行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
海洋微細藻類之抗癌、抗病毒藥物開發與其他活性物質探討
計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC91-2323-B-002-009- 執行期間： 91 年 08 月 01 日至 92 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學漁業科學研究所 計畫主持人： 周宏農 計畫參與人員： 李怡慧 報告類型： 完整報告 處理方式： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 93 年 2 月 5 日
行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告
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海洋天然藥物開發研究 - 海洋微細藻類之抗癌、抗病毒藥物
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開發與其他活性物質探討
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計畫類別：□ 個別型計畫 整合型計畫
計畫編號：NSC 89－2323－
B
－002－013
執行期間： 89 年 8 月 1 日 至 92 年 7 月 31 日
計畫主持人：周宏農
共同主持人：
計畫參與人員：
盧重光、陳逸民、許雅雯、廖美齡、李怡慧
成果報告類型 (依經費核定清單規定繳交)：□精簡報告 完整報告
本成果報告包括以下應繳交之附件：
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處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、
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□涉及專利或其他智慧財產權，□一年□二年後可公開查詢
執行單位：國立台灣大學 漁業科學研究所
中 華 民 國 92 年 10 月 1 日
摘要
關鍵詞： 微細藻，抗癌活性，活性物質，大環內酯 本研究的目的，在於由微細藻中找尋具有抗癌、抗病毒活性的物質，作為後續藥物開 發的基礎。先期由微細藻種源庫的建立著手，於計畫期間共計由本省各地的採樣中純化出 206 株藻，提供理想的材料進行後續的研究。在初步的活性分析中，發現其中至少有 39 株 具有明顯的細胞毒殺活性，以渦鞭毛藻的端溝藻 Amphinidium 及原甲藻 Prorocentrum 發現 活性的比例最高。後續由其中的 4 個藻株純化出 26 個化合物；在其中已完成結構鑑定的 19 個化合物中，發現 1 個 new skeleton 及 5 個新化合物；其餘 7 個結構尚未完全解開的化 合物預期均為新化合物，甚至 new skeleton 化合物。所有化合物中，至少已知有 6 種以上 具有明顯的細胞毒殺活性，顯示省產微細藻類於新型活性化合物開發的潛力與價值。 過去已知存在於海洋生物中的大環內酯化合物 macrolides 均有極強的細胞毒殺活性， 然因結構複雜，產量低，因此難以開發成為抗癌藥物，研究中發現的 prorocentrolides 化合 物亦不例外。然藉由 Prorocentrum 藻株的篩檢，成功挑取出該類化合物含量超高的藻株， 足以克服產量及後續生合成實驗的困難，如此更凸顯出微細藻種源庫的價值。Keywords: microalgae, anti-cancer, bioactive compound, macrolide
This project aimed on the exploitation of bioactive compounds from microalgae to match the need of NHRI in drug development. For the purpose, algae indigenous to Taiwan were isolated, cultivated, and harvested for the previous screening of cytotoxicities. It was found dinoflagellate belonging to the genus of Amphidinium and Prorocentrum exerted strong cytotoxicities with high frequency. The potentially active strains of these genuses were cultivated to larger volume for purifying enough bioactive compounds inside. By the way, twenty-six compounds were purified from four Amphidinium and Prorocentrum strains respectively, and the structures of 19 compounds were fully elucidated. Five of them were new compounds and 1 with new skeleton; other 7 compounds whose structures were partially elucidated were identified as new compounds or new skeletal compounds. At least 6 of them exerted strong cytotoxicities, indicating the potency to explore anti-cancer drugs from the microalgae of Taiwan.
Macrolides produced by marine creatures were known to exerted strong cytotoxicity. The complex structures and the low contents, however, restricted their utilizations on cancer therapy, with no exceptions for prorocentrolides found in our research. It was overcome, however, by finding a strain of Prorocentrum with high prorocentrolide content, indicating the value to keep a library of algal strains.
一、前言
天然物學者於 40 年代開始探索海洋中之天然物，期許浩瀚海洋環境中所蘊藏豐富之生 物物種能提供人類更多更新的藥物。由過去美國癌症研究中心(NCI)所進行相關活性天然物 的篩選計畫中，發現海洋無脊椎動物有相當高的比率具有顯著的細胞毒殺活性(cytotoxicity activity, IC50<2 µg/ml)，特別是海綿動物(Porifera)、苔蘚蟲(Bryozoa)及脊索動物(Chordata) 等，其含毒頻率遠高於一般陸生生物(1)。由此，第一個以海洋天然物為基礎，用來控制疼 痛的藥物已接近上市階段；另有數個用以治療腫瘤的海洋天然物新藥，亦已進入第二期臨 床試驗(2)；然而大多數源自於海洋無脊椎動物的藥物開發案，多因現階段無脊椎動物的人 工培養技術仍有困難而面臨量產上的問題，同時並非所有的化合物均可利用人工方法加以 合成。 近年來的研究發現，許多存在於海洋無脊椎動物的活性物質，事實上為其共生或吞食 之微生物，包括細菌、真菌、渦鞭毛藻或觸絲藻等所產生(3)，其中又以來自渦鞭毛藻的比 例最高，化合物種類亦最為多樣。舉例來說，利馬原甲藻(Prorocentrum lima)證實為海綿 Halichondria okadai 內所含黑海綿酸(okadaic acid)的來源(4, 5)；另由熱帶珊瑚礁魚毒毒源生 物之研究中，亦發現許多底棲性渦鞭毛藻均含有類似活性的化合物，結構十分的多樣；另 Nakajima et al.進行 10 種底棲性渦鞭毛藻的小白鼠活體實驗分析的結果，發現其中 8 種呈現 出各式的活性(6)；另針對行自由生活，或與海洋扁蟲 Amphiscolops magniviridis 共生的渦鞭 毛 藻 Amphidinium spp. 所 含 大 環 內 酯 (macrolides) 化 合 物 – amphidinolides (7-10) 及 caribenolide I (11)的抗腫瘤活性實驗中，發現 amphidinolide B & N 對於 L1210 及 KB 兩種癌 細胞株的 IC50介於 0.05∼0.14 ng/ml，caribenolide I 對於人類大腸癌細胞株 HCT116 及其抗 藥性株 HCT116/VM46 的 IC50為 1 ng/ml，而對老鼠血癌細胞株 P388 的 IC50更低至 0.03 ng/ml，具有十分顯著的抗癌活性。除渦鞭毛藻以外，其他的海洋微細藻尚包含其他 15 個 分類大項(12)，其中絕大多數仍為天然藥物開發的處女地，可預期其活性化合物的多樣與實 用性，加上微藻的可培養性及穩定性，容易克服量產上的問題，為天然藥物開發的明日之 星。 台灣位於熱帶及亞熱帶的交界，地處大陸棚邊緣，東岸緊臨數千米深的海底峽谷，西 岸水深不及百米，在地形及氣候上的變化十分多樣；加上四週各種洋流，包括東岸的黑潮 暖流、西北岸的大陸閩浙沿岸冷水流及西南南海水團等不同性質水團的匯入，造就了種歧 異度甚高之海洋生態環境，水域中富含著各式各樣的微藻，使台灣具備從事微藻天然物研 究與開發之優越環境。近年來本實驗室陸續由台灣周遭海域純化分離出許多渦鞭毛藻，經 初步的活性分析結果，發現其中包括 Alexandrium minutum, Gambierdiscus toxicus, Ostreopsis lenticularis, Prorocentrum spp., Amphidinium spp.及 Gymnodinium spp.在內的藻株有相當高的 比例具有活性，且種間的差異極大，容易從中挑出良好的材料進行研究或應用。 現今腫瘤及病毒仍為造成人類死亡的主要原因之一。目前除由疾病模型的建立與致病 機理的研究著手之外，另一方面則由新藥之開發與藥物機制上的研究尋求解決之道。本研 究以新藥開發的預期目標，提出『台灣產海洋微細藻類之抗癌與抗病毒活性化合物之分離 與結構鑑定』的研究主題，期能以實驗室純化及培養微細藻株的技術，配合國家衛生研究 院生物技術與藥物研究組所提供之新藥研究核心設施，在最短時間之內開發出具有潛力的藻類藥物，而能為我國在醫藥研究的發展上有所貢獻。
二、研究目的
本計畫訴諸微細藻類的題材，致力於抗癌及抗病毒藥物開發的研究；配合總計畫的採 樣，首先由台灣高歧異度的水域環境中單離並培養出不同種類的微藻，以建立本省第一個 具有規模的微細藻種源庫為首要目標；後續以此為基礎，進行種源庫中藻株抗癌活性成分 的分析與純化。在活性分析部分主要以國家衛生研究院的細胞毒殺活性實驗為依據，配合 實驗室的 protein phosphatase 活性抑制分析進行比對；續根據分析結果及藻株大量培養技術 的建立，在研究期間內純化並鑑定出 20 種以上具有活性之化合物。計畫後期尚針對原甲藻 的大環內酯化合物進行分析，由此篩檢出含量較高的藻株，用以量產這類的化合物進行後 續藥物的研究，同時利用 13C 同位素標定的方法進行生合成的研究，期能了解這些具有強 烈抗癌活性的特殊環酯化合物在藻細胞內之生合成途徑，同時由此歸納演繹出人工合成的 步驟，以為後續全人工合成步驟的參考。 圖一、計畫執行工作的重點與流程三、方法
1. 藻類種源庫的建立 於本省週邊沿海及鹹水養殖池為主的區域進行微細藻的採樣，由其中單離出個別的藻 細胞進行培養；培養成功的藻細胞利用顯微鏡檢視其純度，同時進行鑑種及拍照的工作。 後續測試培養條件，針對光照、溫度、打氣、及培養基的調整，尋求個別藻株最適化之生 長條件。 2. 活性分析 將欲分析的藻株擴充培養至兩公升後，利用超音波震盪直接打破細胞；隨後依序以正 己烷、二氯甲烷及正丁醇各 1/2 升萃取。將萃取液減壓濃縮至乾，完成秤重及標示後，送 野外採樣 純化合物 層析分離 活性分析 配比分離 生長條件 拍照建檔 藻株挑取 適量培養 結構鑑定 13 C 位置判別 大量培養 活性分析 第一年 第三年 第二年 藻株大環 內酯分析 13 C 標定至國家衛生研究院進行細胞毒殺活性試驗，測試於 20 µg/ml 及 4 µg/ml 的濃度下，樣品對 人類鼻咽癌細胞株 HONE-1 及人類胃癌細胞株 NUGC 的毒殺活性。 Protein phosphatase 1 (PP-1) 抑制活性的作法是將所有樣品以甲醇溶取，統一調配為 960 µg/ml 後進行分析。取出少量樣品，以酵素反應緩衝液稀釋成 1/200 後，取其中 50 µl， 依序和 100 µl 緩衝液，含 0.05 U 的 PP-1 酵素液 50 µl 加以混合。靜置 10 分鐘後，加入 50 µl 的 250 mM p-NPP 受值液開始反應；另設置以純粹甲醇代替樣品甲醇溶液的控制組進行比 對。由反應一個小時期間，實驗組與控制組於 405 nm 吸光值變化的比值，推估樣品的抑制 活性。 3. 活性物質的純化、鑑定與活性分析 以 AC06、AC09、PL01 及 PM08 等藻株為材料，進行大量培養。利用連續離心機，將 藻液中的細胞收集後，利用甲醇直接萃取；隨後依序以液-液分層、LH-20 膠濾層析、矽膠 速分管柱層析及逆相之高效液相層析法進行純化。純化所得樣品除委請國科會貴儀中心進 行質譜、核磁共振與 X-ray 繞射的分析外，結構解析完成且足量的樣品續送交國家衛生研 究院，進行 HONE-1 及 NUGC 的細胞毒殺活性分析。另委託中國醫藥研究所，按 Alley et al. (14)及 Scudiero et al. (15)的方法，進行人類鼻咽癌細胞株 KB 及人類子宮頸細胞株 Hela 的 細胞毒殺活性分析，測試 pheophorbides 類化合物的光敏反應。 4. 藻株大環內酯化合物的分析 將原甲藻 Prorocentrum 的藻株，在 25 oC，1500 Lux，光週期 12 小時的條件下，以 500 ml 的三角錐形瓶進行培養；待其達對數生長末期後，取其中 50 ml 進行離心，收集藻細胞。 將藻細胞以 50 ml 甲醇萃取 1 次後，萃取液部分以去離子水調整濃度為 90 %，以等體積正 己烷加以萃取。將正己烷移除後，以去離子水稀釋為甲醇溶液至 60 %後，以等體積之二氯 甲烷再萃一次。將甲醇水溶液減壓濃縮至乾，以甲醇回溶，取相當於 5000 個細胞的萃取物 進行高效液相層析分析。以 0.01 M 醋酸銨/氰甲烷的流動相，Cosmosil 5C18-ARII (Nacalai tesque, Japan)，尺寸 4.6 x 250 mm 的管柱，配合氰甲烷於 0-10 分鐘內由 25 - 40 %變化的直 線梯度流動相進行分析，流速 1 ml/min，以自行純化的大環內酯化合物為標準品，配合 235 nm 的偵檢，以及 photo diode array 的吸收光譜分析進行確認。
四、結果與討論
1. 微細藻種源庫的建立 在藻株的純化與培養部分，培養成功的微細藻包括 90 株渦鞭毛藻、66 株藍綠藻、8 株 矽藻以及定鞭藻、綠藻各 1，合計有 166 株；另有 35 個紅藻及褐藻絲狀體藻株亦附帶納入 進行保種與分析(表一、表二)。目前藻株數量仍持續擴增中。 在生長條件部分，初步嘗試經由培養基配方的調整來改善部分藻株的生長情形。實驗 室原本以 K medium (13)為渦鞭毛藻的標準培養基，然發現並非所有的藻株均能培養成功， 同時細胞密度往往未如預期，因此以該配方為基礎，另行添加氮、磷鹽後，發現 Alexandrium 及 Amphidinium 在氮、磷濃度增加(原本濃度的 3 倍以內)的情況下，細胞密度成正比的提昇，顯見氮磷為其限制因子，然 Prorocentrum 的密度卻未見提升，因此將朝向調整其他營養鹽 濃度，亦或改變其他生長條件，諸如溫度、光照或光反應器形式的方向來改善 Prorocentrum 的生長情形。 2. 藻株活性的篩檢 首先在 161 株微細藻中的 37 株發現顯著的細胞毒殺活性(表一、表二)。具有活性的微 細藻以渦鞭毛藻為主，其中 Amphidinium 及 Prorocentrum 有相當高比例的藻株具有活性， 同時活性廣佈於不同的極性分層，顯示活性物質的多樣性；Coolia 亦有相當高比例的藻株 具 有 活 性 ， 然活 性 較低 ， 且 多 侷 限於 氯 仿層 。 此 外 在 Alexandrium、Gambierdiscus、 Gyrodinium、Ostreopsis 中具有活性的藻株雖屬少數，然其活性物質的獨特性亦相對提高， 有進一步研究的價值。相對於渦鞭毛藻，其他種類出現細胞毒殺活性的頻率較低。在所有 藍綠藻及紅藻絲狀體中各僅兩株具有活性，其餘矽藻、綠藻及褐藻中完全沒有發現活性。 有趣的是，所有具有活性的藻種均來自海水或半淡鹹水水域，因此後續的採集將著重 於海洋藻類。 在 PP-1c 抑制活性的分析中，發現有來自 24 株藻的 27 個 fractions 具有顯著的抑制活 性(表一)。明顯的活性主要出現在 Prorocentrum 的氯仿層及 Microcystis 的 butanol 層，此部 分已知和 Prorocentrum 的 OA、DTXs，以及 Microcystis 的 microcystins 化合物有關，其餘 散布於 Alexandrium、Amphidinium、Coolia、Gambierdiscus、Gymnodinium 及絲狀藍綠藻品 系 的 phosphatase inhibitors 則 為 新 的 發 現 。 未 來 將 確 認 這 些 未 知 成 份 是 否 為 new compounds，及對於 PP-1c 是否具有專一的抑制性。而在酵素抑制活性與抗癌活性關連性的 研究中，除 Prorocentrum 的 chloroform 層及 Gambierdiscus GT01 的 butanol 層同時發現具有 此兩種活性外，其餘均無關連。由兩大類純毒︰OA, DTXs 及 microcystins 的活性測試結果， 已知前者同時具 PP-1 抑制活性及細胞毒殺活性，而 microcystins 雖具強烈抑制 PP-1 的活 性，然完全不具細胞毒殺活性，此應和化合物的結構特性有關。推測 OA、DTXs 同時具環 醚碳鏈的脂溶性部分及 carboxyl group 的水溶部分，因此容易通過細胞膜而產生細胞毒殺的 效果，然 microcystins 的 cyclic peptide 結構較偏水溶性，不易通過細胞膜，因此細胞毒殺的 活性極為有限。另其他類藻株所含的 PP-1c 的抑制活性大多來自 hexane 或 butanol 層，屬 於較偏脂溶或水溶的化合物，穿透細胞的能力可能亦較差，此或許為為何這些 fractions 不 具癌細胞毒殺活性的原因。
3. 活性物質的純化與結構鑑定
活性物質純化鑑識部份，共計完成 26 個化合物的純化，以及其中 19 個化合物的鑑定。 首先由 PL-01 藻株純化出 7 種黑海綿酸(Okadaic acid, OA)系列的線狀多醚化合物，以及兩 種大環內酯(macrolide)類的化合物(圖二)，其中 OA-d9D 及 4-hydroxyprorocentrolide、 14-O-acetyl-4-hydroxyprorocentrolide 為新化合物；另由 PM-08 純化出兩種大環內酯類化合 物 spiroprorocentrolide 及 prorocentrolide ， 其 中 前者 為 new skeleton 化 合物 。後 續 由 Amphidinium 藻株 AC-09 中純化出 5 種 polyhydroxy 線狀多醚化合物 amphidinols、3 種脂肪 酸、1 種氨基酸、3 種葉綠素代謝物 pheophorbides (PPBs)，以及一種同屬 polyhydroxy 化合 物的 colopsinol 類似物；另由 AC-06 藻株中純化出另外兩種的 amphidinols 化合物(圖三)。 在 amphidinols 及 colopsinol 部分，雖因其複雜的結構，至今僅完成其中一種化合物的解析， 然由經現有文獻的比對，均能肯定其為新的化合物。後續仍將持續完成這些純質的結構解
析與活性分析。
在活性分析部份，受限於化合物量過少，目前僅完成 pyropheophorbide a、pheophorbide a、pheophorbide a methyl ester 及 amphidinol-A、okadaic acid 及 DTX-1 七個化合物的細胞毒 殺活性的測試(表三)，所有化合物均有明顯細胞毒殺活性存在。其他化合物雖因量少仍無法 送測，然可由上述實驗結果預期其他 amphidinol 及 okadaic acid 系列化合物應同具明顯細胞 毒殺活性；而由文獻中 macrolide 化合物具極顯著細胞毒殺活性的結果，推測本實驗中四個 prorocentrolide 化合物應有極為顯著的細胞毒殺活性，化合物具有活性的比例極高。
在 pheophorbides 部分尚進行光敏反應實驗，比較其在照光的情況下，其細胞毒殺活性 是否有明顯增強的趨勢。結果發現其對 KB 及 Hela 細胞株在照光及不照光的條件下雖均呈 現顯著之細胞毒殺活性(ED50 <20 µg/ml)，然其活性值相近，並未出現預期的光敏效應。在
HONE-1 及 NUGC 的分析結果中，pheophorbides 呈現較弱的毒性，在高達 20 µg/ml 的劑量 時，pheophorbide a 仍不具活性，另兩種 pheophorbide 呈現微弱的活性，顯現國衛院的癌細 胞株對於 pheophorbide 具有較強的耐受性。Amphidinol-A 在國衛院的測試中，於 20 µg/ml 的劑量下有很強的毒殺活性，然 4 µg/ml 則活性較弱；KB 及 Hela 細胞株所測得之 ED50值 則分別為 5.27 及 9.08 µg/ml，顯示其對各種癌細胞株的毒殺活性差異不大。 上述 pheophorbides 的分析，照光與不照光組所以具有近似的活性，推測和照光組所給 的光照強度(620-650 Lux)太弱，不足以啟動光敏反應，或是不照光組在培養箱開啟時所接 受的短暫微弱光源照射，即足以啟動光敏活性有關。Wongsinkongman et al. (16) 的研究中， 以 25W 的日光燈，於距離 30 公分的弱光照條件下進行 KB 的毒殺活性分析，即可測得明 顯的光敏反應效應。由於本實驗的光照參考上述條件進行設計，因此光照強度不夠的問題 理應不存在。另發現 Wongsinkongman et al.的研究中，所測得 pheophorbide a methyl ester 和 pheophorbide a 對 KB 的 ED50值為 0.6 及 0.8 µg/ml，遠較本研究的 4.49 及 4.92 µg/ml 的
值 為 低 。 造 成 此 差 異 的 原 因 可 能 有 二 ， 一 為 反 應 劑 之 差 異 ， 本 實 驗 使 用 MTT ， 而 Wongsinkongman et al.使用 SRB (sulforhodammine B) assay，兩種方法所測得之 ED50可能有
差；二是本實驗所用之細胞株培養較多代，已有老化的趨勢。由於活性分析操作人員曾反 應出同樣的細胞株在培養越多代的情況下，其對許多化合物的耐受性會提升。由一般 KB 對 mitomycin 的 ED50小於 0.1 µg/ml，然本實驗的活性測試值卻高達 0.49 µg/ml，由此研判
本實驗的活性數值的偏高，應和細胞株的老化有關，而來自反應劑劑之差異。
本實驗中另行將過去研究所純化的藍綠藻毒素 microcystin (MCYST)，包括 MCYST-LR, -RR, -FR, -WR, [Dha7]MCYST-LR, -RR 進行細胞毒殺活性分析，結果均未發現顯著活性，推 測和其環狀 peptide 的結構不易進入細胞有關。
4.研究室現有 Prorocentrum 藻株大環內酯成份的分析
研究結果顯示，大多數的 Procentrum lima (PL)與 Procentrum sp. PS 藻株含一至兩種已 知的大環內酯成份，組成形式差異不大；Procentrum minutum (PM)藻株和 PL 與 PS 間則有 較明顯的差異(圖四)，除含有大環內酯的頻率較低外，種類也不太相同。在 PM 藻株中，僅 發 現 prorocentrolide 及 spiroprorocentromine 兩種 ，然 PL 及 PS 除 prorocentrolide、 4-hydroxyl-prorocentrolide 及 14-O-acetyl-prorocnetrolide 外，另在 PL-05、-08 及 PS-01 中發 現一疑似大環內酯類的物質，種類十分多樣。在初步的結夠解析中，已知該化合物為極似 prorocentrolide 的化合物。由於在 PL-08 中所含該物質的含量極高，層析圖譜又十分單純， 容易純化，因此後續除將儘速分析其結構外，同時將以本藻種進行 prorocentrolide 化合物的 生合成實驗，以及該化合物的量產。
表一、實驗室現有藻株的種類及活性測試結果 渦鞭毛藻
學 名 藻 株 Hone-1 NUGC PP-1
C6H14 CH2Cl2 BuOH C6H14 CH2Cl2 BuOH C6H14 CH2Cl2 BuOH
Alexandrium minutum Amtk1 1% 2% 104% 6% 1% 122% 72% 97% 69% Amtk2 1% 1% 93% 7% 5% 126% 103% 98% 58% Amtk3 -1% 104% 92% 0% 117% 124% 91% 95% 105% Amtk4 106% 107% 79% 107% 125% 119% 92% 102% 62% Amtk5 110% 106% 100% 108% 118% 124% 97% 102% 104% Amtk6 105% 104% 98% 114% 118% 120% 107% 114% 98% Amtk7 110% 105% 96% 112% 119% 122% 88% 98% 91% Amks1 124% 127% 109% 99% 106% 103% 104% 101% 90% Amks2 103% 103% 49% 114% 117% 107% 91% 94% 37% Amks3 102% 102% 99% 120% 122% 122% 60% 92% 92% Amks4 106% 104% 99% 115% 121% 122% 106% 102% 74% Amks5 127% 133% 111% 101% 101% 104% 23% 102% 106%
Alexandrium tamarense Athk1 92% 103% 104% 102% 2% 105% 107% 115% 100% Athk2 96% 84% 99% 93% 97% 101% 98% 102% 90% Atan-1 * * * * * * - - -
Amphidinium carterae AC01 90% 88% 94% 11% 3% 1% 42% 32% 42%
AC02 119% 10% -1% 102% 2% 0% 50% 39% 37% AC03 114% 1% 0% 114% 2% 0% 28% 46% 40% AC04 102% 102% 0% 103% 96% 0% 66% 63% 54% AC05 110% 104% 0% 98% 109% 1% 42% 48% 49% AC06 119% 110% 0% 102% 115% 0% 35% 42% 40% AC07 119% 122% 1% 100% 107% 0% 103% 102% 67% AC08 55% 110% 32% 108% 117% 2% 58% 77% 71% AC09 111% 0% 0% 101% 5% 1% 57% 48% 40% AC10 94% 121% 129% 97% 103% 105% 96% 92% 72% AC11 121% 90% 88% 121% 121% 118% 104% 106% 111%
Amphidinium klebsii AK01 78% 96% 0% 100% 117% 0% 40% 50% 51%
Amphidinium spp. AS01 - - - 107% 104% 81% 58% 71% 70% AS02 - - - 105% 100% 104% 55% 52% 75% AS03 - - - 104% 97% 102% 75% 73% 82% AS04 108% 101% 105% 96% 82% 88% 86% 82% 75% AS05 - - - 103% 100% 107% 76% 10% 66% AS06 - - - 105% 104% 103% 23% 64% 69% AS08 * * * * * * - - - AS09 * 83% 109% * 106% 109% - - - Coolia monotis CM01 107% 52% 109% 99% 52% 112% 57% 52% 39% CM02 106% 61% 123% 96% 126% 127% 64% 48% 74% CM03 100% 52% 109% 101% 48% 113% 62% 61% 54% CM04 110% 62% 116% 96% 72% 113% 106% 103% 46% CM05 98% 58% 108% 96% 66% 108% 63% 66% 34% CM06 91% 121% 108% 101% 114% 107% 68% 76% 80% CM08 103% 89% - 99% 86% 108% 77% 75% 68% CM09 - - - 108% 108% 109% 61% 61% 60% CM10 96% 91% 0% 103% 108% 74% 71% 37% 53% CM11 95% 129% 111% 114% 104% 103% 83% 76% 16% CM15 85% 127% 107% 109% 82% 107% 103% 98% 96% CM16 119% 1% 107% 100% 0% 104% 98% 99% 89% Gambierdiscus toxicus GT01 94% -1% 93% 112% 1% 109% 88% 95% GT05 103% 106% 100% 119% 120% 115% 117% 114% 109% Gymnodinium catenatum GCHK01 99% 100% 93% 122% 121% 117% 88% 87% 10% 12%
續表一
渦鞭毛藻
學 名 藻 株 Hone-1 NUGC PP-1
C6H14 CH2Cl2 BuOH C6H14 CH2Cl2 BuOH C6H14 CH2Cl2 BuOH
Gymnodinium sp. YL01 111% 139% 123% 101% 128% 107% 72% 56% 66%
Gyrodinium instriatum GI02 - - - 103% 104% 95% 62% 73% 64% GI03 - - - 104% 103% 109% 78% 67% 80% GI08 - - - 102% 104% 103% 70% 70% 70%
Gyrodinium spp. GY01 110% 105% 97% 112% 125% 121% 73% 90% 83% GY04 82% 11% 113% 37% -1% 104% 100% 104% 112%
GY05 126% 130% 113% 107% 102% 105% 65% 76% 72%
Ostreopsis lenticularis OL01 120% 122% 115% 110% 122% 149% 123% 104% 105%
Ostreopsis spp. OL02 90% 99% 92% 123% 118% 114% 84% 93% 94% OL03 91% 104% 89% 122% 118% 118% 49% 96% 97% OL04 98% 102% 94% 123% 114% 115% 94% 91% 90% OL05 96% 100% 94% 123% 120% 120% 55% 101% 92% OS02 102% 0% -1% 112% 0% 0% 115% 115% 50% Prorocentrum lima PL01 113% -1% 1% 103% 26% 2% 85% 48% 106% PL02 0% 0% 0% 6% 1% 1% 104% 86% 42% PL03 0% 4% 4% 1% 2% 3% 106% 10% 75% PL04 6% 3% 5% 3% 8% 5% 89% 34% 82% PL05 4% 2% 4% 2% 6% 3% 100% 20% 61% Prorocentrum maxicanum PM03 123% 121% 107% 102% 121% 117% 77% 72% 60% Prorocentrum spp. PE01 102% 79% 104% 87% 88% PL07 98% 1% 2% 118% 1% 1% 66% 63% 31% PL08 104% 0% 25% 100% 1% 12% 100% 47% 94% PM01 109% 37% 105% 76% 72% 69% PM02 103% 95% 103% 60% 62% 68% PM04 107% 71% 108% 57% 40% 52% PM05 109% 105% 104% 59% 46% 50% PM06 103% 77% 108% 70% 57% 46% PM07 105% 107% 108% 65% 66% 38% PM08 93% 114% 107% 92% 113% 109% 57% 54% 59% PM09 107% 93% 104% 40% 47% 66% PM10 103% 100% 103% 89% 97% 83% PM11 107% 108% 105% 74% 87% 97% PM12 72% -1% 106% 52% -1% 103% 100% 38% 103% PS01 2% 0% 108% 1% 1% 106% 77% 89% 76% PS02 3% 3% 4% 3% 7% 4% 82% 18% PS03 0% 2% 5% 2% 0% 2% 90% 16% 84% PS04 105% 100% 107% 98% 100% 91% 109% 73% 98% PS06 110% -1% 105% 118% 1% 127% 32% 76% PS07 113% -1% 105% 102% 0% 107% 56% 88% 88% Prorocentrum tropicalis PT01 110% 2% 105% 99% 81% 107% 87% 95% 102% 藍綠藻 Coelosphaerium sp. C.TN1 104% 103% 104% 123% 121% 128% 88% 100% 131%
Microcystis aeruginosa M.TY1 106% 105% 103% 115% 125% 122% 111% 95% 1% M.TY2 109% 109% 107% 117% 110% 110% 75% 92% 0% M.YL1 110% 109% 108% 120% 122% 124% 112% 100% 86%
10%
16%
續表一 藍綠藻
學 名 藻 株 Hone-1 NUGC PP-1
C6H14 CH2Cl2 BuOH C6H14 CH2Cl2 BuOH C6H14 CH2Cl2 BuOH
Microcystis aeruginosa M.TN1 104% 93% 101% 111% 105% 114% 65% 74% 89% M.TN2 100% 102% 105% 109% 104% 112% 97% 83% 9% M.TN3 100% 104% 105% 114% 105% 113% 59% 56% 88% M.TN4 106% 104% 106% 113% 99% 111% 32% 68% -3% M.TN5 95% 105% 103% 120% 112% 111% 30% 63% 43% M.KS1 105% 104% 111% 117% 102% 111% 65% 78% 64% M.KS15 108% 113% 108% 120% 113% 109% 5% 34% 2% M.KS29 112% 111% 114% 121% 113% 113% 72% 101% -1% Oscillatoria sp. O.TS1 106% 103% 106% 115% 116% 112% 50% 67% 70% Spirullina spp. FE-01 94% 101% 106% 108% 95% 100% - - - FE-02 101% 102% 105% 100% 103% 106% - - - FE-03 1055 111% 103% 107% 111% 109% - - - FE-04 102% 95% 105% 95% 105% 105% - - - FE-05 100% 105% 105% 99% 106% 108% - - - FE-06 56% 111% 95% 103% 108% 91% - - - FE-07 102% 85% 98% 99% 102% 105% - - - FE-08 105% 97% 105% 104% 109% 107% - - - FE-09 * * * * * * - - - FE-10 * * * * * * - - - FE-11 83% 104% 102% 101% 96% 109% 88% 85% 88% NP-01 * * * * * * - - - NP-02 * * * * * * - - - NP-03 * * * * * * - - - NP-04 * * * * * * - - - NP-05 * * * * * * - - - NP-06 * * * * * * - - - NP-07 * * * * * * - - - NP-08 * * * * * * - - - NP-09 * * * * * * - - - NP-10 * * * * * * - - - NP-11 * * * * * * - - NP-12 * * * * * * - - - NP-13 * * * * * * - - - NP-14 * * * * * * - - - NP-15 * * * * * * - - - NP-16 * * * * * * - - - NP-17 - - - NP-18 * * * * * * - - - NP-19 * * * * * * - - - NP-20 - - - NP-21 * * * * * * - - - 品種未知 BG1 1% 97% 95% 2% 108% 113% 106% 109% 113% BG2 104% 113% 111% 116% 110% 108% 35% 68% 69% BG3 115% 130% 120% 98% 115% 112% 84% 88% 67% BG4 118% 146% 119% 101% 111% 106% 95% 89% 101% BG5 118% 132% 112% 99% 101% 106% 87% 91% 99% BG6 95% 88% 94% 110% 113% 115% 113% 114% 112% BR1 104% 98% 94% 102% 110% 113% 92% 96% 92% BR2 104% 98% 94% 98% 99% 102% 99% 95% 85% BR3 97% 93% 99% 110% 114% 119% 109% 117% 110% BR4 98% 98% 95% 114% 113% 117% 110% 111% 109% 89%
續表一 藍綠藻
學 名 藻 株 Hone-1 NUGC PP-1
C6H14 CH2Cl2 BuOH C6H14 CH2Cl2 BuOH C6H14 CH2Cl2 BuOH
品種未知 CG1 100% 99% 98% 104% 112% 116% 90% 96% 90% CG2 106% 97% 89% 100% 109% 109% 110% 112% 96% CG3 96% 95% 102% 101% 102% 93% 91% 15% 93% CR1 98% 91% 98% 104% 112% 110% 106% 105% 111% CR2 99% 94% 97% 108% 106% 117% 126% 103% 104% CR3 93% 90% 95% 103% 5% 119% 100% 106% 107% CR4 97% 99% 99% 115% 116% 120% 115% 112% 111% CR5 98% 99% 99% 108% 114% 118% 25% 51% 79% OS1 96% 96% 102% 113% 119% 125% 88% 102% 106% 菲六 * * * * * * - - - 定鞭藻 Prymnesium parvan PP1 29% 130% 117% 47% 113% 105% 96% 92% 93% 綠藻 Dunaliella sp. DS1 58% 52% 105% 102% 111% 63% 104% 110% 94% 矽藻 品種未知 CF3 102% 98% 101% 108% 114% 120% 110% 105% 108% DP1 * * * * * * - - - G2 94% 99% 99% 133% 118% 123% 110% 110% 119% MP1 102% 103% 103% 108% 112% 116% 99% 104% 114% MP2 102% 100% 102% 111% 111% 109% 102% 107% 102% Unk1 - - - Unk2 - - - Unk3 - - - 紅藻絲狀體
Bangia atropurpurea Ba01 123% 119% 105% 104% 101% 108% - - - Ba02 113% 82% 101% 106% 89% 107% - - - Ba03 0% 110% 108% 96% 110% 105% - - - Ba04 93% 113% 107% 88% 107% 106% - - - Ba05 1% 85% 101% 73% 110% 112% - - -
Galaxaura cylindrica Gc01 108% 105% 115% 107% 108% 106% - - -
Galaxaura oblogata Go01 110% 122% 106% 110% 108% 98% - - -
Grateloupia filicina Gf01 103% 110% 110% 108% 109% 108% - - -
Grateloupia sp. Grs01 108% 100% 106% 103% 97% 98% - - -
Grs02 - - - Grs03 - - - Grs04 - - -
Helminthocladia australis Ha01 116% 121% 107% 116% 114% 104%
Ha02 - - - Ha03 101% 98% 98% 103% 104% 103% - - - Ha04 - - - Halymenia ceylanica Hc01 117% 125% 111% 105% 111% 112% 25% 27% 40% Hc02 109% 129% 105% 99% 108% 88% 30% 45% 39% Hc03 119% 105% 106% 110% 108% 108% - - -
Liagora orientalis Lo01 121% 117% 112% 112% 100% 98% - - -
0% 1%
續表一 紅藻絲狀體
學 名 藻 株 Hone-1 NUGC PP-1
C6H14 CH2Cl2 BuOH C6H14 CH2Cl2 BuOH C6H14 CH2Cl2 BuOH
Liagosa sp. Ls01 - - -
Ls02 - - -
Porphyra angusta Pa01 123% 119% 105% 104% 101% 108% - - -
Porphyra dentata Pd01 * * * * * * - - -
Porphyra yenzoensis Py01 - - -
Porphyridium sp. Pos01 - - - Pterocladia capillacea Pc01 - - - Scinaia moniformis Sm01 115% 121% 111% 114% 114% 107% - - - 品種未知 Unk01 - - - -- - - Unk02 - - - Unk03 - - - Unk06 - - - Unk07 - - - Unk08 - - - 褐藻絲狀體 Ectocarpus Ec01 - - - *表已送測，結果未送回， -表未送測
表二、藻株活性分析統計數據 癌細胞毒殺活性數* PP-1 抑制活性數** 分類別 屬 名 總株數 送測數 株數 己烷層 氯仿層 丁醇層 株數 己烷層 氯仿層 丁醇層 Alexandrium 15 15 4 3 3 0 1 1 0 0 Amphidinium 20 20 10 1 4 10 3 2 1 0 Coolia 12 12 2 0 1 1 1 0 0 1 Gamdierdiscus 2 2 1 0 1 0 1 0 0 1 Gymnodinium 2 2 0 0 0 0 1 0 0 1 Gyrodinium 6 6 1 0 1 0 0 0 0 0 Ostreopsis 6 6 1 0 1 1 0 0 0 0 渦鞭藻 Prorocentrum 27 27 14 7 14 9 5 1 3 1 Coelosphaerium 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 Microcystis 12 12 0 0 0 0 8 3 0 7 Oscillatoria 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 Spirullina 32 30 0 0 0 0 0 0 0 0 藍綠藻 Unidentified 20 20 2 1 1 0 2 1 1 0 矽藻 Unidentified 8 5 0 0 0 0 0 0 0 0 定鞭藻 Prymnesium 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 綠藻 Dunallina 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 Bangia 5 5 2 2 0 0 0 0 0 0 Galaxaura 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 Grateloupia 5 2 0 0 0 0 0 0 0 0 Helminthocladia 4 2 0 0 0 0 2 2 1 0 Halymenia 3 3 0 0 0 0 0 0 0 0 Liagora 3 1 0 0 0 0 0 0 0 0 Porphyra 3 1 0 0 0 0 0 0 0 0 Porphyridium 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pterocledia 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Scinaria 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 紅藻 Unidentified 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 褐藻 Ectocarpus 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 總 計 201 178 37 14 26 21 24 10 6 11
Spiroprorocentromine (11) (new skeleton) PL01 Extract Ext liq MeOH Partition n-hexane chloroform n-butanol Chloroform fraction Butanol fraction Purification GPC: LH-20 FC: Si HPLC: ODS R1 R2 H H CH3 H H CH3 H H H H OA (1) DTX-1 (2) OA methyl ester (3) OA-D8 (4) OA-D9d (5) (new) DTX-6 (6) DTX-4b (7) OA~OA-D9d DTX-6、DTX-4b 4-hydroxyprorocentrolide (8) (new) O N O OH C H3 OHHO O OH OH OH CH3 CH 3 OH OH O CH3 O OH O N O OH C H3 OAcHO O OH OH OH CH3 CH3 OH OH O CH3 O OH 14-O-acetyl-4-hydroxyprorocentrolide (9) (new)
PM08
Extract Ext liq MeOH Partition n-hexane chloroform n-butanol Butanol fraction O N O OH C H3 OHHO O OH OH OH CH3 CH3 H OH O CH3 O OH Prorocentrolide (10) 圖二、Prorocentrum 藻株化合物純化流程及結構鑑定結果 O O H C H3 O H O H O S O3 -N H+ O H O O H O H O R1O O O O O O O O O O H O H R2 O H O H O H O H O O O H O H O H O S O 3H O S O 3H O S O3H O O O H O H O H O S O 3H O S O3H O S O 3H. Amphidinol A 圖三、Amphidinium 藻株化合物純化流程及結構鑑定結果
Tryptophan (12) Amphidinol A (13) (new) separation
AC09
Extract Ext liq Partition MeOH n-hexane CHCl3 n-BuOH BuOH fraction CHCl3 fraction HPLC: ODS separation GPC: LH-20 FC: Si Extract MeOH Ext liq Partition n-hexane CHCl3 n-BuOH BuOH fraction GPC: LH-20 FC: ODS HPLC: ODS 1296 Amphidinol F (18) (new) ? Amphidinol G (19) (new) separationAC06
HPLC:ODS R1 R2 H H pyropheophorbide a (23) H CH3OOC pheophorbide a (24)1CH3 CH3OOC pheophorbide a methyl ester (25) Fatty acids: C18:4 (n-3) (20) C20:5 (n-3) (21) C22:6 (n-3) (22) 1402 Amphidinol A (13) (new) 1444 Amphidinol B (14) (new) 1412 Amphidinol C (15) (new) 1388 Amphidinol D (16) (new) 1400 Amphidinol E (17) (new) MW MW Pheophorbides Amphidinols Colopsinol analog (26) (new skeleton) HPLC:ODS -CH2- x 6 -CHOH- x 9 -C-O-C- x 1 O H O H O HH O O H O H O H O H O H O H O H O H O H O H O H O O H O H O H O H H O O O H O H O O H O H H O O H O H N N N N O R2 R1O O C
表三、化合物之活性分析數據 NUGC HONE-1 化合物名稱 編 號 10µM 50µM 10µM 50µM Okadaic acid 1 -1% 3% 5% 3% DTX-1 2 0% 4% 10% 2% MCYST-LR 27 103% 101% 103% 104% MCYST-RR 28 99% 93% 100% 100% MCYST-FR 30 99% 99% 95% 100% MCYST-WR 31 103% 107% 101% 103% [Dha7] MCYST-LR 32 104% 103% 103% 98% [Dha7] MCYST-RR 33 103% 100% 99% 104% NUGC HONE-1 化合物名稱 編 號 4µg/ml 20µg/ml 4µg/ml 20µg/ml Amphidinol-A 13 97% 0% 85% 0% Pyropheophorbide a 23 127% 85% 76% 34% Pheophorbide a 24 94% 1% 75% 0%
Pheophorbide a methyl ester 25 88% 39% 35% 13%
KB ED50 (µg/ml) HELA ED50 (µg/ml)
化合物名稱 編 號
不照光 照光 不照光 照光
Amphidinol-A 13 5.27 - 9.08 -
Pyropheophorbide a 23 1.68 2.36 1.21 1.13
Pheophorbide a 24 5.53 4.92 3.11 4.03
Pheophorbide a methyl ester 25 2.71 4.49 2.15 5.39
Mitomycin* - 0.49 - 0.94 - * positive control 五、成果自評 在藻種源庫的建立部份，目前已完成近兩百株微細藻株的建立與培養。以現有研究室 的人力和經費評量，和國外數個知名大型種原庫的規模與成果相比毫不遜色。本藻株種源 庫的建立，不僅能為本計畫後續研究持續提供良好材料，尚能支援國內外其他相關研究之 進行，價值非凡。在藻株的活性篩檢中，已知在本種源庫的許多渦鞭毛藻藻株中含有許多 獨特的活性成份，極具開發的價值，評估在未來的十至十五年內，可陸續由此開發出許多 成果。而在活性物質的純化與結構解析中，目前雖已完成 26 種化合物的純化，然由於絕大 多數物質的結構均十分複雜，因此目前僅完成 19 個化合物結構的解析。其餘化合物雖仍無 法在近日內解析完成，然由初步與文獻的比對中，得知其幾乎均為新化合物，且含有活性 的比例極高，極具開發的價值。
圖 四 、 Prorocentrum 藻 株 的 大 環 內 酯 分 析 結 果 。 P: prorocentrolide, 4-OH-P: 4-hydroxyprorocentrolide, 14-O-P: 14-O-acetylprorocentrolide, X: prorocentrolide analog, S: spiroprorocentromine. 4-OH-P 4-OH-P PL-01 PL-02 Standard PS-01 PS-03 PL-03 PL-05 PL-07 PL-08 Standard PS-04 PS-06 P X? X 4-OH-P 4-OH-P X? 4-OH-P P S P P PM-01 PM-02 PM-04 PM-06 PM-07 PM-08 PM-09 PM-10 PM-11 Standard 14-O-Ac 4-OH-P
六、參考文獻
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附件：相關著作
註： 群體計畫(PPG)者，不論是否提出各子計畫資料，都必須提出總計畫整合之資料。若 為群體計畫，請勾選本表屬於﹕ 子計畫；或□總計畫(請自行整合) 。 1.列出貴計畫於本年度中之所有計畫產出於下表，包含已發表或已被接受發表之文獻、已 取得或被接受之專利、擬投稿之手稿（manuscript）以及專著等。 2.「計畫產出名稱」欄位：請依「臺灣醫誌」參考文獻方式撰寫﹔ 3.「產出型式」欄位：填寫該產出為國內期刊、國外期刊、專利、手稿或專著等。4.「SCI」欄位：Science Citation Index，若發表之期刊為 SCI 所包含者，請在 欄位上填寫 該期刊當年度之 impact factor。 5.「致謝與否」欄位：請註明該成果產出之致謝單位。若該成果產出有註明國科會資助字 樣者，請以 NSC 註明。 序號 計 畫 產 出 名 稱 產出型式 SCI* 致謝 與否 1.
Lu, C. K., Lee, G. H., Huang, R. and Chou, H. N., 2001. Spiro-prorocentrimine, a noval macrocyclic lactone from a benthic Prorocentrum sp. of Taiwan. Tetrahedren Lett., 42: 1713-1716.
國外期刊 是
2.
Lu, C. K. and Chou, H. N., 2001. Research of marine
dinoflagellate bioactive compounds in Taiwan. Proceeding of 70th anniversary of the Japanese society of fisheries science international commemorative symposium
國外期刊 否
3.
Lu, C. K. and Chou, H. N., 2001. Toxins of Prorocentrum spp. (Dinophyta) isolated from Taiwan.10th International
Symposium on marine nature product, Nanko, Okinawa.
研討會 -
4.
Chou, H. N., Lu, C. K., Oshima, Y. and Quilliam, M. A., 2001. Studies of dinoflagellate toxins toward certified reference material and pharmaceutical development. 10th International Symposium on marine nature product, Nanko, Okinawa.
研討會 -
5.
Chen, Y.-M., Bai, J. -Y, Huang, R. and Chou, H. N., 2001. Protein phosphatase assay for screening toxic Microcystis. 6th Asian fisheries forum, Kaohsiung, Taiwan.
研討會 -
6. 台灣產兩種原甲藻的毒素研究 博士論文 -
7. 渦鞭毛藻 Amphidinium carterae 活性物質的研究及分析 碩士論文 - *本表如不敷使用，請自行影印。
