利用紙片電噴灑質譜快速篩選及毛細管電泳質譜測定唾液中含4-氯安非他命的開發與研究

全文

(1)國立臺灣師範大學化學系碩士論文指導教授︰林震煌博士（Cheng-Huang Lin）. 利用紙片電噴灑質譜快速篩選及毛細管電泳質譜測定唾液中含4-氯安非他命的開發與研究. Rapid screening and determination of 4-chloroamphtamine in saliva by paper spray-mass spectrometry and capillary electrophoresis-mass spectrometry. 研究生︰張智勝 ( Chih-Sheng, Jhang ) 中華民國一百一年六月.

(2) 摘. 要. 本實驗開發了一種新型藥物篩選系統，包括紙片電噴霧質譜. （PS-MS）和毛細管電泳電噴灑質譜法（CE-ESI-MS）的方法。本實驗系統可以很容易地切換的 PS-MS 快速篩選樣品或傳統 CE-ESI-MS 分離方法，並利用同時共享同一台質譜而獲得詳細的質譜信息。在 PS-MS 情況下，當用尖端為（15 度）的濾紙時，從紙尖到質譜入口的最佳距離大約口為 7.7 mm，而最佳化 CE-ESI 尖端的距離為 13.5 mm。另外本實驗是使用 4 -氯安非他命作為測詴樣品，而 PS-MS 和 CE-ESI-MS 偵測極限經過測詴後確定分別為 0.1 和 0.25 ppm。以下是使用 PS-MS 和 CE-ESI-MS 和實驗條件下得到的結果的比較與說明。. Key words：紙片電噴霧質譜/毛細管電泳電噴灑質譜/4 -氯安非他命 I.

(3) Abstract A novel drug-screening system, consisting of paper spray-mass spectrometry (PS-MS) and a capillary electrophoresis electrospray ionization-mass spectrometry (CE-ESI-MS) method was developed. This system can be easily switched either to PS-MS for rapidly screening samples or to the traditional CE-ESI-MS method for separation and to obtain detailed mass spectral information, while sharing the same mass spectrometer. In the former case, when a sharp (15º-tip) chromatography paper was used, the optimized distance from the paper tip to the mass inlet was 7.7 mm, whereas the optimized distance for the CE-ESI tip was ~ 13.5 mm. Using 4-chloro-amphetamine as a model compound, the limits of detection for PS-MS and CE-ESI-MS were determined to ~ 0.1 and 0.25 ppm, respectively. Comparisons of results obtained using PS-MS and CE-ESI-MS and the experimental conditions are described.. Key words：paper spray-mass spectrometry/ capillary electrophoresis electrospray ionization-mass spectrometry/4-chloro-amphetamine II.

(4) 目錄中文摘要 .......................................................................................................... Ⅰ 英文摘要 .......................................................................................................... Ⅱ 目錄 .................................................................................................................. Ⅲ 圖目錄 .............................................................................................................. Ⅴ 表目錄 .............................................................................................................. Ⅵ 第一章、緒論 .................................................................................................... 1 1-1 研究目的 ................................................................................................ 1 1-2 分析物簡介 ............................................................................................ 2 1-2-1 鹵素安非他命結構圖 ............................................................... 3 1-3 濫用藥物的檢驗技術 ............................................................................ 4 1-4 生物檢體之檢驗分析 ............................................................................ 8 第二章、分析方法與原理 .............................................................................. 10 2-1 毛細管電泳電噴灑質譜法 (CE-ESI-MS) .......................................... 10 2-2 離子阱質量分析器簡介 ...................................................................... 12 2-3 紙片電噴灑質譜法 (PS-MS) .............................................................. 13 2-4 大氣壓基質輔助雷射脫附游離法 (AP-MALDI) .............................. 14 2-5 電噴灑輔助雷射脫附游離法 (ELDI) ................................................ 15 2-6 萃取方法 .............................................................................................. 16 第三章、儀器、藥品及實驗方法.................................................................. 18 3-1 CE-ESI-MS 結合 PS-MS 之實驗方法 ................................................ 18 3-1-1 自組式毛細管電泳質譜法 (CE-ESI-MS)............................. 18 3-1-2 紙片電噴灑游離法 (PS-MS) ................................................. 21 3-2 常見雷射脫附游離之實驗方法 .......................................................... 24 3-2-1 大氣壓基質輔助雷射脫附質譜 (AP-MALDI-MS) ............. 24 3-2-2 電噴灑輔助雷射脫附質譜 (ELDI-MS) ................................ 27 3-2-3 真空噴灑沉積 (spray deposition) .......................................... 30 3-3 儀器及周邊設備列表 .......................................................................... 31 3-4 藥品列表 .............................................................................................. 32 第四章、結果與討論 ...................................................................................... 34 4-1 自製鋼筆頭式 PS-MS 及 CE-ESI-MS 位置最佳化 ........................... 35 4-1-1 PS-MS 位置校正圖 ................................................................ 36 4-1-2 CE-ESI-MS 位置校正圖 ........................................................ 41 4-1-3 PS-MS 及 CE-ESI-MS 最佳位置比較 ................................... 43 4-2 CE-ESI-MS 分離鹵素安非他命 .......................................................... 45 III.

(5) 4-3. 4-4 4-5. 鹵素安非他命之真實樣品應用 .......................................................... 47 4-3-1 唾液中鹵素安非他命的偵測 ................................................. 47 4-3-2 真實樣品前處理 ..................................................................... 48 雷射脫附游離源偵測鹵素安非他命 .................................................. 51 各種游離源偵測鹵素安非他命之整理 .............................................. 63. 第五章、結論 .................................................................................................. 65 參考文獻 .......................................................................................................... 66. IV.

(6) 圖目錄第一章圖 1-1. 鹵素安非他命類基本結構 .............................................................. 3. 第二章圖 2-1 圖 2-2 圖 2-3 圖 2-4. 離子阱質量分析器示意圖 ............................................................ 12 紙片電噴灑質譜法示意圖 ............................................................ 13 AP-MALDI 儀器示意圖 ................................................................ 14 ELDI 游離法儀器示意圖 .............................................................. 15. 第三章圖 3-1 毛細管電泳質譜法示意圖 ............................................................ 19 圖 3-2 CE-ESI-MS 儀器裝置圖 ................................................................ 20 圖 3-3 毛細管電泳噴頭裝置圖 ................................................................ 20 圖 3-4 紙片電噴灑質譜法示意圖 ............................................................ 22 圖 3-5 紙片電噴灑質譜法儀器裝置圖 .................................................... 23 圖 3-6 紙片電噴灑質譜法近照 ................................................................ 23 圖 3-7 AP-MALDI 儀器示意圖 ................................................................ 25 圖 3-8 AP-MALDI 儀器裝置圖 ................................................................ 26 圖 3-9 AP-MALDI 中不鏽鋼基材與雷射聚焦位置 ................................ 26 圖 3-10 ELDI 儀器示意圖 .......................................................................... 28 圖 3-11 ELDI 儀器裝置圖 .......................................................................... 29 第四章圖 4-1 PS-MS 位置最佳化之平面圖 ........................................................ 36 圖 4-2 CE-ESI-MS 位置最佳化之平面圖 ................................................ 41 圖 4-3 PS-MS 及 CE-ESI-MS 最佳化位置與質譜之直線距離 .............. 43 圖 4-4 分離兩種鹵素安非他命之毛細管電泳圖 ............................... 45 圖 4-5 (A)唾液萃取之 PS-MS 質譜 ......................................................... 49 圖 4-5 (B)唾液萃取之 CE-ESI-MS 電泳圖 ............................................. 49 圖 4-5 (C)唾液萃取之 CE-UV 電泳圖 ..................................................... 49 圖 4-6 AP-MALDI 偵測 4-fluoro-amphetamine 質譜圖.......................... 52 圖 4-7 AP-MALDI 偵測 4-chloro-amphetamine 質譜圖 ......................... 53 圖 4-8 ELDI 偵測 4-fluoro-amphetamine 質譜圖 .................................... 56 圖 4-9 ELDI 偵測 4-chloro-amphetamine 質譜圖.................................... 57 圖 4-10 真空噴灑配 ELDI 偵測 4-fluoro-amphetamine 質譜圖 ............... 60 圖 4-11 真空噴灑配 ELDI 偵測 4-chloro-amphetamine 質譜圖 ............... 61. V.

(7) 表目錄第一章表 1-1 鹵素安非他命類對照表 .................................................................... 3 第四章表 4-1 六種鹵素安非他命偵測極限表格 .................................................. 64. VI.

(8) 第一章緒論研究目的. 1-1. 現今社會中濫用藥物往往是各界的社會問題，濫用藥物不但會使人產生依賴性亦會使人產生迷幻、興奮等作用，對人們的生理以及心理造成嚴重的危害。而不法集團往往為了逃避法律責任，會自行製造主架構相同但官能基不同的毒品，而此類毒品被稱為狡詐家藥物。近年來此類毒品的濫用越來越氾濫，因此為了達到加強濫用藥物檢驗的機制來嚇阻藥物濫用的擴大，降低毒品對社會的危害。. 過去在台灣法定的檢測濫用藥物之儀器為氣象層析質譜儀，但由於質量偵測範圍較小且無法較極性的藥物。在此本實驗室設計出能兼具快速定性分析以及高效能分離的技術，藉由本實驗來分析狡詐家類藥物-鹵素安非他命類，並且成功地將其應用在唾液檢體上進行分析。. 1.

(9) 1-2 分析物簡介鹵素安非他命類濫用藥物為位置異構物，均是以苯乙胺類的安非他命為主架構，並且在苯環上接上不同位置的官能基 (F、Cl)，分別在鄰 (ortho)、間 (meta)、對 (para)的位置上。. 鹵素安非他命類藥物在 98 年以五星圖案的藍色藥錠(Cl)、黃色圓形錠(F)被使用做當時最新的毒品，並且於 99 年在台北查獲製作鹵素安非他命的製毒工廠，由於此藥物並無醫療用途且在過去並無相關成癮的研究，為了避免遭濫用，台灣在 100 年 10 月已經將 4-氯安非他命 (4-Chloroamphetamine)列為第三級管制藥品。. 鹵素安非他命在藥理上與一般安非他命相當類似，屬於苯乙胺類中樞神經興奮劑及抗鬱症藥，起初被用來殺死動物血清性神經元的神經毒素，而長期使用並觀察發現會造成記憶損傷、高血壓及心跳加速，此外鹵素安非他命的神經毒性也較 MDMA[1]來得更強，致死量計範圍也小，具有高度的危險性。此外不法集團甚至將鹵素安非他命與其他毒品進行混和後製藥，進而大幅提升致死率。. 2.

(10) 1-2-1. 鹵素安非他命結構圖. 5 4. 6. NH2. 4 3 2 3 圖 1-1 鹵素安非他命類基本結構. 表 1-1 鹵素安非他命類對照表 Name 2-fluoro-amphetamine 3-fluoro-amphetamine 4-fluoro-amphetamine 2-chloro-amphetamine 3-chloro-amphetamine 4-chloro-amphetamine. R2 F H H Cl H H. R3 H F H H Cl H. 3. R4 H H F H H Cl. R5 H H H H H H. R6 H H H H H H.

(11) 1-3 濫用藥物的檢驗技術近年來較新的技術有大氣壓基質輔助雷射脫附游離法 (AP-MALDI)[2-5]、電噴灑輔助雷射脫附游離法(ELDI)[6-9]及紙片電噴灑游離質譜法(PS-MS)[10-14]被開發。. 大氣壓基質輔助雷射脫附游離法(AP-MALDI)被用來分析毒品的開發已經相當多[15-17]，實驗上需要選擇好適當的基質避免干擾到待測物即可進行快速分析，常見的基質有 CHCA(α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid)[18-19]、 DHB(2, 5-dihydroxybenzoic acid)[20-22]，在常壓下將分析物與基質充分混合後，將其置乾後利用脈衝式紫外光雷射(337 nm)[23-24]進行游離後分析，在實驗上必頇要進行基質混合的步驟，因此在快速分析上並沒有太大的幫助，此外在雷射脫附游離上，脈衝式雷射所打的每個點會因為分析物與基質的結晶程度不同而造成譜峰的不同，也就是甜點(sweet spots) 的問題，因此在定量上有一定的困難度。. 電噴灑輔助雷射脫附游離法(ELDI)是為了解決加入基質後產生的干擾而被開發出來，實驗上僅需要將分析物置乾於不鏽鋼基材上即可用脈衝式雷射進行游離，實驗中去除了加入基質的步驟，因此較 AP-MALDI 來得快速許多，但是此分析方法仍然是用氮氣脈衝式雷射 4.

(12) (337 nm)[25-26]進行脫附游離，因此仍會有甜點影響分析結果，所以 ELDI 僅適合用來快速的定性分析。. 最近較熱門的分析方法是利用沾濕的濾紙當作游離源進行分析也就是紙片電噴灑游離質譜法(PS-MS)，實驗上僅需在濾紙上施加一高電壓即可藉此達到電噴灑的目的，接著將分析物滴在濾紙的尖端即可觀察到分析物的譜峰，更何況濾紙能讓取樣者攜帶方便得隨處採樣後帶回實驗室再進行分析，此方法相較於前兩者來得簡單且快速，因此更適合用來快速的定性分析。. 以上均是近年來的分析技術，反觀過去傳統的分析技術有氣相層析質譜法(GC-MS)、液相層析質譜法(LC-MS)[27-39]以及毛細管電泳電噴灑質譜法(CE-ESI-MS)[40-45]等等。在氣相層析質譜法(GC-MS)[46-68]上對於分析濫用藥物的發展已經相當純熟，GC-MS 是利用電子游離法(electron ionization,EI)的方式使分析物帶有電荷，進而進入質譜後進行分析，而 GC-MS 具有較高的再現性，並且可以依照特有的滯留時間(retention time)、離子強度 (ion ratio)、離子碎片的片段(ion fragments)進行分析，而在此方法上也建立許多提供比對的資料庫，但是在分析物上必頇受到限制，由於傳統 GC-MS 僅能分析質荷比(mass-to-charge ratio, m/z)在 1000 以內的 5.

(13) 分析物，除此之外，分析物也必頇滿足就有高揮發性、對熱穩定、非極性的性質才可分析。. 液相層析質譜法(LC-MS)由於可以直接分析極性、無揮發性、熱不穩定性與大分子的分析物，因此近年來在分析濫用藥物上相當熱門， LC-MS 不需進行額外的衍生反應因此可簡化樣品前處理的步驟，並且隨著串聯式質譜(tandem mass spectrometry, MS/MS)[69-70]的問世，實驗上能透過選擇前置離子(precursor ion)後進行二次碎裂，藉由碎裂後的分析結果來推測可能的分析物官能基，此外當 LC-MS 結合電噴灑游離(electrospray Ionization, ESI)[71-74]後所能偵測的範圍更為廣，泛指非極性、中性、極性物質均可偵測，除此之外亦能讓蛋白質大分子形成多電荷離子，藉此能使高分子量的分析物可在低質荷比處被偵測到，所以 LC-ESI-MS 在分析大分子上扮演相當重要的角色，但是要配合近年來的環保概念上仍有為人詬病的地方，即是在 LC-MS 上流動相的使用量是相當多。. 為了能解決浪費的問題且又能有高靈敏度的分析技術，後期發展出將毛細管電泳電噴灑質譜技術(CE-ESI-MS)，CE-ESI-MS 結合了毛細管電泳(capillary electrophoresis, CE)的高分離效率以及質譜的高選擇性，此外電灑游離法具有高離子化效率，且為大氣壓力下的游離法， 6.

(14) 因此電灑法質譜儀已成為毛細管電泳質譜儀與液相層析質譜的主要離子化方法。. 7.

(15) 1-4 生物檢體之檢驗分析在濫用藥物分析上生物檢體的檢驗方法常見的有三種，分別是尿液篩檢、毛髮檢驗及唾液檢驗。. 在尿液篩檢上一般來說毒品或藥物經過吸食或施打進入人體後，先會經由肝臟分解成各種代謝物，再經由血液循環分佈全身，大約有 70%至 80%的毒品或其代謝物，會在吸食或施打後漸漸由尿液排出，取出尿液檢體後必頇經前處理、萃取、衍生化、經氣相毛細管柱層析分離，最後以質譜儀偵測。尿液是目前濫用藥物檢驗的主要檢體，也是台灣目前的法定檢體。. 毛髮檢驗會保存受檢者的用藥紀錄。一般而言，在使用完毒品後一段時間，除了在尿液外，其他如血液、汗液、唾液、指甲、毛髮等生物檢體，或多或少都會含有使用過的藥物或其代謝物，因此也可以作為監測毒品的證據。指甲與毛髮由於可以不斷生長，只要不被剪下，都可長久保存。唯獨檢體處理需費時且成本較高。. 另外利用唾液當作檢體，除了採集上快速簡便且不具侵入性，不需專業技能即可操作，採樣時亦可在現場監控，因此也減少檢體被摻假、掉包的情形。唾液中的藥物為由血液分佈而來，亦較能反. 8.

(16) 應採樣當時體內血液之藥物濃度。上述優點使唾液作為濫用藥物篩檢的實用性逐漸受到重視。. 此外檢體的前處理也相當重要，如果前處理未確實則容易汙染儀器進而造成儀器的維修，而常見的檢體前處理是液相萃取法 (liquid-liquid extraction, LLE)[75-77]及固相萃取法(solid-phase extraction, SPE)[78-79]。. 9.

(17) 第二章分析方法及原理 2-1 毛細管電泳電噴灑質譜法 (CE-ESI-MS) 毛細管電泳 (Capillary Electrophoresis)為一種高效率、快速的分離方法，尤其在分離複雜的生物樣品與樣品量極少時，更顯得 CE 的優越性質。質譜儀 (Mass spectrometer)在許多分離方法中廣泛應用的一種選擇性偵測器，它能提供樣品中未知成分的結構訊息，並且具有較高的選擇性及靈敏度，且被認為是近年來較理想的檢測器。目前應用在 CE-MS 中的游離源相當多種，其中以電噴灑游離法的型式為最具低背景噪音且高靈敏度的優點，因此 CE-ESI-MS 被視為較理想的實驗方法。一般而言，毛細管電泳電噴灑法質譜儀最佳的適用流速與液體出口之管徑有關，而一般鞘流介面所使用的管徑大約 300~400 µm，此管徑的最佳流速大約在數個 µL/min 的範圍，然而在無鞘流介面的設計上，由於毛細管電泳的流速極低(大約在 nL/min)，無法達到最佳流速的要求，為了使電灑法的最佳流速範圍符合毛細管電泳的流速，使用出口拉尖的毛細管則可將電灑法適用的最佳流速降低到毛細電泳流速的範圍，拉尖的程度大約是毛細管原來口徑的二分之一或三分之一或是更低。雖然使用拉尖的毛細管使電灑法離子化效率最佳化，但口徑的縮小卻使得毛細電泳的電滲流受到阻礙而降低分離效率，也使 10.

(18) 得毛細管的拉尖部分也變得極容易阻塞或是斷裂。由於無鞘流介面的拉尖毛細管容易有以上問題，因此在實驗設計上採用僅需要鞘流液體的鞘流介面進行實驗，雖然傳統上含有鞘流介面的系統在偵測極限上不如無鞘流介面的系統，但是在方便性以及簡易性來說較無鞘流介面來得方便許多，此外本實驗方法的偵測極限亦能低於法定濃度標準，因此本實驗利用自製 CE-ESI 噴頭搭配一般未拉尖之毛細管進行實驗。. 11.

(19) 2-2. 離子阱質量分析器簡介離子阱 (ion trap)質量分析器主要由一個環電極(ring electrode)加. 上兩個端蓋電極 (endcap electrode)所組成，如圖 2-4 當離子由第二個八級棒 (second octapole)進入質量分析器中，再利用不同交流電壓加在環電極跟蓋端電極達成捕捉、斷裂及釋放不同質荷比之離子。環電極之交流電壓隨時間變化可使離子往軸向 (endcap electrode)或縱向 (ring electrode)移動，將離子收集在阱中時，離子必頇在這兩個方向都穩定，而在掃描離子時，視需要產生可將特定質荷比的離子變成不穩定，而將其往軸向推開而離開離子阱。. 圖 2-1 離子阱質量分析器示意圖. 12.

(20) 2-3. 紙片電噴灑質譜法紙片電噴灑游離法[10]是近年來廣為研究的新型游離方法，此方. 法能有簡單且快速分析的效果，實驗裝置如圖 2-5，由於實驗上僅需將分析物滴在濾紙尖端上即可進行分析，因此僅需替換濾紙就能快速分析，實驗上將濾紙修剪成三角形，是為了能利用尖端放電的方式達到電噴灑游離的效果，接著將分析物點在三角濾紙上後施加電壓，讓分析物能藉電噴灑游離的方式飛進質譜中進行分析。. 圖 2-2 紙片電噴灑質譜法示意圖. 13.

(21) 2-4. 大氣壓基質輔助雷射脫附游離法 (AP-MALDI) 最早使用雷射脫附游離法的方式並未使用基質 (Matrix)，由於雷. 射脫附容易破壞分析物，而在 1980 年發展出加入基質輔助的雷射脫附游離法 (Matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI)，此方法較適合分析生物分子(如蛋白質體)與大分子的有機物質，而使用 MALDI 必頇先將分析物與基質進行適當的混合後再用雷射進行撞擊，基質在此方法上是用來保護分析物避免被雷射破壞以及幫助分析物揮發並游離，但是 MALDI 的游離過程必頇要在 10 mTorr 以下的壓力，而 AP-MALDI 則是在大氣壓力下利用氮氣吹送的方式幫助分析物進行游離，其樣品配製皆同於一般真空系統的 MALDI，但靈敏度以及質譜範圍皆較 MALDI 來得小。. 圖 2-3 AP-MALDI 儀器示意圖 14.

(22) 2-5. 電噴灑輔助雷射脫附游離法 (ELDI) 電噴灑輔助雷射脫附游離法是一種結合電噴灑游離法及雷射脫. 附游離法的新式大氣壓力游離法。電噴灑輔助雷射脫附游離質譜儀主要由雷射、電噴灑系統、樣品平台及質量分析器所組成，其原理為利用高能雷射將樣品表面之化學物種脫附，再使脫附之分析物分子與由電噴灑游離所產生之帶電溶劑液滴反應，形成帶單價或是多價電荷之分析物離子。此儀器可在不需任何樣品前處理下，直接且快速地分析各種固體及液體樣品表面上之化學組成物質。. 圖 2-4 ELDI 游離法儀器示意圖. 15.

(23) 萃取方法. 2-6. 萃取方法是利用溶解度的不同來達到分離的操作，實驗上將混合物中的特定成分轉移到另一種溶劑中，藉此取出該種特定成分達到分離效果，實驗上較常見的萃取方法有固相萃取法、液液萃取法等方法。實驗上所使用的是液液萃取法，液液萃取的過程主要包括兩個階段： (1) 使不互溶的兩液體（溶劑與被萃取物）作暫時的混合與接觸。 (2) 接觸後的液體再度分離成兩相。萃取後溶質在兩相溶液中濃度的關係，可由分配係數求得，分配係數定義： K＝CV / CL CV 與 CL 分別指溶質在萃取相及萃餘相的平衡濃度(單位為ＣM) 若某溶液 L 升，含溶質 M0 克，以 V 升旳溶劑一次萃取後，殘留在萃餘相中溶質重 M0 克，則可由分配係數導出下式：. K=. (M0 − M1 )⁄ V M1⁄ L. 𝑀1 = 𝑀0 (. 𝐿 ) 𝐾𝑉 + 𝐿. 若以 V 升溶劑分成 n 次萃取 L 升之溶液，即每次加入 V / n 升溶 16.

(24) 劑，與萃餘物接觸 n 次後，最後萃餘物含溶質重(Mn)，則公式成為： Mn = M0 (. L V. K +L. )n. n. 由上式可知，將溶劑分成多次萃取旳效果比一次萃取更好。. 17.

(25) 第三章儀器、藥品與實驗方法 3-1. CE-ESI-MS 結合 PS-MS 之實驗方法. 3-1-1 自組裝式毛細管電泳質譜儀 (CE-ESI-MS) 本實驗是以自組式毛細管電泳裝置連接上 Thermo LCQ 離子阱式質譜儀進行偵測，在毛細管電泳裝置上是利用簡單自製的 T 型匯流裝置連結毛細管電泳裝置以及由注射幫浦推送出來的載流液體，而此裝置的噴灑端採用內徑為 0.3 mm 的自製銅管，如圖 3-1 毛細管電泳部分選用內徑為 75 µm 的石英溶矽毛細管柱分離待測物，當管柱中充滿緩衝溶液後施予高電壓於此，使毛細管電泳方可運作，此外在進樣上採取抬高進樣來進行實驗，而在載流液體端則是選用石英溶矽毛細管柱內徑為 250 µm，並且以注射幫浦搭配 500 µL 的注射針推送甲醇進行實驗，實驗上能利用毛細管電泳達到分離的效果且搭配高選擇性的質譜，因此能有效地分析各種分析物。. 18.

(26) CE-ESI-MS 儀器裝置圖. MS inlet. homemade ESI-tip. HV syringe. CE safety box. 圖 3-1 毛細管電泳質譜法示意圖. 19.

(27) CE safety box. 圖 3-2 CE-ESI-MS 儀器裝置圖. 圖 3-3 毛細管電泳噴頭裝置圖. 3-1-2. 紙片電噴灑游離質譜法 (PS-MS) 20.

(28) 實驗上以自製的仿鋼筆式頭當作放置濾紙材料的基座，並且後方一樣搭配 Thermo LCQ 離子阱式質譜儀進行偵測，在仿鋼筆頭上為了能達到電噴灑的目的而施加高電壓於此，此外為了將分析物的質譜訊號利用積分的方式蒐集起來，因此在設計上必頇能讓紙片持續電噴灑，而為了持續電噴灑因此在實驗設計上必頇在仿鋼筆頭上設計一個凹槽以便儲存載流液體，並且在後方搭配注射幫浦達到不斷的補充載流液體的目的，因此實驗上以注射幫浦搭配 500 µL 注射針持續推送甲醇溶劑作為載流液體，另外在分析樣品上先將濾紙剪成 15 度的三角形，並且將三角形濾紙浸於含有分析物的溶劑中，而後用鑷子夾出濾紙便上機分析，分析終了後即可將濾紙丟棄，更換成含有下一個分析物的濾紙進行分析，實驗上能相當快速的更換分析物並且達到快速定性的目的。. PS-MS 儀器圖 21.

(29) tweezers. MS inlet. paper triangle. nib solution HV. syringe. 圖 3-4 紙片電噴灑游離質譜法示意圖. 22.

(30) 圖 3-5 紙片電噴灑質譜法裝置圖. 圖 3-6 紙片電噴灑質譜法近照 3-2. 常見雷射脫附游離之實驗方法 23.

(31) 3-2-1 大氣壓基質輔助雷射脫附質譜 (AP-MALDI-MS) 實驗中選用 337 nm 氮氣脈衝雷射進行脫附游離，氮氣雷射經過 10 倍聚焦鏡以及反射鏡後垂直聚焦於不鏽鋼基材上，藉由雷射脫附游離後分析物與基質混合物進入離子阱式質譜分析器進行分析，實驗中雷射聚焦的位置在質譜洞口前方 3 mm 處，並且在不鏽鋼基台上搭配平移台以便連續地提供待測物進行分析，分析物前處理部分是利用待測物與基質(1：1, v/v)混合後在常壓下置乾後進行分析，而實驗過程中所使用的基質是 CHCA (α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid)其分子量是 189，基質的分子量與分析物可明顯分辨，而實驗上每次以 2 µL 混合物置於不鏽鋼機材上，待其乾燥後即可上機分析。. AP-MALDI-MS 儀器圖 24.

(32) Stainless steel. 圖 3-7 AP-MALDI 儀器示意圖. 25.

(33) 圖 3-8 AP-MALDI 儀器裝置圖. 圖 3-9 AP-MALDI 中不鏽鋼基材與雷射聚焦位置. 26.

(34) 3-2-2. 電噴灑輔助雷射脫附游離質譜 (ELDI-MS). 實驗中同 AP-MALDI 的方式選用 337 nm 氮氣脈衝雷射進行分子脫附，雷射經過 10 倍聚焦鏡與反射鏡後聚焦於質譜洞口前方 3 mm 處，而與 AP-MALDI 不同的地方在於質譜的前方多架設了 ESI 游離源，ESI 的載流液體是選用純甲醇搭配注射幫浦，而甲醇的流速設定是以 4 µL/min 來進行實驗，此外為了要達到電噴灑的目的，實驗上在 ESI 噴頭上施加 3 kV 的高電壓於此，過程中分析物藉由雷射脫附後由電噴灑溶劑帶入質譜中進行分析。分析物部分是將六種鹵素安非他命標準品各別的溶在甲醇中在常壓下置乾於不鏽鋼基材上，置乾後不需要其他前處理步驟即可上機進行分析。. 27.

(35) ELDI 儀器圖. Stainless steel. 圖 3-10 ELDI 儀器示意圖. 28.

(36) 圖 3-11 ELDI 儀器裝置圖. 29.

(37) 3-2-3. 真空噴灑沉積法 (spray depositon). 樣品製備將分析物溶於甲醇後配成各種濃度的樣品進行真空噴灑沉積，儀器上以 250 µm 的毛細管拉細後 (~100 µm)的噴頭進行真空噴灑步驟，實驗中先將不鏽鋼基材放置在真空噴灑腔體中的機台上，接著蓋上真空噴灑裝置之噴頭蓋，之後開啟真空幫浦抽氣以及去除空氣中的雜質，抽 5 分鐘後再用純甲醇進行噴灑順便清洗不鏽鋼基材表面的不純物，接著將 40 µL 的分析物利用真空噴灑沉積至不鏽鋼基材上，過程中溶劑瞬間揮發，此時分析物以固體的方式均勻落在不鏽鋼基材上，而後即可上機進行分析。. 30.

(38) 3-3. 儀器及周邊設備列表. 儀器設備. 廠牌. 型號. 高壓直流電源供應器. Gamma,FL,USA. Model RR30-2R. 毛細管. J&W Scientific,CA,USA. FS,Undeactivated 16-2650. LC/MS. Thermo Finnigan. LCQ. Rotary pump. EDWARDS. EM 30. Centrifugal evaporator. EYELA. Model: CVE-1000. 電子天平. ELECTRONIC BALANCE. ER-120A. 0.1 mg~120 g. ------. 100~1000 L 10~100 L 1~10 L. 微量吸量管. Eppendorf. 規格及示意圖  0~30 kV, 0~2 mA, reversible I.D：75 µm O.D：375 µm. 超音波震盪器. BRANSONIC. B2200R-4. 110 V 50/60 Hz 1.8 AMPS. 高速離心機. -------. Serial N.O : 026702. Max: 6000 rpm 1.5 mL. 氮氣脈衝雷射. Spectra physic. Serial N.O : Z066338. 31.

(39) 3-4. 藥品列表藥品名. 化學式. 結構式 CH3. 2-fluoro-amphetamine. C9H12NF F. NH2. CH3. 3-fluoro-amphetamine. C9H12NF. NH2 F CH3. 4-fluoro-amphetamine. C9H12NF. NH2. F. CH3. 2-chloro-amphetamine. C9H12NCl Cl. NH2. CH3. 3-chloro-amphetamine. C9H12NCl. NH2 Cl CH3. 4-chloro-amphetamine. C9H12NCl Cl. 藥品來源：皆由前憲兵司令部刑事鑑定中心柳如宗中校提供. 32. NH2.

(40) 藥品名. 化學式. Acetonitrile (ACN). CH3CN (Merck). Methyl alcohol (MeOH). CH3OH (Merck). Hexane. C6H12 (Acros). Ethyl acetate. CH3COOC2H5. Ammonium acetate. CH3COONH4. 結構式 N. CH3. H3C OH. CH3. H 3C O. α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid. H3C. H H N H H. HO. O. CH3. O CH CH3 O. N. C10H7NO3. OH O. 33.

(41) 第四章. 研究結果與討論. 實驗上分四個部分討論 1. 一開始由於這兩種分析方法均是自製式的，因此需要位置上的最佳化，本部分利用偵測 4-chloro-amphetamine 進行位置最佳化。在此兩種自製游離源模式下均使用正電壓模式下進行分析，並且進一步進行比較以及討論。 2. 第二部分則是利用兩種鹵素安非他命混合物進行 CE-ESI-MS 的分離實驗以及討論。 3. 第三部分是利用液液萃取將 4-chloro-amphetamine 濫用藥物加入唾液檢體中進行前處理，再將萃取後再回溶的樣品進行 PS-MS 以及 CE-ESI-MS 的分析。 4. 第四部份則是比較各種游離源 (AP-MALDI、ELDI 等方法)對 4-chloro-amphetamine 的分析結果與討論。. 34.

(42) 自製鋼筆頭式 PS-MS 及 CE-ESI-MS 位置最佳化. 4-1. PS-MS 實驗條件確立在過去對 PS-MS 的研究以及實驗上得知當使用濾紙的角度不同會導致離子化效率的不同，經過實驗上的測詴發現當濾紙角度小於 30 度時有較佳的離子化效率，但是當濾紙小於 15 度時其離子化效率變降低，因此最後選擇了離子化效率最佳的 15 度濾紙作為實驗條件。另外在注射幫浦的設定上起初是以 4 µL / min 進行實驗，但是實驗中發現這樣的流速會導致電噴灑的不連續，因此測詴了不同流速的實驗，最後是當流速調高至 6 µL / min 時的 PS-MS 才能穩定的連續噴灑，因此實驗上的流速設定均以 6 µL / min 來進行實驗。此外為了找到三角形濾紙最適合電噴灑位置，實驗上在質譜前方設計了一個 2-D 平面 20 mm x 10 mm (X by Y)來進行位置最佳化的實驗，並且以每移動 1 mm 為一次實驗進行分析，而在分析物上每次進樣量為 5 µL 的 10 ppm 4-chloro-amphetamine，並且施加 3 kV 的高電壓於此進行實驗。質譜部分則是選用正電荷模式進行實驗，而質譜可以偵測的範圍設定從 100 到 300 m/z。. 35.

(43) PS-MS 位置校正圖. Y 22 20 18. 8E5 7E5 6E5 5E5 4E5 3E5 2E5 1E5. 16 14 12 10 8 6 4. (mm). Distance away from the MS inlet in Y direction (mm). 4-1-1. 2. position of MS inlet -4. -2. 0. 2. 4. X. Distance away from the MS inlet in X direction (mm). 圖 4-1 PS-MS 位置最佳化之平面圖. 36.

(44) 由圖 4-1 中可以知道大約在距離質譜前方座標由 (3 , 6)、(3 , 9)、 (-3 , 6)、(-3 , 9)所圍成的 6 mm x 3 mm ( X by Y )範圍內均有較好的訊號，這與文獻上的結果相當吻合[12]，而在圖中也可以發現到有訊較佳的點存在，此點與質譜的直線距離大約是 7 mm，除此之外，在 PS-MS 的偵測極限上相較於 AP-MALDI、ELDI 來得低許多，由表 4-1 中可以得知 AP-MALDI 的偵測極限大約是 7 ppm，另外 ELDI 則是大約 3 ppm，而 PS-MS 則是大約 0.1 ppm 明顯的較上述兩者來得高出許多。由於實驗上 AP-MALDI 及 ELDI 都是使用氮氣脈衝雷射 (337 nm) 進行游離化，因此對於雷射去游離會有甜點的問題，也就是會因為分析物結晶程度的不同而導致所偵測到的訊號不一致的現象，另外傳統 AP-MALDI 的分析上要將分析物與基質混合後結晶，因此也要避免基質對分析物的干擾，所以就方便性是 ELDI 較佳，但就 ELDI 的偵測極限而言卻不如 PS-MS，傳統上 PS-MS 必頇要讓濾紙保持濕潤，也就是要不斷地將載流液體補充到濾紙上，才能達到連續性的游離化進行分析，因此在此實驗中設計了一種鋼筆頭式的基台，此基台上有設計一個凹槽能將載流液體儲存在此，另外在後方仍有注射幫浦進行補充載流液體－甲醇，因此解決了過去傳統濾紙上液體噴灑完就結束分析的問題，此外由於實驗中容易導致分析物的溶劑在空氣中不斷地揮發，且每次進樣溶劑揮發的程度亦不同，因此實驗上要達到定量的分 37.

(45) 析有一定的困難。總結以上，在此自製鋼筆頭的 PS-MS 實驗上設計能同時達到高解析度的分析以及快速分析的目的。. 38.

(46) CE-ESI-MS 實驗條件確立然而如今分析樣品越來越複雜，因此分析物均需要進行分離後分析，如果只是利用 PS-MS 則沒有分離的效果，因此實驗上另一端設計了 CE-ESI-MS 來達到先分離後分析的目的，然而 CE-ESI-MS 並不是一項最新的技術，此實驗中自製的 CE-ESI 頭嘗詴不同口徑 0.2 mm、 0.3 mm 以及 0.5 mm 的 CE-ESI 噴頭，實驗中發現 0.3 mm 孔徑的分析結果較穩定因此較適合用來做 CE-ESI 的噴頭。在緩衝溶液的選用上由於質譜對緩衝溶液的要求較高，因此能進質譜的緩衝溶液不多，只要含有鹽類的緩衝溶液都不適合進質譜，因此傳統 CE-ESI-MS 上常見的緩衝溶液是較軟性的甲酸銨、醋酸銨，而實驗上選用是 10 mM 的醋酸銨 pH 值是 6.9 當作緩衝溶液。而在毛細管的選用長度 40 cm 的 75 µm 石英溶矽毛細管柱來分離分析物，此實驗上並未在毛細管柱上進行任何的修飾，毛細管僅進行 0.1 mM 氫氧化鈉進行活化即可進行實驗，而在進樣方式則是選擇較簡單的抬高 20 cm 進樣時間 10 秒，進樣後將毛細管放置緩衝溶液中即可開啟高電壓使毛細管電泳進行分離，在此所使用的高電壓為 15 kV。另外在載流液體是選用上是以易揮發性的液體，實驗上嘗詴過甲醇、異丙醇來作為載流液體，而結果上以純甲醇作為載流液體時較能 39.

(47) 穩定 CE-ESI 噴灑的效果，另外在流速設定上只要大於 3 µL / min 就能使 CE-ESI 運作，因此實驗上以 4 µL / min 的流速來進行實驗。接著為了最佳化 CE-ESI-MS 噴頭的位置而在質譜前設計了 10 mm x 12 mm (X by Y)的 2-D 平面，並且以每移動 2 mm 的距離進行進樣一次，實驗上選用 50 ppm 的 4-chloro-amphetamine 配在緩衝溶液裡來進行實驗。在質譜設定上選用正電荷模式進行實驗，而質譜所偵測的範圍為了能偵測到分析物而設定從 100 到 300 m/z。. 40.

(48) CE-ESI-MS 位置校正圖. Y 14 12 10 2.0E5 1.7E5 1.5E5 1.2E5 1.0E5 7.7E4 5.4E4 3.0E4 0.7E4. 8 6 4 2 0. (mm). Distance away from the MS inlet in Y direction (mm). 4-1-2. position of MS inlet. X. 0. 6 2 4 8 10 12 Distance away from the MS inlet in X direction (mm). 圖 4-2 CE-ESI-MS 位置最佳化之平面圖. 41.

(49) 由圖 4-2 上可以明顯發現 CE-ESI-MS 訊號最好的區域，而此區域較 PS-MS 訊號較佳的區域來得寬出許多，此外在訊號最佳位置的 CE-ESI 噴頭與質譜的直線距離與傳統的 CE-MS 比起來相對更接近質譜，因此與傳統 CE-MS 相比 CE-ESI-MS 藉由更靠近質譜能達到提升靈敏度的效果。除此之外，相較於這兩種游離方法來看，明顯的發現在 CE-ESI-MS 的最佳化位位置較 PS-MS 最佳會位置來得遠離質譜，而為了能更進一步討論，在處理數據上先將圖 4-1 中最佳位置的點與質譜拉一條直線，並且讀出直線上各位置的訊號強度後進行作圖，接著如法炮製的將圖 4-2 中的點讀出後進行作圖，而後將上述兩者的實驗數據整理成圖 4-3 來進行討論。. 42.

(50) PS-MS 及 CE-ESI-MS 最佳位置比較. 4-1-3. 800000. PS-MS (sample: 10 ppm) 700000 600000. Ion Intensity. paper-tip. CEESI-tip 13.5 mm. 8.5 mm. 500000. 15º 48º. MS inlet. 400000 300000. CE-ESI-MS (sample: 50 ppm) 200000 100000 0 0. 5. 10. 15. 20. Direct distance from the tip to the MS inlet (mm). 圖 4-3 PS-MS 及 CE-ESI-MS 最佳化位置與質譜的直線距離. 43. 25.

(51) 經過比較後從圖 4-3 中可以發現在 PS-MS 上最適合的直線距離大約是距離質譜 7.7 mm，並且濾紙尖端與質譜洞口呈 14 度的夾角，另外在 CE-ESI-MS 噴頭與質譜間最佳的直線距離是 13.5 mm，而噴頭與質譜的夾角大約是 48 度。實驗結果上可以發現在 PS-MS 所使用的分析物是 10 ppm 的 4-chloro-amphetamine，而在 CE-ESI-MS 分析上則是使用 50 ppm 的 4-chloro-amphetamine，很明顯由圖 4-3 發現 PS-MS 雖然使用濃度較低的分析物 (10 ppm)，但是所測得的離子強度反而較使用較高濃度分析物 (50 ppm)的 CE-ESI-MS 來得高出許多，實驗上推測由於 CE-ESI 的噴頭與質譜距離較遠，因此在形成泰勒錐 (Taylor cone)的時候容易因為距離較遠的關係 (13.5 mm)而影響進入質譜的離子數目，反觀在 PS-MS 上的濾紙尖端與質譜較近 (7.7 mm)所以進入質譜的離子數相對較多，因此 CE-ESI-MS 才會濃度明明較高而離子訊號強度較低的這項結果。然而分別找到最適當的距離後，整個系統可以在同一台質譜上選擇性的切換至 PS-MS 達到快速分析以及傳統的 CE-ESI-MS 的分離後質譜分析，以下便是分離兩種鹵素安非他命 4-chloro-amphetamine 及 4-fluoro-amphetamine 的電泳圖。. 44.

(52) 4-2. CE-ESI-MS 分離鹵素安非他命. 圖 4-4 分離兩種鹵素安非他命之毛細管電泳圖. 45.

(53) 由圖 4-4 中可以明顯發現此兩種鹵素安非他命完全的被分離，而此實驗所使用的緩衝溶液是用 10 mM 醋酸銨 (pH 6.9)溶在含有三種有機修飾劑的溶劑中，分別是 acetonitrile : methanol : water (12.5 : 17.5 : 70, v/v/v)，而毛細管上是選用長為 50 cm、內徑為 75 µm 的石英溶矽毛細管柱，並且施加 15 kV 的高電壓以及注射幫浦流速設定為 4 µL / min 的甲醇載流液體。實驗上一開始基線相當不穩，所以只挑選 m/z 為 150 到 200 這範圍來觀察實驗，另外為了能更清楚觀察分析物而做了挑選待分離物 4-fluoro-amphetamine、4-chloro-amphetamine (154、170 m/z)的電泳圖，可以很明顯地看到兩種鹵素安非他命成功的被分離，而被分離的先後順序與 CZE-UV 順序相同，鹵素安非他命因為在游離化的過程中均僅帶一個正電，因此分子較小的含氟的安非他命會較含氯的安非他命來得快被電滲流推出，而此兩種安非他命被分開的時間大約 1 分鐘，另外在 CE-ESI-MS 的偵測極限上能偵測到鹵素安非他命的最低濃度是 250 ppb，而偵測極限的電泳圖則在圖 4-4 中右邊的小圖，實驗中所使用的分析物是 4-chloro-amphetamine，當然以上 CE-ESI-MS 的成果用 LC-MS 也能辦得到，但是基於 LC-MS 容易浪費溶劑以及在架設儀器上要有空間能容納兩種不同的游離源 (LC-MS、PS-MS)在空間上相當困難，因此選用較簡易且不占空間的 CE-ESI-MS 搭配 PS-MS。 46.

(54) 4-3. 鹵素安非他命之真實樣品的應用. 4-3-1 唾液中鹵素安非他命的偵測在國內濫用藥物檢體中仍以尿液為主，但是由於尿液檢體容易造成尿液的稀釋及摻入干擾物質而影響偵測結果；然而血液檢體雖然準確度高，但血液是屬於侵入式的生物檢體方法且在操作上以及血液檢體組成上均有些繁複。因此近年來開發非侵入式採樣生物檢體的方法如擷取毛髮、唾液、汗液等方法，而本實驗所使用的生物檢體為唾液，唾液的優點是取得快速以及容易且不受時間、地點的限制，此外在取得生物檢體的過程中亦可全程監察，藉此避免在取樣過程中摻入一些干擾分析結果的物質，此外在監控人員上亦不需要專業人員在場即可，因此唾液檢體方法是用於現場立即性的藥物檢驗及篩選。. 47.

(55) 4-3-2. 真實樣品前處理. 在真實樣品上，由於無法直接取得吸食濫用藥物者的生物檢體，因此實驗上以額外添加的方式來做以下真實樣品的液液萃取實驗。唾液樣品取自健康且無不良嗜好的實驗室同仁中，將鹵素安非他命標準品添加至唾液樣品中，藉由液液萃取法[82-83]將鹵素安非他命回收，以濃度 5 mg/L 為例，萃取步驟如下： 1. 首先將取得的唾液樣品放入離心管中進行離心約 2 分鐘，而後取出 495 µL 的上層唾液樣品至微量離心管中，接著加入 5 µL 濃度為 500 mg/L 的 4-chloro-amphetamine 標準品。 2. 接著加入 250 µL 濃度為 0.2 M 醋酸銨溶液且加入氨水將 pH 值調整到 9。 3. 加入 1.3 mL 的乙酸乙酯：己烷 (4 : 1, v/v)的有機混和溶劑，震盪約 1 分鐘，使待測分析物被帶到有機相並達成分配平衡，再離心 5 分鐘後使其分層完全，此時上層液為有機相而下層液為水相。 4. 取上層有機液進行真空抽乾後，再加入 0.5 mL 適當溶劑使萃取物完全溶解。 5. 將萃取完成的分析物取出後進行過濾 (0.45 µm)，過濾後即可上機分析。. 48.

(56) 唾液檢體萃取應用. 圖 4-5 (A)唾液萃取之 PS-MS 質譜(B)唾液萃取之 CE-ESI-MS 電泳圖(C)唾液萃取之 CE-UV 電泳圖. 49.

(57) 由上圖 4-5-A 可以明顯發現在 PS-MS 質譜中有一些唾液中的一些雜訊，此外亦可明顯得觀察到 4-chloro-amphetamine 標準品的質譜訊號，而在唾液萃取的部分使用鋼筆頭式 PS-MS 下的偵測極限可以大約在 0.5 ppm，因此本實驗所設計的鋼筆頭式 PS-MS 能在大氣壓力下進行快速分析鹵素安非他命。另外圖 4-5-B 中的電泳圖是使用 10 mM 醋酸銨 (pH 6.9)當作緩衝溶液，並且將唾液萃取後的產物以抬高進樣的方式進樣 10 秒鐘，由圖 4-5-B 中可以觀察到當質譜範圍鎖定在 154-172 m/z 的電泳圖中含有 4-chloro-amphetamine 的唾液萃取物約在 6.5 min 的時候被電滲流推出，另外本實驗搭配 CZE-UV 系統[80-81]觀察到在鹵素安非他命後仍有一些唾液中雜質的訊號，因此本實驗所自製的 CE-ESI-MS 是一種簡單且有用的分離後分析的技術。. 50.

(58) 4-4. 雷射脫附游離源偵測鹵素安非他命本實驗除了 CE-ESI-MS、PS-MS 游離方法亦也嘗詴了較傳統的. AP-MALDI 以及 ELDI 等方法。 (一) AP-MALDI 在 AP-MALDI 的游離方式下選用 337 nm 氮氣脈衝雷射進行游離，而雷射是以與基材垂直的方向聚焦在不鏽鋼基材上，此外雷射所聚焦而成的游離源約在質譜洞口前方約 3 mm 處進行游離，另外分析物部分則是將待測物與 CHCA 進行混合後將其混合物滴在不鏽鋼基材上置乾 (2 µL)，待其乾燥後便可上機分析。首先在分析物與基質混合的比例上經過各種嘗詴後，當分析物：基質 (1：1, v/v)混合時其質譜訊號較佳，此外所使用基質的濃度是 10000 ppm，在以上條件下對六種鹵素安非他命進行分析。. 51.

(59) 100. Relative abundance (%). 153.9. CH3. 80. F. 189.9. NH2. 60. *. 40. 20. 0 100. 110. 120. 130. 140. 150. 160. 170. 180. 190. 200. m/z 100. 153.9 CH3. Relative abundance (%). 80. NH2 F. 60. 189.9 40. * *. 20. 0 100. 110. 120. 130. 140. 160. 170. 180. 190. 200. m/z. 100. 153.9. CH3. 80. Relative abundance (%). 150. NH2. F 60. 40. *. 189.9. *. 20. 0 100. 110. 120. 130. 140. 150. 160. 170. 180. 190. 200. m/z. 圖 4-6 AP-MALDI 偵測 4-fluoro-amphetamine 質譜圖 52.

(60) 100. CH3. Relative abundance (%). 80. Cl. NH2. 169.9. 60. 40. *. 189.9 *. 20. 0 100. 110. 120. 130. 140. 100. 160. NH2 60. 170. 180. 190. 200. CH3. 80. Relative abundance (%). 150. m/z. 169.9. Cl. 40. * 189.9. 20. 0 100. * 110. 120. 130. 140. 150. 160. 170. 180. 190. 200. m/z 100. CH3. Relative abundance (%). 80. NH2. Cl. 169.9. 60. 189.9. 40. * *. 20. 0 100. 110. 120. 130. 140. 150. 160. 170. 180. 190. 200. m/z. 圖 4-7 AP-MALDI 偵測 4-chloro-amphetamine 質譜圖 53.

(61) 實驗上是使用 10 倍聚焦鏡將 337 nm 脈衝氮氣雷射打在不鏽鋼基材上，實驗過程中由於雷射聚焦程度不同而在不鏽鋼基材上會產生亮點的形狀亦不同，因此實驗上統一將聚焦鏡調整到聚焦後的亮點為最亮進行實驗 (約 0.5 mm)，而實驗中也可藉由亮點位置辨識雷射所聚焦的位置約在質譜正前方 (3 mm)進行實驗，由圖 4-6、4-7 中不僅僅只有待測物的質譜訊號 (m/z：154、170)，此外也可以明顯看到 CHCA 的質譜訊號 (m/z：190)，另外在此兩張圖中均會發現兩個質譜訊號分別是 146、149，這兩個質譜訊號在做空白測詴時也同時存在，因此在這實驗中歸類為背景訊號。實驗過程中無可避免的有甜點 (sweet spot)的問題，因此要不斷地移動平移台來找到訊號最佳的位置，而當雷射聚焦在相同位置下該點的分析樣品會因脈衝雷射游離後而逐漸減少，因此必頇持續地移動平移台以便實驗上連續的偵測分析物，另外當樣品濃度低於 5 ppm 時在質譜訊號上即不明顯，因此本實驗中 AP-MALDI 的游離方法其偵測極限大約在 7 ppm 左右。. 54.

(62) (二) ELDI (dried droplet) 實驗上將 ESI 游離源架設起來確定質譜訊號有連續性後在質譜與 ESI 噴頭中間放入不鏽鋼基材，而 ESI 中載流液體 (MeOH) 的流速設定為 4 µL/min，並且在 ESI 噴頭上施加 3 kV 的高電壓以利形成泰勒錐，接著利用 337 nm 脈衝氮氣雷射搭配 10 倍聚焦鏡聚焦至含有分析物的不鏽鋼基材上，此雷射所經路徑亦同上述之 AP-MALDI 之路徑，另外雷射聚焦的位置大約在質譜洞口前方 3 mm。在分析物準備上是直接將分析物溶在甲醇溶液中隨後利用微量滴管取 2 µL 至不鏽鋼基材上，將分析物置於不鏽鋼基材後在空氣下置乾後即可上機分析。. 55.

(63) 100. CH3. Relative abundance (%). 80. F. 154.0. NH2. 60. *. 40. *. 20. 0 100. 110. 120. 130. 140. 150. 160. 170. m/z 100. CH3. Relative abundance (%). 80. NH2. 154.0. F. 60. * 40. *. 20. 0 100. 110. 120. 130. 100. 150. 160. 170. CH3. 80. Relative abundance (%). 140. m/z. NH2. F. * 154.0. 60. 40. *. 20. 0 100. 110. 120. 130. 140. 150. 160. 170. m/z. 圖 4-8 ELDI 偵測 4-fluoro-amphetamine 質譜圖 56.

(64) 100. CH3. Relative abundance (%). 80. Cl. 170.0. NH2. 60. * 40. *. 20. 0 100. 110. 120. 130. 140. 150. 160. 170. m/z 100. CH3. Relative abundance (%). 80. 170.0. NH2 Cl. 60. *. 40. *. 20. 0 100. 110. 120. 130. 140. 150. 160. 170. m/z 100. CH3. Relative abundance (%). 80. 170.0. NH2. Cl. *. 60. 40. *. 20. 0 100. 110. 120. 130. 140. 150. 160. 170. m/z. 圖 4-9 ELDI 偵測 4-chloro-amphetamine 質譜圖 57.

(65) 實驗中起初 ESI 噴頭是正對質譜的洞口，但是發現實驗中容易造成電噴灑的不連續性，為了解決這問題實驗上 ESI 噴頭刻意避開正對質譜洞口，實驗上選擇偏離質譜的洞口約 1.5 mm 然而意外的發現解決了電噴灑不連續的問題，此外刻意偏離質譜洞口亦可以避免因未帶電之物質直接進入質譜而弄髒。實驗上很順利地偵測到此六種鹵素安非他命標準品，此游離方式的訊號較 AP-MALDI 來得高出許多，主要原因推測是 ESI 的游離過程中會將被雷射脫附出的分析物全部蒐集並帶電進而進入質譜中，相較於 AP-MALDI 是僅僅靠雷射脫附游離而帶電，僅靠雷射游離容易因為雷射脫附的方向性導致無法使被脫附的分析物完全地進入質譜中，而在 ELDI 中改善了這項問題使被雷射脫附的分析物全部在 ESI 路徑中進行帶電後進入質譜分析。由於 ELDI 的方式其質譜訊號強度較 AP-MALDI 高出許多，因此 ELDI 的偵測極限也順利降低到 4 ppm 左右，但是在分析物上仍有甜點上的問題。. 58.

(66) (三) ELDI (spray deposition) 為了解決甜點的問題，參考過去文獻[84]曾經在 MALDI 上將分析物與基質混合後利用真空噴灑的方式塗布在不鏽鋼基材上，有鑑於此，將此方式應用在 ELDI 上。首先在樣品製備上較不同於傳統常壓下置乾，利用拉細毛細管搭配幫浦將其噴灑沉積在不鏽鋼基材上，實驗上嘗詴過 50 µm、 75 µm、250 µm 三種不同內徑的毛細管進行拉細，但以上僅僅只有 250 µL 的效果較佳，而每次拉細的程度亦不同，因此實驗上盡量能拉一次毛細管就分析完六種分析物，而實驗上所使用的拉細毛細管內徑大約 100 µm。藉由以上真空噴灑沉積法的前處理後，讓分析物與機材在幫浦的幫忙下放置抽真空一陣子待其乾燥即可上機進行分析。. 59.

(67) 100. 154.1 CH3. Relative abundance (%). 80. F. NH2. 60. * 40. * 20. 0 100. 110. 120. 130. 100. 150. 160. 170. 154.1. CH3. 80. Relative abundance (%). 140. m/z. *. NH2 F. 60. * 40. 20. 0 100. 110. 120. 130. 140. 150. 160. 170. m/z. 100. 154.1. CH3. Relative abundance (%). 80. NH2. F 60. *. 40. * 20. 0 100. 110. 120. 130. 140. 150. 160. 170. m/z. 圖 4-10 真空噴灑配 ELDI 偵測 4-fluoro-amphetamine 質譜圖 60.

(68) 100. 170.1. CH3. Relative abundance (%). 80. Cl. NH2. 60. *. 40. *. 20. 0 100. 110. 120. 130. 140. 150. 160. 170. m/z. 100. 170.1. CH3. Relative abundance (%). 80. NH2 Cl. 60. * 40. * 20. 0 100. 110. 120. 130. 140. 150. 160. 170. m/z. 100. * CH3. Relative abundance (%). 80. NH2. Cl. 170.1. 60. * 40. 20. 0 100. 110. 120. 130. 140. 150. 160. 170. m/z. 圖 4-11 真空噴灑配 ELDI 偵測 4-chloro-amphetamine 質譜圖 61.

(69) 實驗中在移動平移台時明顯可以感覺到此方法解決了一般常壓下置乾容易造成的結晶問題，一般常壓下容易造成某些區塊訊號特別的強反之特別的弱，在真空噴灑沉積下每移動一次平移台其訊號強度均差不多。由圖 4-10、4-11 中可以明顯發現分析物的質譜訊號較一般常壓下置乾來得明顯許多，因此偵測極限亦可繼續往低濃度嘗詴，就實驗結果來看，真空噴灑沉積法的偵測極限與一般常壓置乾相比來得低一個數量級。總結以上這項前處理辦法雖然可以降低偵測極限以及提高分析物的均勻度，但是前處理方面太過費時，此外毛細管拉細部分容易塞管而導致整個實驗需要重來。. 62.

(70) 4-5. 各種游離源偵測鹵素安非他命之整理總結以上實驗過程中嘗詴相當多種方式進行分析六種鹵素安非. 他命，而每個方法各有利弊，AP-MALDI 需要麻煩的前處理步驟且有甜點的問題，而 ELDI 部分上雖然在真空噴灑沉積法可以改善甜點的問題，但是過於麻煩的前處理步驟以及真空噴灑的毛細管容易塞管而就此作罷，實驗中將以上多種游離源之偵測極限整理成表 4-1，由表中得知快速且靈敏度最佳的分析方法是 PS-MS，況且 PS-MS 架設簡單且能快速地得知分析結果，但是基於分析物日漸困難因此還需要搭配能達到前分離的質譜技術，因此實驗最後是以 PS-MS 搭配 CE-ESI-MS 進行討論。. 63.

(71) Aph-o-F AP-MALDI (dried droplet) LOD (μg/mL) ELDI (dried droplet) LOD (μg/mL) ELDI (spray deposition) LOD (μg/mL) Paper spray (filter paper) LOD (μg/mL). 7.0 ± 25%. Aph-m-F. 7.1 ± 32%. Aph-p-F. Aph-o-Cl. 7.87 ± 26% 7.99 ± 29%. 3.73 ± 30% 3.73 ± 25% 3.10 ± 31% 3.53 ± 25%. 0.26 ± 15% 0.26 ± 18% 0.28 ± 13% 0.29 ± 11%. 0.11 ± 6%. 0.13 ± 9%. 0.12 ± 6%. Aph-p-Cl. 8.10 ± 28%. n=7 8.41 ± 21%. 4.17 ± 22%. n=7 2.99 ± 29%. 0.29 ± 12%. n=7 0.34 ± 13%. 0.098 ± 5% 0.13 ± 7%. 表 4-1 六種鹵素安非他命偵測極限表格. 64. Aph-m-Cl. n=7 0.10 ± 9%.

(72) 第五章. 結論. 本實驗設計了能選擇性的切換快速篩選分析 (PS-MS)以及藉由毛細管電泳分離後分析(CE-ESI-MS)的技術。當需要進行快速分析時僅需要將濾紙沾上分析物即可放在自製鋼筆頭式 PS-MS 上進行分析，而此方法不但快速而且偵測極限也相當低 (LOD：0.1 ppm)；另外如果遇到分析物太複雜而需要電泳分離步驟時即可使用另一種游離方法(CE-ESI-MS)進行分離後分析，在 CE-ESI-MS 上架設上簡單且能達到分離效果，同時其偵測極限亦可達到 0.25 ppm 左右。由於兩種方法皆是自製因此需要位置上的最佳化，實驗上也成功的將位置最佳化進而達到較佳的偵測極限，此外在應用上也成功地利用取得的唾液檢體加入標準品後進行分析。因此本實驗系統是一個相當靈敏的分析方法，無論是快速篩選或正式規定的使用在法醫和臨床分析上。總結以上，本實驗方法是一種簡單、經濟且互補性強的方法。. 65.

(73) 參考文獻 [1]. C. H. Frith, L. W. Chang, D. L. Lattin, R. C. Walls, J. Hamm, R. Doblin, Fundamental and Applied Toxicology 9 (1987) 110.. [2]. K. Pihlainen, K. Grigoras, S. Franssila, R. Ketola, T. Kotiaho, R. Kostiainen, J. Mass Spectrom. 40 (2005) 539.. [3]. S. L. Chong, T. Nissila, R. A. Ketola, S. Koutaniemi, M. Derba-Maceluch, E. J. Mellerowicz, M. Tenkanen, P. Tuomainen, Anal. Bioanal.Chem. 401 (2011) 2995.. [4]. M. Cui, M. A. McCooeye, C. Fraser, Z. Mester, Anal. Chem. 76 (2004) 7143.. [5]. K. Shrivas, H. F. Wu, Rapid Commun. Mass Spectrom.21 (2007) 3103.. [6]. M. Z. Huang, S. S. Jhang, C. N. Cheng, S. C. Cheng, J. Shiea, Analyst 135 (2010) 759.. [7]. I. X. Peng, R. R. O. Loo, E. Margalith, M. W. Little, J. A. Loo, Analyst 135 (2010) 767.. [8]. I. X. Peng, J. Shiea, R. R. O. Loo, J. A. Loo, Rapid Commun. Mass Spectrom.21 (2007), 2541.. [9]. S. C. Cheng, Y. S. Lin, M. Z. Huang, J. Shiea, Rapid Commun. Mass Spectrom.24 (2010) 203.. [10]. J. Liu, H. Wang, N. E. Manicke, J. M. Lin, R. G. Cooks, Z. Ouyang, Anal. Chem. 82 (2010) 2463.. [11]. Q. Yang, H. Wang, J. D. Maas, W. J. Chappell, N. E. Manicke, R. G. Cooks, Z. Ouyang, Int. J. Mass Spectrom. 312 (2012) 201.. [12]. Z. Zhang, W. Xu, N. E. Manicke, R. G. Cooks, Z.Ouyang, Anal. Chem. 84 (2012) 931.. [13]. N. E. Manicke, Q.Yang, H. Wang, S. Oradu, Z. Ouyang, R. G. Cooks, Int. J. Mass Spectrom. 300 (2011) 123.. [14]. B. Hu, P. K. So, H. Chen, Z. P. Yao, Anal.Chem. 83 (2011) 8201. 66.

(74) [15]. K. Huikko, P. Ostman, C. Sauber, F. Mandel, K. Grigoras, S. Franssila, T. Kotiaho, R. Kostiainen, Rapid Commun. Mass Spectrom. 17 (2003) 1339. [16] P. K. Salo, H. Salomies, K. Harju, R. A. Ketola, T. Kotiaho, J. Yli-Kauhaluoma, R. Kostiainen, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16 (2005) 906. [17]. H. F. Wu, C. H. Lin, Rapid Commun. Mass Spectrom.20 (2006) 2511.. [18] J. M. Daniel, V. V. Laiko, V. M. Doroshenko, R. Zenobi, Anal. Bioanal.Chem. 383 (2005) 895. [19] T. Keough, M. P. Lacey, R. J. Strife, Rapid Commun. Mass Spectrom.15 (2001) 2227. [20] P. M. Remes, G. L. Glish, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20 (2009) 1801. [21] W. E. Steiner, B. H. Clowers, W. A. English, H. H. Hill, Rapid Commun. Mass Spectrom.18 (2004) 882. [22] S. Trimpin, E. D. Inutan, T. N. Herath, C. N. McEwen, Anal. Chem. 82 (2010) 11. [23]. H. Wei, K. Nolkrantz, D. H. Powell, J. H. Woods, M. Ko, R. T. Kennedy, Rapid Commun. Mass Spectrom.18 (2004) 1193.. [24]. K. Shrivas, H. F. Wu, Anal. Chem. 80 (2008) 2583.. [25]. I. X. Peng, J. Shiea, R. R. O. Loo, J. A. Loo, Rapid Commun. Mass Spectrom.21 (2007) 2541.. [26] J. Dong, Y. H. Rezenom, K. K. Murray, Rapid Commun. Mass Spectrom.21 (2007) 3995. [27]. F. Musshoff, J. Trafkowski, U. Kuepper, B. Madea, J. Mass Spectrom. 41 (2006) 633.. [28]. M. ndersson, E. ustavsson, N. Stephanson, O. eck, J. Chromatogr B 861 (2008) 22.. [29]. M. Concheiro, S. M. S. S. Simoes, O. Quintela, A. Castro, M. J. R. Dias, A. Cruz, M. Lopez-Rivadulla, Forensic Sci. Int. 171 (2007) 44. 67.

(75) [30]. Van Bocxlaer, J. F., Clauwaert, K. M., Lambert, W. E., Deforce, D. L., Van den Eeckhout, E. G., & De Leenheer, A. P. , Mass spectrum. Rev. 19 (2000) 165.. [31]. A. Numan, N. D. Danielson, Anal. Chim.Acta 460 (2002) 49.. [32]. E. Tanaka, T. Kanata, M. Katagi, H. Tsuchihashi, K. Honda, Forensic Sci. Int. 163 (2006) 152.. [33] S. Laks, A. Pelander, E. Vuori, E. Ali-Tolppa, E. Sippola, I. Ojanpera, Anal. Chem. 76 (2004) 7375. [34] T. Kamata, M. Katagi, H. Tsuchihashi, Forensic Toxicol. 28 (2010) 1. [35] S. D. Brandt, S. Freeman, I. A. Fleet, P. McGagh, J. F. Alder, Analyst 130 (2005) 330. [36]. UshtanaAntia, M.Sc., Malcolm D. Tingle, Ph.D., Bruce R. Russell, Ph.D., J Forensic Sci. 55 (2010) 1311.. [37] Sleno L, Staack RF, Varesio E, Hopfgartner G, Rapid Commun. Mass Spectrom.21 (2007) 2301. [38] T. L. Chang, K. W. Chen, Y. D. Lee, K. Fan, J. Clin. Lab. Anal. 13 (1999) 106. [39] Simon Elliott, Bioanalysis 3 (2011) 249. [40]. A. Ramseier, C. Siethoff, J. Caslavska, W. Thormann, Electrophoresis 21 (2000) 380.. [41]. M. Nieddu, G. Boatto, G. Dessi, J. Chromatogr. B 852 (2007) 578.. [42]. G. Boatto, M. Nieddu, A. Carta, A. Pau, M. Palomba, B. Asproni, R. Cerri, J. Chromatogr. B 814 (2005) 93.. [43]. Y. T. Iwata, T. Kanamori, Y. Ohmae, K. Tsujikawa, H. Inoue, T. Kishi, Electrophoresis 24 (2003) 1770.. [44]. M. Nieddu, G. Boatto, M. A. Pirisi, G. Dessi, Rapid Commun. Mass Spectrom.24 (2010) 2357.. [45]. R. Iio, S. Chinaka, N. Takayama, K. Hayakawa, J. Health Sci. 51 (2005) 693.. [46]. D. L. Lin, R. M. Yin, R. H. Liu, J. Food Drug Anal. 13 (2005) 193. 68.

(76) [47]. H. Fujii, K. Hara, M. Kageura, M. Kashiwagi, A. Matsusue, S. Kubo, Forensic Toxicology 27 (2009) 75.. [48]. A. A. Marais, J. B. Laurens, Forensic Sci. Int. 183 (2009) 78.. [39]. P. Meng, D. Zhu, H. He, Y. Wang, F. Guo, L. Zhang, Anal.Sci. 25 (2009) 1115.. [50] Westphal F, Junge T, Girreser U, Stobbe S, Perez SB, Forensic Sci. Int. 187 (2009) 87. [51]. Abdel-Hay KM, Awad T, DeRuiter J, Clark CR, Forensic Sci. Int. 195 (2010) 78.. [52]. Hiroyuki Inoue, Yuko T. Iwata, TatsuyukiKanamori, Hajime Miyaguchi, Kenji Tsujikawa, Kenji Kuwayama, HiroeTsutsumi, MunehiroKatagi, Hitoshi Tsuchihashi, TohruKishi, Jpn. J. Sci. Tech. Iden. 9 (2004) 165.. [53]. M. Pellegrini, F. Rosati, R. Pacifici, P. Zuccaro, F. S. Romolo, A. Lopez, J. Chromatogr. B 769 (2002) 243.. [54]. A. Nakamoto, A. Namera, M. Nishida, M. Yashiki, T. Kuramoto, K. Kimura, Forensic Toxicol. 25 (2007) 1.. [55] T. Kanamori, K. Kuwayama, K. Tsujikawa, H. Miyaguchi, Y. Iwata, H. Inoue, T. Kishi, J. Health Sci. 52 (2005) 425. [56]. F. Centini, A. Masti, I. B. Comparini, Forensic Sci. Int. 83 (1996) 161.. [57] J. M. Wilson, F. McGreoge, S. Smolinske, R. Meatherall, Forensic Sci. Int. 148 (2005) 31. [58] S. D. Brandt, D. Mansell, S. Freeman, I. A. Fleet, J. F. Alder, J. Pharm. Biomed. Anal.41 (2006) 872. [59] S. P. Vorce, J. H. Sklerov, J. Anal. Toxicol.28 (2004) 407. [60]. B. Holmstedt, W. J. A. Vandenheuvel, W. L. Gardiner, E. C. Horning, Anal. Biochem.81 (1964) 51.. [61]. D. Hensley, J. T. Cody, J. Anal. Toxicol.235 (1999) 18.. [62] C. Jurado, M. P. Gimenez, T. Soriano, M. Menendez, M. Repetto, J. Anal. 69.

(77) Toxicol.24 (2000) 11. [63] J. L. Valentine, R. Middleton, J. Anal. Toxicol.24 (2000) 211. [64] Segura, J., Ventura, R., Jurado, C., J. Chromatogr. B Biomed Sci. Appl. 713 (1998) 61. [65] R. Kikura-Hanajiri, M. Hayashi, K. Saisho, Y. Goda, J. Chromatogr. B 825 (2005) 29. [66]. M. Takahashi, M. Nagashima, J. Suzuki, T. Seto, I. Yasuda, T. Yoshida, J. Health Sci. 54 (2008) 89.. [67] T. Kanamori, K. Kuwayama, K. Tsujikawa, H. Miyaguchi, Y. T. Iwata, H. Inoue, Xenobiotica 38 (2008) 1476. [68] T. Kamata, M. Katagi, H. Kamata, A. Miki, N. Shima, K. Zaitsu, M. Nishikawa, H. Tsuchihashi, J. Health Sci. 53 (2007) 585. [69]. M. Gros, M. Petrovic, D. Barcelo, Talanta 70 (2006) 678.. [70] J. K. Eng, A. L. McCormack, J. R. Yates, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 5 (1994) 976. [71] S. Souverain, S. Rudaz, J. L. Veuthey, J. Pharm. Biomed. Anal.35 (2004) 913. [72]. M. J. Bogusz, H. Hassan, E. Al-Enazi, Z. Ibrahim, M. Al-Tufail, J. Pharm. Biomed. Anal.41 (2006) 554.. [73] P. Garcia, A. C. Paris, A. Leufroy, M. A. Popot, Y. Bonnaire, Biomed. Chromatogr.26 (2012) 534. [74]. E. I. Miller, F. M. Wylie, J. S. Oliver, Journal of Analytical Toxicology 32 (2008) 457.. [75]. N. Zhang, K. L. Hoffman, W. Li, D. T. Rossi, J. Pharm. Biomed. Anal.22 (2000) 131.. [76] S. Pedersen-Bjergaard, K. E. Rasmussen, J. Chromatogr. A 1184 (2008) 132. [77] S. Steinbormer, J. Henion, Anal. Chem. 71 (1999) 2340. [78] C. K. Lai, T. Lee, K. M. Au, Y. W. Chen, Clinical Chemistry 43 (1997) 312. 70.

(78) [79]. B. Dirion, F. Lanza, B. Sellergren, C. Chassaing, R. Venn, C. Berggren,Chromatographia 56 (2002) 237.. [80]. C. C. Tsai, J. T. Liu, Y. R. Shu, P. H. Chan, C. H. Lin, J. Chromatogr. A 1101 (2006) 319.. [81]. Y. Y. Yang, J. T. Liu, C. H. Lin, Electrophoresis 30 (2009) 1084. [82]. M. Yonamine, N. Tawil, R. L. D. Moreau, O. A. Silva, J. Chromatogr. B 789 (2003) 73.. [83]. P. J. Meng, Y. Y. Wang, Forensic Sci. Int. 197 (2010) 80.. [84]. C. F. Lin, J. T. Liu, C. H. Lin, Analytical sciences 25 (2009) 845.. 71.

(79)