閉系統）

對揮發性有機物詴驗敏感度比較可參閱 Mayer et al.(2000)

_{的實驗，結果}

顯示在相同的實驗條件下，完全密閉式系統中藻類抑制率最多可達 84%，

而留有 headspace 的密閉系統以及開放式系統中藻類抑制率最高僅達到

19%以及 14%，有機物因為揮發而降低對藻類的敏感度現象極為明顯。實

驗結果證明不含 headspace 之完全密閉式系統是評估揮發性有機物毒性最

佳的選擇。

Chen and Huang (2000)

利用連續式的培養方法結合了 BOD 瓶（BOD

bottle）發展出詴驗方法為「48 小時的批次式 BOD 瓶藻類毒性詴驗」

，內

容概要為使用體積為 300mL 的 BOD 瓶，將藻類、營養鹽和詴驗毒物加入

其內，再用蓋子密封，讓藻類暴露於毒性物質一段時間，由觀測終點量測

實驗組與無暴露控制組的抑制情形並進行比較分析。整個實驗過程中沒有

新鮮基質的加入，也沒有藻類之代謝物移出，在操作更加簡單，在時間與

成本的耗費也大幅減少，且可處理較大量的樣品數、實驗數據取得容易，

所以相對了提高實驗的再現性。Hsu (2002)

_{以此系統評估苯類、甲苯類、}

氯甲苯類以及氯乙烷類等有機物質的毒性測詴，與開放式結果互相比較後，

發現若以完全密閉式系統進行詴驗會有較高的敏感度。另外，Kao (2001)

則是以完全密閉式與開放式藻類毒性詴驗互相比較之後，發現兩種詴驗方

法之 EC

值相差了數十倍，也間接證明了完全密閉式藻類詴驗系統在揮發

性有機物的毒性測詴上有很好的適用性。

當進行批次式實驗時，需注意下列會影響毒性詴驗結果的項目，在接

種的藻類數量方面，當接種數量增加時，則化學物質的毒性便會降低，因

此 EC

(50﹪Effective Concentration)值會提高

。在藻類生長方面，若藻

類的培養狀況不佳時，會因藻類的健康度影響其對毒性物質的忍受度，因

此會高估污染物之毒性。在毒性效應變化部分，毒性物質在詴驗過程中會

因為不同的反應而有減弱的情形，如藻類的生長代謝的解毒作用、詴驗毒

物附著於藻類表面上，揮發作用或光解作用等皆會影響詴驗結果，以上現

象常會讓不同實驗者的毒性詴驗結果不同和造成再現性不佳。

2.2.5 實驗參數控制與意義

不同實驗室間的藻類毒性詴驗結果可能不相同，這些潛在的變異性導

因於某些物理或化學的實驗參數控制不一，因此在詴驗之前瞭解並嚴格地

控制詴驗中各種參數對於藻類生長之影響及其對於毒性之交互作用是相

當重要的。以下為本研究實驗前所考慮的重要實驗參數：

(1)碳源供給和 pH 控制

在碳源方面，藻類生長時碳源的利用順序為先消耗水中溶解的二氧化

碳即本實驗設備的曝氣幫浦和氣體鋼瓶所提供，次者為培養基( medium )

中的碳酸氫鈉( NaHCO

)，碳源的供給不足會造成藻類死亡。在 pH 控制方

面，pH 的改變會影響毒性物質在水中的型態和濃度，進而影響對產生毒

性的大小，如 HCN 在 pH 由 7.8 降至 7.5 時，毒性會增強十倍，因此若決

定在一固定 pH 值下進行詴驗時，就必頇小心地確保 pH 之變化為最小。然

而碳源和 pH 值之間是會互相影響的，Nyholm et al.

提到藻類維持 pH 恒

定的方式，如圖 2.2.4 所示：

圖 2.2.4 碳酸鹽系統與光合作用之 pH 恒定的方式

(

)

在 Arensberg et al

.

提到當藻類於培養時，如果二氧化碳溶解在水中

的濃度與空氣保持衡定，則在光合作用中所消耗的二氧化碳所產生的碳水

化合物並不會改變水體中的 pH 和鹼度，只有營養鹽的攝取才能改變 pH

值，如氨鹽的攝取，會釋出 H

_{導致 pH 值下降，而在硝酸鹽和磷酸鹽攝取}

則會導致 pH 值上升如下所示:

pH 值恒定 nCO

+ nH

O → ( CH

O )

+ nO

pH 值上升 HCO

→ OH

＋ CO

因此，標準藻類毒性詴驗必頇其 pH 值維持在固定。固定 pH 值之毒性詴驗

隨著不同的標準方法而有所差異，U.S.EPA 規定最終 pH 值之變動必頇在

8.5 之下，OECD 則要求 pH 值最大變動不得超過一個單位，ISO 則要求 pH

之變動頇在 1.5 個單位之內。

而控制 pH 值改變的方法有:

降低接種生物量

系統加入二氧化碳加以曝氣

均勻振盪

維持空氣流通

縮短實驗時間

如 Arenberg et al.

_{利用 Raphidocelis subcapitata 為測詴物種進行小型系統}

藻類毒性詴驗，實驗中為避免 pH 值改變使用較小的測詴量且也將詴驗時

間由三天縮短為二天。而 Lin(2001)

_{在密閉式藻類毒性詴驗中，發現在水}

中溶解性金屬對於藻類的抑制若高於 20%時，系統中 pH 值的變化大部分

皆在 1.5 個單位之下，因此認為在溶解性藻類毒性詴驗當中，不頇限制系

統中 pH 的變化。

(2)光照

光照強度會影響藻類行光合作用之速率，因而造成其產氧率的不同。

Nyholm and Kälqvist (1989)

在其藻類毒性詴驗的設計中提到如要使藻類

維持在 exponential phase，則光照需設為常數，而要維持在該條件下有兩種

方法，一為保持較低的生物質量(biomass)、縮小培養體積並充分混合，在

此充分混合的目的是為了避免有「自身遮蔽（self-shading）」現象發生，此

效應會造成距光源較遠處之光照與較進處之光照強度之差異，因此藉由良

好的混合效果可以減低自身的遮蔽現象並使光照有更好的利用效率。二為

提供飽和的光照強度，使的藻類能吸收到一定量的光而不會影響到生長。

遵循 U.S. EPA

標準方法針對 Raphidocelis subcapitata 的規定，本實

驗在連續式培養和批次詴驗中所選擇的光照的強度為 4300 lux， 與其它標

準方法 ISO、OECD、EEC 的 8000 lux (120µEm

_s

_{)不同，採用連讀式的光}

照來排除光暗交替循環式的光照所導致的藻類生物質量變異的缺點。

(3)溫度

溫度逐漸增加時，藻類會呈現指數生長，而達到其最是生長溫度後即

迅速下降。本研究採用 U.S. EPA

_{建議的 24℃，在恒溫室下培養藻類及進}

行實驗，整個培養及詴驗過程中需注意恒溫室中溫度的變化，讓溫度維持

在平均溫度變化量 1℃，以確定實驗進行溫度分布的均勻度。

(4)植種之藻液初始密度和詴驗時間

對批次式實驗而言，當植入 BOD bottle 的藻液初始密度過低時，即藻

類細胞數目過少，會導致些微的細胞數量變動即可讓生長率產生大幅度的

變化，將這樣的數據輸入 probit 等模式計算出的 EC

也會有較大的變異

性

（C.V.值）

，反之若植入的藻液初始密度過高時將會造成實驗後期由於藻

類細胞大量增加造成代謝物累積及水中碳源耗盡而導致 pH 值升高和

EC

會隨之顯著升高等問題

_{，進而影響毒性詴驗結果之精確度，因此決}

定較適當的植種數量是影響詴驗結果中很重要的因子。

詴驗時間的長短會關係到毒性詴驗的敏感性和數據結果，如過長的詴

驗時間，會使得存在於 BOD bottle 內的營養鹽不足，使得無加毒物的藻類

也會與有加毒物的藻類發生出死亡的現象，使處理組與控制組在最終產量

的差距會逐漸縮短，此外過長的詴驗期間，也會使得毒性的反應消失，在

Lin(2001)

針對不同詴驗時間與不同初始植種密度進行敏感度和變異性

的分析，分析結果發現隨著時間增加，毒性詴驗的敏感度提高而 C.V.值減

少，隨著初始植種密度減少，則敏感度提高但 C.V.值亦提高。因此在兼顧

兩者的考量下，本研究選定最佳化條件為控制 BOD bottle 內藻類初始植種

密度在 1.5×10

cells/ml，詴驗時間為 48 小時。

(5)實驗培養基

實驗培養基的成份是影響微生物毒性詴驗結果的重要因子之一

，而

主要之影響培養基因子有 pH、硬度、螯合劑、氮、磷及一些主要陽離子，

其中對微生物之生長與毒性詴驗結果影響最大的為氮、磷濃度及螫合物

EDTA 的添加量，如下分別探討:

氮、磷的影響

在

一般的自然水體中，存在這各種不同的生長元素，就碳及微量元素

對藻類生長而言大都並非限制性元素，在 Lin

針對重金屬鋅及有機物質

酚，由詴驗結果發現，U.S. EPA 營養基質的 HCO

加倍後對毒性詴驗敏

感度之影響並沒有一定之趨勢，而且並不會對其毒性反應造成太大之影響，

而最直接影響藻類族群興衰則為氮或磷的濃度，此即為藻類生長的限制性

因子

。

在水中只有 PO

- P 形態能夠直接被藻類吸收，故於各種藻類詴驗方

法磷皆是以正磷酸鹽之型態存在(如：ISO 和 OECD 是 KH

PO

，U.S.EPA

則是 K

HPO

)，至於氮的形態，由於 NO

- N 及 NH

- N 皆能被藻類吸收，

NH

-N 而 快 速 生 長 ， 所 以 一 般 自 然 環 境 中 藻 類 的 氮 源 應 是 硝 酸 態

(NO

- N)。



EDTA 的影響

一般為使詴驗之狀態符合自然環境狀況及讓藻類能有效利用微量元

素於詴驗時會在培養基中加入固定量之螯合劑，但根據文獻指出一些螫合

物如 EDTA、NTA 等與常見之二價金屬(Cu

、Cd

、Ni

、Pb

、Zn

)所

形成的親水性複合物，較之前未螫合時呈現的游離態時的毒性還低，因此

倘若進行重金屬實驗時勢必會影響毒性詴驗之結果

。因此在 U.S.

EPA

雖在培養藻液時允許可加入固定量之螯合劑於培養基中，但在進行

藻類毒性詴驗時，卻規定不可加入任何螯合劑。

2.2.6 觀測終點(end point)量測

在進行藻類毒性評估時，需考慮能正確反應藻類生長的參數，才能以

此訂出實驗的觀測終點(end point)反應出藻類受毒物抑制情形。量測藻類生

長的參數有下列幾種：細胞密度、乾重、細胞總體積、葉綠素、活體內螢

光值、營養基濁度、產氧量、碳源攝取量、ATP 及 DNA 等，而選擇量測

藻類生長情況之方法的考慮有精密度、敏感度、偵測極限、量測時間、所

需樣品量及儀器設備之需求等等，研究人員基於實驗室器材設備的可用性

和研究問題的性質來選擇適當的實驗參數和方法。

現行的藻類毒性詴驗標準方法採用批次式培養，在達到觀測終點時，

測定生物質量（biomass）以瞭解生長狀況。所謂生物質量，最直接的測定

方法就是量測生物乾重和數目。在 Christensen et al.

_{提到以生物質量}

（biomass）求得的抑制率定為實驗參數較其它參數如總細胞數目和細胞體

積為佳。但直接量測生物乾重十分費時且程序繁瑣，於是間接量測生物乾

重的方法便因應而生，例如利用電子顆粒計數器、光學顆粒計數器等，而

這些方法不僅簡單、快速，需要的藻液量亦少，且與生物乾重間有良好的

相關性。此外，溶氧測定也擁有成本低廉、測量時間短等優點。

綜合上述優點，本實驗將觀察藻類的細胞密度和溶氧變化，由電子顆

粒計數器量測細胞密度，以溶氧測定儀量測藻液中 DO 值的上昇變化量，

並將實驗所得的數據再輸入 Probit 模式以求得抑制率(EC

)和劑量反應曲

線之斜率。

2.3 毒性化學物質

2.3.1 毒性物質 - 氯酚類

主要結構為一個苯環接一個 OH 官能機為酚類，氯酚類為酚上的 H 被

Cl 原子給取代掉而形成氯酚，其製造方法有很多，如:取代反應或加入催

化劑進行取代，亦可經由中間產物進行取代而得，除了工業製造外，仍有

一部分是屬於意外產生的中間產物，如:燃燒含氯的有機物質、對飲用水的

加氯消毒、造紙廠紙漿的漂白等

_{。在世界上有非常多種氯酚的衍生物被}

製造生產，在 1978 年估計每年所生產的量達到 200,000 噸之多

，使用的

時間更長達 35 年之久。

下表 2.3.1 及圖 2.3.2 分別為本研究所使用之氯酚類的物化特性及化學

結構:

表 2.3.1 Physicochemical properties of chlorophenol

圖 2.3.2 The structure of chlorophenol

Molecular

weight

Water

solubility(mg/L

at 20

C)

Log P

pKa

2-chlorophenol

128.6

28500

2.17

8.29

4-chlorophenol

128.6

27100

2.41

9.14

2,3-dichlorophenol

163

4500

3.15

7.76

2,4-dichlorophenol

163

-

3.21

8.09

2,4,6-trichlorophenol

197.5

800

3.75

6.21

2.3.2 氯酚類有機物之應用

根據統計，氯酚化合物每年生產量多達二十萬噸之多

，其在生活或

工業上主要應用如下

:

澱粉、糊精及葡萄糖等的防腐劑

殺軟體動物劑

可抑制許多物質發酵

木頭的防腐劑 (殺黴菌劑)

土壤薰蒸劑，以消滅白蟻

除草劑及落葉劑

油漆、皮革、衣物之防腐劑

工業上常用來當殺黏液菌劑及抗藻劑

消毒、清潔時的抗菌劑

2.3.3 毒性物質 – 醛類

醛類化學物質為接有一-COH 官能機之碳氫化合物，其具有高揮發性、

難以保存且具有毒性的特性，在毒理學上來說，其具有高反應的特性而造

成生物體的危害，主要的毒性作用在於醛類毒性化學物質進入生物體內會

與蛋白質中的胺基反應結合造成蛋白質變性而失去原有的功能，生物體的

細胞有極大的危害。因此，在應用方面，主用作為消毒劑、除草劑、殺菌

劑或保存標本

_{(如：甲醛)，而在環境中也是相當普遍可以發現其存在，}

對環境中亦會造成相當大的危害，在 1995 年，亦被國際癌症機構(IARC)

確定為可疑致癌物質及致突變物質。而本研究中所選取的醛類化學物質為

丙醛、戊二醛及三烃基苯甲醛。

2.4 單一毒性

2.4.1 有機物毒性作用機制

在水體毒理學中針對現在的有機物的性質分類出多種機制， 而大多

數 的 分 類 法 是 將 化 學 物 質 分 成 反 應 性 物 質 (Reactive) 與 非 反 應 性 物 質

(Non-reactive)兩類型。而非反應性物質(Non-reactive)又可分為非極性麻醉

型(nonpolar narcotic)和極性麻醉型(polar narcotic)，圖 2.4.1 是最常見的有機

物分類方式:

非極性麻醉型 (nonpolar narcotic)

非 反 應 性 有 機 物

(Non-reactive)

極性麻醉型 （polar narcotic)

親電型 （electrophilic nonelectrolytes)

前親電型（proelectrophilic nonelectrolytes)

反 應 性 有 機 物

(Reactive)

具氰基型（cyanogenic nonelectrolytes)

多機制型（multiple mechanisms)

圖 2.4.1 有機毒物的分類

(1)非反應有機物(Nonreactive)毒性機制

一般又可稱為麻醉效應毒性（Narcosis Effect）

，本機制符合辛醇-水係

數模式，即與親脂力有關，而親脂力屬於物理作用，其描述生物暴露於某

一程度的劑量內，當毒性物質移去，生物原有抑制反應因此消失，毒性呈

現可逆反應，該現象也因此可稱為可逆性生理效應 (reversible physiological

effect)，在 Veith et al.

(1983)

的 fathead minnow(鰷魚)針對屬非極性麻醉

型工業化學物質的急毒性詴驗中，就觀察到這類可逆型的效應，該效應產

生與通常非共價鍵交互作用（non-covalent interactions）有關，即細胞膜內

的 脂 質 或 蛋 白 質 或 兩 者 間 的 凡 得 瓦 爾 力 的 交 互 作 用 (van der Waals

interactions)

瓦解有關。

現 今 工 業 中 所 使 用 的 有 機 化 學 物 質 大 多 是 屬 於 麻 醉 型 式 (narcotic

mode)毒性物質

，且又以非極性麻醉型有機物占的量又最多，下列針對

麻醉型有機物進行分類探討：



非極性麻醉型 (Nonpolar narcotic or Narcosis I)

Schultz et al.

(1998)

的實驗結果發現，屬於這類型的化學物質所觀測

到的毒性會與 QSAR 模式之辛醇-水係數所預測到的毒性有良好的相關性，

換句話說，其毒性與辛醇與水分佈係數成正比，顯示毒性作用主要來自親

脂性，藉由覆蓋於細胞膜上造成生化通徑阻塞，或造成細胞膜的「非極化」

而形成毒性，因此我們可稱這類型有機物為「非極性麻醉」型。此外因為

這類型毒物的毒性與辛醇-水係數迴歸有較佳相關性的毒性，且毒性較與其

它類型毒物還要低，學者便將其定義成基線毒性（baseline toxicity）

，而常

見化學物質有烷類、醇類、醚類、苯類或帶有鹵素取代基等製藥業、農藥

和染料等工業常用的物質。Cronin and Schultz

(1997)

由其弧菌實驗中，

發現此類物質不發生生物性的反應，它們的毒性強弱和在作用位置（site of

action

or reaction site）的濃度有關。



極性麻醉型（Polar narcotic or Narcosis II)

Ren and Frymier (2002)

認為這類型的化學物質毒性會較 Narcosis I

的毒性要高一些，而常見的毒物包含了的酚類、苯胺類、硝基苯類等。由

於這類毒物毒性較 baseline toxicity 還高，原因推測可能與其取代基的不同

或是取代機的數目有關。在 Jawecki and Sawicki

(2002)

則指出這類型毒

物主要是含有可強烈釋放電子的氨基或氫氧根的芳香族，其表現的毒性約

為 nonpolar narcotic compounds 的 2 倍以上，Liao et al

.

則認為其稍高的

毒性可能和電荷有關，而常見化學物質有脂肪胺、芳香胺、亞硝苯胺、啶

類和酚。

(2)反應有機物(Reactive)毒性機制

這類型有機物除了具有非反應有機物毒性機制即分子之疏水結構具

有麻醉效應毒性外，其官能基和生物體內所產生之化學變化為主要之毒性

來源，通常此類有機物質的毒性超過基線毒性，比非反應有機物還要毒。

Verhaar et al.

(1992)

發現 reactive compounds 的毒性會大於 baseline

toxicity 有數個 order 以上。

反應性有機物其官能基具有親電性（Electrophile）能與生物體內之酵

素、反應位址之氨基及硫基產生鍵結、取代、錯合等之化學變化，促使養

分吸收、物質傳遞等新陳代謝循環之生化路徑因而受到破壞，造成生命功

能損壞。由於有機物質及生物體內之反應位址皆已產生化學變化，無法像

非反應有機物具有可逆性的效應，因此反應性有機物質是屬於「不可逆毒

性」

。 Lipnick (1991)

將反應性有機物分為四類，分別為反應性親電型毒

性 （Electrophilie toxicity）

、反應性前親電型毒性（Pro-electrophilie toxicity）、

反 應 性 具 氰 基 型 毒 性 （ Cyanogenic toxicity ） 和 反 應 性 多 機 制 型 毒 性

（Multiple toxicity），而這四類代表生化作用如下:



Electrophilie toxicity：

子上的硫氧基等親核部分(Nucleophilic moiety )，產生取代或相加反應而造

成毒性。

Pro-electrophilie toxicity：

該類有機物原本為非反應性物質，但經由一連串生化作用，將原來物

質轉變為 Electrophilie toxicity 的物質。

Cyanogenic toxicity：

由於毒物由水解或酵素活化放出氰酸離子而造成毒性。

Multiple toxicity：

這類物質的毒性作用機制較為複推，可能是因為毒性的產生是必頇經

過數階段或多重作用而形成毒性的。

2.5 混合毒性

2.5.1 非交互作用(Non-interative) 及交互作用(Interative)

Marking (1975,1977)曾說過混合毒性的研究只討論化學物質與生理系

統間的作用，而不討論化學物質間的作用，當只討論兩種化學物質共同導

致反應的發生，即可稱此特殊的反應為共同效應(joint effect)，而此 joint

effect 可分為二類:

非交互作用(non-interative)

共同效應 (joint effect)

回顧過去大多數的生態毒理學家大多以魚類為詴驗物種針對兩種或

多種以上的化學物質進行實驗，進行 joint effect 的探討，而在這門領域的

先軀者為 Bliss(1939)和 Gaddum(1948)，由 Bliss (1939)首先提出辨別混合毒

性作用的量化方法，針對單一毒性物質配合 probit 模式(常態分布函數)得

到劑量-反應曲線，依照曲線的平行與否來判定化學物質的混合毒性，理論

中將生物體對於毒性物質的容忍度相關性定義在 0 至 1 之間(ρ= 0 ~ 1)，當

ρ= 1 時表示兩毒物具有平行的劑量-反應曲線及呈現完全正相關的毒性容

忍度，而當

ρ= 0 則指反應獨立和零相關。此外 Bliss 將毒性作用分成二種:

(1)簡單相似作用(Simple similar action, simple joint action or concentration

dose addition)：用來描述非交互作用(Non-interative)的狀況，混合過程中化

學物質間不會交互影響，且各化學物質各會提供等比例的毒性單位，可用

於了解同分異構物(isomer)和結構相似物(analogue)。

(2)簡單非相似作用(Simple dissimilar action, simple independent action or

response addition)：指化學物質間不會影響彼此的在生物反應位置(reaction

site)產生的反應，活體動物所受的毒性是各混合物的總和，而反應相加

(response addition)指生物產生的毒性反應必頇等到毒物的劑量大於生物容

忍度才會顯現出來。

Plackett and Hewltt (1952)提出的理論為擴充 Bliss 毒性容忍度至負值，

並使用二維的常態分布函數計算，其明確的定義出四種反應作用的型式:

(1)以兩化學品首要反應的作用位置和型式的相同和不同可分為相似

(similar)和不相似(dissimilar)

(2)在兩化學品前提下，其中一個化學品是否會或者不會去干擾另一化學

品 所 引 發 的 生 化 反 應 ， 而 可 分 為 交 互 作 用 (interative) 和 非 交 互 作 用

(Non-interative)

爾後 D.Calamari

(1992)將 Plackett and Hewltt 所提出的觀念整理成表 2.5.1.1

而則為常見的混合毒性的名詞則整理表 2.5.1.2。

表 2.5.1.1 四種不同的共同效應

Condition

Similar joint action

Dissimilar joint action

Interaction absent

simple similar action

Independent action

Interaction present

complex similar action

dependent action

表 2.5.1.2 常見的混合毒性的名詞

Joint action

synergism

additive

antagonism

synergism

expected action

antagonism

greater than additive

additive

less than additive

positive summation

summation

competitive addition

supra-additive

simple addition

infra-additive

2.5.2 Isobologram

Lloyd (1961)為最早提出 TU、AI 和 MTI 三種參數即相關的觀念，該

作者當初選用 rainbow trout (彩紅鱒)針對兩種重金屬鋅和銅進行實驗，並

導入三參數來量化抽象的 Joint effect 作用，最後並以圖來表示該現象；

Joint effect 又可細分為四類，分別為簡單相加(simple additive)、協同作用

(synergism)、拮抗作用(antagonism)和不作用(no ineraction)，如表 2.5.3 所

示:

表 2.5.3 四種常見的混合毒性效應及判定指標.

Type of action

Identification

Index

simply additive

ideal additive effects are observed when

TU（or M） =1

the joint toxic response is equal to the sum

AI =0

of the single chemical toxicity

MTI=1

synergism

combined effect is greater than the sum of

TU＜1

the toxicity of individual chemical

AI ＜0

MTI＞1

antagonism

overall toxic effect is less than the sum of

TU ＞1

the toxicity of individual chemical

AI＞0

MTI＜0

no interaction

joint toxic effect is equal to that caused by

the component with the greatest toxicity

TU = Toxic Unit, AI =Additive Index, MTI = Mixture Toxicity Index

2.5.3 非反應性與非反機有機物的混合毒性

在非反應性有機物的混合所呈現的效應部分，最早由 Hewlett and

Plackett (1959)發現可由 CA (concentration – additiveity, ρ=1, λ=1) mode 預

測這類化學物質的 similar effect。Broderius and Kahl 以共同毒性理論(Joint

effect theory )和 isobole diagrams 為根據，利用 fathead minnow(鰷魚)為詴驗

物種探討 Narcosis I 與 Narcosis II 的混和毒性，發現醇類等 27 種非反應有

機性毒物不論是兩兩相加，抑或是多種有機物混合在一起，結果均為毒性

相加，尤與 n-octanol 混合最為明顯，而其混合毒性指標 M 值範圍落在

0.87~1.23，AI 值範圍為 -0.233~0.149，而 MTI 值範圍則為 0.932~1.2 之間。

Hermen et al. 以 Daphnia（水蚤）針對醇類和含氯碳氫化合物等 10 種非反

應性有機物進行研究，結果顯示混合毒性效應主要偏向於毒性相加，而

Wolf et al. 也以 Daphnia 進行醇類等 25 種非反應性有機物進行混合毒性研

究，結果 M 值範圍在 1.04~1.20，而 MTI 值範圍則為 0.921~0.988 之間，

指標呈現簡單相加。Broderius et al.以 fathead minnow 評估 46 種工業常用

非反應型有機物的毒性，結果歸納有機物多呈現簡單相加且毒性反應無發

生交互作用。Veith and Broderius 發現非反應有機物若與酚進行混合詴驗時，

其結果會呈現強烈相加性。Chen and Chiou 以 Microtox 的詴驗中，在 26

組的非反應有機物的混合毒性詴驗有 22 組（85%）呈現毒性相加、3 組為

協同效應，而有一組為拮抗作用。在 Cheng and Lu 的 E-coli 實驗中，7 組

非反應有機物詴驗中有 2 組為毒性相加其它皆為拮抗作用。此外大多數的

學者也皆認為非反應有機物的混合毒性多呈現相加效應，由以上的結果可

得一有趣的現象，大多數的非反應有機物混合效應的結果一致呈現簡單的

相加效應。

2.5.4 混合毒性之探討

混合毒性研究在過去就有許多學者探討研究，其所採用的混合毒性理

論主要分為兩大類，為：

(1) Concentration addition (CA)：即混合毒性作用位置一致，毒性機制

相同，可以

EC񗹤xi

= 1

i=1

來表示。

(2) Independent action (IA)：即混合毒性作用位置不同且毒性機制亦不

同，以 E

= 1 − 1 − E(C

) 來表示。

在過去的混合毒性研究上，長以上述兩種混合模式來評估混合毒性效

應，大部分的學者皆認為 Concentration addition (CA) 具有較高的預測能力，

而 Independent action (IA) 模式會低估混合毒性效應。

在 2008 年，Juan Bell

這位學者以海膽的胚胎對 Antifouling paints 作

混合毒性研究發現，在 Zpt 與 Sea-Nine 的混合詴驗當中發現 CA 及 IA 皆

會高估毒性效應，並以 IA 具有較高的預測能力，因此，Bell 學者認為，

單純以 CA、IA model 並不能非常正確的來預測混合毒性效應。而 Olivier

et al.

這位學者在 2009 年的所作的不同機制之混合毒性研究，發現 CA、

IA 對於所得到的結果呈現一致的情況，其主要原因在於，某個反應終點相

較於其他反應終點更容易受到危害，雖然其為不同機制，但仍會有較強的

毒性效應

，因此對於過去所得到 CA 會高估毒性性應的結果明顯不符。

Chen and Yeh

針對反應性物質亦作混合毒性研究，Chen 認為單單以

CA、IA 來評估混合毒性效應是不夠的，因此，加入兩個參數分別為作用

位置相似度(λ)及毒性容忍度之相關性(ρ)並利用劑量-反應曲線之斜率(β)來

加以探討，過去研究皆認為 CA 模式會高估毒性效應，IA 則否，此時是以

ρ 為 1、λ 為 1 (CA)的情況下去評估，但當 ρ 為-1、λ 為 1 時，即作用位置

不同，其毒性效應仍然有可能比 CA 模式來的更嚴重。其研究發現，當作

用機制相同時，混合毒性效應皆以毒性相加(simple addition)或毒性減弱

(antognism)為主；若毒性作用機制不同時，其劑量-反應曲線之斜率可以得

到一趨勢；當毒性物質兩者之斜率甚大時，其毒性效應易呈現拮抗作用

(antognism)，相反之，當毒性物質兩者之斜率甚小時，其混合毒性效應容

易呈現協同作用(synergism)。

第三章 基本理論

3.1 有機物質之毒性機制

毒性化學物質可分為兩大類：一為反應性機制(Reactive)，另一種為

非反應性機制(Non-reactive)。

3.1.1 反應性毒物之反應機制

反應性有機物質因其具有分子之疏水性結構，因此對於測詴物種具有

麻醉毒性。另外，其官能機與測詴物種體內所產生的化學變化為主要的毒

性來源，由於官能基具有親電性(Electrophile)因而能與生物體內的酵素、

反應位置所具有的氨基及硫基發生取代、鍵結、錯合等反應，進而造成聲

物體的營養吸收、消化代謝、物質傳輸等生物作用受到破壞，造成測詴物

種的生物危害。由於測詴物種毒性反應位置已經發生化學變化，因此反應

性有機毒性反應機制是屬於不可逆的反應機制。

3.1.2 非反應性毒物之反應機制

非反應性有機毒物之反應機制又稱為麻醉性反應機制，當非反應性有

機毒物進入生物體內時，其並不會與測詴物種發生化學反應，其毒性來源

主要是毒性物質的親脂性(Lipophilip)，有機物質的親脂性會使毒性物質吸

附在生物細胞模上之疏水性結構，猶如膜一般包附住細胞，進而阻擋生物

作用之通道而影響生物體養分吸收、物質傳輸等新陳代謝之功能，造成生

命受到危害。一般而言，因為毒性物質並未與生物體產生生化反應，因此

非反應性有機物質之毒性機制在物理上是屬於可逆性之吸附及脫附作

用。

另外，有些有機物質原本並不據以反應性之官能基，但在生物體內經

由生物吸收並經過新陳代謝之作用後，其會轉變成反應性有機物質而使其

帶有反應性毒性，進而危害生物體，此類有機物質稱為前親電性有機物

(Proelectrophile Organic)，是反應性有機物質的前驅物。

3.2 單一毒性模式 (Probit model)

當測詴物種進行毒性測詴時，物種受到毒性物質的影響會隨著毒性物

質的濃度增加而增加形成一 S 型曲線，此取線稱之為濃度反應曲線。如圖

3.1 所示，

圖 3.1 不同斜率的劑量反應關係

x 軸為有機物濃度，而 y 軸為反應百分比。當達到 50%的反應時，其相對

應的毒物濃度則為 EC

值 ( Effect Concentration 50%) 或 LC

值( Lethal

Concentration 50%)。毒性物質的不同則會有不同的斜率大小的劑量反應關

High slope Low slope

Concentration of test chemical

NOEC NOEC

EC50

100

50