Isobologram

第二章文獻回顧

2.5 混合毒性

2.5.2 Isobologram

Lloyd (1961)為最早提出 TU、AI 和 MTI 三種參數即相關的觀念，該作者當初選用 rainbow trout (彩紅鱒)針對兩種重金屬鋅和銅進行實驗，並導入三參數來量化抽象的 Joint effect 作用，最後並以圖來表示該現象；

Joint effect 又可細分為四類，分別為簡單相加(simple additive)、協同作用 (synergism)、拮抗作用(antagonism)和不作用(no ineraction)，如表 2.5.3 所示:

表 2.5.3 四種常見的混合毒性效應及判定指標.

Type of action Identification Index

simply additive ideal additive effects are observed when TU（or M） =1 the joint toxic response is equal to the sum AI =0

of the single chemical toxicity MTI=1 synergism combined effect is greater than the sum of TU＜1 the toxicity of individual chemical AI ＜0

MTI＞1 antagonism overall toxic effect is less than the sum of TU ＞1

the toxicity of individual chemical AI＞0 MTI＜0 no interaction joint toxic effect is equal to that caused by

the component with the greatest toxicity

TU = Toxic Unit, AI =Additive Index, MTI = Mixture Toxicity Index

2.5.3 非反應性與非反機有機物的混合毒性

在非反應性有機物的混合所呈現的效應部分，最早由 Hewlett and Plackett (1959)發現可由 CA (concentration – additiveity, ρ=1, λ=1) mode 預測這類化學物質的 similar effect。Broderius and Kahl 以共同毒性理論(Joint effect theory )和 isobole diagrams 為根據，利用 fathead minnow(鰷魚)為詴驗物種探討 Narcosis I 與 Narcosis II 的混和毒性，發現醇類等 27 種非反應有機性毒物不論是兩兩相加，抑或是多種有機物混合在一起，結果均為毒性相加，尤與 n-octanol 混合最為明顯，而其混合毒性指標 M 值範圍落在 0.87~1.23，AI 值範圍為 -0.233~0.149，而 MTI 值範圍則為 0.932~1.2 之間。

Hermen et al. 以 Daphnia（水蚤）針對醇類和含氯碳氫化合物等 10 種非反 應性有機物進行研究，結果顯示混合毒性效應主要偏向於毒性相加，而 Wolf et al. 也以 Daphnia 進行醇類等 25 種非反應性有機物進行混合毒性研 究，結果 M 值範圍在 1.04~1.20，而 MTI 值範圍則為 0.921~0.988 之間，

指標呈現簡單相加。Broderius et al.以 fathead minnow 評估 46 種工業常用 非反應型有機物的毒性，結果歸納有機物多呈現簡單相加且毒性反應無發生交互作用。Veith and Broderius 發現非反應有機物若與酚進行混合詴驗時，

其結果會呈現強烈相加性。Chen and Chiou 以 Microtox 的詴驗中，在 26 組的非反應有機物的混合毒性詴驗有 22 組（85%）呈現毒性相加、3 組為協同效應，而有一組為拮抗作用。在 Cheng and Lu 的 E-coli 實驗中，7 組非反應有機物詴驗中有 2 組為毒性相加其它皆為拮抗作用。此外大多數的學者也皆認為非反應有機物的混合毒性多呈現相加效應，由以上的結果可得一有趣的現象，大多數的非反應有機物混合效應的結果一致呈現簡單的相加效應。

2.5.4 混合毒性之探討

混合毒性研究在過去就有許多學者探討研究，其所採用的混合毒性理

論主要分為兩大類，為：

(1) Concentration addition (CA)：即混合毒性作用位置一致，毒性機制相同，可以 ^Cⁱ

EC_񗹤_xi = 1

ni=1 來表示。

(2) Independent action (IA)：即混合毒性作用位置不同且毒性機制亦不同，以 E_mix = 1 − 1 − E(C_i) 來表示。

在過去的混合毒性研究上，長以上述兩種混合模式來評估混合毒性效應，大部分的學者皆認為 Concentration addition (CA) 具有較高的預測能力，

而 Independent action (IA) 模式會低估混合毒性效應。

在 2008 年，Juan Bell^[67]這位學者以海膽的胚胎對 Antifouling paints 作混合毒性研究發現，在 Zpt 與 Sea-Nine 的混合詴驗當中發現 CA 及 IA 皆會高估毒性效應，並以 IA 具有較高的預測能力，因此，Bell 學者認為，

單純以 CA、IA model 並不能非常正確的來預測混合毒性效應。而 Olivier

et al.

^[68]這位學者在 2009 年的所作的不同機制之混合毒性研究，發現 CA、

IA 對於所得到的結果呈現一致的情況，其主要原因在於，某個反應終點相較於其他反應終點更容易受到危害，雖然其為不同機制，但仍會有較強的毒性效應^[66]，因此對於過去所得到 CA 會高估毒性性應的結果明顯不符。

Chen and Yeh^[69]針對反應性物質亦作混合毒性研究，Chen 認為單單以 CA、IA 來評估混合毒性效應是不夠的，因此，加入兩個參數分別為作用位置相似度(λ)及毒性容忍度之相關性(ρ)並利用劑量-反應曲線之斜率(β)來加以探討，過去研究皆認為 CA 模式會高估毒性效應，IA 則否，此時是以 ρ 為 1、λ 為 1 (CA)的情況下去評估，但當 ρ 為-1、λ 為 1 時，即作用位置不同，其毒性效應仍然有可能比 CA 模式來的更嚴重。其研究發現，當作用機制相同時，混合毒性效應皆以毒性相加(simple addition)或毒性減弱 (antognism)為主；若毒性作用機制不同時，其劑量-反應曲線之斜率可以得到一趨勢；當毒性物質兩者之斜率甚大時，其毒性效應易呈現拮抗作用 (antognism)，相反之，當毒性物質兩者之斜率甚小時，其混合毒性效應容易呈現協同作用(synergism)。

第三章基本理論

3.1 有機物質之毒性機制

毒性化學物質可分為兩大類：一為反應性機制(Reactive)，另一種為非反應性機制(Non-reactive)。

3.1.1 反應性毒物之反應機制

反應性有機物質因其具有分子之疏水性結構，因此對於測詴物種具有

麻醉毒性。另外，其官能機與測詴物種體內所產生的化學變化為主要的毒性來源，由於官能基具有親電性(Electrophile)因而能與生物體內的酵素、

反應位置所具有的氨基及硫基發生取代、鍵結、錯合等反應，進而造成聲物體的營養吸收、消化代謝、物質傳輸等生物作用受到破壞，造成測詴物種的生物危害。由於測詴物種毒性反應位置已經發生化學變化，因此反應性有機毒性反應機制是屬於不可逆的反應機制。

3.1.2 非反應性毒物之反應機制

非反應性有機毒物之反應機制又稱為麻醉性反應機制，當非反應性有

機毒物進入生物體內時，其並不會與測詴物種發生化學反應，其毒性來源主要是毒性物質的親脂性(Lipophilip)，有機物質的親脂性會使毒性物質吸附在生物細胞模上之疏水性結構，猶如膜一般包附住細胞，進而阻擋生物作用之通道而影響生物體養分吸收、物質傳輸等新陳代謝之功能，造成生命受到危害。一般而言，因為毒性物質並未與生物體產生生化反應，因此非反應性有機物質之毒性機制在物理上是屬於可逆性之吸附及脫附作用。

另外，有些有機物質原本並不據以反應性之官能基，但在生物體內經

由生物吸收並經過新陳代謝之作用後，其會轉變成反應性有機物質而使其帶有反應性毒性，進而危害生物體，此類有機物質稱為前親電性有機物 (Proelectrophile Organic)，是反應性有機物質的前驅物。

3.2 單一毒性模式 (Probit model)

當測詴物種進行毒性測詴時，物種受到毒性物質的影響會隨著毒性物質的濃度增加而增加形成一 S 型曲線，此取線稱之為濃度反應曲線。如圖 3.1 所示，

圖 3.1 不同斜率的劑量反應關係

x 軸為有機物濃度，而 y 軸為反應百分比。當達到 50%的反應時，其相對應的毒物濃度則為 EC₅₀值 ( Effect Concentration 50%) 或 LC₅₀ 值( Lethal Concentration 50%)。毒性物質的不同則會有不同的斜率大小的劑量反應關

Percent effect or response

High slope Low slope

Concentration of test chemical

NOEC NOEC

EC50 100

係。

而 Probit 模式為最常用的劑量-反應(dose-response)模式，除了一些理論基礎外，主要是由實驗經驗所得的一個模式。其假設生物對毒性物質的容忍度分布為常態分布(Log-normal distribution)，其主要以毒性物質濃度的 Log 值與反應率的 NED 值(Normal equivalent deviation)具有線性關係為基礎，因此以常態分佈函數來表示毒物對生物抑制率 P 對毒物濃度（劑量）

交互作用發生，並假設生物反應為非生及死(quantal)，亦即另一種毒性物

      ^ ^

3.3.2 混合毒性效應與 ρ、λ 的關係

在作用位置之相似係數(λ)和毒性容忍度之相關係數(ρ)這兩種參數互

相配對下，混合毒性效應模式的 active mode 主要分為四種:Response multiplication (RM)、No addition (NA)、Concentration addition (CA)、

Response addition (RA)，這四種不同的組合與相似係數(λ)、相關係數(ρ)的關係可由表 3.3.2.1 觀察得知，包括各種 action mode 的 response。兩種毒性物質彼此之間與相關係數的表現上如圖 3.3.2.1 所示，Z1、Z2分別代表兩種不同毒性物質之容忍度濃度，(a)、(b)、(c)分別是兩種毒性物質在 ρ=1、0、

-1 的情況下所產生的情形，當 ρ=1 時，表示兩毒性物質容忍度分佈為正相關，以此類推，ρ=-1 時則為負相關，ρ=0 時則為不相關。經由以上的數學模式推導，發現在相關係數ρ 趨近於-1 時，亦即兩毒性物質容忍度分佈為負相關的情況下，產生 Response addition (RA)，使的生物體對混合毒性物質容忍度降低效應機率最大，因而產生所謂的協同作用(synergism)，毒性加強的作用。

表 3.3.2.1

Definitions of basic modes of action

Parameter

values

ρ λ Type of action Abbreviation Response 0 0 Response multiplication RM 1-(1-P₁)(1-P₂) 1 0 No addition NA max (P₁,P₂) 1 1 Concentration addition CA

--1 0 Response addition RA min (1, P₁+P₂)

圖 3.3.2.1 The action mode of response

3.4 混合毒性指標

一般研究常用的混合毒性指標有毒性單位(toxic unit , TU)、加成指標 (additive index ,AI)、混合毒性指標(mixture toxicity index ,MTI) 三種，而本研究採用混合毒性指標，介紹如下：

         

3 3

2 2

1 1

Z Z Z

Z Z

TU Z

ρ= 1

(a)

ρ= -1

(b)

(c)  = 0

其中，

Z

_i 為一特定毒性容忍度(Toxicity Tolerance)，即 EC₅₀

Z

i 為毒性物質 i 的濃度 TU 為毒性單位

而混合毒性單位若大於一 (TU > 1)，代表混合毒性效應為毒性減弱

(antognistic)；若混合毒性單位等於一 (TU = 1)時，代表混合毒性效應為毒性相加(additive)；若混合毒性單位小於一 (TU < 1)時，代表混合毒性效應為毒性加強(synersistic)。

3.5 Isobologram

將混合毒性詴驗中之兩種毒性物質以不同的毒性單位比例加以混合，

在一個固定的抑制率或死亡率下(如 EC₅₀ 或 LC₅₀)，兩軸分別代表兩毒性物質對此抑制率之個別貢獻的毒性單位，按不同的混合比例畫出一條等抑制率或死亡率曲線，如圖 3.3，此一圖形則稱為 Isobologram。

當此曲線在 (1,0) 及 (0,1) 兩點相連之直線的右上方，即曲線向外击出偏離原點時，表示混合毒性效應為毒性減弱(antognism)；當此曲線在 (1,0) 及 (0,1) 兩點相連之直線的左下方，即曲線向內凹接近原點時，表示混合毒性效應為毒性加強(synergism)；當曲線進四重疊在(1,0) 及 (0,1) 兩點相連之直線時，則表示混合毒性效應為毒性相加(simple addition)。通常兩毒性物質會以毒性單位 1:3、1:1 和 3:1 的比例互相混合，將實驗結果繪製成 Isobologram 以判斷混合毒性的效應。

Isobologram 另一個主要的功能，即可用來判斷混合毒性效應是否為

complex joint action。而 complex joint action 的主要特性如下: (1) 在任何毒性單位比例之下，均呈現混合毒性減弱的現象。(2) 不同毒性單位比例，

其混合毒性效應減弱之強度會有所不同，即在某一毒性單位比例下會有較強的毒性減弱現象發生。(3) 對於劑量-反應曲線斜率較大之毒性物質，其在毒性單位較小時，對另一種毒性物質會有解毒作用。因此我們可以依此特性對 Isobologram 加以應用。

圖 3.5 Isobologram 示意圖

Z2/EC50,2

Antagonism

1.0 0.0

Z1/EC50,1

1.0

Synergism NA

0.5

0.5 0.0

第四章實驗流程及設備

4.1 實驗設備

1.恆溫無塵室

恆溫無塵室溫度控制在 24 ± l ℃，保持恆溫，藻類毒性測詴、培養皆 在此恆溫室進行。

2.水質

所有實驗及培養用水皆經過過濾、離子交換、RO 逆滲透及蒸餾，最後再經由超過濾 (Milipore) 處理之去離子水，實驗前必頇將去離子水以 0.45μm 之濾紙過濾，其水質之比電阻≧18.2 Megaohm 才可開始使用。

3.連續式培養母槽

連續式培養之母槽使用體積 5 公升，直徑為 18 cm 之玻璃容器。於體積 4 公升之處開口作為溢流口，並且於體積 2 公升之處開一口作為取樣之用，母槽上方亦有兩個開口，一作為營養基質流入之用，另一作為空氣進

在文檔中以密閉式藻類毒性詴驗方法評估反應性與麻醉性有機物之混合毒性研究 (頁 39-0)

第二章 文獻回顧