實驗參數控制與意義

不同實驗室間的藻類毒性詴驗結果可能不相同，這些潛在的變異性導 因於某些物理或化學的實驗參數控制不一，因此在詴驗之前瞭解並嚴格地 控制詴驗中各種參數對於藻類生長之影響及其對於毒性之交互作用是相 當重要的。以下為本研究實驗前所考慮的重要實驗參數：

(1)碳源供給和 pH 控制

在碳源方面，藻類生長時碳源的利用順序為先消耗水中溶解的二氧化 碳即本實驗設備的曝氣幫浦和氣體鋼瓶所提供，次者為培養基( medium ) 中的碳酸氫鈉( NaHCO₃ )，碳源的供給不足會造成藻類死亡。在 pH 控制方 面，pH 的改變會影響毒性物質在水中的型態和濃度，進而影響對產生毒 性的大小，如 HCN 在 pH 由 7.8 降至 7.5 時，毒性會增強十倍，因此若決 定在一固定 pH 值下進行詴驗時，就必頇小心地確保 pH 之變化為最小。然 而碳源和 pH 值之間是會互相影響的，Nyholm et al.^[27]提到藻類維持 pH 恒 定的方式，如圖 2.2.4 所示：

圖 2.2.4 碳酸鹽系統與光合作用之 pH 恒定的方式

(

Biomass production

CO2(gas) CO2(aqua)

HCO3

-CO3

-H2CO3 )

在 Arensberg et al. ^[28]提到當藻類於培養時，如果二氧化碳溶解在水中 的濃度與空氣保持衡定，則在光合作用中所消耗的二氧化碳所產生的碳水 化合物並不會改變水體中的 pH 和鹼度，只有營養鹽的攝取才能改變 pH 值，如氨鹽的攝取，會釋出 H⁺導致 pH 值下降，而在硝酸鹽和磷酸鹽攝取 則會導致 pH 值上升如下所示:

pH 值恒定 nCO

₂ + nH₂O → ( CH₂O )_n + nO₂

pH 值上升 HCO

₃^- → OH^- ＋ CO₂

因此，標準藻類毒性詴驗必頇其 pH 值維持在固定。固定 pH 值之毒性詴驗 隨著不同的標準方法而有所差異，U.S.EPA 規定最終 pH 值之變動必頇在 8.5 之下，OECD 則要求 pH 值最大變動不得超過一個單位，ISO 則要求 pH 之變動頇在 1.5 個單位之內。

而控制 pH 值改變的方法有:

 降低接種生物量

 系統加入二氧化碳加以曝氣

 均勻振盪

 維持空氣流通

 縮短實驗時間

如 Arenberg et al. ^[28]利用 Raphidocelis subcapitata 為測詴物種進行小型系統 藻類毒性詴驗，實驗中為避免 pH 值改變使用較小的測詴量且也將詴驗時 間由三天縮短為二天。而 Lin(2001)^[30]在密閉式藻類毒性詴驗中，發現在水 中溶解性金屬對於藻類的抑制若高於 20%時，系統中 pH 值的變化大部分 皆在 1.5 個單位之下，因此認為在溶解性藻類毒性詴驗當中，不頇限制系 統中 pH 的變化。

(2)光照

光照強度會影響藻類行光合作用之速率，因而造成其產氧率的不同。

Nyholm and Kälqvist (1989)^[31]在其藻類毒性詴驗的設計中提到如要使藻類 維持在 exponential phase，則光照需設為常數，而要維持在該條件下有兩種 方法，一為保持較低的生物質量(biomass)、縮小培養體積並充分混合，在 此充分混合的目的是為了避免有「自身遮蔽（self-shading）」現象發生，此 效應會造成距光源較遠處之光照與較進處之光照強度之差異，因此藉由良 好的混合效果可以減低自身的遮蔽現象並使光照有更好的利用效率。二為 提供飽和的光照強度，使的藻類能吸收到一定量的光而不會影響到生長。

遵循 U.S. EPA^[32]標準方法針對 Raphidocelis subcapitata 的規定，本實 驗在連續式培養和批次詴驗中所選擇的光照的強度為 4300 lux， 與其它標 準方法 ISO、OECD、EEC 的 8000 lux (120µEm^-2s^-1)不同，採用連讀式的光 照來排除光暗交替循環式的光照所導致的藻類生物質量變異的缺點。

(3)溫度

溫度逐漸增加時，藻類會呈現指數生長，而達到其最是生長溫度後即 迅速下降。本研究採用 U.S. EPA^[32]建議的 24℃，在恒溫室下培養藻類及進 行實驗，整個培養及詴驗過程中需注意恒溫室中溫度的變化，讓溫度維持 在平均溫度變化量 1℃，以確定實驗進行溫度分布的均勻度。

(4)植種之藻液初始密度和詴驗時間

對批次式實驗而言，當植入 BOD bottle 的藻液初始密度過低時，即藻 類細胞數目過少，會導致些微的細胞數量變動即可讓生長率產生大幅度的 變化，將這樣的數據輸入 probit 等模式計算出的 EC₅₀ 也會有較大的變異

性

（C.V.值）

，反之若植入的藻液初始密度過高時將會造成實驗後期由於藻

類細胞大量增加造成代謝物累積及水中碳源耗盡而導致 pH 值升高和 EC₅₀會隨之顯著升高等問題^[33]，進而影響毒性詴驗結果之精確度，因此決 定較適當的植種數量是影響詴驗結果中很重要的因子。

詴驗時間的長短會關係到毒性詴驗的敏感性和數據結果，如過長的詴 驗時間，會使得存在於 BOD bottle 內的營養鹽不足，使得無加毒物的藻類 也會與有加毒物的藻類發生出死亡的現象，使處理組與控制組在最終產量 的差距會逐漸縮短，此外過長的詴驗期間，也會使得毒性的反應消失，在 Lin(2001)^[34]針對不同詴驗時間與不同初始植種密度進行敏感度和變異性 的分析，分析結果發現隨著時間增加，毒性詴驗的敏感度提高而 C.V.值減 少，隨著初始植種密度減少，則敏感度提高但 C.V.值亦提高。因此在兼顧 兩者的考量下，本研究選定最佳化條件為控制 BOD bottle 內藻類初始植種 密度在 1.5×10⁴ cells/ml，詴驗時間為 48 小時。

(5)實驗培養基

實驗培養基的成份是影響微生物毒性詴驗結果的重要因子之一^[35]，而 主要之影響培養基因子有 pH、硬度、螯合劑、氮、磷及一些主要陽離子，

其中對微生物之生長與毒性詴驗結果影響最大的為氮、磷濃度及螫合物 EDTA 的添加量，如下分別探討:

 氮、磷的影響

在

一般的自然水體中，存在這各種不同的生長元素，就碳及微量元素 對藻類生長而言大都並非限制性元素，在 Lin^[34]針對重金屬鋅及有機物質 酚，由詴驗結果發現，U.S. EPA 營養基質的 HCO₃^- 加倍後對毒性詴驗敏 感度之影響並沒有一定之趨勢，而且並不會對其毒性反應造成太大之影響，

而最直接影響藻類族群興衰則為氮或磷的濃度，此即為藻類生長的限制性 因子。

在水中只有 PO₄^3-- P 形態能夠直接被藻類吸收，故於各種藻類詴驗方 法磷皆是以正磷酸鹽之型態存在(如：ISO 和 OECD 是 KH₂PO₄，U.S.EPA 則是 K₂HPO₄)，至於氮的形態，由於 NO₃^-- N 及 NH₄⁺- N 皆能被藻類吸收，

在 ISO 和 OECD 用的是 NH₄⁺(NH₄Cl)形態，U.S.EPA 用的則為 NO₃^-(NaNO₃)

NH₄⁺-N 而 快 速 生 長 ， 所 以 一 般 自 然 環 境 中 藻 類 的 氮 源 應 是 硝 酸 態 (NO₃^- - N)。

 EDTA 的影響

一般為使詴驗之狀態符合自然環境狀況及讓藻類能有效利用微量元 素於詴驗時會在培養基中加入固定量之螯合劑，但根據文獻指出一些螫合 物如 EDTA、NTA 等與常見之二價金屬(Cu²⁺、Cd²⁺、Ni²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺)所 形成的親水性複合物，較之前未螫合時呈現的游離態時的毒性還低，因此 倘若進行重金屬實驗時勢必會影響毒性詴驗之結果^[37-39]。因此在 U.S.

EPA^[13]雖在培養藻液時允許可加入固定量之螯合劑於培養基中，但在進行 藻類毒性詴驗時，卻規定不可加入任何螯合劑。

在文檔中 以密閉式藻類毒性詴驗方法評估反應性與麻醉性有機物之混合毒性研究 (頁 26-30)