不同氮含量螢光奈米鑽石製備及光譜特性研究與生物應用

全文

(1)國立台灣師範大學化學系 Department (Graduate institute) of Chemistry National Taiwan Normal University. 不同氮含量螢光奈米鑽石製備及光譜特性研究與生物應用 Fabrication and Characterization of Fluorescent Nanodiamonds with Different Nitrogen Contents for Biological Application. 蘇隆畯 Long-Jyun Su. 指導教授：張煥正博士陳家俊博士 Advisor：Dr. Huan-Cheng Chang Dr. Chia-Chun Chen 中華民國 101 年 6 月 June, 2012 I.

(2) Abstract Fluorescent nanodiamond (FND) containing a high density of negatively charged nitrogen-vacancy centers (NV–) as built-in fluorophores has recently emerged as a promising tool for bioimaging owing to its excellent photostability, high biocompatibility, and facile surface modification. However, compared to that of quantum dots, organic dyes, and fluorescent proteins, its fluorescent intensity is not sufficiently high enough for practical applications.. In this. thesis, we explore the possibility of increasing the density of NV– in FNDs by using nitrogen-rich type Ib diamond powders. The nanodiamonds (size ~ 100 nm) used in this work were prepared by ball-milling of microdiamonds, in which the density of neutral, atomically dispersed nitrogen atoms ([N0]) was measured by diffuse reflectance infrared Fourier transform spectroscopy (DRIFTS). These nanodiamonds, with known nitrogen densities of 100 − 400 ppm, were then converted to FNDs by radiation damage using a 40-KeV He+ beam, followed by thermal annealing. We found that the fluorescent intensity of the FND so prepared is not in linear proportion to [N0]. The FND with [N0] ~ 157 ppm has the highest fluorescence intensity, which is at least 2-fold higher than that of our standard FND samples made of diamonds from Element Six.. Furthermore, an increase of the fluorescence. intensity by 3 − 4 folds was achieved for 30-nm FNDs prepared by ball-milling of the 100-nm FNDs, compared to that of 35-nm FNDs prepared directly from pristine nanodiamonds. We conclude that the methods developed in this work can not only increase the fluorescent intensity but also decrease the particle size of the FND without significant loss of the NV– density. These particles are well suited for bioimaging applications.. Key-words：Fluorescent nanodiamond, nitrogen content, bio-labeling II.

(3) 中文摘要螢光奈米鑽石(fluorescent nanodiamond) 是一種擁有許多獨特性質的新穎奈米材料，螢光奈米鑽石具有極佳的光穩定性並具有非常好的生物相容性，而且其表面容易修飾一些特定的官能基團，如果我們能增加螢光奈米鑽石的螢光強度，將更有助於我們在生物標記(bio-label)上的應用。具有 N-V0 及 N-V- 缺陷中心(defect center)的螢光奈米鑽石是最常使用的紅色螢光奈米鑽石(red-FND)，我們推估，如果增加奈米鑽石中的氮含量，有助於更多N-V0 及 N-V- 缺陷中心(defect center)產生，將使得螢光奈米鑽石放出的螢光強度更高，有利於我們在生物顯影上的應用。因此，我們利用擴散反射紅外線傅立葉轉換光譜法 Diffuse Reflectance Infrared Fourier Transform (DRIFT) Spectroscopy，偵測不同鑽石材料，並且依據單聲子區域 (1000-1400cm-1) 有獨自的特徵吸收峰來推算不同鑽石材料所含的氮含量，由於起初量測的鑽石粒徑均為10~40微米，因此我們再利用3維高能量球磨機 (3D-Ball mill machine)將這些不同氮含量的鑽石材料研磨並分離出粒徑約100奈米的不同氮含量奈米鑽石，接續再利用我們實驗室自行架設的離子佈植設備(40KeV Helium beam)將這些不同氮含量的奈米鑽石製作成不同氮含量的100奈米螢光鑽石，以利我們進行探討與應用。經由本篇論文研究後，得知並非氮含量越高的螢光奈米鑽石其螢光強 III.

(4) 度就越強，根據研究指出，氮含量約為 ~157 ppm時 (Yellow RVD sample)，會有最高的螢光強度表現，其螢光強度為我們實驗室原本所生產的Ele6_100 奈米螢光鑽石的兩倍；另外，我們直接將Ele6_100奈米螢光鑽石利用3維高能量球磨機研磨，經過處理後，可以得到30奈米螢光鑽石，其螢光強度為原始我們實驗室自行生產的35奈米螢光鑽石的3~4倍，因此我們不僅僅找尋到螢光強度更高的螢光鑽米鑽石，也成功地製備粒徑小、螢光強度高的30 奈米螢光鑽石，以利我們接續的生物顯影以及光學上的研究及應用。. 關鍵字：螢光奈米鑽石、氮含量、生物標記. IV.

(5) 目錄 Abstract ...................................................................................................... I 摘要.......................................................................................................... III 目錄............................................................................................................V 圖目錄................................................................................................... VIII 表目錄........................................................................................................X Chapter 1 緒論 .........................................................................................1 1.1 前言 ...............................................................................................1 1.2 奈米鑽石之結構與特性 ..............................................................4 1.3 奈米鑽石的總類...........................................................................5 1.4 奈米鑽石的缺陷中心(Defect center) ..........................................7 1.5 螢光標記方式...............................................................................9 1.5.1. CD44 glycoprotein ..........................................................9. 1.5.2. Glycolipid receptor ganglioside GM1 ..........................10. 1.6 研究動機.....................................................................................12 Chapter2 實驗藥品與儀器介紹 ............................................................13 2.1 實驗藥品...................................................................................13 2.2 實驗儀器...................................................................................14 2.2.1 離子束佈植裝置（Ion beam implantation） ................14. V.

(6) 2.2.2 管狀高溫爐（Tube furnace）： .....................................17 2.2.3 三維單研磨罐高能量球磨機.........................................18 2.2.4 螢光光譜儀（Fluorescence Spectrometer） ...................19 2.2.5 擴散反射紅外線傅立葉轉換光譜法(DRIFT) ..............21 Chapter 3 實驗方法 ...............................................................................22 3.1 GR1 center(V0) 鑽石製備 .......................................................22 3.2 100 奈米紅色螢光奈米鑽石樣品製備 ...................................24 3.3 3 維球磨(3-D Ball mill)與差速離心法(differential centrifugation）分離不同粒徑之奈米鑽石...........................27 3.4 30 奈米螢光鑽石新製程 .........................................................28 3.5 不同氮含量螢光鑽石製備 ......................................................29 3.6 螢光光譜測量...........................................................................30. Chapter 4 結果與討論 ...........................................................................32 Part I - GR1 center 吸收光譜/螢光光譜探討 ..................................32 4.1.1 天然鑽石單晶...................................................................32 4.1.1.1 天然鑽石單晶 – FTIR-DRIFT ..............................32 4.1.1.2 天然鑽石單晶 – UV-VIS 吸收光譜 ....................34 4.1.1.3 天然鑽石單晶 – GR1 center 螢光光譜圖 ...........36 4.1.2 天然鑽石粉末...................................................................38 VI.

(7) 4.1.2.1 天然鑽石粉末 –UV-VIS 吸收光譜 .....................38 4.1.2.2 天然鑽石粉末 –GR1 center Dose dependent .......39. Part II – 3 維球磨(3D-Ball mill) Ele6_100nm-rFND .......................41 4.2.1 3D-Ball mill Ele6_100nmrFND – 粒徑分布 ................41 4.2.2 3D-Ball mill Ele6_100nmrFND – 螢光強度變化 ........43 4.2.3 3D-Ball mill Ele6_100nmrFND – 材料與球磨影響 ....45 4.2.4 3D-Ball mill time dependent – 球磨時間的影響 ......48. Part III –不同氮含量的螢光鑽石及螢光光譜探討 .........................51 4.3.1 不同氮含量鑽石FTIR—DRIFT 光譜 ..........................51 4.3.2 製備 100nm不同氮含量螢光奈米鑽石及螢光光譜探討 .....................................................................................................53 Chapter 5 結論 .......................................................................................58 Chapter 6 參考文獻 ...............................................................................59. VII.

(8) 圖目錄圖 1. 調控放出不同螢光顏色的量子點 .................................................2 圖 2. 鑽石與石墨結構圖 .........................................................................5 圖 3. 各式鑽石內部缺陷中心結構圖 ......................................................8 圖 4. GM1 之結構 ................................................................................ 11 圖 5. 霍亂毒素之結構 (a) AB5 (b) 五個次單元B 形成之 hexamieric 與ligand 連接的結構 .................................................. 11 圖 6. 離子佈植裝置全貌 ........................................................................14 圖 7. 離子束佈植裝置示意圖 ................................................................15 圖 8. 管狀高溫爐 ....................................................................................17 圖 9. 三維單研磨罐高能量球磨機 ........................................................18 圖 10. 碳化鎢研磨罐 ..............................................................................18 圖 11. 螢光光譜儀...................................................................................19 圖 12. Diffuse Reflectance Infrared Fourier Transform Spectroscopy ....21 圖 13. 螢光奈米鑽石製備流程圖 ..........................................................26 圖 14. 螢光光譜儀全貌 ..........................................................................31 圖 15. Type Ia 晶體(crystal)的FTIR spectrum........................................33 圖 16. Type IA 晶體(crystal)經由 3MeV H+ beam轟擊，於液態氮溫度下所測量的吸收光譜圖 ................................................................35 VIII.

(9) 圖 17. Type IA 晶體(crystal)經由 3MeV H+ beam轟擊的螢光光譜圖36 圖 18. 感光耦合元件( Charge Coupled Device )的量子效率(quantum efficiency)參考圖 .........................................................................36 圖 19. NAT 150nm ND 利用 40KeV He+ beam 轟擊 200s三次之......38 圖 20. NAT 150nm ND 利用 40KeV He+ beam轟擊不同Dose量之螢光光譜圖 ..............................................................................40 圖 21. 利用 40KeV He+ beam轟擊不同Dose量與強度對照圖.............40 圖 22. 經由球磨所分離得到的粒徑分析 ..............................................42 圖 23. 經由球磨所得到的 85nm、30nm、15nm螢光奈米鑽石之螢光光譜圖 ..............................................................................44 圖 24. 經由球磨所得到的 30nm、15nm螢光奈米鑽石與 ...................44 圖 25. 探討在球磨過程中，奈米鑽石表面所產生的雜質影響 ..........45 圖 26. 經研磨過後分離出來的奈米鑽石(BM_ND)粒徑 .....................46 圖 27. 經研磨過後分離出來的奈米鑽石(BM_ND)，再經高溫 annealing後的螢光光譜比較圖...................................................47 圖 28. 經研磨過後分離出來的奈米鑽石(BM_ND)，再經高溫 annealing後的螢光光譜比較圖...................................................48 圖 29. 球磨時間對各粒徑產率的影響 ..................................................50 圖 30. 不同球磨的時間對應各粒徑分佈的影響 ..................................50 IX.

(10) 圖 31. 球磨時間對螢光強度的影響 ......................................................51 圖 32. 各個不同氮含量鑽石材料的FTIR-DRIFT 光譜.......................52 圖 33. 粒徑為 100 奈米的不同氮含量鑽石材料 ..................................53 圖 34. 經由 40KeV He+ beam進行離子佈值所得到的螢光光譜圖 .....55 圖 35. 經由 3MeV H+ beam進行離子佈值所得到的螢光光譜圖 ........55 圖 36. 氮含量的不同對於螢光奈米鑽石螢光關係圖 ..........................56 圖 37. 不同螢光奈米鑽石餵食(feeding) Hela cell流式細胞儀圖譜 ....57. 表目錄表 1. 鑽石的種類 ......................................................................................5 表 2. 鑽石中 Nitrogen-vacancy 缺陷中心性質表....................................8 表 3. 離心條件與分離出來的粒徑表 ....................................................27 表 4. 離心條件與分離出來的粒徑表 ....................................................41 表 5. 各個不同氮含量鑽石材料之氮含量 ............................................53. X.

(11) Chapter 1 緒論 1.1. 前言奈米科技發展逐漸成熟，近年來在生醫研究上被廣泛做為特殊的. 載體，奈米粒子可以接上抗癌藥物，有效地將藥物帶往腫瘤處1，而奈米粒子因其表面接上的藥物或抗體的不同，可開發出多功能性的奈米粒子，但要應用於生物醫學方面還必須具備一些條件，例如：無毒性 (nontoxic)、高生物相容性 (high biocompatible)、長時間的循環 (prolonged circulation time) 等，其中，利用螢光探針來標記生物樣品的結構以及生物反應的過程，是一個極為重要的課題2。一般而言，適合進行生物體標記的螢光探針（fluorescent probe），需要具有下列特性，例如：螢光明亮、高光穩定性、高生物相容性（bio-compatibility）、易進行表面化學修飾3與螢光放光波段在近紅外光範圍4等。在早期，多以螢光合成染料分子5（fluorescent synthetic 6 dye molecules）或螢光蛋白（fluorescent protein）做為專一性（specific）. 標記，然而其中卻存在著螢光訊號穩定性差、容易產生光漂白7 （photobleaching）現象以及螢光放光特性容易受環境與化學修飾干擾等問題，為了解決上述問題，遂發展出了量子點8（quantum dot）。量子點是一種奈米級大小的半導體，其大小為2~10 奈米，人們可以藉由調控量子點的粒徑大小 (size) 、形狀 (shape) 、侷限位 1.

(12) 能(confinement potential)來操控量子點的能階帶(energy spectrum)，使量子點擁有可調控性的螢光顏色，如圖1所示。然而，即使量子點可突破有機螢光染料的限制，並擁有永久的螢光及極佳的光穩定性，但其具有的螢光閃爍性（blinking）和生物毒性（cytotoxicity），卻侷限了量子點在生物醫學上的應用9,10, 11, 12。圖 1. 調控放出不同螢光顏色的量子點. http://www.rsc.org/chemistryworld/News/2005/September/19090501.asp. 因此，近年來螢光奈米鑽石3, 13（fluorescent nanodiamond）逐漸被重視與發展。鑽石結晶體在結構上非常穩定且不易與物質發生反應，因此具有良好的化學惰性（chemical inert）以及低生物毒性14，此外，其表面能透過化學處理產生羧基15（carboxyl group ,-COOH），以修飾想要的官能基或者是運輸的藥物，另一方面，鑽石的螢光缺陷中心（fluorescent defect center）位於堅固的晶體結構中，使其具有優異的光學穩定性，不會因表面化學修飾而改變螢光特性，非常適合用來進行長時間的生物體螢光標記16，這些特性使得螢光奈米鑽石成為極具 2.

(13) 發展潛力的碳結構奈米材料17, 18。因此，為了開發螢光強度更高、且粒徑更小的螢光奈米鑽石，本篇致力於探討氮含量對螢光奈米鑽石螢光強度的影響，並且更進一步利用奈米鑽石的無細胞毒性和極高的光穩定性以進行生物顯影以及生物標記的應用與開發。. 3.

(14) 1.2 奈米鑽石之結構與特性「The Diamond is Forever。」-- 鑽石乃是世界上最珍貴的寶石，晶瑩瑰麗的光采，以及希罕難求，自古以來，一直是女人們的最愛，也是世上財富與權勢的象徵。然而鑽石雖然寶貴，但其成分與石墨卻是相同，皆屬於碳的同素異構物，只是兩者的結構與原子排列不同而已，如圖2所示。石墨是由巨型共價結構組成，其碳原子相互結合成一個層狀結構，同一層的碳原子之間有很強的共價鍵結，但是兩層石墨之間卻只有微弱的凡得瓦力相連結，因此石墨晶體層間的結合並不堅固；然而，組成鑽石之碳原子乃是相互共價結合 (Covalent Bonding)成為面心立方 (FCC) 結構，每一個碳原子外圍的四個價電子與最相鄰之四個碳原子的價電子構成一個完整的共價三度空間結合，由於原子與原子間是由強大的共價鍵結合，因此鑽石具有最高之硬度(莫氏硬度10)，以及極高的熔點。. 4.

(15) 圖 2. 鑽石與石墨結構圖. 1.3 奈米鑽石的總類 Type. Feature. Color. Natural Abundance. Note. 1a. Nitrogen atom concentration up to 0.3% clustered together within the carbon lattice. Colorless, yellow. 98%. Most natural diamonds. 1b. Nitrogen atom spread evenly throughout the carbon lattice. 0.1%. Almost all synthetic diamonds. 2a. No or little nitrogen atoms contained. 1–2%. The “purest” diamonds. 2b. No or little nitrogen but boron contained p-type semiconductor. Yellow, orange, brown Colorless, yellow, brown, pink, purple Blue, gray. 表 1. 鑽石的種類 19. 5. 0.1%.

(16) 鑽石的分類，如表1，依據鑽石內部所參雜不同成份及含量，可區分為四大類： Type Ia、Type Ib、Type IIa、Type IIb。參雜物質為氮原子被歸類於Type I 類，而Type II類則為接近純物質或是擁有其他參雜物質。於自然界中有 98% 的鑽石都屬於 Type Ia，其含氮濃度達 0.3%，通常這些氮原子會聚集在一起，依照聚集方式不同，Type Ia 分為Type IaA -- 碳原子（C center）鄰近兩個氮原子（A aggregate19）及 Type IaB -- 碳原子被四個氮原子圍繞（B aggregate19）。而 Type Ib 中氮原子含量較少，大多數的人工合成的鑽石粉末多屬此類。 Type IIa 即是市面上備受注目的寶石級鑽石，只占自然界1~2%，含量更為稀少且幾乎不含雜質，是世上最純的鑽石，加上鑽石極高的折射率，經過切磨後展現出七彩燦爛的光芒，是深受世人喜愛的珍品。 Type IIb 類不含氮原子，但是含有其他元素，例如硼原子（B），也讓此類鑽石呈藍色且具導電性，可作為P型半導體材料使用。. 6.

(17) 1.4 奈米鑽石的缺陷中心(Defect center) 當Type I類鑽石經高能量離子束(如:電子、氫離子或氦離子束)或高能量粒子束(如:中子束)轟擊之後，隨即於真空內800℃下高溫焠火 (annealing)，使經由轟擊產生的空缺與鑽石內部原本所含有的氮原子互相結合，因而形成各種不同的缺陷中心，在光譜上能夠觀察到許多獨特的吸收或螢光帶 (vibronic absorption /luminescence bands)。在Type Ib類鑽石，依照含氮量的不同會有兩個缺陷中心產生，一為較高含氮量 (~200ppm) 所形成的 (N-V)- center，這個中心所擁有的零聲子線(Zero-phonon line)位置為637.2nm (1.945eV) 20。而氮原子濃度較低 (<10 ppm) 的Type Ib類鑽石，其所形成的缺陷中心為中性不帶電的 (N-V)0 center，此缺陷中心所擁有的 ZPL 位置為574.9nm (2.156eV) 21。而Type 1aA類鑽石，主要所形成的缺陷中心為 N-V-N center，被稱為H3 center，這個缺陷中心所擁有的 ZPL 位置為503.2nm (2.463eV) 22。N-V-N 也有中性不帶電的形式，此時稱這類形式為 H2 center，其 ZPL 位置為986.2 (1.257eV)23。另外還有一種缺陷中心，我們稱為N3 center，此類型缺陷中心主要是空缺鄰近三個氮原子，而氮原子位於晶體{111}面24，此類型所生成的 ZPL 位置為 415.2nm (2.985eV)。圖3與表2 為上述缺陷中心之圖形與性質。 7.

(18) 圖 3. 各式鑽石內部缺陷中心結構圖 25 氮原子以黑色表示碳原子以灰色表示空缺以空心圓表示. 表 2. 鑽石中 Nitrogen-vacancy 缺陷中心性質表 26 Note：zero-phonon line(ZPL) emission maxima(λman) Emission lifetimes(τ) quantum efficiencies(ψ). 8.

(19) 1.5 螢光標記方式將螢光物質利用免疫抗體 (antibody) 與抗原 (antigen) 結合的專一性，在特定結構或位置上做標定，然後進行觀察與研究是常用的標記方式，此法可以針對特定細胞型態、發育、或是細胞內的組成進行螢光染色分析。. 1.5.1. CD44 glycoprotein. CD44是細胞表面上的醣蛋白 (glycoprotein)，在不同的癌細胞中 CD44可調控細胞的增生與凋亡27，其與細胞分化、遷移、生長因子（cytokines）、趨化素（chemokines）以及細胞存活的訊號也都有所關連，先前研究亦顯示CD44會影響著癌細胞的病理現象（pathologic activity）28,29。由於CD44分子對癌細胞的存亡扮演著重要角色，因此若能以螢光穩定且生物相容性極好的螢光奈米鑽石標定CD44 glycoprotein的，便能讓生物學家更了解腫瘤細胞 (tumor cell) 表面 CD44的分佈，進而知道 CD44 的表現量，或是追蹤 tumor cell的轉移過程，甚至更進一步的抑制 tumor cell。. 9.

(20) 1.5.2. Glycolipid receptor ganglioside GM1. 脂筏(Lipid raft) 位於細胞膜上，是由脂質(lipid) 以及一些特殊蛋白所組成，其對於細胞訊息的傳遞扮演著重要的角色，raft 上面具有許多細胞的接收器(receptor) 及訊息傳遞蛋白質，例如：cholesterol、 Glycolipid (sphingolipid)、G protein-coupled receptors (GPCRs) 等，透過lipid-lipid interaction、protein-protein interaction、lipid-protein interaction等形成 microdomain30,31。 GM1(monosialotetrahexosy 1 ganalioside) ，如圖4所示. 32. ，是位. 於 lipid raft 上的醣基之一，是病毒或毒素的 receptor，例如:猿猴空泡病毒 40 (simian virus 40,SV40)、腫瘤病毒(polyoma virus)、霍亂病毒的毒素(cholera toxin, CT) 的次單元B(CTB)，而霍亂毒素常用來作為 lipid raft 的標記。霍亂病毒具有兩個次單元，如圖5所示，分別為 A subunit 以及由五個相同的subunit所組成 hexamieric 的次單元B，因為次單元B可專一性辨認lipid上的GM1 receptor ，因此利用可次單元B將次單元A運送到細胞內，再由次單元A的活化酵素位置 (enzyme-active site)引發毒性，因此，我們利用螢光穩定且生物相容性極好的螢光奈米鑽石作為GM1的標定，觀察lipid raft聚集的程度，進而追蹤GM1遷徙的過程。. 10.

(21) 圖 4. GM1 之結構. 圖 5. 霍亂毒素之結構 (a) AB5 (b) 五個次單元 B 形成之 hexamieric 與 ligand 連接的結構. 11.

(22) 1.6 研究動機螢光奈米鑽石具有良好的生物相容性，且擁有永久螢光性質，適合在生物標記上作為長久的追蹤與觀測，因此開發螢光強度更高且粒徑更小的螢光奈米鑽石有其必要性，螢光強度越高會越有利於生物標定以及追蹤的觀察，而粒徑更小會有助於螢光奈米粒子具有更佳的流動性。就此，我們推論，如果增加Type1b類奈米鑽石內部的氮含量，將有助於更多N-V0 及 N-V- 缺陷中心(defect center)產生，我們利用三維球磨機進行研磨，利用研磨時間與離心速度的差別，篩選出合適粒徑大小的螢光奈米鑽石，進而開發出螢光強度更高，且粒徑更小的奈米材料，並應用於CD44以及GM1等生物標定的應用上。. 12.

(23) Chapter2 實驗藥品與儀器介紹 2.1. 實驗藥品.  Monocrystalline diamond powder : MSY, 0-0.05 micron, Lot L9033  Synthesis metal bond diamond diamond : Elementsix Micron+ MDA , 0-0.1 micron, Lot 1621720  Synthetic diamond：Microdiamant, Nature Diamond Powder NAT 0.25-0.5 micron, Lot 866C  Sulfuric acid (H2SO4)： J. T. Baker 9681-01  Nitric acid (HNO3)： ACROS 124660010  Sodium hydroxide (NaOH)： ACROS 134070010  Hydrogen peroxide 34.5-36.5%：Sigma-Aldrich  DMEM/HG (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/ High Glucose) : GIBCO  PBS (Phosphate-Buffered Saline, pH=7.4) : GIBCO  BSA (Albumin from bovine serum) : Sigma-Aldrich  Sulfo-NHS-SS-Biotin : Thermo Scientific  Streptavidin protein (cat. 60659) : Thermo Scientific  Cholera toxin subunit B (CTB), Biotin conjugated (C-34779) : Molecular Probes  α-Lactalbumin from bovine milk (L6010) : Sigma 13.

(24) 2.2. 實驗儀器. 2.2.1 離子束佈植裝置（Ion beam implantation）離子佈植裝置通常具有以下幾個重要的部份：（1）離子源：主要以欲佈植在材料上的元素為主。（2）加速器：離子主要經由高能量的電場加速。（3）佈值室：離子佈植時，目標物所處的地方。. 圖 6. 離子佈植裝置全貌由左到右依序為為離子源、加速器及佈植室. 基本上離子佈植通常是從單一原子產生，本實驗室所使用的離子源是氦（Helium）以及能夠提供40 keV加速電壓的加速器。整個離子束佈植裝置的真空系統，包含了兩個機械幫浦（mechanical pump, 14.

(25) Pfeiffer, duo 016b; Edwards, e2m28），四組渦輪幫浦組（Turbo pump station, Pfeiffer, Tmu 521; Seiko-seiki, stp-400; Alcatel, act600t; Osaka vacuum, tg350fcam）。整個裝置主要分為兩大部分，中間以移動隔版分離前後兩個部分。前半部分主要為離子源（RF source）及加速器，真空系統則是由兩部渦輪幫浦和一台機械幫浦將壓力抽至 1 x 10-7 Torr，並使壓力維持在高真空；而後半部則是佈植室，由另外兩部渦輪幫浦與一台機械幫浦維持真空狀態，其中渦輪幫浦與佈植室之間也以移動隔版分隔。在放置樣品時，必須先將壓力回復到一大氣壓，因此在破真空時需先用隔版阻絕渦輪幫浦與佈植室，待樣品放入後，先以機械幫浦將壓力降至 200 mTorr，再把隔版打開，利用兩渦輪幫補將壓力抽至1 x 10-6 Torr，才能進行離子束佈植。. 圖 7. 離子束佈植裝置示意圖由左到右依序為為離子源、加速器及佈植室，樣品則先鋪在銅帶上。. 15.

(26) 離子源部分，主要由震盪器（oscillator, NEC Model 2HA036900）與電源供應器（oscillator power supply, NEC standard model 2HA036910）組成。震盪器則包含兩個功率放大四極管（power tetrode）與一個多重震盪線圈（mutivibratior circuit）。加速器則是由五萬伏特隔離變壓器（50 keV isolation transformer, NEC model 2HA068300）與電源供應器構成。電源供應器的電壓經由變壓器升壓至40 keV的高電壓後，連接到加速器的前端，而加速器的尾端則接地維持其電位為零，使得加速器前後有四萬伏特的電位差將離子加速。加速後的離子會直接靶擊放置於佈植室中銅帶上的奈米鑽石樣品，同時轉動系統會帶動銅帶轉動，使得銅帶上的奈米鑽石樣品能夠均勻地被氦離子輻射（irradiation）。. 16.

(27) 2.2.2 管狀高溫爐（Tube furnace）：. 圖 8. 管狀高溫爐管狀高溫爐可提供大範圍（30.5㎝）的加熱、快速的升溫速度（25℃/分鐘）及非常高的溫度（1200℃），並且達到目標溫度後可維持長時間定溫狀態，此外，其半開放的設計使得研究者可以引入真空系統，讓樣品處於真空狀態下以減少不必要的損耗。其數位式電子控溫系統，可使研究者依照不同實驗需求設計不同的升溫程式（temperature programming），以控制其升溫速率。. 17.

(28) 2.2.3 三維單研磨罐高能量球磨機廠牌：SPEX CertiPrep 型號：8000 Mixer/Mills. 圖 9. 三維單研磨罐高能量球磨機 SPEX 8000 單研磨罐高能量奈米級球磨機，集強力沖擊、研磨及振動等高能動作于一體，其研磨軌跡是獨特的三維8 字形，研磨球高速旋轉運動與樣品相互撞擊，以達到磨細樣品的目的，是現在所有球磨機中能量最高的，高效率的球磨機能在較短的時間內向樣品粉末輸送較高的機械能量，使材料在較短的時間內研磨得充分而均勻。球磨罐的部份，我們選用莫氏硬度8.5～9的碳化鎢球磨罐(Tungsten Carbide Vial Set)，碳化鎢是一種由鎢和碳組成的化合物，化學式為 WC，英文為Tungsten Carbide，也常被簡稱為Carbide，碳化鎢的硬度極高，適用於研磨奈米材料。. 圖 10. 碳化鎢研磨罐 SPEX Certiprep. 8004 Tungsten Carbide Vial Set 18.

(29) 2.2.4 螢光光譜儀（Fluorescence Spectrometer）由於鑽石的折射率為2.42，如此高的折射率會使得在溶液與鑽石的介面上極易產生散射光 (Scattering light)，而一般螢光光譜儀的設置，通常都在與入射光垂直的位置偵測螢光，然而極大部分的訊號都會由於鑽石的散射而使得偵測效率降低，因此一般的螢光光譜儀並不適合用來量測螢光鑽石，所以我們實驗室自行搭設裝置，利用類似螢光顯微鏡的收光方式，來進行螢光光譜的測量，感謝張老師的指導以及嘉謚學長、郭雍在螢光光譜搭設上的協助。. 圖 11. 螢光光譜儀 19.

(30) 在光源的部分，我們同時架設三台雷射，分別為 (a) He/Ne (Helium/Neon) Laser 05-LHR-551提供波長633奈米的紅光雷射 (b)固態雷射(JL-LD532-GTE; Jetlaser)提供波長532奈米的綠光雷射 (c) PHOTOP LDC-2500S提供473奈米的藍光雷射，經由各自的分光鏡(a) RazorEdge Dichroic™ LPD01 633RS, (b)dichroic mirror, Chroma Tech., Z532RDC,(c)505 dichroic mirror,反射後進入五十倍物鏡（Nikon Plan Fluor 50x）聚焦到樣品上，樣品受到雷射激發後發出螢光，螢光由物鏡收光後通過分光鏡及屬於各自的長通濾片(a)FF01-855/210BP， (b)Chroma Tech.550LP，(c) 488LP，並以透鏡聚焦，將螢光耦合至多道光譜儀（multichannel spectrometer, Hamamatsu C7374）的光纖中，透過光譜儀所提供的電腦軟體分析得到其螢光光譜，而此儀器裝置的好處是我們同時架設的三台不同波段的雷射，針對不同的樣品材料可以選擇適合的激發波段雷射，節省置換雷射裝置與重新校正光路的時間。. 20.

(31) 2.2.5 擴散反射紅外線傅立葉轉換光譜法(DRIFT) Diffuse Reflectance Infrared Fourier Transform Spectroscopy 擴散反射現象乃是一複雜過程，當輻射光束撞擊到一個粗糙的表面或是細微粉末的表面時，光線會有許多不同方向的反射。. 擴散反射紅外線傅立葉轉換光譜法(DRIFT)是將來自光源的紅外光在第一個橢圓體鏡面上反射後聚焦照射於樣品(細微顆粒)的表面，紅外光於樣品表面穿透數個微米之後再反射出，並經過另一個橢圓體鏡面收集各個方向的反射光，以利進入FTIR儀器的偵測器區域。而擴散反射紅外線傅立葉轉換光譜法(DRIFT)是直接對粉末樣品取得紅外線光譜的一種有效方法，此法僅需最小的樣品準備過程，而且除了節省製備樣品的時間外，也幾乎未改變樣品其原始的狀態，就得以收集其IR光譜資料。. 圖 12. Diffuse Reflectance Infrared Fourier Transform Spectroscopy (DRIFT). 21.

(32) Chapter 3 實驗方法 3.1. GR1 center(V0) 鑽石製備在GR1 center鑽石的製備中，我們分別使用type Ia的鑽石單晶. (diamond single crystal)與粒徑約150奈米的天然鑽石粉末(NAT nanodiamond)來製備，Type Ia 單晶的部分，我們使用3MeV（劑量約為2劑量約16 H+/cm2）proton來進行離子佈值，在經3MeV proton beam 輻射後，不進行焠火(annealing)，因為根據文獻19指出，Type Ia diamond 經焠火(annealing)會使得空缺移動(Vacancies migrate)，形成 A nitrogen aggregates或B nitrogen aggregates，A aggregate 是形成N-V-N (H3) center; ZPL為 2.463eV(503nm)，B aggregate 是形成H4 center ;ZPL為 2.498eV，所以我們將Type Ia單晶進行3MeV proton beam輻射後，接著進行酸洗，待表面的雜質洗去後，就直接進行UV-VIS與螢光光譜的量測。而天然鑽石粉末(NAT nanodiamond)部分，則是秤取粒徑大小約為150奈米的天然奈米鑽石粉末(NAT nanodiamond powder)1克，以 450℃加熱2小時並利用空氣中的氧氣進行氧蝕（oxygen etching )，去除鑽石表面其他雜質，再將鑽石移置於單頸圓底瓶中，並放入磁攪拌子，接著加入硫酸及硝酸的混合液（體積比v/v=3:1），以超音波震盪器震盪使鑽石均勻分散於強酸混合液，加熱溫度100度、瓦數100瓦、 22.

(33) 加熱三小時，將奈米鑽石的雜質去除，並且使得奈米鑽石表面帶有羧基(-COOH)以利增加其在溶液中的懸浮性。三小時過後，將奈米鑽石從玻璃圓底瓶中吸出，反覆用去離子水清洗鑽石直到pH值到中性為止，最後取30毫克的天然奈米鑽石(NAT nanodiamond powder)溶於10 毫升的95% 乙醇，並用超音波震盪使鑽石均勻懸浮,接著將此懸浮液均勻地鋪在乾淨的銅帶（長2公尺，寬30毫米）上，再用熱空氣加熱使乙醇溶劑蒸發以乾燥銅帶，接著進入離子束佈植程序。在離子束佈值的程序，我們利用自行架設的離子束佈植裝置進行佈植，將已佈滿奈米鑽石的銅帶放入佈植室，先用機械幫浦將壓力抽至5 × 10-2 torr，再以渦輪幫浦（turbo pump）將壓力抽至低於1 × 10-6 torr，接著打開氦氣閥、高壓系統（40keV accelerator）並以每40keV Helium beam每40公分銅帶照射200秒，重複此步驟三次，以確保鑽石能均勻地被離子佈值，以利增加內部空缺(Vacancy)的含量，經計算鑽石內部所含的空缺(Vacancy)大約有3000ppm，經離子束佈值後，不做真空焠火(Annealing)的步驟，因為根據文獻指出當溫度超過450℃時，鑽石內部的空缺(Vacancy)會開始移動，與聚集的氮形成N-V-N center (H3 center)，此時我們所增加的空缺(Vacancy)會消失，故在離子束佈值後，直接進行酸洗，洗去表面經離子佈值時所產生的石墨，接著測量其吸收光譜與螢光光譜。 23.

(34) 3.2. 100奈米紅色螢光奈米鑽石樣品製備秤取買來的人工合成奈米鑽石粉末(Type1b)粒徑大小約為100奈. 米（Ele6 nanodiamond），放置700 mg在玻璃皿中於高溫爐中以450℃ 加熱2小時，並利用空氣中的氧氣進行氧蝕（oxygen etching )，以利去除鑽石表面的其他雜質，再將鑽石移置於單頸圓底瓶中，並放入磁攪拌子，接著加入硫酸及硝酸的混合液（體積比v/v=3:1），以超音波震盪器震盪使鑽石均勻分散於強酸混合液, 將玻璃圓底瓶移置微波反應器內，架上迴流裝置，酸洗時儀器條件為加熱溫度100度、瓦數 100瓦、加熱時間為三小時，此步驟目的是將奈米鑽石的雜質去除，並且使得奈米鑽石表面帶有羧基(-COOH)以增加其在溶液中的懸浮性。三小時後，將奈米鑽石從玻璃圓底瓶中吸出，反覆用去離子水清洗鑽石直到pH值到中性為止，最後將鑽石溶於95% 的乙醇並用超音波震盪使鑽石均勻懸浮,接著將此懸浮液均勻地鋪在乾淨的銅帶（長 20公尺，寬30毫米）上，並用熱空氣加熱使乙醇溶劑蒸發以乾燥銅帶，如此將形成一厚度約為300奈米的奈米鑽石薄層，以進入離子束佈植程序。我們利用自行架設的離子束佈植裝置進行佈植，將已佈滿奈米鑽石的銅帶放入佈植室，先用機械幫浦將壓力抽至5 × 10-2 torr，再以渦 24.

(35) 輪幫浦（turbo pump）將壓力抽至低於1 × 10-6 torr，接著打開氦氣閥、高壓系統（40keV accelerator）與轉動系統，進行氦離子束佈植。接著，將佈植過的奈米鑽石顆粒以95％酒精水溶液自銅帶上取下，由於鑽石不易均勻分布在銅帶上，使得鑽石也不易均勻接受離子束的照射, 因此須重複此動作2次以確保鑽石均勻接受照射。平均而言，每單位面積所接受氦離子的劑量約為 1×1013 cm-2 。將受ion beam轟擊的鑽石以棉花棒(CleanTip Swabs)沾酒精自銅帶上刮下，再置於800℃，壓力低於50 mtorr的橫式管狀高溫爐中，高溫淬火（annealing）2小時，以形成nitrogen-vacancy (N-V ) defect centers ，在高溫焠火之後，使橫式高溫爐回到一大氣壓，並在480，下加熱兩個小時(Oxygen etching)，以去除在高溫焠火（annealing）時在鑽石表面產生的石墨，接著再以硫酸及硝酸的混合液（體積比v/v=3:1）進行酸洗，反應過後，用去離子水洗至中性，接著利用氮氣將樣品吹乾。. 25.

(36) 圖 13. 螢光奈米鑽石製備流程圖. 26.

(37) 3.3. 3維球磨(3-D Ball mill)與差速離心法(differential. centrifugation）分離不同粒徑之奈米鑽石取1克的PK5(size:20~40µm)、China(size:>40µm)、 Yellow-RVD(size:>40µm)、YK-J、MDA(8~16µm)、Ele6_FND (size:100nm)鑽石粉末，各別放入碳化鎢球磨罐中，並放入五顆碳化鎢球，接著將之固定於3D單研磨罐高能量球磨機 (SPEX CertiPrep 8000 Mixer/Mills)上，電壓設定為80V，研磨時間為期30分鐘(研磨15 分鐘休息5分鐘)；研磨完畢之後，將研磨罐靜置於桌面上約10分鐘，讓研磨罐內飄散的粉末落於罐底，接著再以刮勺刮取粉末，並以棉花棒(CleanTip Swabs)沾酒精將研磨罐內部以及上下的蓋子擦拭乾淨，收集於50毫升的離心管中。接著利用酸去除雜質，並利用離心分離不同大小的鑽石。. Rpm. 4000. 4000. 15000. 15000. Min. 7. 19. 7. 90. Size. >500nm. ~100nm. ~85nm. ~30nm. 表 3. 離心條件與分離出來的粒徑表. 27.

(38) 3.4. 30奈米螢光鑽石新製程利用上述研磨方式，直接將我們由實驗3.2所製備出來的. Ele6_100nm螢光奈米鑽石(FND)，秤取300mg，進行球磨，研磨時間為30分鐘(研磨15分鐘休息5分鐘)，接著利用實驗3.2所述的清洗方式，洗去在研磨過程中所產生的碳化鎢雜質，接著再以離心的方式分離出球磨後的30nm螢光奈米鑽石。接著將30nm螢光奈米鑽石，置於800℃，壓力低於50 mtorr的橫式管狀高溫爐中，高溫淬火（annealing）2小時，以產生更多的 nitrogen-vacancy (N-V ) defect centers，並在常壓480常下加熱兩個小時 (Oxygen etching)，接續以硫酸及硝酸的混合液（v/v=3:1）進行酸洗，最後洗成中性，配置成1mg/mL的30nm螢光奈米鑽石。. 28.

(39) 3.5. 不同氮含量螢光鑽石製備將從實驗3.3所分離出來得到的100nm各個不同氮含量的MDA、. YK-J、Yellow-RVD、China、PK-5五種鑽石(ND)，各別秤取30mg，溶於95% 的乙醇並用超音波震盪使鑽石均勻懸浮,接著將此懸浮液均勻地鋪在乾淨的銅帶（長2公尺，寬30毫米）上，並用熱空氣加熱使乙醇溶劑蒸發以乾燥銅帶，如此將形成一厚度約為300奈米的奈米鑽石薄層，以進入離子束佈植程序。離子束佈植程序也如上述一般，詳情請見實驗3.2 ，而且由於這些鑽石的氮含量比較高，高於我們實驗室常用的Ele6_100nm螢光奈米鑽石(~100ppm)，所以在進行離子束佈植時，我們為了增加這些不同氮含量鑽石的螢光，所以將China與PK5這兩類的奈米鑽石(ND)，做了不同dose量的束佈植，分別為兩次離子束佈植與三次離子束佈植 (每單位面積所接受氦離子的劑量約為 1×1013 cm-2)，接著一樣置於 800℃，壓力低於50 mtorr的橫式管狀高溫爐中，高溫淬火（annealing） 2小時，以形成nitrogen-vacancy (N-V ) defect centers ，並在480r下加熱兩個小時(Oxygen etching)，以去除在高溫焠火（annealing）時在鑽石表面產生的石墨，接著再以硫酸及硝酸的混合液（體積比v/v=3:1）進行酸洗，反應過後，用去離子水洗至中性，配置成濃度1mg/mL的水溶液，進行螢光強度的測量。 29.

(40) 3.6. 螢光光譜測量如同在前面小節中所提及，螢光奈米鑽石樣品本身非常容易散射. 光線，因此以傳統的螢光光譜在垂直入射光位置收光的方式並不適合用來測量螢光奈米鑽石的螢光，因此，我們採用了類似螢光顯微鏡的方式，以物鏡收光後藉由分光鏡（dichroic mirror）將入射的雷射光與螢光奈米鑽石發出的螢光分開，接著透過濾光片將激發雷射光濾除後，以透鏡將螢光訊號耦合進光譜儀中，經過電腦分析所測得的螢光光譜，感謝張老師的指導以及嘉謚學長、郭雍在螢光光譜搭設上的協助。而且儀器裝置的好處是我們同時架設的三台不同波段的雷射，分別為：激發 H3 center 的473nm laser、激發 N-V- 與 N-V0 center的 532nm laser、激發 GR1 center 的633nm laser，我們針對不同的樣品材料選擇適當的激發波段雷射，僅需調整對應的分光鏡（dichroic mirror）將入射的雷射光與螢光奈米鑽石發出的螢光分開，在搭配適當的濾光片將激發雷射光濾除後，以透鏡將螢光訊號耦合進光譜儀中，不僅僅節省置換雷射裝置的繁瑣，還節省了重新校正光路的時間，使得我們測量含有不同缺陷中心的奈米螢光鑽石更加地便利。. 30.

(41) 圖 14. 螢光光譜儀全貌. (可與2.2.4的圖11相互對照). 31.

(42) Chapter 4 結果與討論 Part I - GR1 center 吸收光譜/螢光光譜探討 4.1.1 天然鑽石單晶 4.1.1.1 天然鑽石單晶 – FTIR-DRIFT 我們先以Type Ia 天然鑽石做為討論的對象。首先，將未經任何離子輻射處理的Type Ia天然鑽石單晶 (Type Ia Nature diamond single crystal) 以擴散反射紅外線傅立葉轉換光譜法(DRIFT)測得Type Ia天然鑽石單晶的氮含量，根據關係式【4.1】可以得到A (Absorbance)，加上此顆單晶的厚度(L) 為1.88mm，利用下列關係式將 A 轉換成 µ (Absorption Coefficient)，. µ=. 𝐀. 𝐋 𝐱 𝐥𝐨𝐠𝐞. 式 4.1. 從圖15 中可以發現，在1282cm-1的位置有很強的特徵峰產生，和文獻資料相比對，發現此特徵峰是 A-aggregates 形式的-N-V-N-所產生的 vibrational modes，雖然在 1175 cm-1及 1365 cm-1 也有 B-aggregates 及 plated的特徵峰存在，但是強度較弱，因此，可以將此顆單晶歸類於Type IaA的種類，再利用Davies, G.在1999年所提出的關係式【4.2】33，可以算出此顆鑽石單晶所含的A-aggregates 氮含量為 ~1900±10ppm。 32.

(43) [NA] = (16.5±1) µA (1282 cm-1). 式 4.2. 15. Absorbance. 1282cm-1 10. 1365cm-1. 5. 0 1000. 1100. 1200. 1300. 1400. 1500. 1600. Wavenumber (cm-1) 圖 15. Type Ia 晶體(crystal)的 FTIR spectrum. 33.

(44) 4.1.1.2 天然鑽石單晶 – UV-VIS 吸收光譜圖16 是Type Ia天然鑽石單晶 (Type Ia Nature diamond single crystal) 以3MeV H+處理後，未經高溫真空淬火並保留轟擊後的空缺 (Vacancy)，在低溫~80K的液態氮溫度下所測得的UV-VIS吸收光譜。從 UV-visible 光譜中可以發現，此鑽石單晶主要吸收位置大約在630nm左右，除此之外，可以在 503nm (2.463eV) 處得到明顯 H3 center (N-V-N center) 的ZPL (zero phonon line)，與742nm (1.673eV) 處得到明顯的GR1 center (V0 center)的ZPL (zero phonon line)，利用 GR1 center 吸收訊號的強度、及依據SRIM (The Stopping and Range of Ions in Matter) 軟體計算模擬3MeV H+的穿隧深度為50µm ，利用 Davies, G. 提出的關係式【4.3】33可以計算出此顆單晶的GR1 center 含量約為~ 1.343 x 1019 atoms/cm3 ( ~76.316 ppm)；而AGR1 是在~80K 的液態氮溫度下偵測出的 GR1 center ZPL 的 integrated absorption coefficient，單位是meV x cm-1。. AGR1 = (1.2 ± 0.3) × 10-16 [V0] 1ppm = 1.76 x 1017 atoms/cm3. 34. 式 4.3.

(45) 0.7 0.6. absorbance. 0.5 0.4. 503. 0.3. 742. 0.2 0.1 0.0 -0.1 400. 500. 600. 700. 800. 900. Wavelength (nm) 圖 16. Type IA 晶體(crystal)經由 3MeV H+ beam 轟擊，於液態氮溫度下所測量的吸收光譜圖. AGR1 ＝ (1.2 ± 0.3) × 10-16 [V0] AGR1 ＝ 1611 meV x cm-1 [V 0] ＝ 1.343 × 1019 atoms/cm3 ＝ 76.316 ppm. 35.

(46) 4.1.1.3 天然鑽石單晶 – GR1 center 螢光光譜圖將處理過的鑽石單晶(3MeV H+ 轟擊) 放置在自行架設的螢光光譜儀上(可參考前述實驗部分)，以633nm laser，曝光時間 (exposure time)為20ms的激發條件去激發 GR1 center，從圖17中可以看見在 742nm 處有明顯的GR1 center (V0 )的ZPL (zero phonon line)，而圖中 742nm GR1訊號後面的 photon sideband 衰降的原因推測是因為螢光光譜儀裝置的CCD (感光耦合元件， Charge Coupled Device )的量子效率(quantum efficiency)到800nm後就衰退到20%的效率，所以在長波長的收光效率會受到影響，參考圖18。. 7000. Excite laser: 633nm laser Exposure time : 20ms. 742. 6000. Intensity. 5000 4000 3000 2000 1000 0 600. 700. 800. 900. 1000. Wavelength (nm) 圖 18. Type IA 晶體(crystal)經由 3MeV H+ beam 轟擊的螢光光譜圖 36.

(47) 37.

(48) 4.1.2 天然鑽石粉末 4.1.2.1 天然鑽石粉末 –UV-VIS 吸收光譜圖19 為150奈米天然鑽石粉末(NAT nanodiamond powders)經 40keV Helium beam每40公分照射200秒，重複三次後，再經酸洗洗去石墨後的UV-VIS吸收光譜。在圖中可以看出其與3MeV H+ beam轟擊過後的Type Ia 單晶擁有相似的吸收光譜趨勢(參考圖16)，但因為鑽石粉末的顆粒大小達到奈米級，加上奈米鑽石粉末的折射率(n=2.24) 很高，所以光散射(scattering light)的影響很大，. 0.04 0.03 0.02 0.01. abs. 0.00 -0.01 -0.02 -0.03 -0.04 -0.05 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900. nm 圖 19. NAT 150nm ND 利用 40KeV He+ beam 轟擊 200s 三次之吸收光譜圖 (Using integrating sphere). 38.

(49) 4.1.2.2 天然鑽石粉末 – GR1 center Dose dependent 這個實驗是將天然鑽石粉末鋪於 silica wafer上(2mg)，以40KeV He+ beam分別轟擊不同dose量，分別為160s、180s、200s、220s、240s、 260s、280s，去比較轟擊Dose量的不同對於GR1 center強度的影響。結果如圖20，圖中我們可以看到有明顯的GR1 center(742nm )的訊號，而從Dose量的不同我們可以發現，轟擊220s具有最高的GR1訊號，如圖21。因此我們以此時間做為基準，製備具含有GR1 center的鑽石粒子，利用其低 quantum yield，應用在聲光顯影 ( Photoacoustic Image)上，不過 photoacoustic的應用在這邊沒有做詳細說明。. 39.

(50) 160s 180s 200s 220s 240s 260s 280s. 35000 30000. Intensity. 25000 20000 15000 10000 5000 0 600. 650. 700. 750. 800. 850. 900. 950 1000. Wavelength (nm) 圖 20. NAT 150nm ND 利用 40KeV He+ beam 轟擊不同 Dose 量之螢光光譜圖 741nm. 35000. Intensity. 30000. 25000. 20000. 15000 160s. 180s. 200s. 220s. 240s. 260s. 280s. Time dependent 圖 21. 利用 40KeV He+ beam 轟擊不同 Dose 量與強度對照圖 40.

(51) Part II – 3維球磨(3D-Ball mill) Ele6_100nm-rFND 4.2.1 3D-Ball mill Ele6_100nmrFND – 粒徑分布在這個章節我們將探討經由3維球磨機所研磨過後的Ele6_100nm 螢光奈米鑽石(Ele6_100nm FND)，其在粒徑與螢光強度上的改變。原本 Ele6_100nm螢光奈米鑽石的粒徑約為~ 93.2±25.0nm (如圖我們分離出 ~ 80.9±22.1 nm (15000rpm、7分鐘沉澱) 的鑽石 (如圖 22)，再取上清液進行15000rpm、90分鐘的離心，沉澱的部分粒徑約 ~28.3±9.1nm(15000rpm、90分鐘沉澱)，上清液的部分再利用50000rpm、 30分鐘進行離心，所得到沉澱的部分粒徑約 ~14.9±5.1nm (50000rpm、 30分鐘沉澱)，從粒徑的變化上，我們可以得知經由3維球磨機，能有效地得到較小粒徑的奈米鑽石。. Rpm Min Size. 15000 7 ~85nm. 15000 90 ~30nm. 表 4. 離心條件與分離出來的粒徑表. 41. 50000 30 ~15nm.

(52) 100nmFND_control BM_80nmFND BM_30nmFND BM_15nmFND. Differential Intensity (%). 16. 12. 8. 4. 0 1. 10. 100 Diameter (nm). 1000. 圖 22. 經由球磨所分離得到的粒徑分析. 42.

(53) 4.2.2 3D-Ball mill Ele6_100nmrFND – 螢光強度變化將經由3維球磨機研磨所得到的不同粒徑大小的奈米鑽石，再做後續的800的高溫焠火(annealing)以及接續的處理完成後 (請參考前述實驗部分)，將不同粒徑大小螢光奈米鑽石配置成濃度1mg/mL的溶液，然後利用自行架設的螢光光譜儀進行螢光強度的量測。從圖23中可以觀察到經3維球磨後所分離出來的球磨30nm螢光奈米鑽石(BM_30nmFND)，螢光強度增強為原本100奈米螢光鑽石的一半，而與原本我們實驗室的舊製程35nm螢光奈米鑽石 (Micro D 35nmFND)做比較，如圖24所示，螢光強度更是高出4倍；至於分離出來更小的球磨14nm螢光奈米鑽石(BM_14nmFND)，經過測量後，螢光強度與原本舊製程的35nm螢光奈米鑽石同樣亮。這直接證明了，利用3維球磨機去研磨Ele6_100nm螢光奈米鑽石不僅僅可以得到更小粒徑的螢光奈米鑽石，而且在螢光強度上，有顯著的突破，這有助我們在生物實驗上與光學實驗上的應用。. 43.

(54) ele6_100nmFND BM_85nmFND_all treament BM_30nmFND_all treament BM_14nmFND_all treament. 50000. Intensity. 40000 30000 20000 10000 0 500. 550. 600. 650. 700. 750. 800. 850. 900. 圖 23. 經由球磨所得到的 85nm、30nm、15nm Wavelength (nm) 螢光奈米鑽石之螢光光譜圖. BM_30nmFND_all treament BM_14nmFND_all treament micro D_35nmFND. 25000. Intensity. 20000 15000 10000 5000 0 500. 550. 600. 650. 700. 750. 800. 850. 900. Wavelength (nm). 圖 24. 經由球磨所得到的 30nm、15nm 螢光奈米鑽石與 44 舊製程 35nm 螢光奈米鑽石之螢光光譜圖比較.

(55) 接著我們探討球磨後對於奈米鑽石表面的影響，因為在球磨過程中，除了鎢鋼屑的產生，也會伴隨著鑽石表面的石墨化或產生雜質，因此做了幾個不同階段的測試， ball-mill_30nmFND 35nmFND_homemake ball-mill_30nmFND_acid wash ball-mill_30nmFND_Ox+acid wash ball-mill_30nmFND_anneal. 18000 16000. Intensity. 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 500. 600. 700. 800. 900. Wavelength (nm). 圖 25. 探討在球磨過程中，奈米鑽石表面所產生的雜質影響. 4.2.3 3D-Ball mill Ele6_100nmrFND – 材料與球磨影響然而我們從圖23也可以觀察到，經由3維球磨所分離出來的85奈米螢光鑽石的螢光比原本的Ele6_100奈米鑽石的螢光高出一些，我們推判經由3維球磨機球磨後，有可能會增加奈米鑽石內部的空缺 (Vacancies)，所以我們進行了以下實驗：將Ele6_100奈米鑽石(Ele6_100nmND)與研磨過後分離出來粒徑約~ 80.9±22.1nm的大顆奈米鑽石(BM_ND) (如圖26)，一同進行800進高溫焠火(annealing)，由於原本奈米鑽石自身就含有些空缺 45.

(56) (Vacancies)，再經800c高溫焠火(annealing)後，內部的Nitrogen會與空缺(Vacancies)形成穩定的 N-V- defect center，而在圖27中可以觀察到經由3維球磨過的奈米鑽石螢光(BM_ND)強度的確比未經研磨 (Ele6_100nmND)還多，由此可以推判經由3維球磨可以增加奈米鑽石內部的空缺(Vacancies)。接著，我們也有考慮到新30奈米螢光鑽石製程跟舊35奈米螢光鑽石製成的材料來源雖然都是屬於人工合成鑽石(Type Ib, HPHT)，但由於購買的廠商不同，材料的品質或許也會有不同，因此才會有不一樣的螢光強度表現，所以我們將Ele6_100奈米鑽石經由3維研磨機研磨，分離出粒徑大約30奈米左右的鑽石(BM_30nmND)，再經由前述的螢光奈米鑽石製成步驟(請參考步驟3.3)，製作出BM_30nmND to FND，. 圖 26. 經研磨過後分離出來的奈米鑽石(BM_ND)粒徑 46.

(57) 100nmND_+anneal_oxid_acid BM_ND_+anneal_oxid_acid. 1600. Intensity. 1200 800 400 0 500. 550. 600. 650. 700. 750. 800. 850. 900. Wavelength (nm) 圖 27. 經研磨過後分離出來的奈米鑽石(BM_ND)，再經高溫 annealing 後的螢光光譜比較圖. 並與同樣製成的Micro D_35nmFND互相比較，從圖28中，我們可以看從ele6_30nmND製作的FND與micro D_35nmFND沒有相差太多，因此可以得知，螢光增強並非來自於材料的問題，而是必須直接經由3 維球磨Ele6_100奈米螢光鑽石，我們才能得到粒徑小、且螢光強度高的30奈米螢光鑽石。. 47.

(58) BM_30nmFND_all treament BM_30nmND to do FND micro D_35nmFND. 25000. Intensity. 20000 15000 10000 5000 0 500. 550. 600. 650 700 750 Wavelength (nm). 800. 850. 900. 圖 28. 經研磨過後分離出來的奈米鑽石(BM_ND)，再經高溫 annealing 後的螢光光譜比較圖. 4.2.4 3D-Ball mill time dependent – 球磨時間的影響由前面的章節可以得知，直接將Ele6_100奈米螢光鑽石進行三維球磨，才能有效地得到粒徑小、且螢光強度高的30奈米螢光鑽石，因此在這個章節將探討，研磨時間的長短對於粒徑、產率、螢光強度是否有顯著的影響，我們分別取300毫克的Ele6_100奈米螢光鑽石進行 15分鐘、30分鐘、45分鐘以及60分鐘的球磨時間(中間以研磨15分鐘，休息10分鐘隔開)，從圖29 中可以發現，隨著球磨時間的增加，粒徑大的螢光奈米鑽石(~80nmFND)產量也隨之減少，而粒徑小的螢光奈 48.

(59) 米鑽石(~30nmFND、~15nmFND)卻逐漸增加，因此推斷隨著球時間的增加會增加小粒徑螢光奈米鑽石的產量，並從圖30 的球磨時間對粒徑分布的影響，可明顯從圖中看到與尚未經球磨的89.9奈米相比，經由60分鐘的球磨時間所分離出來的大粒徑螢光奈米鑽石，粒徑大小明顯地下降(~75.9奈米)，而小粒徑(~30奈米)的分布則很穩定。接著探討粒徑~30nm的螢光奈米鑽石螢光強度的變化，可以從圖 31 的球磨時間對螢光強度對照圖發現，經由60分鐘的球磨時間所得到的粒徑為75.9奈米以及~30奈米的螢光鑽石，其螢光強度有明顯地下降，我們推估因為球磨時間的增長，因此會大大減少螢光奈米鑽石的粒徑，進而影響到螢光的強度，而在球磨60分鐘後所收集到 ~30nmFND的部分，在測量粒徑的時候，發現有些15奈米的訊號產生，因此推判在這個30奈米的分布中，其實含有很多小於30奈米的奈米螢光鑽石，因次在測量螢光強度的時候，螢光強度會有降低的情況發生。透過此不同球磨時間實驗(Ball Mill Time Dependent)，我們找到最佳球磨的時間，我們推論，經由進行球磨45分鐘所得到的30奈米螢光鑽石，產率高(~10%)，且螢光強度也有一定的強度。. 49.

(60) 228.5. mass (mg). 225. 29.1. 222.9. 35 30. 26.7. 220. 25 21.1. 23.8. 19.3. 215. 209.2. 210 205. 15 206.2. 14.3. 10.1. 20. mass (mg). 230. 80nmFND 30nmFND 15nmFND. 10. 7.1. 200. 5 15. 30. 45. 60. Ball Mill time (mins) 圖 29. 球磨時間對各粒徑產率的影響 80nmFND 30nmFND. 100. 33. 32 89.9. (initial). 80. 85.3. 31.2 83.7. 82.9. 31 75.9 30. 20 29.8. 29. 10 28.7. 28. 0 0. 15. 30. 45. 60. Ball Mill time (min) 圖 30. 不同球磨的時間對應各粒徑分佈的影響 50. size distribution (nm). size distribution (nm). 32.4.

(61) BM_80nmFND BM_30nmFND. 42000. 18000. 36000. 15000. Intensity. Intensity. 39000. 21000. 33000 12000 30000 15min. 30min. 45min. 60min. Ball mill time (min) 圖 31. 球磨時間對螢光強度的影響. Part III –不同氮含量的螢光鑽石及螢光光譜探討奈米螢光鑽石具有良好的光穩定性，但目前有些生物實驗，仍受限於現階段所開發出來的螢光奈米鑽石的螢光強度不足的問題，因此開發螢光強度更高的螢光奈米鑽石，將會有助於在生物標記(bio-label) 以及影像(image)、追蹤(tracking)的應用。由此我們推論，如果能增加奈米鑽石內部的氮含量，將有助於增加內部 N-V- center 的轉換，進而開發出螢光強度更高的螢光奈米鑽石。. 4.3.1 不同氮含量鑽石FTIR—DRIFT 光譜首先，在這個章節將探討不同氮含量的人工合成鑽石IR光譜，一 51.

(62) 般人工製造的鑽石大都屬於Type Ib型，根據鑽石在紅外線吸收光譜的單聲子區域(1000-1400cm-1)有獨自的特徵吸收峰，並根據文獻34，可得知氮含量計算公式為：N(ppm) = [ µ(1130) / µ(2120) ] x 5.5 x 25，其中µ (2120) = [40 x A (2030) + 87x A (2160) ] / 127 – A(2120)，µ (2120) 為基線不平時的修正量，用µ (2120)修正後的吸收強度標準去量化紅外線吸收光譜在單聲子區域與氮含量相關的峰之吸收強度，經由公式我們可以計算出鑽石中氮的含量。圖32為各個不同氮含量鑽石的FTIR-DRIFT吸收圖譜，根據碳氮鍵的特徵峰(1130cm-1)，可以推算出鑽石的氮含量(如表5)。. (f) (e). 2.0 1.6. Abs.. (d) 1.2. 2030 cm. -1. 2060 cm. -1. -1. 0.8. 1130 cm -1 1344 cm. (c). 0.4. (b) (a). 0.0 1000. 1500 2000 2500 Wavelength ( cm-1 ). 3000. 圖 32. 各個不同氮含量鑽石材料的 FTIR-DRIFT 光譜 (a)MDA, (b)YK-J, (c)China, (d)Yellow-RVD, (e)Pk-5, (f)Jilin 52.

(63) 4.3.2 製備100nm不同氮含量螢光奈米鑽石及螢光光譜探討接著將這些不同氮含量的鑽石利用前述實驗步驟3.3的球磨機進行研磨，並分離出粒徑約100奈米的不同氮含量鑽石，如圖33。接著分別以40Kev He+ beam 及 3MeV H+ beam 進行離子佈值，再依照前述實驗步驟3.1處理後，將所得到的100奈米不同氮含量螢光奈米鑽石進行螢光強度的比較，探討氮含量對螢光奈米鑽石螢光強度的影響。 Ele6 MDA YK-J Yellow-RVD China PK-5. Differential Intensity (%). 16 12 8 4 0 10. 100 Diameter (nm). 1000. 圖 33. 粒徑為 100 奈米的不同氮含量鑽石材料. Diamonds. MDA. YK-J. Yellow -RVD. China. PK-5. Jilin. N (ppm). 119. 150. 157. 208. 386. 1464.1. 表 5. 各個不同氮含量鑽石材料之氮含量 53.

(64) 從圖34及圖35的螢光光譜圖中可以\發現，不同氮含量的螢光奈米鑽石具有不同的螢光強度，因此我們推論氮含量與 N-V- center的轉換效率有關，接著以685.46nm為基準，去比較不同氮含量與螢光強度的關係，從圖36 的關係圖中可以發現，無論利用40KeV He+beam 或3MeV H+ beam進行離子佈值，螢光強度並非隨著氮含量的增加而增加，增加的幅度其實存在著一個極限值，從關係圖中可以發現氮含量為157ppm的樣品: Yellow-RVD具有最高的螢光強度，且螢光強度為實驗室原先使用的材料:Ele6樣品高出約兩倍，但在更高氮含量的樣品，其螢光強度會開始下降，因此我們推論，增加奈米鑽石內部的氮含量會有助於螢光的增強，但氮含量過量的時候，多餘的電子(excess electronic)、核的旋轉(nuclear spin)與電荷的波動(fluctuating charge)會影響到N-V center 的螢光35，進而造成奈米螢光鑽石螢光的降低，透過本實驗，我們了解到氮含量對螢光奈米鑽石螢光強度的影響，也間接找尋到比實驗室現在所使用的Ele6奈米鑽石螢光強度更高的鑽石材料，因此在生物顯影上，會有良好的應用。. 54.

(65) ele6-100nmFND MDA-100nmFND YK-J-100nmFND yellow-100nmFND china-100nmFND pk5-100nmFND. 35000 30000. Intensity. 25000. Ion source : 40KeV He+ beam Excite laser ： 532nm laser Exposure time ： 50ms. 20000 15000 10000 5000 0 500. 550. 600. 650. 700. 750. 800. 850. 900. Wavelength (nm) 圖 34. 經由 40KeV He+ beam 進行離子佈值所得到的螢光光譜圖. Phy_pk5-100nmFND Phy_china-100nmFND Phy_yellow-100nmFND Phy_yk-J-100nmFND Phy_MDA-100nmFND Phy_ele6-100nmFND. 90000. Intensity. 75000. Ion source : 3MeV H+ beam Excite laser ： 532nm laser Exposure time ： 50ms. 60000 45000 30000 15000 0 500. 550. 600. 650. 700. 750. 800. 850. 900. Wavelength (nm) 圖 35. 經由 3MeV H+ beam 進行離子佈值所得到的螢光光譜圖 55.

(66) 40KeV He+ beam 3MeV H+ beam. Yellow-RVD 157ppm. 80000 70000. MDA 119ppm. Intensity. 60000 50000. Ele6 ~100ppm. 40000 30000. China 208ppm YK- J 150ppm. Yellow-RVD 157ppm PK-5 386ppm. 119ppm China MDA YK- J 208ppm 150ppm Ele6 ~100ppm. 20000 10000. PK-5 386ppm. 0 0. 50. 100. 150. 200. 250. 300. 350. Nitrogen concentration (ppm) 圖 36. 氮含量的不同對於螢光奈米鑽石螢光關係圖. 56. 400.

(67) Part IV –生物應用 (Biological application) 4.4.1 不同螢光奈米鑽石餵食細胞 (Hela cell) 將前述的螢光強度最大Yellow-RVD樣品、新製程的粒徑30奈米螢光鑽石，原本的Ele6_100奈米螢光鑽石以及原本的Micro_D_35奈米螢光鑽石等四個樣品，進行細胞餵食(feeding)實驗，每35mm-Dish有 2x105個Hela cell (子宮頸癌細胞)，分別加入各25µg/ml DMEM的四個不同樣品，反應時間為5個小時，讓Hela cell進行胞吞作用，反應後用 PBS洗掉未胞吞的奈米鑽石，接著以流式細胞儀(flow cytometer)進行偵測，從圖37 可以看出，不同亮度的螢光奈米鑽石，在流式細胞儀上可以很明確地被偵測到，而且根據奈米鑽石材料螢光強度的不同，遠紅外光 (Far Red)的位移(Shift)也有很明顯的改變，因此證明螢光強度越亮的螢光奈米鑽石在生物顯影上具有較大的優勢。. 圖 37. 不同螢光奈米鑽石餵食 57. (feeding)Hela cell 之流式細胞儀圖譜.

(68) Chapter 5 結論本篇研究中，我們致力於開發螢光強度更高且粒徑更小的螢光奈米鑽石，從上述的實驗可以得知，螢光奈米鑽石的螢光強度跟其氮含量並非呈線性的關係，當氮含量太高時，會有螢光淬熄36 (Quenching) 的現象產生；但經由此實驗，我們成功地開發出比現有材料(Element six)具有更高螢光亮度的螢光奈米鑽石(Yellow-RVD)，而經由三維球磨機球磨後所得到的30nm螢光奈米鑽石，其螢光強度為原先實驗室就製程的35奈米螢光鑽石的3~4倍，在生物應用上，此兩種新開發的奈米材料，對於CD44專一性的標定(bio-labeling)以及GM1標定的 image(bio-image)都有良好的表現。因此，開發出粒徑更小且螢光亮度更高的螢光奈米鑽石，不僅僅是在奈米鑽石材料上重大的突破，也為生物標記與生物顯影應用上開啟了另一個康莊大道。. 58.

(69) Chapter 6 參考文獻 1. Schröder, U.; Sabel, B. A., Nanoparticles, a drug carrier system to pass the blood-brain barrier, permit central analgesic effects of i.v. dalargin injections. Brain Research 1996, 710 (1-2), 121-124. 2. Neugart, F.; Zappe, A.; Jelezko, F.; Tietz, C.; Boudou, J. P.; Krueger, A.; Wrachtrup, J., Dynamics of Diamond Nanoparticles in Solution and Cells. Nano Letters 2007, 7 (12), 3588-3591. 3. Yu, S.-J.; Kang, M.-W.; Chang, H.-C.; Chen, K.-M.; Yu, Y.-C., Bright Fluorescent Nanodiamonds: No Photobleaching and Low Cytotoxicity. Journal of the American Chemical Society 2005, 127 (50), 17604-17605. 4. Weissleder, R.; Ntziachristos, V., Shedding light onto live molecular targets. Nat Med 2003, 9 (1), 123-128. 5. Johnson, I., Review: Fluorescent probes for living cells Histochemical Journal 1999, 7 (3), 123-140. 6. Tsien, R. Y., The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry 1998, 67 (1), 509-544. 7. Jennifer Lippincott-Schwartz, N. A.-B. a. G. H. P., Review: Photobleaching and photoactivation: following protein dynamics in living cells. Nature Cell Biology 2003, 5, S7-S14. 8. X. Michalet, F. F. P., L. A. Bentolila, J. M. Tsay, S. Doose, J. J. Li, G. Sundaresan, A. M. Wu, S. S. Gambhir, S. Weiss, Quantum Dots for Live Cells, in Vivo Imaging, and Diagnostics. Science 2005, 307, 538-544. 9. Derfus, A. M.; Chan, W. C. W.; Bhatia, S. N., Probing the 59.

(70) Cytotoxicity of Semiconductor Quantum Dots. Nano Letters 2003, 4 (1), 11-18. 10. Su, Y.; He, Y.; Lu, H.; Sai, L.; Li, Q.; Li, W.; Wang, L.; Shen, P.; Huang, Q.; Fan, C., The cytotoxicity of cadmium based, aqueous phase - Synthesized, quantum dots and its modulation by surface coating. Biomaterials 2009, 30 (1), 19-25. 11. Quantum-Dot Leap. Science News Online. Retrieved on 2005-06-17 12. Electric Field Assisted Assembly of Functionalized Quantum Dots into Multiple Layer Thin Films D.A. Dehlinger, B.D. Sullivan, S. Esener and M.J. Heller 13. Fu, C.-C.; Lee, H.-Y.; Chen, K.; Lim, T.-S.; Wu, H.-Y.; Lin, P.-K.; Wei, P.-K.; Tsao, P.-H.; Chang, H.-C.; Fann, W., Characterization and application of single fluorescent nanodiamonds as cellular biomarkers. Proceedings of the National Academy of Sciences 2007, 104 (3), 727-732. 14. Schrand, A. M.; Huang, H.; Carlson, C.; Schlager, J. J.; sawa, E.; Hussain, S. M.; Dai, L., Are Diamond Nanoparticles Cytotoxic? The Journal of Physical Chemistry B 2006, 111 (1), 2-7. 15. Nguyen, T. T.-B.; Chang, H.-C.; Wu, V. W.-K., Adsorption and hydrolytic activity of lysozyme on diamond nanocrystallites. Diamond and Related Materials 2007,16 (4-7), 872-876. 16. Hui, Y. Y.; Zhang, B.; Chang, Y.-C.; Chang, C.-C.; Chang, H.-C.; Hsu, J.-H.; Chang, K.; Chang, F.-H., Two-photon fluorescence correlation spectroscopy of lipid-encapsulated fluorescent nanodiamonds in living cells. Opt. Express 2010, 18 (6), 5896-5905. 17. Xing, Y.; Dai, L., Nanodiamonds for nanomedicine. Nanomedicine 60.

(71) 2009, 4 (2), 207-218. 18. Vaijayanthimala, V.; Chang, H.-C., Functionalized fluorescent nanodiamonds for biomedical applications. Nanomedicine 2009, 4 (1), 47-55. 19. Davies, G., Properties and Growth of Diamond. the Institution of Electric Engineers: London, 1994. 20. G. Davies and M. F. Hamer, Proc. R. Soc. London, Ser. A. 1976,348,285 21. S. C. Lawson, D. Fisher, D. C. Hunt, and M. E. Newton, J. Phys.: Condens.Matter ,1998,10, 6167. 22. G. Davies, J. Phys. C.1972 ,5, 2534 23. Y. Mita, Y. Nisida, K. Suito, A. Onodera, and S. Yazu, J. Phys.: Condens.Matter ,1990,2, 8567 24. J. A. van Wyk and J. H. N. Loubser, J. Phys.: Condens. matter ,1993,5, 3019 25. Jones, R. G., J. P., Theory of aggregation of nitrogen in diamond. 2000. 26. Chang, H.-C.; et al., Nanodiamond as a Possible Carrier of Extended Red Emission. The Astrophysical Journal Letters 2006, 639 (2), L63. 27. Hauptschein, R.S. et al., 2005. Functional proteomic screen identifies a modulating role for CD44 in death receptor-mediated apoptosis. Cancer Res. 65, 1887–1896. 28. CD44 in Cancer. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 2002, 39, 527-579. 29. Naor, D.; Sionov, R. V.; Ish-Shalom, D., CD44: Structure, Function and Association with the Malignant Process. In Advances in Cancer 61.

(72) Research, George, F. V. W.; George, K., Eds. Academic Press: 1997; Vol. Volume 71, pp 241-319. 30. Lingwood, D.; Simons, K., Lipid Rafts As a Membrane-Organizing Principle. Science 2010, 327 (5961), 46-50. 31. Soenen, S. J. H.; Hodenius, M.; Schmitz-Rode, T.; De Cuyper, M., Protein-stabilized magnetic fluids. Journal of Magnetism and Magnetic Materials 2008, 320 (5), 634-641. 32. Lencer, W. I.; Tsai, B., The intracellular voyage of cholera toxin: going retro. Trends in Biochemical Sciences 2003, 28 (12), 639-645. 33.Gordon Davies, Current problems in diamond: towards a quantitative understanding. Physica B 273-274, 1999, 15-23, 34. 梁中翥,梁静秋,郑娜,贾晓鹏,李桂菊, 掺氮金刚石的光学吸收与氮杂质含量的分析研究, Chin.Phys.Soc, vol.58,No.11, 2009 35. Aharonovich et al, Producing optimized ensembles of nitrogen-vacancy color centers for quantum information applications. J. Appl. Phys. 106, 124904 2009. 62.

(73)