科別:生物(生命科學)科 組別:高中組

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中華民國第 51 屆中小學科學展覽會

作品說明書

科別:生物(生命科學)科 組別:高中組

作品名稱:是敵 人 還是 朋 友?

- 蘭科 菌 根解 剖 學特 性 及其 菌 根真 菌 之應 用 關鍵詞:蘭根真菌、內生菌根、台灣金線連

編號:

(2)

摘要

我們在 2010 年 7 月 23 日的野外採集,從烏來山區找到數種野生的蘭科植物,採其根及果莢。

首先進行初步的菌根解剖觀察,同時準備進一步的石蠟包埋切片和真菌的分離純化,根據文獻資 料和初步的觀察後,確定採集回來的樣本為菌根菌類中的絲核菌類。進一步我們著手真菌鑑定,

藉由菌落特性、菌絲型態、核染觀察,將其分類為雙核絲核菌類、多核絲核菌類,再以電子顯微 鏡進行隔膜孔觀察,以分子生物學為輔,確認它所對應的有性世代屬名─ Thanatepjorus、

Ceratobasidium、Tulasnella。然後依菌落培養特性、融合群種類,挑選四隻真菌,進行生理生化測 試,找到真菌生長的最佳溫度(25℃~30℃)及 pH(5.5~6.5)值。最後我們將此真菌與珍貴藥材臺灣金 線連進行共生測試,從接種到生長,經過五個月後,測量植株長度與重量,測量發現編號 Cno10-3 的 菌 株 , 單 一 植 株 最 重 , 而 Cno3-2 的 菌 株 總 重 最 重 , 因 此 編 號 Cno10-3、 Cno3-2 的真 菌對台灣金線連的生長有較好的效果。

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壹、 研究動機

台灣位處亞熱帶和熱帶的交界處地區,造就了多樣的地理及氣候環境,因此孕育了許多植物 種類,其中維管束顯花植物又以蘭科植物為最大的植物族群,根據中央研究院生物多樣性研究中 心的台灣物種名錄資料庫(Catalogue of Life in Taiwan)台灣目前共有 109 屬、300 多種的野生蘭科植 物,究竟是什麼原因使得蘭科植物如此多樣化呢?

由於蘭科植物的種子無胚乳可提供發芽所需的養份,因此野生的蘭科植物種子無法自行生長 成熟,故需真菌與之交互作用才能順利發芽成長,於是我們深入台灣烏來山區,一窺台灣野生蘭 的世界,並採集數種野生蘭科植物回來進行研究與探討,根據前人的文獻,其中存在的關係可能 有助於生長也可能造成危害,為了更進一步探討這些現象,我們選擇蘭科植物台灣金線連和不同 真菌進行共生培養來觀察彼此之間的關係。

台灣金線連(

Anoectochilus formosanus Hayata

)在民間是一種極珍貴的藥材。在「2004 國際藥用 植物產業發展研討會專刊」中提到,金線連有抗病毒、抗腫瘤 、抗氧化的功效,其中,中研院 生農所徐麗芬等人的研究則指出金線連含有很強的抗氧化作用的金線連酮。但台灣金線連栽種不 易,一般民間種植時,不僅成長緩慢而且容易受病蟲侵入,造成農民的損失。因此想藉由經過鑑 定的真菌與之共生,藉此找到對於金線連生長較有幫助的真菌,以提高金線連培育時的存活率,

而且減少使用農藥,以最貼近自然的方法,以達到永續農業。

貳、 研究目的

一、 證明從野外採集的蘭科植物根中有真菌存在,並進一步確認真菌侵入植 物體的部位。

二、 以型態鑑定,鑑定存在於蘭科植物中編號 Cno10-3、Cno3-2、Bno7-3、Sno5-12 的真菌,其對 應的有性世代屬名。

三、 以分子鑑定,找到和編號 Cno10-3、Cno3-2、Bno7-3、Sno5-12 四株真菌親緣關係相近的真菌,

進而輔助型態鑑定的不足。

四、 在不同酸鹼值,其他培養條件相同下,Cno10-3、Cno3-2、Sno5-12 三株真菌,生長曲線的比 較。

五、 在不同溫度,其他培養條件相同下,Cno10-3、Cno3-2、Bno7-3、Sno5-12 四株真菌,生長曲 線的比較。

六、 在不同基質,其他培養條件相同下,比較 Cno10-3、Cno3-2 二株真菌,得生長情形,並綜合 上述三點,找到最適合的酸鹼值、基質、溫度。

七、 在相同的培養條件下,比較分別與四株真菌進行共生培養之金線連的生長情形。

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參、 研究設備及器材

一、野外採集蘭科植物

(一)凡尼蘭 (二)烏來石山桃

(三)竹柏蘭 (四)長距根節蘭

(五)烏來石山桃 二、實驗菌種

(一)編 號 為 Cno10-3,Cno3-2,Bno7-3,Sno5-12 的 四 株 真 菌 三、實驗藥品及配方

(一)培養基(V8 PSA PDA WA OMA)

V8 OMA PDA PSA WA

10%V8 80ml

水 400ml

水 500ml

水 400ml

水 400ml CaCO3

0.8%

Agar 2%

Agar 1.6%

Agar 2%

Agar 2%

燕麥 0.25%

PDB 2.4%

馬鈴薯煎汁 (240g 馬鈴薯)

(二)NaOCl(次氯酸鈉)

(三)FAA(福馬林 37%、冰醋酸 99.8%、酒 95%)

(四)TBA(第三級丁醇&乙醇)

(五)Cotton blue

(六)Xylene(二甲苯)

(七)EtOH (100% 95% 70% 50%)

(八)KOH

(九)HCl 四、實驗設備

(一)無菌操作台(Laminar Flow Horizontal)

(二)轉動式石蠟切片機(Rotary Microtome-RM2235)

(三)高壓滅菌釜(Auto clave- YTM-D)

(四)桌上型酸鹼度計(PH-Meter-S20)

(五)分析天平(Analytical Balances -AB204-L)

(六)烘箱(Oven-150 general purpose)

(七)離心機(Centrifuge)

(八)器材

微量吸管(Micropipette)、微吸管頭(Micro Pipettor tip)血清瓶、秤量紙、藥匙、

震盪器、試管分注器、磁石、離心管(Tube)

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肆、 研究過程或方法

一、研究程序

【實驗三】真菌鑑定 以分子鑑定來確認野 生蘭科植物根部真菌 所屬種類。

【實驗二】真菌鑑定 型態鑑定,將野生蘭科植物 根部觀察到的真菌,依菌落 生長特性、核染、電子顯微 鏡等型態鑑定,鑑定菌的種 類。

【實驗六】基質測試 在不同基質,其他培養條 件相同下,找出最適合真 菌生活的基質。

【實驗五】溫度測試 在不同溫度,其他培養條 件相同下,找出最適合真 菌生活的溫度。

三、生理生化測試

在不同酸鹼值、溫度、基質中,

找出最適合真菌生活的條件。

四、共生測試 【實驗七】

將編號 Cno10-3、Cno3-2、Bno7-3、Sno5-12 的真菌,在最相同條件下與台灣金線連進行共 生。

【實驗四】酸鹼值測試 在不同酸鹼值,其他培養 條件相同下,找出最適合 真菌生活的 pH 值。

二、菌種選擇

根據前人研究與觀察,在蘭科植物中分離出來的以絲 核菌類為最大宗。而其中又分為單核、雙核及多核絲 核菌類。而我們所試驗的真菌,則是絲核菌類中選取 培養特性差異較大的四株真菌。

【實驗一】樣本切片 以石蠟切片、徒手切 片觀察野生蘭科植物 物。根。部的真菌。

一、蘭根採集

到烏來採集野生蘭科植物,帶回 並加以清洗、消毒。

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二、實驗方法

在 2010 年 7 月 23 日,前往烏來山區進行野生蘭科植物的採集,採後的標本,經簡易處 理帶回實驗室,用清潔劑洗淨表面後,在接續下面一連串的表面消毒。

〈圖一〉:長距根節蘭 〈圖二〉:根節蘭屬 〈圖三〉:一葉罈花蘭

〈圖四〉:蕙蘭屬 〈圖五〉:凡尼蘭屬

將取回來的野生蘭科植物的根用清潔劑清洗表面

加入無菌水,Vortex 3 分鐘(重複 2 次)

加入 70%的酒精 Vortex 1 分鐘

加入 1%次氯酸鈉(漂白水) Vortex 5 分鐘

加入無菌水,Vortex 3 分鐘(重複 2 次)

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(一)、 實驗一:徒手切片、石蠟切片

1. 徒手切片將採集回來的野生蘭科植物的根徒手切片,觀察根部是否有 真菌存在。

2. 在顯微鏡下確定蘭科植物的根部有真菌後,放入 tube 加入 FAA。

〈圖六〉:將植物置入 FAA 溶液中

3. 以 FAA 浸泡靜置 12hr~24hr,倒掉 FAA,用 50%酒精搖晃清洗 5 次,放置在 50%的酒精 4hr。

4. 以濃度低(50%)~濃度高(pure)的 TBA 取代組織間的液體,進行脫水 5. 將蠟粒在 58℃下加熱,使其溶進組織間。

〈圖七〉:蠟粒在定溫 58℃下加熱溶解

6. 將液態蠟倒入模具中,並把植物組織整齊放上,放進冰箱中冷卻。

7. 將植物組織放到轉動式切片機上,以每片 10μm 的厚度切片。

(8)

〈圖八〉:切下厚 10μm 的組織 8. 用 Xylene(二甲苯) 、100%~50%的 EtOH 脫蠟。

9. 用 Cotton blue 染色。

(二)、 實驗二:真菌鑑定一型態鑑定

根 據 前 人 研 究 與 觀 察 , 在 蘭 科 植 物 中 分 離 出 來 的 以 絲 核 菌 類 為 最 大 宗 。 而 其 中 又 分 為 單 核 、 雙 核 及 多 核 絲 核 菌 類 。 而 我 們 所 試 驗 的 真 菌 , 則 是 絲 核 菌 類 中 選 取 培 養 特 性 差 異 較 大 的 四 株 真 菌 。

Rhizoctonia- like fungi

Rhizoctonia solani

(Kühn,1858)

Rhizoctonia solani

(Kühn,1858)

Waitea circinata

(Oniki,1985)

Waitea circinata

(Oniki,1985)

Binucleate Rhizoctonia(BNR) BNR

(Parmeter and Whitney,1970) (Ogoshi, 1975,1979)

(Warcup and Talbot) (Currah et al, 1987)

Multinucleate Rhizoctonia (MNR)

(Parmeter and Whitney,1970)

UNR

(Hietala et al,1994) (Oterol et al, 2002)

Rhizoctonia- like fungi

Rhizoctonia solani

(Kühn,1858)

Rhizoctonia solani

(Kühn,1858)

Waitea circinata

(Oniki,1985)

Waitea circinata

(Oniki,1985)

Binucleate Rhizoctonia(BNR) BNR

(Parmeter and Whitney,1970) (Ogoshi, 1975,1979)

(Warcup and Talbot) (Currah et al, 1987)

Multinucleate Rhizoctonia (MNR)

(Parmeter and Whitney,1970)

UNR

(Hietala et al,1994) (Oterol et al, 2002)

〈 圖 九 〉: 根據前人的研究報告,繪製絲核菌分類簡圖,並依這照此圖,選出並判斷出我們所 要研究的真菌在分類學上所屬位置。

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1. 菌落生長特性

觀察 Cno10-3、Bno7-3、Cno3-2、Sno5-12 四株真菌,在 PDA 培養基中,生長 14 天後之菌落型態,並且進行比較。

2. 絲核菌特徵

(1)將菌塊放在載玻片上,

(2)用 Cotton blue 染色

(3)進行鏡檢,觀察菌絲是否有出現下列特徵。

【縊縮處附近有隔膜,菌絲分支成特定角度,可能形成菌絲圈和念珠狀細胞。】

3. 核染

(1)在菌落切下菌塊後,將菌絲養在載玻片上

(2)經數日無菌培養後用 safranin O 染劑滴在菌絲上染色,再用 3%(KOH) 退染

(3)鏡檢並拍照。

4. 用 TEM 穿透式電子顯微鏡進行隔膜孔的觀察 (三)、 實驗三:真 菌 鑑 定 一 分子鑑定

1. 從盛裝 10%V8 培養液的三角瓶中取出菌絲 2. 抽取 DNA

3. PCR

(1)以限制梅切取 ITS1~ITS4

(2)加入 DNA 引子

(3)放入 PCR system

(4)等待 2 小時 30 分鐘

〈 圖 十 〉: PCR 示意圖

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(5)膠體電泳

(A) (B)

〈 圖 十 一 〉:(A)電泳示意圖(B)使用 EtBr 染膠 (四)、 實驗四:生理生化測試一 pH 值測試

1. 配置 10%V8 培養液 1600ml

(1)250c.c V8 果菜汁+10g 碳酸鈣

(2)分裝並離心取上清液

(3)取 160ml 加水定量至 1600ml 2. 裝 220c.c 至燒杯

3. 分別調整 pH(pH2~7)

4. 每個燒杯分裝至 4 個小三角瓶(50c.c) 5. 滅菌(1.5 磅 121℃)

6. 將各 pH 值所需之酸鹼量加入。搖勻後殖入兩塊接種源 7. 每兩天測量一次,測量一週

8. 最後取出菌絲秤量其乾重

9. 觀察真菌在不同 PH 值內的生長狀況 (五)、 實驗五:生理生化測試一溫度測試

1. 定量 20ml PDA、V8 培養基

2. 將 Cno10-3、Bno7-3、Cno3-2、Sno5-12 四隻真菌置於正中央 3. 在每個培養皿底部畫上十字以方便測量

4. 每 4 個培養皿放置 1 個溫度下生長(5℃~35℃),測量至長滿為止或到第五天。(每八小時測 量一次),以找出最適合此四隻真菌最適合生長的溫度。

(六)、 實驗六:生理生化測試一基質測試 1. 配製 5%V8 培養基

2. 放置白蘿蔔、芋頭、青剛櫟葉 3. 中 心 放 置 接 種 源

4. 觀察真菌對於不同基質的生長情形

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(七)、 實驗七:共生培養

1. 用試管分注器定量 OMA 培養基 2. 滅菌後,傾斜等待冷卻

3. 再倒入 WA 培養基(瓊脂)

4. 將金線連的幼苗接種在瓊脂,再將真菌接在 OMA 培養基上

〈 圖 十 二 〉: 斜面培養基示意圖 5. 觀察五個月金線連的生長狀況

6. 五個月後取出照相並秤重

7. 切片後使用強鹼軟化組織,並染色觀察其根部及莖部有無菌根真菌存在

伍、 研究結果

一. 實驗一:徒手切片、石蠟切片 (一 ) 結果一:徒手切片結果

peloton peloton

〈 圖 十 三 〉:杜 鵑 蘭 根 部 切 片 , 在 根 毛 中 發 現 菌 絲 的 入 侵 。

〈 圖 十 四 〉: 竹 柏 蘭 根 部 切 片,菌 絲 從 四 方 纏 住 細 胞 核 的 情 形 。

〈 圖 十 五 〉:斑 葉 蘭 根 部 切 片 , 此 為 較 後 期 的 菌 絲 團 。

Hyph

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(二) 結果二:石蠟切片結果

〈 圖 十 六 〉: 凡 尼 蘭 根 部 切 片,有 菌 絲 團 和 一 些 疑 似 澱 粉 粒 的 構 造 。

〈 圖 十 七 〉: 長 距 根 節 蘭 根 部 切 片 , 變 為 後 期 菌 絲 團 , 看 不 出 一 條 一 條 的 感 覺 。

〈 圖 十 八 〉: 凡 尼 蘭 根 部 切 片,低 倍 顯 微 鏡,看 到 大 範 圍 的 植 物 組 織,且 含 有 菌 絲 團 。

二. 實驗二:真菌鑑定一型態鑑定 (一 ) 結果一:菌落生長 14 天後的結果

Cno10-3 Bno7-3

〈 圖 十 九 〉: 菌 絲 生 長 較 鬆 散 , 外 圈 處 菌 絲 較 內 圈 厚 。

〈 圖 二 十 〉: 菌 絲 生 長 緩 慢 但 綿 密 , 呈 現 乳 白 色 。

Cno3-2 Sno5-12

〈 圖 二 十 一 〉: 菌 絲 十 分 均 勻 有 菌 核 的 構 造 產 生 。

〈 圖 二 十 二 〉: 菌 絲 在 中 心 處 有 菌 核 的 構 造 產 生 。

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(二 ) 結 果 二 : 顯 微 鏡 下 菌 絲 觀 察 照

〈 圖 二 十 三 〉: 絲 核 菌 的 菌 絲 分 支 處 有 縊 縮 且 成 特 定 角 度 。

〈 圖 二 十 四 〉: 縊 縮 附 近 有 隔 膜 。

〈 圖 二 十 五 〉: 念 珠 狀 細 胞 〈 圖 二 十 六 〉 絲 核 菌 的 菌 絲 可 能 形 成 菌 絲 圈 。

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(三 ) 結 果 三 : 核 染 觀 察 照

Cno10-3 Bno7-3

〈 圖 二 十 七 〉: 箭 頭 處 指 著 雙 核 〈 圖 二 十 八 〉: 箭 頭 處 指 著 雙 核

〈 圖 二 十 九 〉: 箭 頭 處 指 著 雙 核 〈 圖 三 十 〉:在 編 號 Bno7-3 中,發 現 菌 絲 圈 的 構 造 。

Cno3-2 Sno5-12

〈 圖 三 十 一 〉: 箭 頭 處 指 著 雙 核 〈 圖 三 十 二 〉: 箭 頭 處 指 著 雙 核

〈 圖 三 十 三 〉: 箭 頭 處 指 著 雙 核 〈 圖 三 十 四 〉: 箭 頭 處 指 著 雙 核

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(四) 結果四:電子顯微鏡觀察結果

Sno5-12 Cno10-3

〈 圖 三 十 五 〉: Sno5-12 雙 核 絲 核 菌 , 隔 膜 孔 構 造 之 parenthesome 為 有 孔 洞 型 , 有 性 世 代 屬 名 應 為

Ceratobasidium

〈 圖 三 十 六 〉: Cno10-3 雙 核 絲 核 菌 , 隔 膜 孔 構 造 之 parenthesome 為 有 孔 洞 型 , 有 性 世 代 屬 名 應 為

Ceratobasidium (五) 總結:

經過一連串的觀察鑑定,看到了縊縮處附近有隔膜,菌絲分支成特定角度,可能形成菌絲圈和 念珠狀細胞,這些都是符合絲核菌的特徵;再更進一步的觀察電子顯微鏡,發現編 Sno5-12、

Cno10-3 的隔膜孔構造之 parenthesome 為有孔洞型,有性世代屬名應為 Ceratobasidium。

三. 實驗三:真 菌 鑑 定 一 分子鑑定 (一) 結果一: 電泳圖

3kb

600bp 1kb

5 μl

M ar ke r Sn o5 ‐1 2

Bn o7 ‐3 Cno

3‐ 2 Cn o1 0‐ 3

Fn o1 ‐2 a Fn o1 ‐2 b

3kb

600bp 1kb

5 μl

M ar ke r Sn o5 ‐1 2

Bn o7 ‐3 Cno

3‐ 2 Cn o1 0‐ 3

Fn o1 ‐2 a Fn o1 ‐2 b

3kb

600bp 1kb

5 μl

M ar ke r Sn o5 ‐1 2

Bn o7 ‐3 Cno

3‐ 2 Cn o1 0‐ 3

Fn o1 ‐2 a Fn o1 ‐2 b

〈 圖 三 十 七 〉: 電泳結果呈現如上

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(二) 結果二:解序及比對結果 1. Bno7-3

〈 圖 三 十 八 〉: Bno7-3 的序列比對結果

〈 圖 三 十 九 〉: 與Bno7-3 親源關係最近的真菌序列比較 2. Cno10-3

〈 圖 四 十 〉: Cno10-3 的序列比對結果

〈 圖 四 十 一 〉: 與 Cno10-3 親源關係最近的真菌序列比較

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3. Cno3-2

〈 圖 四 十 二 〉: Cno3-2 的序列比對結果

〈 圖 四 十 三 〉: 與Cno3-2 親源關係最近的真菌序列比較 4. Sno5-12

〈圖四十四〉:Sno5-12 的序列比對結果

〈 圖 四 十 五 〉: 與Sno5-12 親源關係最近的真菌序列比較

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(三) 總結:

1. 由〈 圖 三 十 八 〉〈 圖 三 十 九 〉中可得知 Bno7-3 屬於絲核菌類中的 Tulasnella,且與 Bno7-3 親源關係最近的真菌與 Bno7-3 序列相似度達到 93%。

2. 由〈 圖 四 十 〉〈 圖 四 十 一 〉中可得知Cno10-3 屬於絲核菌類的Ceratobasidium,且與Cno10- 親源關係最近的真菌與Cno10-3 序列相似度達 93%。

3

3. 由〈 圖 四 十 二 〉〈 圖 四 十 三 〉可得知Cno3-2 屬於絲核菌類的Ceratobasidium且與Cno3-2 親源關係最近的真菌與Cno3-2 序列相似度達 94%。

4. 由〈 圖 四 十 四 〉〈 圖 四 十 五 〉 可得知Sno5-12 屬於絲核菌類的Ceratobasidium

,且與 Sno5-12 親源關係最近的真菌與 Cno3-2 序列相似度達 65%。

四. 實驗四:生理生化測試一 pH 值測試

(一 ) 結果一:Cno10-3 在 25℃ , 50mlV8 培 養 液 中 pH值 的 變 化

1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8

0 2 4 6 8

天數

pH 值

pH7 pH6 pH5 pH4 pH3 pH2

〈 圖 四 十 六 〉: Cno10-3pH 值改變折線圖

編號 Cno10-3 的菌株在 25℃,50mlV8 培養液中,每兩天測量一次,依照實驗結果顯示 pH 值 4

-6 的酸鹼度變化趨向中性,pH 值 2-3 則無明顯變化,由此可見,真菌具有改變環境的能力。

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(二 ) 結果二: Cno3-2 在 25℃ , 50mlV8 培 養 液 中 pH 值 的 變 化

1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8

0 2 4 6 8

天數

pH值

pH7 pH6 pH5 pH4 pH3 pH2

〈 圖 四 十 七 〉: Cno3-2pH 值改變折線圖

編號 Cno3-2 菌 株 在 25℃ , 50mlV8 培 養 液 中 , 每 兩 天 測 量 一 次 , 依 照 實 驗 結 果 顯 示 pH 值 4- 6 的 酸 鹼 度 變 化 趨 向 中 性 , pH 值 2- 3 則 無 明 顯 變 化 , 由 此 可 見 , 真 菌 具 有 改 變 環 境 的 能 力 。

(三 ) 結果三:Sno5-12 在 25℃ , 50mlV8 培 養 液 中 pH值 的 變 化

生理生化測試-pH值

1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5

0 2 4 6 8

天數

pH值

pH7 pH6 pH5 pH4 pH3 pH2

〈 圖 四 十 八 〉: Sno5-12pH值改變折線圖

編號 Sno5-12 菌 株 在 25℃,50mlV8 培 養 液 中,每 兩 天 測 量 一 次,依 照 實 驗 結 果 顯 示 pH 值 4- 7 的 變 化 趨 向 弱 酸 , pH 值 2- 3 則 無 明 顯 變 化 , 由 此 可 見 , 真 菌 具 有 改 變 環 境 的 能 力

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(四) 結果四:藉由菌絲乾重的比較,可得知最適合真菌生長的 pH 範圍為 5~6

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16

2 3 4 5 6 7 C

Cno10-3 Cno3-2 Sno5-12

〈 圖 四 十 九 〉: 為Cno10-3、Cno3-2 八天後菌絲乾重長條圖 (五) 總結:

根據編號Cno3-2、Cno10-3 在 25℃,50mlV8 培 養 液 中 經 過 八 天 的 生 長,從 實 驗 結 果 圖 表 中 我 們 很 清 楚 的 發 現 pH值 4- 6 的 菌 絲 比 pH值 2- 3 的 更 重,由 此 我 們 驗 證 了,真 菌 喜 好弱酸的環境。藉此我們便可以利用這個結果為真菌營造更適合其生長的環境,並後續應用到蘭 科植物上。

五. 實驗五:生理生化測試一溫度值測試

(一) 結果一:Cno10-3、Cno3-2、Sno5-12、Bno7-3 在 7 個溫度下、PDA培養基的生長速率

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0 5 10 15 20 25 30 35 40

溫度(℃)

平 均 速 率 (mm/8hr)

Cno3-2 Cno10-3 Sno5-12 Bno7-3

〈 圖 五 十 〉: 為 Cno10-3、Cno3-2、Sno5-12、Bno7-3 在 7 個溫度下、

PDA 培養基的生長速率比較折線圖

在 PDA 培養基上,經由實驗數據得知這四種真菌在 25℃~30℃時生長速率最快。而在 5℃及 35℃時則最慢。

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(二) 結果二:Cno10-3、Cno3-2、Sno5-12、Bno7-3 在 7 個溫度下、V8 培養基的生長速率

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

0 5 10 15 20 25 30 35 40

溫度(℃)

生長速率(mm/8hr)

Cno10-3 Cno3-2 Sno5-12 Bno7-3

〈 圖 五 十 一 〉: 為 Cno10-3、Cno3-2、Sno5-12、Bno7-3 在 7 個溫度下、

10%V8 培養基的生長速率比較折線圖

在 10%V8 培養基上,經由實驗數據得知這四種真菌在 25℃~30℃時生長速率最快。而在 5℃及 35

℃時則最慢。

(三) 總結:

比對 PDA 實驗組的實驗數據後,發現最佳的生長溫度也是 25℃~30℃。而 V8 培養基上的生 長速率略快於 PDA 培養基,藉此可推測 V8 培養基比 PDA 培養基含有更豐富的養分。

六. 實驗六:生理生化測試一基質測試 (一) 結果一:

Cno3-2 Cno3-2 Cno3-2

白 蘿 蔔 芋 頭 青 剛 櫟 葉

〈圖五十二〉:為Cno3-2基質試驗之培養皿照。左到右依序為白 蘿 蔔、芋 頭、青 剛 櫟 葉 。基質測定發現,在放有芋頭的培養基上,菌絲長的最好,因此推測芋頭的養分對 真菌較有幫助

(22)

(二) 結果二:

七. 實驗七:共生培養

(一) 結果一:植株五個月後的重量 〈 表 一 〉: 五個月後秤重結果

Sno5-12 Bno7-3 Cno10-3 Cno3-2 0.4334g 0.1248 g 0.4512g 0.6475g

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

四個月後重量

克重

Cno10-3 Cno3-2 Sno5-12 Bno7-3

五個月重量 0

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

四個月後重量

克重

Cno10-3 Cno3-2 Sno5-12 Bno7-3

五個月重量

〈 圖 五 十 四 〉: 植株五個月後的重量

〈圖五十五〉 〈圖五十六〉 〈圖五十七〉 〈圖五十八〉

Cno10-3 Cno10-3 Cno10-3

白 蘿 蔔 芋 頭 青 剛 櫟 葉

〈 圖 五 十 三 〉: 為 Cno3-2 基質試驗之培養皿照。左到右依序為白 蘿 蔔 、 芋 頭 、 青 剛 櫟 葉。基質測定發現,在放有芋頭的培養基上,菌絲長的最好,因此推測芋頭的養 分對真菌較有幫助

Sno5-12 Bno7-3 Cno10-3 Cno3-2

(23)

(二 )結 果 二

Cno10-3 Cno3-2 Sno5-12 Bno7-3

〈 圖 五 十 九 〉: 為根 莖部切片照。

〈圖六十〉:為根莖部 切片照。

〈圖六十一〉:為根莖 部切片照。

〈圖六十二〉:為根毛 照。

〈圖六十三〉:為根莖 部切片照。

〈圖六十四〉:為根莖 部切片照。

〈圖六十五〉:為根莖 部切片照。

〈圖六十六〉:為菌絲 纏繞照。

〈圖六十七〉:為根莖 部切片照。

〈 圖 六 十 八 〉: 為菌 絲穿過細胞壁照。

根 部 有 菌 絲 團 , 莖 部 沒 有 , 根 尖 無 褐 化 。

菌 絲 有 進 入 根 毛 內 , 莖 部 沒 有 , 根 尖 無 褐 化 。

根 部 有 菌 絲 團 , 莖 部 沒 有 , 根 尖 有 褐 化 。

根 部 沒 有 菌 絲 團 , 莖 部 亦 沒 有 , 但 有 侵 入 根 毛 , 根 尖 無 褐 化 。

(三 )總 結 :

由 圖 六 十 五 可 知 , Sno5-12 可 幫 助 植 株 生 長 , 卻 也 同 時 使 根 尖 有 核 化 的 現 象 。 真 菌 到 底 對 植 株 有 益 還 是 有 害,還 需 後 續 研 究 探 討。Bno7-3 的 植 株 生 長 較 慢,推 測 是 因 為 菌 絲 團 尚 未 形 成 , 或 不 會 形 成 。

(24)

陸、 討論

一 . 野 生 蘭 花 不 易 辨 識 , 尤 其 在 未 開 花 時 期 , 加 上 因 環 境 不 同 而 造 成 構 造 上 些 許 不 同 , 對 照 圖 鑑 也 不 能 比 照 現 實 , 造 成 辨 識 上 更 加 的 不 易 , 因 此 我 們 認 為 有 專 人 帶 領 採 集 樣 品 是 必 須 的 。 實 驗 過 程 中 石 蠟 切 片 標 本 容 易 破 裂 , 推 測 原 因 有 二 , 其 一 為 放 入 植 物 組 織 時,液 態 蠟 溫 度 過 高,造 成 組 織 的 破 壞;其 二 為 冷 卻 時 溫 差 太 大 , 造 成 劇 烈 的 熱 脹 冷 縮 , 使 組 織 破 裂 , 若 能 克 服 這 些 原 因 , 便 可 得 到 完 整 的 切 片 標 本 。

二 . 經 過 生 理 生 化 測 試 後 , 我 們 觀 察 到 烏 來 採 集 的 蘭 科 真 菌 在 25 ℃ -30 ℃ , 及 弱 酸 (pH5.5~6.5)環 境 下 生 長 的 最 好 , 推 測 與 台 北 烏 來 的 環 境 有 相 關 聯 , 在 中 央 氣 象 局 的 統 計 資 料 中 , 得 知 烏 來 平 均 降 雨 的 酸 鹼 值 為 pH5.5, 而 平 均 氣 溫 是 23℃ , 和 我 們 的 實 驗 結 果 十 分 相 近 , 因 此 認 為 我 們 可 以 複 製 真 菌 生 長 環 境 , 或 更 進 一 步 和 蘭 科 植 物 共 生 , 對 未 來 提 高 蘭 科 植 物 的 附 加 價 值 或 野 生 蘭 類 的 復 育 有 很 大 的 幫 助 。 三 . 經 過 共 生 培 養 及 切 片 觀 察 後 , 發 現 生 長 最 好 的 兩 株 (Cno10-3、 Cno3-2 在 其 根 莖 部

都 有 發 現 真 菌 的 存 在 。 Sno5-12 表 面 看 似 也 幫 助 了 植 株 生 長 , 但 我 們 卻 在 根 部 末 端 發 現 有 褐 化 之 病 徵 , 切 片 結 果 發 現 真 菌 已 侵 入 維 管 束 , 影 響 植 物 的 運 輸 ; 這 讓 我 們 感 到 訝 異 , 原 來 菌 根 真 菌 不 全 然 對 蘭 科 植 物 有 益 , 而 這 類 真 菌 後 續 會 對 植 株 造 成 什 麼 影 響 還 是 未 知 數 , 也 值 得 我 們 更 多 的 探 討 。

柒、 結論

一 . 經切片證實野生蘭科植物根內,確實有真菌的存在,並發現菌絲從根毛和根莖處的吸收毛侵 入植物體內,進一步發現編號Cno10-3、Cno3-2 真菌和植物存在著某種平衡,且不會傷害植 物體。

二. 經過一連串的觀察鑑定,看到了縊縮處附近有隔膜,菌絲分支成特定角度,可能形成菌絲圈 和念珠狀細胞,這些都是符合絲核菌的特徵;再更進一步已穿透式電子顯微鏡觀察,發現編 Sno5-12、Cno10-3 的隔膜孔構造之 parenthesome 為有孔洞型,有性世代屬名應為

Ceratobasidium。

三 . 在 生 理 生 化 測 試 方 面 由 酸 鹼 值 前 後 的 差 異 , 發 現 真 菌 會 調 整 身 處 的 不 適 環 境 ,使 其 更 適 合 生 長,而 我 們 所 挑 選 的 菌 株 喜 好 弱 酸 環 境,會 將 pH4-6 提 高,pH2-3 則 無 明 顯 改 變。所 挑 選 的 四 株 真 菌 (編 號 Cno10-3、Cno3-2、Bno7-3、Sno5-12)在 25℃ -30℃

的 環 境 下 生 長 情 形 最 好 。 基 質 測 定 發 現 , 有 鋪芋頭的真菌生長狀況較好,推測芋頭的 養分較利於真菌生長,青 剛 櫟 葉 則對生長無明顯影響。

四. 台灣金線連在適當環境條件下依然可以發芽生長,但經共生培養試驗證實接種不同真菌(編 號 Cno10-3、Cno3-2、Bno7-3、Sno5-12)後有不同的生長狀況。Cno10-3、Cno3-2 根莖部有菌絲 團, 莖部沒有, 根尖無褐化;Sno5-12 根莖部有菌絲團, 莖部沒有, 根尖褐化。Bno7-3 菌絲有 進入根毛內, 但根莖部沒有菌絲團形成,因此金線連和 Cno10-3、Cno3-2 共生最好。

(25)

捌、 參考資料及未來展望

一. 未來展望

(一) 許多真菌都有與植物共生的現象,而我們發現了蘭花與真菌的關係是密不可分的。號稱 蘭花王國的臺灣擁有生物多樣性豐富、數以百計種的蘭科植物;經過某些自然因素或人 為因素,造成棲地破壞,許多蘭科植物瀕臨滅絕,已知蘭科植物生長方面真菌便扮演了 極奇重要的角色,未來可朝此方面發展,在溫室內復育蘭科植物。

(二) 台灣金線連栽種不易,因此我們若能藉由真菌與其共生,提高存活率,並且縮短生長週 期,以降低農夫在栽培中的成本,提高其獲利。

(三) 目前化學的肥料和農藥所造成的環境負擔是許多農民頭痛的問題,因為真菌為大自然的 一部分,若能以此取代化學肥料、農藥,便能達到不破壞自然環境,達到永續農業的願 景。

二. 參考資料

(一) 林文川﹙2004﹚。國際藥用植物產業發展研討會專刊。

(二) 林維明﹙2006﹚。台灣野生蘭賞蘭大圖鑑。天下遠見出版股份有限公司。P.64~65、P.110、

P.184

(三) 林讚標﹙1976﹚。臺灣蘭科植物。發行人王積祺。P.82~83、236~237、248~249。

(四) 陳家全、李家為、楊瑞森﹙1991﹚。生物電子顯鏡學。中央圖書館。P.23~37。

(五) 蔡淑華(1975)。植物切片組織綱要。茂昌圖書股份有限公司。P.1~33。

(六) 劉新裕、林俊義、張成國﹙2002﹚。藥用植物專輯。行政院農業委員會農業試驗所。

P.124~128。

(七) 劉潤進、陳應龍﹙2006﹚。菌根學。科學出版社。 P.1~6 、P.14~15 、P.35~36。

(八) Jane B. Reece。 編譯:鍾楊聰、張立雪、徐歷鵬、黃璧祈﹙2005﹚。Neil A. Campbell 偉 明圖書有限公司。P.763~761

(九) Smith, S.E., Read, D.J.﹙2008﹚. Mycorrhizal symbiosis. 3nd ed., Academic Press, San Diego, California, USA.

(十) Sneh, B., Burbee, L., and Ogoshi, A.﹙1991﹚. Identification of Rhizoctonia species.The American Phytopathological Society,St Paul,Minnesota,USA

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