褐樹蛙(Buergeria robusta)的親緣地理學研究

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(1)目. 錄. 中文摘要…………………………………………………………...1. Abstract…………………………………………………………….2. 壹、前. 言………………………………………………………...3. 貳、材料與方法…………………………………………………...6. 參、結. 果………………………………………………………..11. 肆、討. 論………………………………………………………..18. 伍、謝. 誌………………………………………………………..23. 陸、參考文獻……………………………………………………..24. -0-.

(2) 中文摘要親緣地理學（phylogeography）討論當物種受到歷史地質事件影響時，族群遺傳結構所產生的改變，並利用建構物種的親緣關係與調查族群在地理上的分佈，來檢視族群分化的歷史。在臺灣針對兩棲爬行動物的研究大多支持山脈為臺灣島上對物種分化而言最主要的地理屏障，然而目前卻尚未有針對褐樹蛙（Buergeria robusta）這種棲息生態同時受到陸域及淡水域影響的全島廣布物種進行親緣地理學的研究。本研究採集全島33個採樣點一共564隻褐樹蛙個體，以粒線體DNA中的細胞色素b（cytochrome b）基因片段做為分子遺傳標記，建構基因單型的親緣關係樹（phylogeny）與網狀譜系圖（network），討論褐樹蛙各族群間的遺傳分化程度及分布擴散歷程，並與前人研究的淡水魚類或其他小型兩棲爬行動物相比較。結果顯示褐樹蛙在親緣關係上可以分成七個支系，在地理分佈上可以分成五個區域。其中東部區域由於受到中央山脈的阻隔，與其他區域形成高度分化，而成為一個獨立的系群。在西部族群中，東北部、北部、中部與南部區域之間的遺傳交流極為有限，也各自擁有特殊的單基因型，而雪山山脈、苗栗丘陵與臺灣堆均成為阻礙基因交流的地理屏障。在族群歷史變動的部分，大部分主要遺傳支序皆呈現歷史上的分布範圍擴張，而大多數的地理區域則呈現歷史上的族群數量成長。總結而論，在臺灣造成物種產生遺傳分化的地理障礙，幾乎每一項都會成為褐樹蛙基因交流上的地理障礙，因此本研究認為褐樹蛙的遺傳分化模式兼具陸域生物與水域生物特徵而自成一格的特殊模式。. 關鍵詞：族群遺傳、褐樹蛙、親緣地理學. -1-.

(3) Abstract The Brown Treefrog, Buergeria robusta (Boulenger, 1909) is endemic to Taiwan and is widely-distributed throughout the island. In this study, phylogeographic pattern and population genetic structure of B. robusta were investigated based on 1080-bp mitochondrial cytochrome b sequences. A total of 564 samples of B. robusta specimens from 33 populations were analyzed. Phylogenetic tree and haplotype network reconstruction both showed that the entire species could be divided into the western and the eastern lineages, showing the role of the Central Mountain Range as a major barrier separating the western and eastern populations. The western populations could be further divided into 6 minor genetic clades and 4 subregions with limited gene flow. High-level nested clades showed strong tendency of historical range expansion and most regional populations showed evidences of population expansion in their geological history. Compared to other vertebrates in Taiwan, B. robusta shows high congruence with both terrestrial amphibians/reptiles and freshwater fishes, showing a combination of both terrestrial and water-living characteristics.. Keywords: Buergeria robusta, phylogeography, population genetics. -2-.

(4) 壹、前. 言. 一、親緣地理學生物族群遺傳結構（population genetic structure）與地理分佈的現況，往往受到該物種生態學（ecology）、擴散能力（dispersal）、族群變動統計學（population demography）以及地區性的歷史地質隔離事件（historical vicariance）等因素所影響（Avise, 1986, 2000；Harrison & Hastings, 1996；Thomas, 2002）。物種受到地理屏障（geographic barrier）隔離之後，各族群間常會伴隨著遺傳分化（Harrison & 。當同一地區內多個物種呈現極為相似的親緣結構時， Hastings, 1996；Avise, 2000）而此分歧情況又與受到某特定地理屏障引致的結果相符合，甚至更進一步顯示此地理屏障是該地區物種種化的重要因子，如此一來就能夠在該地區找到許多符合「此地理屏障會構成物種分化」的相關證據（Avise, 2000）。 Avise等（1987）所提出的親緣地理學（phylogeography）就是對物種族群遺傳與地理分佈的現狀與成因進行討論的一門學問，強調當物種受到歷史地質事件影響時，族群遺傳結構會受到改變，藉由建構物種種內譜系（genealogy）之間的親緣關係，並配合地理分佈來推敲族群間所經歷的地質事件，即可檢視族群分化的歷史。臺灣位處於歐亞大陸板塊與菲律賓海洋板塊交界處，板塊交界帶經年累月的交錯運動，造成臺灣超過一千公尺以上海拔高度的地勢佔全島31.5%面積（紀， 1998），全島海拔高度的落差甚至超過三千公尺，起伏多變的地形使得臺灣在地形樣貌、氣候條件上都具高度的多樣性。島嶼中央有著南北向的高聳地勢，使得臺灣的溪流多呈現東西走勢，又因為甚大的海拔落差造就臺灣河川湍急（林和王， 2002），使得物種分佈與種內族群的遺傳結構造成變異。在這種情形下，臺灣物種分佈或遺傳結構可能會受到由鄰近地區物種的多次入侵（multiple invasion）或因地理隔離所造成變異，因此臺灣是研究生物遺傳分化歷史與族群地理分佈間相關性的良好環境（Creer et al., 2001）。藉由研究各個不同物種的親緣地理，足以使我們更了解臺灣的地理結構存在哪些重要的地理屏障。. -3-.

(5) 二、研究物種兩棲爬行動物遷移能力較差（Palo et al., 2004），此特性使得物種容易因為地形結構的影響而構成族群間的遺傳分化。本研究使用褐樹蛙（Buergeria robusta）作為研究對象。溪樹蛙屬（Buergeria, Boulenger, 1909）是屬於無尾目（Anura）樹蛙科（Rhacophoridae）當中特別的一個類群，樹蛙科當中的大多數類群都是棲息在森林地區（森林中下層或森林邊緣），而溪樹蛙屬卻主要棲息在溪流附近。褐樹蛙是廣泛分布全臺灣低海拔山區溪流附近的常見蛙種，其體色為黃褐色或綠褐色，兩眼之間有一褐色的三角形斑是其辨識特徵；吸盤相當發達，直徑可達眼直徑的二分之一（Boulenger, 1909）。繁殖期以夏天為主，主要集中於5月到8月，平時棲息在樹上或躲在石縫中，繁殖時期黃昏時會就近遷移到溪流岸邊水流較緩的地方進行生殖活動。具有明顯的雌雄二型性，雄蛙體長約4~5公分，雌蛙體長約6~7 公分。蝌蚪時期通常吸附在石頭上，出現於溪邊水流較緩的地方，生活史約有2/3 需要傍水而棲，因此對於褐樹蛙來說，溪流兩岸是相當重要的棲息環境（朱，1996； Huang et al., 2001；林，2001；張，2006）。目前在臺灣針對兩棲爬行動物的親緣地理學研究，大多支持中央山脈為臺灣島上對廣布種分化而言為最主要的地理屏障，使物種的族群遺傳結構呈現東、西分群，其可能的案例有以下：莫氏樹蛙（Rhacophorus moltrechti，葉，1997；劉， 2000）、臺北樹蛙（Rhacophorus taipeianus，Yang et al., 1994；劉，2000）、澤蛙（Rana limnocharis，Toda et al., 1998）、黑蒙西氏小雨蛙（Microhyla heymonsi，林，2009）、斯文豪氏攀蜥（Japalira swinhonis，劉，1994；張和劉，1997）以及赤尾青竹絲（Trimeresurus stejnegeri，Creer et al., 2001）等。另外針對白頷樹蛙複合種群（Polypedates leucomystax species complex，張，2008）以及臺灣草蜥複合種群（Takydromus formosanus species complex，Lue & Lin, 2008）等研究結果顯示除了臨近地區物種藉由陸橋遷入外，中央山脈對族群擴散亦造成顯著阻隔，使物種的親緣地理結構形成多次入侵（multiple invasion）現象。不過對於以溪流兩岸做為重要棲息環境的褐樹蛙而言，其親緣結構亦有可能與淡水魚類較為相似。Tzeng（1986）依據臺灣淡水魚類的分布情形，提出臺灣中央山脈以西的西部水系受到自中國大陸的南嶺山脈向東延伸經澎湖延續至臺灣本島中部阿里山山脈一帶的『臺灣堆』（曾，1992）所影響，呈現南、北兩水系， -4-.

(6) 因此淡水魚類的分部明顯呈現由不同起源的南（濁水溪以南的曾文溪、高屏溪流域，不包含濁水溪）、北（後龍溪以北至蘭陽溪）兩區，例如：馬口魚（Candidia 、埔里華吸鰍（Sinogastromyzon puliensis，Liao et al., 2008）。 barbata，Wu et al., 2007）有些研究也指出中部地區（大安溪至濁水溪流域）為南北兩區魚類的過度地帶，例如：臺灣石. （Acrossocheilus paradoxus，Wang et al., 2000）、粗首鱲（Zacco. pachycephalus，Wang et al., 1999）及赤斑吻蝦虎（Rhinogobius rubromaculatus， Cheng et al., 2005）。另外因為中央山脈隆起的影響，東部地區（中央山脈以東，立霧溪以南至卑南溪流域）的水系與西部明顯隔離，例如：臺灣間吸鰍（Hemimyzon formosanus）與臺東間吸鰍（H. taitungensis，Wang et al., 2007b）以及親緣結構上分成南部、北部和東部三群的臺灣鏟頷魚（Varicorhinus barbatulus，Wang et al., 2004）。淡水魚類在各流域的分佈模式，使得傍水而棲的褐樹蛙親緣地理結構分佈有了別於其他兩棲爬行動物不同的解釋，然而目前卻尚未有針對褐樹蛙所進行的親緣地理學相關研究。有鑑於此，本研究選擇以褐樹蛙來進行探究，希望能釐清同時橫跨陸域及淡水兩生態系的物種，其遺傳結構會呈現何種狀況，藉此增補臺灣親緣地理學資料的研究佐證。. 三、研究目的本研究以臺灣各地褐樹蛙族群的粒線體DNA中細胞色素b（cytochrome b）基因序列做為分子遺傳標記，建立褐樹蛙各族群間的親緣關係，探討臺灣地形對於褐樹蛙在族群遺傳結構可能產生的影響，以此檢視褐樹蛙族群的親緣地理關係。預期達成下列幾個目標： 1.. 褐樹蛙的族群遺傳結構與地理分布狀況是否相關？. 2.. 瞭解褐樹蛙各族群間基因交流（gene flow）程度，及其與地形間的關係。. 3.. 探討褐樹蛙在地質歷史上的族群波動。. 4.. 比較褐樹蛙族群的親緣地理與其他已發表研究案例的異同。例如：是否與兩. 棲爬行類相近？或是與淡水魚類相近？. -5-.

(7) 貳、材料與方法一、研究材料 1.. 樣本採集本實驗於2009年6月至8月間，以徒手採集的方式進行採樣。剪取個體左後第. 五趾之趾墊保存於95%酒精中，以供進行後續的遺傳分析；採樣個體則當場野放回原棲息點。. 2.. 採集樣點選擇本研究的採集地點包含臺灣全島28條水系的33個樣點。其中流域較廣的淡水. 河、花蓮溪、秀姑巒溪與南澳溪選擇兩個或三個樣點。總樣本數為564隻個體（Fig. 1）。. 3.. 分子遺傳標記將採集所得到的樣本組織使用Qiagen公司的DNeasy Blood & tissue Kit萃取. DNA，所有步驟根據Spin-Column Protocol（Qiagen Inc., 2009）操作。利用近緣物種的共同序列設計兩條引子，其中輕股（light strand）引子座落於 tRNA-Glu上，而重股引子座落於細胞色素b（cytochrome b）基因後端。此對引子可成功增幅褐樹蛙cytochrome b與鄰近區域的序列約1150bp。引子序列如下： BueCBF1─TTTCTgCCAggRTTYTAACCTAgACC BueCBR2─gTCYARTTTgATgAgTTTRTTTTC 以萃取好的DNA為模板，進行聚合酶連鎖反應（polymerase chain reaction， PCR）。在總體積為20μl的反應溶液中，加入0.15μl聚合酵素（taq polymerase）、2μl 10X緩衝溶液、0.25μl三磷酸去氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotide triphosphate,dNTP, 濃度為10mM）、濃度為10mM的引子各0.5μl最後加入1μl的DNA，以去離子水（double-distilled water）補足至20μl進行反應，反應條件為：前置裂解（predenature）在94℃持續3分鐘後進入35次循環流程：於94℃裂解（Denature）30秒，於52℃融和（annealing）40秒，於72℃延長（extension）1分鐘30秒；循環結束後，在72℃ 持續10分鐘進行最終延長（final extension）。. -6-.

(8) 增幅片段送至源資生物科技公司進行核苷酸序列定序，該公司所使用的儀器為ABI 3730自動定序儀（automatic sequencer）。定序結果回收後再以人工方式使用Sequencher ver.4.1（Gene Codes Corporation,1999）進行雙股序列校正，並去除序列引子部分修正片段長度為1080 bp，片段完全相同之序列判別為同一個單基因型（haplotype）。以歸納所得共201個單基因型作為進行親緣關係分析的操作單元（operational taxonomic units）（Table 1）。. 二、資料分析 1. 親緣地理關係重建： a. 建構親緣關係樹：使用MODELTEST ver.3.7（Posada & Crandall, 1998）中的Hierarchical likelihood ration test來選擇序列最適合的演化模型與參數，再參考此結果進行後續分析。分別使用MEGA ver.4.1（Kumar et al., 2008）與MrBayes 3.1（Ronquist & Huelsenbeck, 2003），以鄰聚法（neighbor Joining，或簡稱NJ）與貝氏分析（Bayesian inference）兩種方法建構單基因型之間的親緣關係樹。在建構鄰聚法的親緣關係樹時，同時以1000次bootstrap（Felsenstein, 1985）重複來計算親緣關係樹各節點上的支持強度。建置貝氏親緣關係樹時以4條Markov chains搜尋較佳機率值的樹型圖，並同時進行 2次。設定1×106個世代（generations）進行Markov Chain Monte Carlo（MCMC）搜尋，每100個世代取樣一次。將取樣結果前四分之一的樹（likelihood計算尚未到達穩定的樹）捨棄（burn-in），剩餘的樣本合併後用於產生共識樹（consensus tree）。分支的支持強度則以貝氏機率（Bayesian posterior probabilities）來輔證。 b. 建構親緣地理網狀圖：使用TCS（Clement et al., 2000）建構基因型的最小關聯網狀圖（minimum spanning network），將近緣的單基因型彼此連接。藉由連接單基因型而構成的網狀關聯圖可以推論單基因型彼此之間的關係，藉此可以找出較基礎（basal）的單基因型，另外結合單基因型在地理位置上的分部，可以瞭解關連相近的各個單基因型在地理分布上是否也處於相近的位置。. -7-.

(9) 2. 遺傳多樣性與族群結構分析： a. 遺傳多樣性測試以DnaSP ver.4.10（Rozas et al., 2003）計算單基因型歧異度（haplotype diversity， H，Nei & Tajima, 1983）及核苷酸歧異度（nucleotide diversity，π，Nei, 1987），以計算族群內部的遺傳多樣性（genetic diversity）。比較此二數值可以推測族群演化歷史（Page & Holmes, 1998；Avise, 2000；Graur & Li, 2000）。 b. 遺傳分化程度以DnaSP ver.4.0計算族群間的遺傳分化指數（fixation index Fst，Slatkin, 1993）。將採樣點間的地理距離（pairwise geographic distance）為自變數（independent ，族群間的Fst為應變數（dependent variable）繪製散佈圖，並利用JMP ver.6.0 variable）（SAS Institute Inc., 2005）軟體中進行簡單線性迴歸分析（simple linear regression），以檢測褐樹蛙是否符合距離隔離模式（isolation by distance model）。 c. 遺傳變異分佈模式使用SAMOVA ver.1.0（Dupanloup et al., 2002）軟體，設定二群至最多十群依序進行運算，評估群間所佔變異的比例，以群間變異比例愈高為愈佳，找出最適合的分群方式。依最適合的分群方式，利用ARLEQUIN 3.01（Excoffier & Schneider, 2005）套裝軟體進行分子變異分析（Analysis of Molecular Variance, AMOVA）計算遺傳分化（genetic differentiation）的程度與檢測族群間與地理區間的遺傳結構，分子變異分析檢測進行1000次的permutation，計算不同地理區間（ΦCT）、同地理區內不同族群間（ΦSC）及族群內（ΦST）三個不同層級的遺傳分化指數。 d. 遺傳交流與地理分佈模式將個體間的遺傳距離於AIS（Miller, 2005）套裝軟體，內插出遺傳距離地景形狀（genetic landscape shape interpolation）。其計算方式是距離權重反比法（inverse distance weighted），公式如下： = 其中為遺傳距離，. ∑. × ∑. 為未知點的值，為已知點的值，１. = [(. −. ) +( -8-. −. ) ]. 為加權參數：.

(10) 以、兩地點間的地理距離為加權參數時，為經度，為緯度。求得所有第三點（未採樣地點）受到地理距離加權後的遺傳距離值，此值愈大表示第三點與其他點間的遺傳距離愈大。最後以經緯度為X軸與Y軸，遺傳距離為高度，以等高線法（digital-contours）繪製成與採集地形圖吻合的遺傳距離等高線圖，此方式配合地形圖可以直接觀察到族群間的遺傳交流（gene flow）是否受地形起伏而有所隔離。. 3. 族群歷史動態分析 a. 中性測試（neutrality test）以ARLEQUIN ver.3.01（Excoffier & Schneider, 2005）進行Tajima's D test （Tajima, 1989）以及Fu's FS test（Fu, 1997）兩項檢測，測試所選用的遺傳標記在各族群中的遺傳變異是否不受選汰（selection）的影響而呈現中性，並可檢測族群是否歷經顯著的族群波動：當中性檢測呈現顯著偏離0的現象時，即表示所選用的遺傳標記會受選汰影響，或是族群曾歷經顯著的族群變動現象。當中性檢測的結果為顯著負值，表示所選用的遺傳標記可能受到負選汰（negative selection）影響，或是族群可能歷經過族群擴張（population expansion）；而當中性檢測的結果顯示為正值，則表示所選用的遺傳標記可能受到正選汰（positive selection）或平衡選汰（balancing selection）的影響，亦可能是族群量縮減（population decline）的結果。 b. 族群核苷酸變異分佈（mismatch distribution）使用DnaSP ver. 4.0軟體，以constant population size model進行族群核苷酸變異分佈，計算任兩個體間的核苷酸序列差異（pairwise difference）在統計上的分佈情形。當族群在過去一段時間內曾經過族群量或地理上的擴張事件（range expansion events），族群內多數個體所累積核苷酸變異的量都很接近，此時核苷酸變異分佈就會呈現符合普瓦松分佈（Possion distribution）的單峰分佈（uni-modal distribution）。反之，若圖譜呈多峰分布（multi-modal distribution），則代表族群量呈現穩定的狀態，或種內呈現明顯的遺傳分化（Slatking & Hudson 1991； Harpending, 1994；Rogers & Harpending,1992）。使用ARLEQUIN ver. 3.01軟體計算Harpending’s raggedness index （r），如果r值越小，則代表曲線越光滑；並且計. -9-.

(11) 算適合度檢測（sum of square deviations; SSD）檢測觀測值與期望值之間是否具有顯著差異（Ramos-Onsins ＆ Rozas, 2002）。 c. 貝氏天際線點圖（Basyesian skyline plot）使用BEAST ver.1.4（Drummond & Rambaut, 2007）進行馬可夫鍊蒙地卡羅法（Markov Chain Monte Carlo，MCMC）運算，設定進行1×107代的取樣，每1000代取樣一次，取樣的前10%做為burn-in捨棄。序列演化模型的選擇，參考 MODELTEST後所得到的結果。假設無尾類粒線體基因的演化速度與大部分脊椎動物相似，約為每百萬年1%的核苷酸置換速率（1% substitution per million years， Austin et al., 2004），故設定此速率進行分歧時間的估算。由於本次研究所使用的樣本數為564條核苷酸序列，使用BEAST ver. 1.4無法輸入全部序列同時進行運算，因此根據親緣關係樹及親緣地理網狀圖，將所有樣本以東、西兩區域分別計算；又西部區域樣本共431條序列，仍然超過系統負荷，故根據分子變異分析的結果將西部區域細分為四個區域分別進行分析。在TRACER ver. 1.3 （Drummond & Rambaut, 2007）中進行貝氏天際線點圖繪製。而讀取天際線點圖的橫軸，即可大致推估族群波動所發生的地質年代。 d. 歷史族群成長指數（growth rate）使用LAMARC ver. 2.1.3軟體進行Maximum Likelihood Parameter Estimation，以Metropolis-Hastings演算法進行MCMC運算，設定進行1×106代的取樣，每1000 代取樣一次，取樣的前10%做為burn-in捨棄。以求得歷史族群成長指數。 e. 網狀支序分析（Nested clade analysis）將分子遺傳資料與地理資訊放進ANeCA ver.1.2（Panchal, 2007）套裝軟體中，進行網狀支序分析法（Nested Clade Analysis，NCA），建立不同層級的系群（nested clade），與族群間地理距離比較，並計算clade distance（Dc）與nested clade distance （Dn）是否達統計上顯著的標準後，以Templeton（2004）所提出的檢索表（inference key）來解釋各層級的分系群過去可能歷經的歷史事件，如曾歷經過族群擴張（range expansion）、過去曾面臨棲地零碎化（past fragmentation）或歷史上族群間基因交流有限（restricted gene flow）等事件（Table 7）。. - 10 -.

(12) 參、結. 果. 一、序列長度本研究在臺灣共33個採樣點採得564隻樣本（Fig. 1），並成功定序564隻個體的粒線體細胞色素b基因部份序列。該片段並無任何插入（insertions）、缺失（deletions）或停止碼（stop codons）。從總長度為1080 bp的序列片段中，歸納出 169個多態位點（polymorphic sites），所有序列可整理出201個單基因型（haplotypes）。. 二、親緣地理關係重建： 1. 親緣關係樹：使用MODELTEST 3.7中的Hierarchical likelihood ration test運算的結果，顯示樹蛙序列最適合的演化模型為Tamura-Nei（TrN）+G（shape parameter of the gamma-distributed rate heterogeneity）+I（proportion of invariable sites）Tamura & Nei,1993；Yang, 1994）。因此，在後續建構親緣關係樹時，均使用相同的演化模型。由於利用貝氏分析所得到的親緣關係樹與鄰聚法建構的樹形大致相同，因此我們在此使用後者的樹形圖做為代表（Fig. 2），而將bootstrap值與貝氏機率（Bayesian posterior probability）分別標示於重要的分支節點上。結果顯示褐樹蛙的親緣關係大致上可分成與地理位置相關的兩個主要支系，約略以中央山脈為界，分別為西部支系（Western lineage）以及東部支系（Eastern lineage）兩個主要系群，其bootstrap value呈現100%的高度支持。東部支系全部隸屬於同一單系群，而西部支系則可再細分為六個亞支；各分支分佈於各族群中的數量列於Table 3。在親緣關係樹的結果中可得知，中央山脈對於褐樹蛙具有地理隔離的效應，使得東部及西部族群擁有各自獨立的支系（Fig. 2）。. 2. 最小關聯網狀圖：最小關聯網狀圖顯示褐樹蛙族群可以根據單基因型彼此間的近緣狀況，分成東部與西部兩個次網狀圖（subnetworks）。東部次網狀圖（Eastern subnetwork） - 11 -.

(13) 部分，以E001與E002兩個單基因型為中心，呈現兩個相連的星狀結構（star-like structure），除此之外沒有其他明顯的結構（Fig. 3）。西部次網狀圖（Western subnetwork）部分，則可以根據六個較中心位置的單基因型，將網狀圖分開成相關相對較遠的六個部分：（Ⅰ）W079與W089、（Ⅱ）W059、（Ⅲ）W019、（Ⅳ） W009與W006、（Ⅴ）W010和（Ⅵ）W129等，此分割方式與親緣關係樹上六個分支的分群方式相符合（Fig. 3）。. 三、遺傳多樣性與族群結構分析 1. 遺傳多樣性測試褐樹蛙的平均單基因型歧異度（H）為0.97884，各族群間單基因型歧異度範圍在0.65497到0.99167之間；平均核苷酸歧異度為0.01138，各族群間核苷酸歧異度（π）介於0.00187到0.00775之間（Table 1）。根據親緣關係樹與親緣地理網狀圖皆顯示褐樹蛙可以根據各個族群的地理分布，分為不重疊的東、西兩個區域。東部區域（East）包含卑南溪、秀姑巒溪上游、秀姑巒溪下游、花蓮溪、木瓜溪、美崙溪、三棧溪及立霧溪等八個族群，單基因型歧異度（H）為0.90909，核苷酸歧異度為0.00180；西區（West）則為其餘二十五個族群，單基因型歧異度（H）為 0.97646，核苷酸歧異度為0.00773（Table 2）。比較各個單基因單型在族群中出現的次數，其中西部區域以W129、W009及W079三個基因型擁有較高的頻率，分別由五個族群29個體、六個族群28個體以及七個族群25個體共同擁有；東部區域則以E001及E002兩個基因型擁更較高頻率，分別以八個族群33個體及三個族群21個體共同擁有。依照親緣關係樹與最小關聯網狀圖，可將所有的基因單型細分成七群，而各群在各採集點出現的次數與頻率則分別呈現於Table 3與Fig. 4。. 2. 遺傳分化程度褐樹蛙全島採樣的各族群間遺傳分化指數（Fst）介於-0.052到0.963，分析根據親緣關係樹與親緣地理網狀圖所顯示的東、西兩分群，東部區域內的八個族群彼此間的Fst值為0.007到0.318，西部區域內的二十五個族群彼此間的Fst值是-0.052 到0.828；而排除掉區域內，僅保留東部區域族群與西部區域間各族群相互比較的 Fst值結果則介於0.781到0.936，東部區域與西部區域間的Fst值為0.775，顯示東、 - 12 -.

(14) 西兩區域彼此之間的遺傳分化程度相對高於區域內各族群之間的遺傳分化程度，其中遺傳分化程度最高發生在北港溪和卑南溪這兩族群間（Table 4）。將所有採樣點間的地理距離為自變數，族群間的Fst為應變數，進行簡單線性迴歸分析，褐樹蛙所有族群的地理距離與Fst值的線性迴歸結果，經過F-test檢測後所得之P值小於0.0001，表示地理距離與Fst值顯著成正比，地理距離愈大，遺傳分化程度愈大，此結果顯示褐樹蛙符合距離隔離模式（Fig. 5a）。西部二十五個族群的的地理距離與Fst值的線性迴歸F-test的P值小於0.0001，顯示褐樹蛙在西部區域的族群有顯著的距離隔離現象（Fig. 5b）。東部區域的八個族群線性迴歸，經過F-test 檢測後所得之P值為0.0355，P值小於0.05的結果也顯示東部區域亦符合距離隔離模式（Fig. 5c）。. 3. 遺傳變異分佈模式首先使用SAMOVA ver.1.0（Dupanloup et al., 2002）分析，嘗試將褐樹蛙族群分為兩群到十群等多種分群方式後，發現褐樹蛙族群最適合的分群模式為五群，其群間分子變異（percentage of variation among groups）所占的比例為73.79%，其餘分群群間差異結果則介於73.62%（分成六群）到65.59%（分成七群）。檢視最適合分群模式的結果，與親緣關係樹及親緣地理網狀圖所顯示的東、西兩分群相較之下，支持東部區域包含卑南溪、秀姑巒溪上游、秀姑巒溪下游、花蓮溪、木瓜溪、美崙溪、三棧溪及立霧溪等八個族群可視為一個分群；而西部區域的二十五的族群可以根據地理區域分成不重疊的細分成四群，（1）東北部區域（north-eastern region）：包含和平溪、南澳南溪、南澳北溪、東澳溪、蘇澳溪、新城溪及蘭陽溪等七個族群；（2）北部區域（northern region）：包含基隆河、新店溪、大漢溪、鳳山溪、頭前溪及中港溪等六個族群；（3）中部區域（central region）：包含後龍溪、大安溪、大肚溪、大甲溪、濁水溪及北港溪等六個族群；（4）南部區域（southern region）：包含曾文溪、高屏溪、林邊溪、楓港溪、保力溪及太麻里溪等六個族群（Table 5）。依此分群方式，利用ARLEQUIN 3.01（Excoffier & Schneider, 2005）套裝軟體進行分子變異分析（Analysis of Molecular Variance, AMOVA）計算五個地理區域的遺傳分化（genetic differentiation）的程度，結果與使用SAMOVA ver.1.0軟體分析結果完全吻合，顯示大部分的分子變異發生在地理區域之間（73.79%），地理 - 13 -.

(15) 區域間的遺傳分化指數（ΦCT）為0.73792（P=0.00），此結果支持各個地理區域間具有高度的遺傳分化；屬於同地理區域內不同族群間的變異為2.86%，其遺傳分化指數（ΦSC）為0.10926（P=0.00），顯示相同地理區域內的各個族群有顯著的遺傳分化；而屬於族群內的分子變異為23.34%，族群彼此間的遺傳分化指數（ΦST）為 0.76656（P=0.00）顯示族群間亦具有高度的遺傳分化（Table 5）。. 4. 遺傳交流與地理分佈模式由遺傳距離等高線圖，配合地理地形圖觀察到褐樹蛙族群有四區遺傳交流（gene flow）順暢的區域（Fig. 6），分別是（1）北部：東起和平溪以北，至西以中港溪為南界，遺傳交流最順暢的地點為東澳溪與蘇澳溪一帶；（2）中部：後龍溪以南至北港溪，其中遺傳交流最順暢的地點為大肚溪一帶；（3）南部：西起曾文溪以南，至東以太麻里溪為北界，以楓港溪一帶為遺傳交流最順暢的地點；（4）東部：卑南溪以北至花蓮溪之間，以及美崙溪至立霧溪之間，遺傳交流都是順暢的；而花蓮溪與美崙溪之間遺傳交流略受阻隔。此分區結果與分子變異分析結果相較，除了合併分子變異分析中的東北部與北部區域，而成一北部分群之外，劃分區域的方式兩者皆相同；另外，此結果亦支持褐樹蛙族群形成東、西兩分群，並且以中央山脈為最主要的地理屏障。. 四、族群歷史動態分析 1. 中性測試褐樹蛙各個族群進行Tajima's D test（Tajima, 1989）以及Fu's FS test（Fu, 1997）兩項中性檢測後，結果僅少部分族群的結果呈現顯著值，顯示並非各個族群皆可能歷經顯著的族群擴張現象。將整體族群進行中性檢測的結果則呈現顯著負值（D=-1.34870，0.01<P<0.05；FS =-23.57596，0.001<P<0.01），根據先前分析結果，顯示褐樹蛙族群可以分成明顯的東、西兩主要分群，並且西部區域可再細分成四個區域。依據上述方式將褐樹蛙族群分成五群後，分別進行Tajima's D test與Fu's FS test兩項檢測後，Tajima's D值部分，西部區域（West）呈現顯著負值（D=-1.79335， 0.001<P<0.01），而西部的四個分區域皆具有顯著負值，Tajima's D值介於-2.04714 到-1.38023間（0.001<P<0.05），並且以東部區域（East）具有最小值（D=-2.37672， - 14 -.

(16) P<0.001）；Fu's FS值部分，西部區域（West）呈現顯著負值（FS=-24.09950， 0.001<P<0.01），西部四個區域則介於-25.90028到-11.43513之間（0<P<0.01），均具有高度顯著負值，東部區域（East）同樣具有高度顯著的最小值（D=-27.48493， P<0.001）（Table 6）。. 2. 族群核苷酸變異分佈（mismatch distribution）在褐樹蛙所有族群的核苷酸變異分佈圖中，呈現一個多峰型的狀況（SSD=0.0195，P=0.0300；Harpending's Raggedness index r=0.0072，P=0.2000）。根據先前分析結果，在此針對對東、西兩主要分群，以及西部區域再細分的四個區域，分別進行族群核苷酸變異分佈分析。東部區域（East）部分，族群核苷酸變異分佈圖呈現趨近於普瓦松分佈（Possion distribution）的明顯單峰分佈（SSD=0.0066，P=0.0200；Harpending's Raggedness index r =0.0753，P=0.1800），顯示單就褐樹蛙東部族群而言，在過去一段時間內曾經過族群量或地理上的擴張現象（range expansion events）。西部區域（West）的族群核苷酸變異分佈圖，雖然不如東部區域明顯，但仍呈現趨近於單峰分佈的狀況（SSD=0.0072，P=0.1000； Harpending's Raggedness index r=0.0087，P=0.1000）（Fig. 7），而西部區域細分成的四個區域後分析，呈現的單峰分佈狀況則相對清楚（Fig. 8）。此結果顯示褐樹蛙族群所歷經的族群擴張現象，相對於整體族群歷經族群擴張現象而言，以五個區域各自分別歷經族群擴張現象較為可能，其中更以東部區域最為顯著的呈現曾經歷經族群擴張現象。. 3. 貝氏天際線點圖（Bayesian skyline plot）參考MODELTEST後所得到的結果，選擇以Tamura-Nei作為演化模型進行分歧時間的估算，推估褐樹蛙的族群變動歷史。西部區域部分，結果顯示東北部區域約在七萬五千年~十萬年間發生一次族群擴張事件，北部區域約在五萬年~七萬五千年間歷經族群擴張事件，中部區域同樣約五萬年~七萬五千年間歷經族群擴張，南部區域則約在兩萬五千年~五萬年間發生族群擴張（Fig. 9）。東部區域則呈現持續且緩慢的族群上升，與並沒有突然發生族群擴張的特定時間點。. - 15 -.

(17) 4. 歷史族群成長指數（growth rate）褐樹蛙整體族群的歷史族群成長指數為709.46，東部區域為775.121，西部區域為1452.61，西部區域細分的東北部區域為1686.97，北部區域為837.95，中部區域為899.32，南部區域為568.31（Table 6）。. 5. 網狀支序分析（Nested Clade Analysis，NCA）由最小關聯網狀圖進行網狀支序分析的結果，總共包含108個1-step clade、43 個2-step clade、18個3-step clade、7個4-step clade、4個5-step clade以及2個6-step clade。褐樹蛙族群可以分成6-1（西部系群，Western nested clade）與6-2（東部系群，Eastern nested clade）兩個主要的clade（Fig. 10）。西部系群當中5-1（由4-2 與4-5組成）即為親緣關係樹所顯示的cladeⅠ，5-3（由4-1與4-6組成）涵蓋cladeⅡ、 cladeⅢ與cladeⅣ，5-4（由4-4與4-7組成）則親緣關係樹上的與cladeⅤ與cladeⅥ完全吻合，在4-step clade部分，NCA的結果同樣支持西部族群可以分為六個分支，其中4-1、4-2及4-5相較先前分析出的六個分支在歸群方式有些微差異，但單基因型在各個Clade的分佈結果兩者大致上相似。東部系群部分可細分為3-9與3-16兩個 clades。根據Templeton（2004）提出的檢索表（inference key），顯示褐樹蛙西部系群（clade 6-1）呈現族群連續性的分佈並擴張（contiguous range expansion），而高階分系群可能歷經過的地理事件可以分為三類，（1）5-1分系群（北部與中部族群）發生過長距離傳播伴隨或歷經棲地破碎化的歷史（long-distance colonisation and/or past fragmenation）；（2）5-3分系群（東北部與北部族群）曾因距離隔離效應而僅有限的基因交流（restricted gene flow with isolation by distance）；（3）5-4分系群（南部與東北部族群）則可能歷經過長距離傳播並隨後歷經棲地破碎化的事件（long-distance colonisation possibly coupled with subsequent fragmentation）或經由族群分佈擴張而面臨過去棲地破碎化的事件（past fragmentation followed by range expansion）。東部系群（clade 6-2）則可能遭遇過在有限的基因交流或傳播的歷史中伴隨跨過中間區域的長距離傳播（restricted gene flow/dispersal but with some long-distance dispersal over intermediate areas not occupied by the species），或曾經歷過基因交流但隨後發生中間地區族群滅絕的事件（past gene flow followed by extinction of intermediate populations）。另外clade 3-7與4-2（中部和南部族群）似 - 16 -.

(18) 乎曾歷經過族群連續性的分佈並擴張的歷史事件（Table 7 與 Appendix I）。整體而言褐樹蛙的東、西部系群曾經歷過差異甚大的歷史事件，東部族群經歷基因交流中斷的狀況，而西部族群雖然整體而言呈現族群擴張，但也深受棲地破碎化事件的影響。. - 17 -.

(19) 肆、討. 論. 一、褐樹蛙的族群遺傳結構根據褐樹蛙的親緣關係樹（Fig. 2）與親緣地理網狀圖（Fig. 3）所呈現的族群遺傳結構兩者完全一致。根據單基因型的分群狀況共形成七個支系，分別對應到各個採集地點，發現褐樹蛙的單基因型支系可裡分為兩類，（1）分佈平均並橫跨兩至三個區域的廣布支系，包含支系Ⅱ、Ⅲ及Ⅴ，其中又以Ⅴ支系最平均分佈於東北部與北部區域的各個族群之間；（2）主要分布於單一區域，在其他僅零星分佈的特有支系，支系Ⅰ、Ⅳ、Ⅵ支系以及東部支系的單基因型即屬於此類，除東部支系所有單基因型僅分布在東部地區，另外Ⅵ支系的單基因型亦僅屬於南部區域特有，分布在曾文溪以南到東至太麻里溪一帶。族群遺傳結構的結果更清楚顯示褐樹蛙族群可以分成兩個相當顯著的支系，分別對應了中央山脈東側及西側族群，並且彼此之間沒有分享任何單基因型，粗略估計東、西兩支系的分歧時間為一百一十萬年（1.1 Mya）左右，顯示中央山脈的確足以成為阻礙東、西部族群彼此之間的遺傳交流，造成東、西部族群分歧。. 二、褐樹蛙各族群間基因交流與地形間的關係褐樹蛙東部區域與西部區域各族群彼此間的遺傳分化指數相當高，介於 0.781~0.936之間，明確顯示中央山脈兩側族群的基因交流甚為貧乏。將西部區域各族群根據地理位置再劃分為東北部區域、北部區域、中部區域及南部區域後，發現各區域間的族群彼此遺傳分化指數幾乎都大於0.200，顯示褐樹蛙族群除了受到中央山脈的影響之外，其他地區的遺傳分化也非常顯著。 Wright（1943）提出針對兩兩族群之間基因交流的頻度，提出距離隔離模式（isolation by distance model），描述在物種自然播遷的狀況之下，其基因交流主要發生在地理位置相近的族群之間（Slatkin, 1985），因此距離越相近的族群，基因交流愈順暢，遺傳分化程度也就愈低。本研究利用簡單線性迴歸，分析族群間的遺傳分化與地理距離間的相關性，結果顯示不論是整體族群，亦或是中央山脈兩側分區來看，遺傳分化與地理距離皆呈現顯著正相關，表示褐樹蛙符合距離隔離模式，也就是說褐樹蛙族群的擴散符合自然播遷的狀況。 - 18 -.

(20) 許多案例都指出遷移能力不甚佳的兩棲動物容易因為族群間的地理屏障形成特有的地理分區（Palo et al., 2004）。如：莫氏樹蛙（葉，1997；劉，2000）、臺北樹蛙（Yang et al., 1994；劉，2000）、澤蛙（Toda et al., 1998）與白頷樹蛙複合種群（張，2008）等兩棲動物其遺傳結構皆在中央山脈的阻隔之下，形成東部與西部兩側族群基因交流極為有限。全島廣布的物種除了受到中央山脈的影響，卻也可能因為遷移能力有限，形成更為複雜的遺傳結構，張廖（2006）以臺灣中低海拔陸域脊椎動物歸納而得的五個動物地理區，分別是（1）北部動物地理區：東起清水斷崖以北至西以苗栗丘陵為界；（2）西部地理區北區：苗栗丘陵以南，濁水溪以北一帶；（3）西部地理區南區：濁水溪以南至枋寮以北，中央山脈西側；（4）恆春半島動物地理區：恆春半島地區；與（5）東部動物地理區：中央山脈以東，清水斷崖以南至臺東大武斷層。經研究拉都希氏赤蛙（Sylvirana latouchii）親緣分佈後，發現其遺傳結構分佈與五個地理區相當符合（Jang-Liaw et al., 2008）。另外在黑蒙西氏小雨蛙的研究（林，2009）中，也發現其遺傳結構亦可根據族群得地理分佈，分為東、西兩個主要支系，而西部支系又可再細分為（1）西南（2）東南（3）西南與中以及（4）中部等四個分支。而褐樹蛙的根據AMOVA得分群結果顯示，比起單純的分成東、西兩群，事實上一共分成（1）東北部區域、（2）北部區域、（3）中部區域、（4）南部區域以及（5）東部區域等五群才是最適合的分群方式。遺傳距離等高線圖的結果與臺灣地形等高線圖相當契合，也就是說許多遺傳交流中斷的部分，在地勢也是比較高的地段，因此可以歸納出各區域間的遺傳分化是由哪個地理屏障所造成。（1）東北部區域與北部區域之間，由雪山山脈造成主要的阻隔。（2）北部區域與中部區域，在苗栗丘陵一代形成了基因交流程度較低的狀況，此現象與張廖（2006）以苗栗丘陵為界，將濁水溪以北至東部清水短崖地區劃分為不同動物地理區的推論相符合，在爬蟲動物中也有許多物種因苗栗丘陵的高起地勢而分化成中部、北部兩群，例如蓬萊草蜥（Takydromus stejnegeri）的遺傳結構即以苗栗丘陵為界，分成兩個不同支系（林，2003）。（3）中部區域與南部區域則以曾文溪為界，在阿里山山脈一帶的臺灣堆形成分界，此分界與多數淡水魚相同，加上嘉南平原可能沒有適合褐樹蛙棲息的環境以致兩區域間基因交流瓶貧乏。（4）南部區域與東部區域的分界，從地圖上比對發現並沒有特殊地形，也沒有其他已研究的案例顯示物種在卑南溪與秀姑巒溪之間具有明顯的遺傳 - 19 -.

(21) 分化；然而本研究在進行卑南溪族群的採樣時，正好遇到莫克拉颱風行經臺灣，颱風抵臺前的前置鋒面就已經挾帶豐沛的雨量，接連兩、三周的豪大雨造成溪水暴漲，以致無法趕在繁殖季採集到足夠的樣本數，最後卑南溪僅四隻樣本進行分析，此因素可能導致我們無法採集到足夠的單基因型或是遺漏東南部共同擁有的單基因型，使得南部區域與東部區域造成遺傳分化明顯的結果。（5）東部區域與東北部區域的交會地帶，是由中央山脈東北稜山脈直深入海的清水斷崖為最明顯的地理屏障，因為山脈陡峭，經陸路的生物無法橫越，使得許多物種在和平溪與立霧溪間就有顯著遺傳分化。近年發現的翠斑草蜥與鹿野草蜥，分布的界線就與這個地理位置極為吻合（Lue & Lin, 2008）。. 三、探討褐樹蛙在地質歷史上的族群波動利用單基因型歧異度（haplotype diversity，H，Nei & Tajima, 1983）及核苷酸歧異度（nucleotide diversity，π，Nei, 1987）兩者間的高低比較，可以推斷族群變遷的歷史。當單基因型歧異度偏高（≧0.5）與核苷酸歧異度亦呈現較高（≧0.5）的狀況下，代表族群可以不斷的累積突變，是一個沒有受到干擾或重大災害且長期穩定的族群；當兩者皆低（≦0.1）的情狀之下，則代表族群可能長期受到瓶頸效應（bottleneck effect）的影響而造成基因多樣性下降；當單基因型歧異度高而核苷酸歧異度低的時候，表示突變尚未累積，可能是族群量快速擴張的結果；當單基因型歧異度低而核苷酸歧異度高，則顯示曾經有遺傳分化的小族群在近期有的基因交流，或是古老的大族群正面臨瓶頸效應（Grant & Bowen,1998）。而褐樹蛙整體而言的單基因型歧異度為0.97884（≧0.5），平均核苷酸歧異度為0.01138 （≦0.1），顯示褐樹蛙的族群量是短期內快速擴張的結果。中性檢測的結果是以各區域分別進行檢測，其偏離0的顯著程度比整體族群明顯來的高，顯示褐樹蛙族群所歷經的族群波動，相對於整體族群歷經族群擴張現象而言，以（1）東、西兩區域或是（2）五個區域各自分別歷經族群擴張現象較為可能；並且數值皆呈現負值，表示所選用的遺傳標記可能受到負選汰影響，或是族群可能歷經過族群擴張；而本研究中性檢測的結果相當顯著偏離0，呈現明顯的負值，此現象可能不是單純的因為所選用的遺傳標記受天擇汰選所造成，尤其 Fu's F test對於族群擴張現象具有相當敏銳的檢測性（Fu, 1997），這樣Tajima's D - 20 -.

(22) 值與Fu's F值明顯偏離0的情形，可能代表褐樹蛙族群曾歷經擴張現象。此結果可以與褐樹蛙單基因型歧異度偏高而核苷酸歧異度偏低的現象共同解釋，褐樹蛙的族群量確實有快速擴張的情況，並且，根據褐樹蛙的貝氏天際線點圖的結果來看，其族群量開始上升的時間點約在五萬年~十萬年之間。褐樹蛙的地理分佈狀況，根據網狀支序分析結果，發現西部區域整體族群在地理分佈上呈現連續性的分佈並且分布範圍有小擴張至今；北部、中部與南部族群區域顯示曾經歷經過長距離傳播棲與地破碎化的歷史。東部族群的部分，雖然貝氏天際線點圖和網狀支序分析並未支持太顯著的族群上升現象，但是核苷酸變異分佈（mismatch distribution）亦呈現明顯的族群擴張。以上結果都表示合樹蛙在地理分佈上有逐漸擴散的趨勢，地理分佈範圍變廣的主要原因可能是環境中適合褐樹蛙棲息的範圍變多而致。此現象未來可以結合臺灣地區的全球地理資訊系統（geographical information system, G.I.S）衛星資料與地質史料來進行褐樹蛙棲位模型（niche modeling）的探討。. 四、褐樹蛙遺傳分化模式與其他物種的比較（Avise, 1996; Avise曾經針對親緣地理學的研究方針提出不同層級上的「一致性」 2000），分別是（I）同一基因片段上，不同序列特徵的一致性；（II）同一物種中，不同基因座呈現的一致性；（III）不同物種在同樣的研究方法下，所呈現族群遺傳分化的一致性；以及（IV）不同物種，利用同樣的地理障壁進行分區，所呈現族群遺傳分化的一致性。為了歸納Avise所提出的第III與第IV層級，我們列出造成褐樹蛙遺傳分化的幾個重要的地理障蔽，並分別討論如下：（1）中央山脈中央山脈的南北兩端是形成褐樹蛙遺傳分化的最主要屏障，這個分布上的界線不但許多兩棲爬行動物的遺傳分化模式相符合，也與許多物種的分布界線相符合。在遺傳分化的案例之中，出現東西分化的案例包括了兩棲類的莫氏樹蛙（葉，1997; 劉，2000）、澤蛙（Toda et al., 1998）、拉都希氏赤蛙（Jang-Liaw et al., 2008）、艾氏樹蛙（張，2008）、黑蒙西氏小雨蛙（林，2009）與白頷樹蛙複合種群（張， 2008）等。出現東西分化的爬行動物則有蜥蜴類群中的斯文豪氏攀蜥（劉，1994；張和劉，1997；向，1997）、鉛山壁虎（蔡，1999），以及蛇類中的赤尾青竹絲 - 21 -.

(23) （Creer et al., 2001）、龜殼花（林和林，2007）、眼鏡蛇（Lin et al., 2008）與白腹游蛇（陳，2008）等。長期隔離的結果，有機會導致山脈兩側形成島內種化的現象，在陸域的脊椎動物之中，兩個較為特殊的案例發生在翠斑草蜥與鹿野草蜥（王，2006；Lin & Lue, 2008）以及烏頭翁與白頭翁（許，1999；許，2008；許等， 2008）。另一方面，對許多兩棲爬行動物而言，中央山脈雖然並不是造成「種化」的直接原因，但也造成物種的分佈界線。後者的案例以兩棲類與爬行類居多，例如面天樹蛙、古氏赤蛙、蓬萊草蜥和臺灣草蜥從未在中央山脈東側被記錄，而梭德氏草蜥、鹿野草蜥、半葉趾蝎虎、鱗趾蝎虎等，則從未或鮮少出現在中央山脈西側（呂等，1999；向等，2009；楊，2009）。水域生物同樣亦受到中央山脈的影響，而形成物種或遺傳上的分化。產生遺傳分化的案例例如臺灣鏟頷魚（Wang et al., 2004）、菊池氏細鯽（Lin et al., 2008）、短腹幽蟌（黃，2007）等。產生物種差異的案例則包括多種鯉科魚類（陳與張， 2005）與多種底棲性的平鰭鰍科魚類（Wang et al., 2007）等。（2）雪山山脈雪山山脈是臺北盆地與蘭陽平原的分佈界線。針對雪山山脈造成遺傳分化的研究證據較少，目前已知的有翠斑草蜥在雪山山脈兩側形成的不同系群（林，2003），而在水域生物部分則有臺灣纓口鰍（Formosania lacustre）的案例（Wang et al., 2007a）。（3）苗栗丘陵對低海拔的陸域兩棲爬行動物而言，苗栗丘陵在臺灣的分隔效應可能僅次於中央山脈。目前已經知道在苗栗附近形成遺傳分化的物種有蓬萊草蜥（林，2003）與赤尾青竹絲（Creer et al., 2001）。而在苗栗地區形成物種界線的則包括了臺灣草蜥（僅分布在苗栗以南），臺北樹蛙、無疣蝎虎、黃口攀蜥（主要族群分布在苗栗以北）等（呂等，1999；向等，2009；楊，2009）。受到苗栗丘陵影響的魚類也很多，包括小鰾鮈（陳，2001），臺灣鏟頷魚（Wang et al., 2004）、粗首鱲（Zacco pachycephalus，Ma et al., 2006）、臺灣間吸鰍（Wang et al., 2007）、臺灣馬口魚（Wu et al., 2007）、以及其他多種鯉科魚類（陳及張， 2005）。（4）臺灣堆 - 22 -.

(24) 臺灣堆影響物種基因交流的原因主要是因為冰河時期海平面下降，但延伸自南嶺山脈的海底地形在此形成屏障，因此阻礙部分淡水魚類中部與南部族群間的基因交流（林，2007）。嘉南平原地區這個地理現象對水域產生影響大於陸域生物，而在淡水魚類的案例中，各個魚種受到影響的嚴重程度和造成分化的詳細位置並不盡相同。包括粗首鱲（Wang et al., 1999；Ma et al., 2006），臺灣鏟頷魚（Wang et al., 2004），臺灣馬口魚（Wu et al., 2007），臺灣間吸鰍（Wang et al., 2007）與埔里華吸鰍（Liao et al., 2008）等物種，在遺傳上或型態上都受到這個地形的影響。在褐樹蛙的案例中，本分布界線位於北港溪與曾文溪之間，而值得注意的是，褐樹蛙是目前所知少數受到臺灣堆影響而形成遺傳分化的陸域脊椎動物。本研究認為臺灣堆確實構成冰河時期基因交流的障礙，但海平面上升後，中部與南部區域族群沒有順暢的基因交流，有可能是嘉南平原沒有適合褐樹蛙棲息環境的原因構成。經過前人在不同領域的反覆研究，促成臺灣親緣地理分化模式的地理障蔽大致上已經成形，藉由褐樹蛙的親緣地理學研究，更加突顯臺灣複雜地形地貌對島內物種遺傳分化的影響。總結而論，造成物種產生遺傳分化的地理障礙，幾乎每一項都同時造成褐樹蛙的地理障礙，因此本研究認為褐樹蛙的遺傳分化模式兼具陸域生物與水域生物特徵而自成一格的特殊模式。. 伍、謝. 誌. 感謝林思民教授對本論文的指導，並感謝呂光洋教授與許育誠教授在口試過程中提供寶貴的建議。同時感謝李壽先教授在研究所第一年的指導，嚴謹的學術啟蒙令我獲益良多。感謝王昭均、李岱芬、林容仟、林美珠、洪心怡、洪貫捷、許祐薰、楊愷樂、葉佳芬、羅文穗等多位學長姐在實驗上給予的協助，並感謝本實驗室研究夥伴陳薇云、陳盈如、曾書萍、林展蔚、汪仁傑、游崇瑋等協助褐樹蛙樣本的採集，感謝林弘都博士、張仲德博士、洪東耀及劉建秦等人在地圖繪製與資料分析上所給予的協助。研究前半部牽涉到的草蜥採樣工作，則承蒙文化大學梁彧禎、鍾坤燕、趙芯妘、侯宣伊、高維苓、李允意、劉建秦、翁瑞鴻、施尚汶、林恩平、陳宏年、陳殿麒、鄭舜仁、嚴國恩、李粹文、童泰力、林宜潔等同學大力襄助，謹此一併致上謝忱。特別要感謝在研究過程中引領我走出低潮與陰霾的張慧羽教授與顏聖紘教授。最後感謝太魯閣國家公園管理處在研究經費上的支柱。本論文獻給我的家人以及陪伴我的朋友與摯愛。 - 23 -.

(25) 陸、參考文獻 Austin, J. D., S. C. Lougheed, and P. T. Boag, 2004. Discordant temporal and geographic pattern in maternal lineages of eastern north American frogs, Rana catesbeiana (Ranidae) and Pseudacris crucifer (Hylidae). Molecular Phylogenetics and Evolution 32: 799-816. Avise, J. C., 1986. A note for molecular genetics in the recognition and conservation of endangered species. Trend in Ecology and Evolution 4: 279-281. Avise, J. C., 2000. Phylogeography: The history and formation of species. Harvard University Press, Cambridge. Avise, J. C., J. Arnold, R. M. Ball, E. Bermingham, T. Lamb, J. E. Neigel, C. A. Reeb, and N. C. Saunders, 1987. Intraspecific phylogeography: the mitochondrial DNA bridge between population genetics and systematics. Annual Review of Ecology and Systematics 8: 489-522. Boulenger, G. A., 1909. Descriptions of four new frogs and a new snake discovered by Mr. H. Sauter in Formosa. Annals and Magazine of Natural History 8: 492-496. Cheng, H. L., S. Huang, and S. C. Lee, 2005. Morphological and molecular variation in Rhinogobius rubromaculatus (Pisces: Gobiidae) in Taiwan. Zoological Studies 44: 119-129. Clement, M., D. Posada, and K. Crandall, 2000. TCS: a computer program to estimate gene genealogies. Molecular Ecology 9: 1657-1660. Creer, S., A. Malhotra, R. S. Thorpe, and W. H. Chou, 2001. Multiple causation of phylogeographical pattern as revealed by nested clade analysis of the bamboo viper (Trimeresurus stejnegeri) within Taiwan. Molecular Ecology 10: 1967-1981. Drummond, A. J., and A. Rambaut, 2007. BEAST: Bayesian evolutionary analysis by sampling trees. BMC Evolutionary Biology 7: 214. - 24 -.

(26) Dupanloup, I., S. Schneider, and Excoffier, L, 2002. A simulated annealing approach to define the genetic structure of populations. Molecular Ecology 11: 2571-81. Excoffier, L., and S. Schneider, 2005. Arlequin ver. 3.0: An integrated software package for population genetics data analysis. Evolutionary Bioinformatics Online 1: 47-50. Felsenstein, J., 1985. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution 39: 783-791. Fu, Y. X., 1997. Statistical tests of neutrality of mutations against population growth, hitchhiking and background selection. Genetics 147: 915-925. Grant, W. S., and B. W. Bowen, 1998. Shallow population histories in deep evolutionary lineages of marine fishes: insights from sardines and anchovies and lessons for conservation. Journal of Heredity 89: 415-426. Graur, D., and W. H. Li, 2000. Fundamentals of Molecular Evolution, 2nd ed. Sinauer Associates, Inc., Sunderland. Harpending, H., 1994. Signature of ancient population growth in a low-resolution mitochondrial DNA mismatch distribution. Human Biology 66: 591-600. Harrison, S., and A. Hastings, 1996. Genetic and evolutionary consequences of metapopulation structure. Trend in Ecology and Evolution 11: 180-183. Huang, W. S., J. K. Lee, and C. H. Ho, 2001. Reproductive patterns of two sympatric rhacophorid frogs, Buergeria japonica and B. robusta, with comments on anuran breeding seasons in Taiwan. Zoological Science 18: 63-70. Kumar, S., J. Dudley, M. Nei, and K. Tamura, 2008. MEGA: A biologist-centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences. Briefings in Bioinformatics 9: 299-306. Jang-Liaw N. H., T. H. Lee, and W. H. chou, 2008. phylogeography of Sylvirana latouchii (Anura, Ranidae) in Taiwan. Zoological Science 25: 68–79.. - 25 -.

(27) Lin, H. C., S. H. Li, J. Fong, and S. M. Lin, 2008 . Ventral coloration differentiation and mitochondrial sequences of the Chinese Cobra (Naja atra) in Taiwan. Conservation Genetics 9: 1089-1097. Lin, H. D., K. C. Hsu, K. T. Shao, Y. C. Chang, J. P. Wang, C. J. Lin, and T. Y. Chiang, 2008. Population structure and phylogeography of Aphyocypris kikuchii (Oshima) based on mitochondrial DNA variation. Journal of Fish Biology 72: 2011–2025. Liao, T. Y., T. Y. Wang, H. D. Lin, S. C. Shen, and C. S. Tzeng, 2008. Phylogeography of the endangered species, Sinogastromyzon puliensis (Cypriniformes: Balitoridae), in southwestern Taiwan based on mtDNA. Zoological Studies 47: 383-392. Lue, K. Y., and S. M. Lin, 2008. Two New Crypic Species of Takydromus (Squamata: Lacertidae) from Taiwan. Herpetologica 64: 379-395. Ma, G. C., H. S. Tsao, H. P. Lu, and H. T. Yu, 2006. AFLPs congruent with morphological differentiation of Asian common minnow Zacco (Pisces: Cyprinidae) in Taiwan. Zoologica Scripta 35: 341–351. Miller, M. P, 2005. Alleles In Space: Computer software for the joint analysis of interindividual spatial and genetic information. Journal of Heredity 96: 722-724. Nei, M., and F. Tajima, 1983. Maximum likelihood estimation of the number of nucleotide substitutions from restriction sites data. Genetics 105: 205-217. Nei, M., 1987. Molecular Evolutionary Genetics. Columbia Univ. Press. New York. Page, R. D. M., and E. C. Holmes, 1998. Molecular evolution: A phylogenetic approach. Blackwell Science Inc. London. Panchal, M., 2007. The automation of nested clade phylogeographic analysis. Bioinformatics 23: 509-510. Palo, J. U., D. S. Schmeller, A. Laurila, C. R. Primmer, S. L. Kuzmin, and J. Merila, 2004. High degree of population subdivision in a widespread amphibian. Molecular Ecology 13: 2631-2644. - 26 -.

(28) Posada, D., and K. A. Crandall, 1998. MODELTEST: testing the model of DNA substitution. Bioinformatics 14: 817-818. Ramos-Onsins, S. E., and J. Rozas, 2002. Statistical properties of new neutrality tests against population growth. Molecular Biology and Evolution 19: 2092-2100. Rogers, A. R., and H. Harpending, 1992. Population growth makes waves in the distribution of pairwise genetic differences. Molecular Biology and Evolution 9: 552-569. Ronquist, F., and J. P. Huelsenbeck, 2003. MrBayes 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models. Bioinformatics 19: 572-1574. Rozas, J., J. C. Sanchez-DelBarrio, X. Messeguer, and R. Rozas, 2003. DnaSP, DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods. Bioinformatics 19: 2496-2497. Slatkin, M., 1985. Gene flow in natural population. Annual Review of Ecology and Systematics 16: 393-430. Slatkin, M., 1993. Isolation by distance in equilibrium and non-equilibrium populations. Evolution 47: 264-279. Slatkin, M., and R. R. Hudson, 1991. Pairwise comparisons of mitochondrial DNA sequences in stable and exponentially growing populations. Genetics 129: 555-562. Tajima, F., 1989. Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by DNA polymorphism. Genetics 123: 585-595. Tamura, K., and M. Nei, 1993. Estimation of the number of nucleotide substitution in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Molecular Biology and Evolution 10: 512–526. Templeton, A. R., 2004. Statistical phylogeography: methods of evaluating and minimizing inference errors. Molecular Ecology 13: 789-809.. - 27 -.

(29) Thomas, S., 2002. Influence of habitat fragmentation on the genetic structure of Polyommatus coridon (Lepidoptera: Lycaenidae): implications for conservation. Biological Conservation 107: 291-297. Toda, M., M. Nishida, M. Matsui, K.Y. Lue, and H. Ota, 1998. Genetic variation in the Indian rice frog, Rana limnocharis (Amphibia: Anura), in Taiwan, as revealed by allozyme data. Herpetologica 54: 73-82. Tzeng, C. S., 1986. Distribution of freshwater fishes of Taiwan. Journal of Taiwan Museum 39: 127-146. Wang, H.Y., M. P. Tsai, M. J. Yu, and S. C. Lee, 1999. Influence of glaciation on divergence patterns of the endemic minnow, Zacco pachycephalus, in Taiwan. Molecular Ecology 8: 1879–1888. Wang, J. P., H. D. Lin, S. Huang, C. H. Pan, X. L. Chen, and T. Y. Chiang, 2004. Phylogeography of Varicorhinus barbatulus (Cyprinidae) in Taiwan based on nucleotide variation of mtDNA and allozymes . Molecular Phylogenetics and Evolution 31: 1143-1156. Wang, J. P., K. C. Hsu, and T. Y. Chiang, 2000. Mitochondrial DNA phylogeography of Acrossocheilus paradoxus (Cyprinidae) in Taiwan. Molecular Ecology 9: 1483–1494. Wang, T. Y., C. S. Tzeng, H. Y. Teng, and T. Chang, 2007a. Phylogeography and identification of a 187-bp-long duplication within the mitochondrial control region of Formosania lacustre (Teleostei: Balitoridae). Zoological Studies 46: 569-582. Wang, T. Y., T. Y. Liao, and C. S. Tzeng, 2007b. Phylogeography of the Taiwanese endemic hillstream loaches, Hemimyzon formosanus and H. taitungensis (Cypriniformes: Balitoridae). Zoological Studies 46: 569-582. Wright, S., 1943. Isolation by distance. Genetics 28: 114-138.. - 28 -.

(30) Wu, J. H., C. H. Hsu, L. S. Fang, and I. S. Chen, 2007. Themolecular phylogeography of Candidia barbata species complex (Teleostei: Cyprinidae) from Taiwan. The Raffles Bulletin of Zoology 14: 61–67. Yang, Y. J., Y. S. Lin, J. L. Wu, and C. F. Hui, 1994. Variation in mitochondrial DNA and population structure of the Taipei treefrog Rhacophorus taipeianus in Taiwan. Molecular Ecology 3: 219-228. Yang, Z. H., 1994. Maximum likelihood phylogenetic estimation from DNA sequences with variable rates over sites: Approximate methods. Journal of Molecular Evolution 39: 306-314. 王昭均，2006。臺灣東部地區草蜥屬雜交現象之偵測。國立臺灣師範大學生命科學研究所碩士論文。臺北市。向高世，2006。由粒線體核酸序列分析臺灣產攀蜥屬蜥蝪之親緣關係及生物地理。國立中山大學生命科學研究所碩士論文。高雄市。向高世，李鵬翔，楊懿如，2009。臺灣兩棲爬行類圖鑑。貓頭鷹出版社。臺北市。朱哲民，1996。臺灣北部溪流蛙類群聚之研究。國立臺灣師範大學生物研究所碩士論文。臺北市。呂光洋，杜銘章，向高世，1999。臺灣兩棲爬行動物圖鑑。中華民國自然生態保育協會，大自然雜誌社。臺北市。林中一，2001。北縣雙溪河流域褐樹蛙之生殖生態與族群分布。國立臺灣大學動物學研究所碩士論文林弘都，2007。臺灣與中國大陸地區鯉科魚類之親緣地理研究。國立成功大學生命科學系碩博士班博士論文。臺南市。林孟龍，王鑫，2002。臺灣的河流。遠足文化出版社發行。林思民，2003。臺灣及鄰近地區草蜥屬的親緣關係與親緣地理學研究（有鱗目：蜥蜴科）。國立臺灣師範大學生命科學系博士論文。臺北市。. - 29 -.

(31) 林彥博，2009。臺灣產黑蒙西氏小雨蛙(Microhyla heymonsi)族群遺傳結構與親緣地理學研究。國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文。臺北市。林華慶，林思民，2007。臺灣地區龜殼花遺傳多樣性研究。行政院農業委員會林務局科技計畫期末報告。臺北市。許祐薰，2008。使用分子遺傳標記偵測白頭翁與烏頭翁可能的雜交子代。國立臺灣大學生態與演化所碩士論文。臺北市。許祐薰，許育誠，劉小如，2008。使用分子遺傳標記區辨烏頭翁、白頭翁及其雜交子代。第七屆海峽兩岸鳥類學術研討會（1st, Jan., 2008）。臺北市。許譽騰，1999。由族群遺傳結構探討白頭翁與烏頭翁之演化關係。國立臺灣大學動物所碩士論文。臺北市。陳宏年，2008。臺灣地區白腹游蛇族群遺傳與親緣地理。中國文化大學生命科學系學士論文。臺北市。陳聖宗，2001。臺灣與鄰近地區小鰾鮈分子親緣關係之研究。國立清華大學生命科學系碩士論文。新竹市。陳義雄，張詠青，2005。臺灣淡水魚類原色圖鑑：第壹卷--鯉形目。水產出版社。基隆市。紀水上，1998。臺灣的氣侯。教育部環境保護小組發行。臺北市。張天佑，2008。區內白頷樹蛙複合種群族群遺傳結構與分類地位之探討。國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文。臺北市。張伊鈞，2008。以粒線體 DNA 與形態特徵探討艾氏樹蛙族群親緣地理與演化。國立中興大學生命科學系碩士論文。臺中市。張俊文，2006。臺灣北部溪流蛙類資源分配與人為干擾對資源利用影響之研究。國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文。臺北市。張學文，劉國強，1997，斯文豪氏攀蜥的生物地理與分子親緣關係。野生動物保育經營管理研討會論文集。臺北市。張廖年鴻，2006。臺灣兩種赤蛙的親緣地理結構比較。中興大學生命科學系所博士論文。臺中市。 - 30 -.

(32) 曾晴賢，1992。臺灣纓口鰍之粒線體基因組和臺灣產平鰭鰍科魚類之分子演化的研究。國立臺灣大學動物學研究所博士論文。臺北市。楊胤勛，2009。賞蛙地圖，晨星出板有限公司，臺北市黃仁磐，2007。臺灣特有種短腹幽蟌的多次入侵暨更新世晚期族群擴張事件。東海大學生命科學系碩士論文。臺中市。葉文珊，1997。莫氏樹蛙族群地理親源關係之研究。國立臺灣大學動物學研究所碩士論文。臺北市。蔡長益，1999。以粒線體 12S 核糖體核酸與細胞色素 b 序列分析守宮族群親緣關係。國立中山大學生命科學研究所碩士論文。高雄市。劉怡里，2000。以 RAPD 方法分析臺灣產樹蛙屬樹蛙之族群遺傳結構。國立臺灣大學動物學研究所碩士論文。臺北市。劉國強，1994。以粒線體核酸分析斯文豪氏攀析之生物地理與親緣關係。國立中山大學生命科學研究所碩士論文。臺北市。. - 31 -.

(33) 8 10. 9. 11. 1 3. NAB 南澳北溪 N=16. 4. DAO. 東澳溪. N=19. 5. SAO. 蘇澳溪. N=27. 6. SC. 新城溪. N=15. 7. LY. 蘭陽溪. N=14. 33. 8. KL. 基隆河. N=17. 32. 9. SD. 新店溪. N=16. 31. 10. DH. 大漢溪. N=14. 11. FS. 鳳山溪. N=19. 12. TC. 頭前溪. N=10. 13. ZG. 中港溪. N=17. 14. HL. 後龍溪. N=29. 15. DA. 大安溪. N=21. 16. DJ. 大甲溪. N=11. 17. DD. 大肚溪. N=25. 18 JSH. 濁水溪. N=27. 19. BG. 北港溪. N=16. 20. TW. 曾文溪. N=10. 21. KP. 高屏溪. N=18. 22. LB. 林邊溪. N=17. 23. FG. 楓港溪. N=19. 24. BL. 保力溪. N=14. 13. 6 3. 14 2 15. 1. 30 29. 18. 19 28 27 20. 26. 21. N=13. NAN 南澳南溪 N=20. 7. 17. 和平溪. 2. 12. 16. HP. 25. 5 4. 25 TML 太麻里溪 N= 7 26. BN. 卑南溪. N= 4. 27 SGS 秀姑巒溪南 N=16 22. 28 SGN 秀姑巒溪北 N=20 29 HLS 花蓮溪南 N=20 30 HLN 花蓮溪北 N=20 23 24. 0. 25. 31. ML. 美崙溪. N=20. 32. SJ. 三棧溪. N=19. 33. LW. 立霧溪. N=14. 50km. Figure 1. Sample localities and sample sizes of Buergeria robusta from each population in this study..

(34) W100 W110 W109 W097 W101. W089. NJ/BI Probability values W079. W092 W134 W116 W086 W094 W091 W123 W083. W102 W112. W114. W025. W063. W061 W003 W066. W121. W119 W107 W105. W059. W001 W020. 44/69. 21/51. W042. W009. W014 W008. 23/X. W018 W034 W045 W002. 100/100. W010. W070 W068 W049 W056 W069 W028 W039 W046. W124. Ⅱ Ⅲ. W053 W023. W022 W004 W031 W035 W036 W030 W032 W017 W007. Ⅳ W026 W012. W038. W048 W054 W075 W015 W005. W013. W021 W057 W044 W081. Ⅴ. W074. W058. 58/99. W113. W016 W027. W064. W146. W111. W142. W043. W033 W041. W006. W084 W085 W103 W099 W136 W138 W122 W104. W147 W145 W151. W040 W065 W011 W024 W029 W153. W149 W135 W141 W139 W127. W129. Western lineage. W019. W118. W037 W088. W077 W051 W080 W072 W093 W082 W073 W078 W060 W087 W076 W050. 64/79. W106. Ⅰ. W095. W090. W062. W055 W071. W052 W047. W098. W117. W067. W108. W125. W128. 85/100. W096 W120 W115. W150 W152 W126 W130. W144. W143. Ⅵ. W131 W132 W148 W133 W137. W140 E035. 100/100. E013 E012. E037. E047. E006 E034 E046 E045. E042. E039 E044 E048 E040 E002 E041 E036 E008 E043 E038 E009 E011 E015 E004 E028 E005 E031 E025 E030 E007. 0.002 substitutions/site. Figure 2. Neighbor-joining tree of the 201 haplotypes from Buergeria robusta cytochrome b sequences. Statistic support on each node was represented by bootstrap values with 1000 replicates and Bayesian posterior probabilities.. E001. E033 E022 E010 E016 E021 E003 E024 E026 E018 E017 E023. E020 E019 E032 E027. E029. Eastern lineage. E014.

(35) 43. 40. 41. 36. 30 31. 2 32 38. 25. 8. 35. 5 4. 18. 15 3. 33 26. 20. 37. 28. 19. 27. 29. 11. 7 1. 45. 9 24. 48. 42 23. 47. 10. 22. 12 17. 14. 16. 13. 44. 39. 46. 34. 6. Eastern subnetwork. Figure 3. Network of the 201 Buergeria robusta haplotypes. The eastern and the western subnetworks were not connected because of large amount of mutation steps. The western network was further divided into 6 parts to be shown on the figure. Small open circles represent hypothetical unsampled haplotypes. Size of each haplotype circle roughly represents its sample size..

(36) Ⅵ. Ⅴ. Western subnetwork. Ⅱ. Ⅳ. 138. Ⅰ. 122. 124. 104. 142 111. 108. Ⅲ. 113. 106. 136. 117. 120. 128. 115. 99 98. 101 102 100. 84. 96. 67 97. 61. 89. 63. 79. 85. 83 105. 94 112. 109. 86. 110 134. 103. 91 92. 116 107. 121. 123. 90. 125. 119. Western subnetworkⅠ. 95. 118. 82 78. 80. 88. 93. 77 73 72 52 51. 59. 62. 47 37 25. 6. 63. 61. 3. Ⅵ. Ⅴ Ⅳ. Western subnetwork. Ⅱ. Ⅰ. 19. Western subnetwork Ⅱ. Ⅲ. 25. 87. 76 60 53. 50. 19. Ⅵ 42. Western subnetwork Ⅲ Figure 3: continued.. 43. Ⅴ Ⅳ. Western subnetwork. Ⅱ Ⅲ. Ⅰ.

(37) Ⅵ. Ⅴ. 23. Western subnetwork. Ⅱ. Ⅳ. 38. Ⅰ. Ⅲ. 32. 4. 33. 1. 7. 31 20. 8. 26. 9. 25. 6. 30. 14 22 41. 35. Western subnetwork Ⅳ Ⅵ. Ⅴ. 36. Western subnetwork. Ⅱ. Ⅳ. 17. 12. 13. Ⅰ. 40 21. 57. Ⅲ. 65 69. 18. 28. 5. 15. 2 10. 68. 148. 64. 70. 39. 56. 46. 75. 45. 81 49. 58. 54. 48. 34. 44. 74 25. 16. Western subnetwork Ⅴ. 11. 24. 27. 29. Ⅵ. 144. 126. 150. 127. Ⅴ Ⅳ. 151 130. Western subnetwork. Ⅱ. Ⅰ. 141. Ⅲ 135. 132. 131. 148. 129. 139 133. 147. 153 149. 154 152. 137 140. 155. Western subnetwork Ⅵ. Figure 3: continued.. 68. 146.

(38) 雪山山脈. 17. 苗栗丘陵. 14. 16. 19 10. 14 15 16 27 19 20 113. 17 29 21 11. 14 19 20 20. 25. 20. 27. 清水斷崖 16 20 16. 10. 4. 18. 臺灣堆嘉南平原. 7 17. 19 14. 中央山脈 Figure 4. Haplotype lineage composition of the 33 Buergeria robusta populations in this study. Each color represents a genetic lineage, referred to Fig. 2 ..

(39) Fixation index or genetic differentation鴔Fst Fixation index or genetic differentation，Fst. a.. 0.010. 0.008. 0.006. 0.004. 0.002. y = 0.0015x + 0.4022 R² = 0.1335 F:81.0322, P<0.0001. 0.000. -0.002 0. 0.5. 1. 1.5. 2. 2.5. 3. 3.5. b.. Fixation index or genetic differentation鴔Fst Fixation index or genetic differentation，Fst. geographic distance (100km) 0.010. 0.008. 0.006. 0.004. 0.002. y = 0.0019x + 0.1732 R² = 0.442 F:235.925, P<0.0001. 0.000. -0.002 0. 0.5. 1. 1.5. 2. 2.5. 3. 3.5. c.. Fixation index ororgenetic Fixation index genetic differentation，Fst differentation鴔Fst. geographic distance (100km). 0.004. 0.003. 0.002. 0.001 y = 0.001x + 0.1124 R² = 0.1587 F:4.9188, P=0.0355 0.000 0. 0.5. 1. 1.5. geographic distance (100km). Figure 5. Evaluation of the “isolation-by-distance” model from (a) the entire species; (b) the western populations; and (C) the eastern populations of Buergeria robusta..

(40) Figure 6. Genetic landscape of Buergeria robusta (right) compared to the real topographic map of Taiwan (left)..

(41) a. SSD=0.0195,P=0.0300 Harpending's Raggedness index: r=0.0072,P=0.2000. b. SSD=0.0072,P=0.1000 Harpending's Raggedness index: r=0.0087,P=0.1000. c. SSD=0.0066,P=0.0200 Harpending's Raggedness index: r=0.0753,P=0.1800. Figure 7. Mismatch distribution of Buergeria robusta cytochrome b sequences from (a) the entire species; (b) the western populations; and (C) the easterm populations..

(42) a.. b.. SSD=0.0099,P=0.5800 Harpending's Raggedness index: r=0.0144,P=0.8500. SSD=0.0109,P=0.0700 Harpending's Raggedness index: r=0.0186,P=0.1800. c. SSD=0.0058,P=0.0800 Harpending's Raggedness index: r=0.0282,P=0.6500. d. SSD=0.0126,P=0.6100 Harpending's Raggedness index: r=0.0216,P=0.7000. Figure 8. Mismatch distribution of Buergeria robusta cytochrome b sequences from the 4 regional populations in western Taiwan: (a) the north-eastern region, (b) the northern region, (c) the central region, and (d) the southern region..

(43) a.. million year. b.. million year. Figure 9. Historical demographic change of Buergeria robusta deduced from Bayesian skyline plot. (a) the north-eastern region; and (b) the northern region..

(44) c.. million year. d.. million year. Figure 9. continued: (c) the central region; and (d) the southern region..

(45) e.. million year. Figigure 9. continued: (e) the eastren region..

(46) 5-1 4-5 3-5 2-36. 5-3 4-1 3-1 2-6. 2-34 63. 2-4. 52. 62. 61. 55 71. 5-4 4-4 3-15 2-14. 37 82 88. 59. 15. 2-23 101. 95. 119. 79. 99. 2-37. 42. 43. 2-9. 28 39 46 56 69 70. 103. 125. 53. 105. 11. 4-7 3-13 2-41. 2-43. 113. 26. 153. 18. 154 17. 14. 41. 6. 124. 3-10. 3-18 2-3. 2-26. 20. 2-31. 22 33. 1. 9. 31 136. 3-4 2-15. 68. 140. 2-39 7. 12. 2-17. 2-16. 32 155 146. 149. 144. 148. 131. 132. 133. 137. 126 130 127 139 152. 150. 2-1 8. 129. 30 35 36. 142 38. 2-35. 23. 4. 138. 13. 57. 87. 50. 4-6 3-6 2-2. 117. 104. 128. 21 44 81. 85 83. 114. 58. 10. 60. 19. 76. 106. 122. 2-13. 2-11. 84. 2-20. 3-8 2-19. 3-3 2-10. 94. 121 107. 4-2 3-6 2-24. 2-8. 67. 118. 92. 111. 3. 24 29. 3-12 2-7. 2-18. 86 116 134. 25. 108. 123. 2-21. 66. 115. 97. 91. 75. 48. 102. 96. 90. 45. 2-5. 89. 3-11 2-22. 54. 2. 3-2. 98 100 102 109 110 112. 2-32. 5. 47 51 72 73 77 78 80 93. 3-7 2-25. 2-12. 151 135. 141. 147. Figure 10. Nested clade design for NCA in this study. Clades 5-1 and 5-2 represents the western and eastern lineages of Buergeria robusta, respectively. Closes circles filled with grey indicates haplotypes with more than 10 individuals..

(47) 5-2 4-3 3-9 2-27. 3-16 2-28. 45. 37 44 35. 47 39. 42. 4. 11 15. 48 46. 2-29. 29. 2-38. 20. 38. 24 3 7 9 10 12 13 16 17 18 21 22 23 26 33. 1. 2. 27. 36 40 41 44. 8 19 32. 2-42. 2-30. 14 34. 6. Figure 10. Continued.. 5. 31 28. 25. 30.