第三章 基本理論
3.4 混合毒性指標
一般研究常用的混合毒性指標有毒性單位(toxic unit , TU)、加成指標 (additive index ,AI)、混合毒性指標(mixture toxicity index ,MTI) 三種，而本 研究採用混合毒性指標，介紹如下：
3 3
2 2
1 1
Z Z Z
Z Z
TU Z
Z2
Z1
ρ= 1
(a)
Z1
Z2
ρ= -1
(b)
Z1
Z2
(c) = 0
其中，
Z
i 為一特定毒性容忍度(Toxicity Tolerance)，即 EC50
Z
i 為毒性物質 i 的濃度 TU 為毒性單位而混合毒性單位若大於一 (TU > 1)，代表混合毒性效應為毒性減弱
(antognistic)；若混合毒性單位等於一 (TU = 1)時，代表混合毒性效應為毒 性相加(additive)；若混合毒性單位小於一 (TU < 1)時，代表混合毒性效應 為毒性加強(synersistic)。
3.5 Isobologram
將混合毒性詴驗中之兩種毒性物質以不同的毒性單位比例加以混合，
在一個固定的抑制率或死亡率下(如 EC50 或 LC50)，兩軸分別代表兩毒性 物質對此抑制率之個別貢獻的毒性單位，按不同的混合比例畫出一條等抑 制率或死亡率曲線，如圖 3.3，此一圖形則稱為 Isobologram。
當此曲線在 (1,0) 及 (0,1) 兩點相連之直線的右上方，即曲線向外击 出偏離原點時，表示混合毒性效應為毒性減弱(antognism)；當此曲線在 (1,0) 及 (0,1) 兩點相連之直線的左下方，即曲線向內凹接近原點時，表示混合 毒性效應為毒性加強(synergism)；當曲線進四重疊在(1,0) 及 (0,1) 兩點相 連之直線時，則表示混合毒性效應為毒性相加(simple addition)。通常兩毒 性物質會以毒性單位 1:3、1:1 和 3:1 的比例互相混合，將實驗結果繪製成 Isobologram 以判斷混合毒性的效應。
Isobologram 另一個主要的功能，即可用來判斷混合毒性效應是否為
complex joint action。而 complex joint action 的主要特性如下: (1) 在任何毒 性單位比例之下，均呈現混合毒性減弱的現象。(2) 不同毒性單位比例，
其混合毒性效應減弱之強度會有所不同，即在某一毒性單位比例下會有較 強的毒性減弱現象發生。(3) 對於劑量-反應曲線斜率較大之毒性物質，其 在毒性單位較小時，對另一種毒性物質會有解毒作用。因此我們可以依此 特性對 Isobologram 加以應用。
圖 3.5 Isobologram 示意圖
Z2/EC50,2
Antagonism
Antagonism
1.0 0.0
Z1/EC50,1
1.0
NA
Synergism NA
0.5
0.5 0.0
CA
第四章 實驗流程及設備
4.1 實驗設備
1.恆溫無塵室
恆溫無塵室溫度控制在 24 ± l ℃，保持恆溫，藻類毒性測詴、培養皆 在此恆溫室進行。
2.水質
所有實驗及培養用水皆經過過濾、離子交換、RO 逆滲透及蒸餾，最 後再經由超過濾 (Milipore) 處理之去離子水，實驗前必頇將去離子水以 0.45μm 之濾紙過濾，其水質之比電阻≧18.2 Megaohm 才可開始使用。
3.連續式培養母槽
連續式培養之母槽使用體積 5 公升，直徑為 18 cm 之玻璃容器。於體 積 4 公升之處開口作為溢流口，並且於體積 2 公升之處開一口作為取樣之 用，母槽上方亦有兩個開口，一作為營養基質流入之用，另一作為空氣進 流用。
4.蠕動幫浦
蠕動幫浦使用 Masterflex 公司，型號為 7533-70 pump drive 及 7518-10
pump head 之定量幫浦，作為輸送營養基質到連續式培養母槽之動力，並 可控制其流量。其幫浦管採用矽膠材質，不具毒性，可避免影響母槽培養 及毒性測詴的結果。5.電子顆粒計數器
以電子顆粒計數器來計數細胞數。使用 Coulter Electronincs 公司之
Coulter Counter，型號為 MULTISIZER II，並以 5.06 µm 標準顆粒乳液來校 正。配有 50 及 100μm 孔徑之玻璃管。本實驗使用 50μm 孔徑之玻璃管，
其量測之顆粒直徑範圍為1μm ~ 30μm。
6.溶氧測定儀
使用美國 YSI 公司出產之數字型溶氧測定器，型號 Model 59，BOD 探頭型號為 YSI5730。於 BOD 探頭處設有電動攪拌器，可以對樣品進行 攪拌，精準度為 ± 0.01mg/l。
7.培養裝置
培養裝置為自行裝配之培養箱，檯面上可依需求而更換、拆裝，以角 鋼為架構主體，長、寬、高各為 135、107、90cm，頂面予以 120cm 長 40W 之白色螢光燈管，可控制光照強度為 4300lux，並設有迴轉式震盪混合器 (WEST 公司，型號 S103)，震盪速度設定為 100rpm。而培養箱設置於無
塵恆溫室內，溫度控制在 24± 1oC，作為藻類批次式培養與毒性詴驗之用。
8.BOD 瓶
毒性詴驗時所使用的玻璃器皿，體積為 300ml，直徑為 8cm 之 BOD
玻璃瓶，上頭開口處有玻璃瓶塞，使毒性詴驗可在水封情況下進行，如此 即可避免外界物質或氣體進入干擾實驗，更可防治揮發性毒物揮發散失，亦即整個系統為封閉系統。
4.2 實驗藥品
本實驗所做的目標毒性物質包含急性麻醉性毒物以及反應性讀物，均 為用途廣大且常見之化合物，其物化特性如下表 4.2.1 及表 4.2.2 所示：
表 4.2.1 有機化學物質之物化特性(1)
Raphidocelis subcapitata 屬於綠藻綱（Chlorophceae）
，購於 University of Texas，Austin，其特徵為單細胞、成群體但不糾結、不能移動，培養達穩 定時藻類平均細胞體積在 40-60 µm3之間，其體型呈半月型。此藻種之使 用極為廣泛，例如 U.S. EPA、ISO、OECD 及 APHA 等單位之藻類毒性詴驗法，皆使用此藻種為標準詴驗物種之一。
4.4 培養基質配製
本研究使用之培養基質為參考 U.S. EPA 使用之營養基質組成，配製 方法如下：
將下列 (1) ~ (7) 的貯備液 (Stock Solution)各加 1 ml 至含 900 ml 去離子水中，再稀釋至 l 公升。接著以 0.l N 當量濃度的 NaOH 或 HCl 將營養基質之 pH 值調至 7.50 ± 0.10。
儲備液的配法如下：
(1)硝酸鈉貯備液：溶解 12.750 g NaNO3 於 500 ml 去離子水。
(2)氯化鎂貯備液：溶解 6.082 g MgCl2〃6 H2O 於 500 ml 去離子水。
(3)氯化鈣貯備液：溶解 2.205 g CaCl2〃2 H2O 於 500 ml 去離子水。
(4)微營養鹽貯備液：共配製 stock1 (100％ EDTA)、 stock2 (10％ EDTA) 和 stock3 (0％ EDTA)三瓶不同編號的貯備溶液，100﹪是使用於活化藻類 時，而在連續式母槽中培養藻類時所使用之入流基質則為 10﹪，進行實 驗時則使用不含 EDTA 之貯備液。每瓶的配法為先秤取下列七種藥品加入 500 ml 去離子水中，加完後，再加入螫合劑（EDTA），然後定量為一升
。
而各藥品所需加的量如下：
92.760 mg H3BO3 0.714 mg CoC12〃6H2O
207.690 mg MnCl2〃4H2O 3.630 mg Na2MoO4〃2H2O
1.635 mg ZnC12 0.006 mg CuCl2〃2H2O
79.880 mg FeC13〃6H2O
stock1： 150 mg Na2EDTA〃2H2O
表 4.4.2 藻類營養基質之微量營養組成份
4.5.3 ISOTON II 之配製
ISOTON II 之作用主要是作為電子顆粒計數器之導電液，當再使用顆
粒計數器量測藻類細胞數目時，所使用之溶液皆為 ISOTON II。ISOTON II 的配製方法為用 2 公升的超純水，稱取 20 克之氯化鈉(NaCl)加入其中，攪 拌使其混合均勻，再以導電度計量測其導電度，所要達到之導電度為 17mmho，若是導電度低於 17mmho 時，則在慢慢加入氯化鈉(NaCl)，攪拌 均勻直到導點度達到 17mmho 為止；相反的，如果導電度大於 17mmho，則加入超純水攪拌均勻，直到導電度降至 17mmho 為止，當溶液配製完成 後再以 0.2μm 的濾膜過濾三次，其濾液即是進行藻類細胞計數時所需之 ISOTON II 溶液。
4.5.4 藻類之培養及保存
本 實 驗 所 使 用 之 實 驗 物 種 Raphidocelis subcapitata ( 另 一 學 名 :
Pseudokirchneriella subcapitata)，藻類之培養從最出之固態培養開始，其 以固態培養基培養並保存，其固態培養基之成分與液態培養基成分相同，唯一不同就是固態培養基有多加 1%的洋菜膠(Agar)，在固體培養基的型態 下，通常可以再 4 oC 下保存六個月。此外，亦做液體培養基培養，取藻種 時必頇在無菌操作台中，而無菌操作台必頇先以 UV 燈管滅菌半小時以上 才可使用，操作人員必頇以 95%的酒精進行殺菌，再以白金刮取固態培養 基上之藻種，將其至於液態培養基質 (含 100% EDTA)中培養。通常液態 培養基中之藻類可在 4 oC 下保存四個星期，於四星期後作移植以繼續培養、
保存菌種。
4.6 實驗條件之控制
溫度：藻類之培養及毒性詴驗皆在 24 ± 1 o C 下進行。
光 度 ： 藻 類 之 培 養 及 毒 性 詴 驗 皆 在 光 度 為 64.5 ±10 ﹪ μEm-2s-1 (4300±10% Lux)進行，所使用之光源為連續白冷光。
氮、磷濃度：培養藻類之入流基質使用 USEPA 規定濃度的一半濃度 進行培養，活化及毒性詴驗時則維持規定濃度。
HCO
3-濃度：原濃度不變。
pH：稀釋水的初始 pH 值需控制在 7.5 ± 0.1 下實驗。
EDTA 含量：在批次培養活化藻類時使用 USEPA 規定的 EDTA 濃度
(100﹪)，而在連續式母槽中培養藻類時使用 USEPA 規定 EDTA 濃度 的 10﹪，進行實驗時則使用不含 EDTA 之貯備液。
詴驗時間：48 小時。
藻類初始植種密度：1.5 ×104 cells /ml。
4.7 毒物配置
4.7.1 氯酚類有機毒物
在本研究中，氯酚類仍是以去離子水進行配置，在步驟方面，以 BOD
瓶裝置去離子水進行配置，利用 BOD 瓶的水封特性將此類毒物溶液加以 水封，最後以磁石攪拌器攪拌即可。而由文獻可得知(表 4.7.1)，當氯酚所 接的氯原子越多時，其溶解度會下降，在文獻上 Boyd et al.[64]有提到，接 三個氯原子以上可以強鹼(0.1N NaOH)進行配置，在以 0.1N 之 HCl 滴定 回 pH =7 以進行實驗。表 4.7.1 The water solubility of chlorophenols [54]
毒性物質 分子量(M.W.) Water solubility (mg/L at 20oC) 2-Chlorophenol
4-Chlorophenol 2,3-Dichlorophenol 2,4-Dichlorophenol 2,4,6-Trichlorophenol
128.6 128.6 163.0 163.0 197.5
28500 27100
- 4500
800
4.7.2 醛類有機毒物
醛類有機物配置仍是以 BOD 瓶來進行配置，由於醛類具有非常高揮
發性及密度皆小於 1，因此在配置過程中，BOD 瓶中 headspace 必頇減至 最小再進行水封，以減少溶解過程中的損失。當醛類完全溶於水之後再用 去離子水將其補滿進行水封即可。4.8 儀器之操作原理
4.8.1 電子顆粒計數器及其操作原理
電子顆粒計數器量測設備為玻璃管及攪拌器，操作時玻璃管需浸入含 有 ISOTON II 稀釋樣品的燒杯中，水樣在計數的過程需攪拌以使顆粒均勻 分佈。其原理為玻璃管近底端的側面鑲有紅寶石的精準小圓孔，玻璃管利 用虹吸原理從小圓孔吸入水樣，而玻璃管內外各有一電極片通以直流電，
當水樣中所含之顆粒被帶經圓孔時，會暫時性地干擾到電流，形成某特定 量的電阻。而電阻量透過示波器的派衝波顯示，其高度正比於顆粒的大小，
脈衝數為顆粒的數目，直接以電子計數器紀錄顯示，如此即可得到水中顆 粒粒徑分佈及數量，最終資料可輸送到電腦，以軟體程式（Multisizer Accucomp V. 2.01）進行分析。電子顆粒計數器主要條件設定如下表 4.8.1，
本實驗採用 50 µm 孔徑之毛細玻璃管，
其量測之顆粒直徑範圍為 1μm ~
30μm
。表 4.8.1 電子計數器設定之條件
項 目 數 值 滿刻度電流量 (Full scale) 10 mA
極性 (Polarity) +
電流 (Currents I) 100
粒徑下限 (Diameter Lower Threshold , Tl) 1µm 粒徑上限 (Diameter Lower Threshold , Tu) 30 µm 脈衝衰減倍率 (Attenuation , A) 1
脈衝放大倍率 (Preset Gain) 1
警戒粒徑限度 (Alarm Threshold) OFF
分析量 500 µL
進行藻類計數時，僅需吸取 1 ml 的藻液置入 50 ml 之定量瓶內，再加 入 ISOTON II 至 50 ml，然後倒入燒杯中，置入顆粒計數器內計數。顯示 之數值需扣除 ISOTON II 之背景值(即純 ISOTON II 之測量值)，連續三次 值相差皆在 2%者之平均值為測量值。
藻液每毫升顆粒數(cells/ml)
= (測量值 / 0.5ml) × (100ml / 所取的藻液量)
4.8.2 溶氧測定儀之校正
一般溶氧測定儀可使用飽和空氣於水中校正與空氣校正兩種，但前者 頇將水曝氣至 100﹪，操作上相當困難，因此在此採用空氣校正法。空氣 校正之方法是將電極置於盛有 2.5 公分左右水量之 BOD 瓶上，將此可視為 100﹪之溼度，轉鈕至校正鍵（calibrate），輸入校正值 (100%)，確認後轉 回測定鍵，連續重覆校正三次。每個月定期更換 CLARK-TYPE 薄膜與 3 M 氯化鉀電解質。必要時，需以 30﹪之亞硫酸鈉將 PROBE 表面清洗乾淨，
使其不殘留任何化學物質，而得 0﹪之 DO 溶液，進行零點校正。
4.8.3 總有機碳分析儀(TOC)
總有機碳分析儀主要使用於有機毒物之定量，利用所偵測到的碳量回
推出毒性有機物質的濃度，以確保所配置的毒物濃度品質，而總有機碳分 析儀有高溫燃燒式與濕式氧化兩種，本研究所採用為高溫燃燒式總有機碳 分析儀，其設定參數如下表 4.8.3.1 所示。在使用上，必頇先開啟儀器熱機，使其達到工作溫度(850oC)，達到工作溫度時，再使用 Device countrol 吸取 超純水清洗管路，再將探針插入樣品中即可。其作用原理，利用 10%磷酸 去除樣品中的無機碳(Inorganic carbon)，在將樣品打入高溫觸媒轉化爐進
使其達到工作溫度(850oC)，達到工作溫度時，再使用 Device countrol 吸取 超純水清洗管路，再將探針插入樣品中即可。其作用原理，利用 10%磷酸 去除樣品中的無機碳(Inorganic carbon)，在將樣品打入高溫觸媒轉化爐進