行政院國家科學委員會專題計畫研究成果報告
愛滋病疾病發展相關因子之研究
Study of the factors associated with AIDS disease progression
計畫編號︰NSC – 89 – 2320 – B002 – 094
執行期限︰ 88 年 8 月 1 日 至 89 年 7 月 31 日
主持人︰李君男 執行機構及單位︰國立台灣大學醫學院醫事技術學
系
計畫參與人員︰羅令佩、游大慶 執行機構及單位︰國立台灣大學醫學
院醫事技術學系
一、中文摘要 愛滋病是由人類免疫缺乏病毒(HIV) 引起的，HIV 感染人類的 CD4 細胞，造 成免疫機能之下降，而導致愛滋病症狀的 產生。與 HIV 疾病發展相關之因子，病 毒與宿主同樣重要。HIV-1 感染者由開始 感染發展至愛滋病的時間因人而異，由數 月至超過十年不等，此與感染者本身之免 疫力有密切之關連，其中又以細胞免疫力 具關鍵性之作用。 本計畫為瞭解本地 HIV-1 感染者疾 病病程之變化，研究疾病發展與細胞免疫 力之間的關係，建立偵測 HIV-1 特異之細 胞毒殺反應（CTL）。首先建立病人之 B 細胞株，以 synthetic peptide 處理，以之 做為目標細胞，進行 CTL 反應。目前 CTL 反應大都是利用放射線來進行偵測，本計 畫嘗試利用非放射線之方法，7-AAD 染 色法來偵測 CTL 反應中的凋亡細胞，研 究其取代傳統放射線方法之可能性。結果 顯示 7-AAD 染色法與傳統之51 Cr 釋放試 驗之結果相符，惟敏感度較低，仍有待後 續之改進。另亦建立台大醫院愛滋病人之 HLA class I 組織型資料，以 PCR 的方法 首先篩選出 A2 之病人，在 106 個病人中 A2 約佔了 45%，再由核酸序列分析進一 步鑑定 A2 亞型，以配合未來進行 與 CTL 相關之 Tetramer 結合試驗之用。 關鍵詞：人類免疫缺乏病毒、愛滋病、細 胞毒殺反應、HLA 組織型 AbstractThe causative agent of acquired immunodeficiency syndrome is human immunodeficiency virus (HIV). HIV mainly infects human CD4+ cells, that eventually induces the deficiency of immune system. Both viral and host factors are important for the disease progression. The time for
development to AIDS varied from several months to over ten years in different individuals, that is related to the immunity, especially cellular immunity, of the infected individual.
In order to understand the relationship between cellular immunity and disease progression. The cytotoxic T lymphocyte activity (CTL) was detected by 51Cr release assay. The B cell lines derived from the subjects were prepared and treated with synthetic peptides. Non-radioactive method, 7-AAD staining method, was applied to evaluate the possibility to replace the isotopes in CTL assay. The results shown by 7-AAD method were comparable to those obtained by CTL assay. Though the sensitivity was lower and needs to be improved in the future. We also examined the HLA class I types of 106 HIV-infected patients in NTUH by PCR. About 45% of them belonged to A2 type. The A2 subtype of these patients were further identified by nucleotide sequence analysis. These data will be useful for future application to tetramer binding assay, a CTL related assay.
Keywords: HIV-1, AIDS, CTL, HLA type
二、緣由與目的
愛滋病(AIDS)是由人類免疫缺乏病毒 (Human immunodeficiency virus， HIV) 引起的。HIV 是一種反錄病毒(Retrovirus) ，其外形呈球狀，直徑約在 80-100nm 之 間(1)。它的外套膜上有兩個醣蛋白質 的結合，進而病毒和細胞膜融合在一起而 進到細胞內。除了 CD4 受體外，近來亦 發 現 CXCR4 、 CCR5 等β-chemokine receptors 是 HIV-1 進入細胞主要的輔助受 體。緊貼著外套膜之內，有一層 p17 蛋白 質， 再 內 層 是 一 個 正 十 二 面 體 之 核 殼 (Nucleocapsid)，主要是由 p24 蛋白質所組 成。病毒的核心部份含有兩條單股正向的 RNA(各約 9.2 kb)，與 p9 及 p7 蛋白質緊 密的結合在一起。與基因結合在一起的還 有三種酵素，分別為反轉錄脢(Reverse transcriptase)、嵌入脢(Integrase)及蛋白脢 (Protease)（1）。HIV 之基因體結構與同屬 南提病毒屬(Lentivirus)之病毒相似，除了 與一般反錄病毒一樣，均含有 gag、pol 、env 基因，兩端各有長重覆序列(LTR) 之外，尚有一些輔助性之基因，它們具有 調控之功能，如 tat、rev、nef、vif、vpu 等六個基因。 HIV-1 感染人體的 CD4 細胞，造成 免疫機能之下降，而導致愛滋病症狀的產 生。HIV-1 感染者由開始感染發展至愛滋 病的時間因人而異，由數月至超過十年不 定。此與感染者本身之免疫力有密切之關 連，其中又以細胞免疫力具關鍵性之作用 。 病 程 發 展 快 者 稱 為 快 速 進 行 者 (Fast progressor)，有少數人(約 5%)超過十年仍 維持穩定之狀況，此種人稱為長期非進行 性 者 (Long-term nonprogressor ， LTNP) (2-4)。 研究 HIV-1 感染者在疾病發展過程 中，體內各種生物標記(Biological marker) 之變化，發現有些標記之變化與疾病之進 行 或 惡 化 有 關， 如 血 漿 中病 毒 負 荷 量 (viral load)的增加、CD4 細胞數目的降低 、CD8 細胞反應活性的降低、p24 抗原之
microglobulin、neopterin、IgG、IgA 量之 上升等(5-14)。HIV-1 感染者在抗體陽轉 後,體內病毒負荷量之高低與疾病之預後 有關，隨著病毒負荷量之增加，五年後發 展成 AIDS 之機率亦隨之而上升(15)。 在追蹤 LTNP 之免疫機能時，發現其 中有一些人測不到中和抗體，但有很強的 HIV-1 特異性的細胞毒殺反應(CTL)，故 推論 CTL 與保持穩定且非進行性之感染 有關，而中和抗體則非絕對必需的(16)。 CTL 主要是由 CD8 細胞執行，它們能認 識病毒之抗原是受到 HLA-class I 之限制 ，故當感染了病毒之細胞，具有 CTL 抗 原決定位(epitope)之蛋白質片段與 HLA-class I 之分子結合而表現於其表面，則會 受到毒殺細胞之攻擊而被破壞。CTL 在控 制病毒感染上極為重要。 目前國內尚無實驗室進行 HIV-1 之 細胞免疫力之研究，本計畫為瞭解本地 HIV-1 感染者疾病病程之變化，研究疾病 發展與細胞免疫力之間的關係。本實驗室 擬建立偵測 HIV-1 特異之 CTL 試驗。目 前 CTL 反應大都是利用放射線（51 Cr 釋 放試驗）來做偵測，不久前有研究報告指 出 Tetramer 結合試驗與 CTL 試驗之結果 有 甚 佳 之 相 關 性 。 但 在 目 前 受 限 於 Tetramer 取得不易，尚無法進行 Tetramer 結合試驗。本計畫嘗試利用非放射線之方 法，7-AAD 染色法(17, 18)，以之偵測 CTL 反應中之凋亡細胞，研究其可行性及取代 傳統放射線方法之可能性。期以細胞免疫 力之測定應用於推測感染者疾病預後之 狀況，及評估藥物治療之效果，所得結果 將與血漿中病毒負荷量、CD4 細胞數目 做一相關性比較。本計畫亦將針對國人之 組織型研究，以配合未來進行 Tetramer 結合試驗之用。 三、結果與討論 本計畫為瞭解本地 HIV-1 感染者疾病 病程之變化，研究疾病發展與細胞免疫力 之間的關係，建立偵測 HIV-1 特異之細胞 毒殺反應（CTL）。因參考文獻中 HLA class I 組織型與 synthetic peptide 之搭配有限， A2 組織型是被研究得最多者，且國人中此 型亦佔了了相當的比例。故首先由台大醫 院病人中篩選出 A2 組織型之病人，接著 以 EB 病毒感染的方式建立病人之 B 細胞 株，成功的建立了三個病人之 B 細胞株。 接著以 p24 或 gp41 之 synthetic peptide 處 理，以之做為目標細胞，進行 CTL 反應。 CTL 反應除了利用傳統的放射線方法來進 行偵測外，亦利用非放射線之方法，即以 7-AAD 染色法來偵測 CTL 反應中的凋亡 細胞。結果顯示 7-AAD 染色法與傳統之 51 Cr 釋放試驗之結果相符，惟敏感度較低 ，欲取代傳統放射線方法仍有待後續之改 進。CTL 反應之結果與病毒負荷量之結果 呈負相關之關係。另亦建立台大醫院愛滋 病人之 HLA class I 組織型資料，以 PCR 的方法首先篩選出 A2 之病人，在 106 個 病人中 A2 約佔了 45%，此比例較一般國 人中 A2 所佔之比例 30%(19)明顯的高些 ，台大醫院的愛滋病人代表的多是已出現 過疾病症狀且曾經住院的病人，此是否與 A2 病人疾病之發展較快有關，將有待分析 比較更多的病人方可下結論。針對 A2 之 病人，利用核酸序列分析進一步鑑定 A2 亞型，發現 A2 亞型中，以 0201/09 與 0207/15N 者最多，分別佔了約三分之一， 0203 佔了近兩成，0217 則不到一成。此亞 型之結果未來可以配合進行 與 CTL 相關 之 Tetramer 結合試驗之用。 四、計畫成果自評；
本計畫奠立了研究細胞免疫力之基礎 ，細胞免疫力之研究必須長期進行，原來 本計畫預定執行三年，但不幸被刪減成一 年，此計畫無法繼續，殊為可惜。
五、參考文獻
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