行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
單分子螢光技術應用於奈米結構之型態與性質之研究(3/3)
研究成果報告(精簡版)
計 畫 類 別 ： 個別型 計 畫 編 號 ： NSC 94-2112-M-110-014- 執 行 期 間 ： 94 年 08 月 01 日至 95 年 10 月 31 日 執 行 單 位 ： 國立中山大學材料與光電工程學系 計 畫 主 持 人 ： 徐瑞鴻 計畫參與人員： 碩士班研究生-兼任助理：李長曄、陳志豪、魏一中、陳益 成、洪俊逸 報 告 附 件 ： 出席國際會議研究心得報告及發表論文 處 理 方 式 ： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 96 年 12 月 19 日
本計畫之主要成果是建立單分子螢光量測能力，特別是我們應用這系統進行單一 DiI 分子的光物理及光化學過程，包括光激發過程隨機產生的 Photo-isomerization 現象，光激 發過程中產生的 triplet state quenching 現象，及確認激發範圍內的有效分子數目等工作。
在過去(含目前執行)的兩年半計畫中，我們提出的研究計畫內容主要是建立具有單分 子螢光量測能力之實驗設備，以及利用這設備分別進行單一半導體量子點、螢光分子、以 及共軛高分子在溶液中的螢光性質量測。這些工作正在陸續進行中，目前已設立了具備測 量單分子螢光之設備，並完成一些成果，包括(1)觀察單一 DiI 分子在光激發過程中所產生 的 Photo-isomerization 現象。(2)配合穿透式電子顯微鏡(TEM)結果，確定現有量子點樣品 之形狀及大小分佈，並得到對應之光譜分佈及螢光生命期之分佈。(3)為了能進一步在高 NA 值之物鏡下能具備變溫功能，我們自行設計利用電致冷卻晶片完成一個可在高 NA 之 油鏡下工作之樣品平台，預期可工作之溫度範圍約在 15.C 至 50.C 間，(這條件是由顯微鏡 物鏡可工作之溫度範圍，以及低溫下周遭環境造成凝結水之限制而決定)且溫度穩定度可 以逼近 0.01.C，目前我們正使用這系統進行液晶環境之單分子觀測實驗。及(4)進行單一量 子點之螢光偏振(polarization)測量。以下僅就第一項結果描述之。 單一 DiI 分子量測的實驗裝置如下﹕我們將 DiI 分子稀釋至~10-10 M 濃度之甲苯溶液 中，內有 3% PMMA，再以旋轉塗佈方式將樣品散佈在乾淨的蓋玻片表面，所得到為 DiI 分子散佈之平均距離約 1~10 micron。如此我們可以將雷射光束擴散，激發數十 micron 範 圍，利用 CCD 收集螢光點的分佈及動態。或者將雷射光束聚焦在一個光點上，進行單分 子測量。所得到螢光，藉著一個 polarization beam-splitter 區分為兩正交偏振光方向，再個 別進入光偵測器中。
圖二(a)表示其中一個 DiI 分子的結果。這個分子約在雷射光開始照射 55 秒後就產生 photo- bleaching. ，在分子被 photo-bleached 之前，已被有效的光激發過程產生螢光約數百萬次。 Objective lens Sample stage Laser SHG Optics Imaging CCD Filters electronics P I S I APD APD
圖二
而(b)則表示當螢光經過 polarization beamsplitter 之後，兩個光偵測器所得到之強度之比
值。在這裡，Anisotropy 被定義為
(
I
P
I
S)
(
I
P
I
S)
，其中I
P與I
S為兩光偵測器所得 到之強度。若我們忽略去在 17.7sec 時因為突然強度變化所造成之假象，則其餘時間內這 Anisotropy 的值約在 0.62 至 0.7 間，可視為定值。單一分子的 Polarization Anisotropy 代表 著一個分子在接受光激發之後，產生螢光過程所對應的光耦極矩(transition dipole moment) 之方向。由於 DiI 分子被固定於蓋玻片基板上，因此我們會預期實驗所得到的 Anisotropy 會是個定值，分子不會隨意轉動。然而在我們的實驗中，曾經觀察到分子的 Polarization Anisotropy 的變化，圖三所顯示的是其中的一個例子。(a)這個所觀測的分子，經過約 30 秒的光激發後就被 photo bleached，但不同於前一個例子，這分子的螢光偏振並非固定在 特定方向。(a) (b) 圖三 而圖(b)顯示這分子在 15 至 21 秒階段時的 Anisotropy 行為，圖中可見其大約在兩個值之間 跳躍。更進一步的結果顯示在圖四，其中(a)之藍線與紅線分別表示兩個光偵測器所得到的 光強度， 圖四
而(b)表示其對應之 Anisotropy。圖(a)中可以清楚的看到分子的 on-off blinking 行為，而且兩 個光偵測器所得到的 on-off 強度變化均一致，這些行為表現說明這個光點的變化是來自於
單一分子，而非其他因素造成。特別的是這分子不但具備兩階段式的 Polarization 變化，而 且在接近 18.7sec 時的變化，所需時間遠較我們在這實驗中所有的時間解析度(1 millisecond) 為長。這些結果告訴我們﹕這分子具有 discrete level of polarization orientation. ，而且在某 些 change of polarization 過程中，所需要的時間可以高達數十 milliseconds. 。這些現象的合 理解釋是所觀察得到的是來自於這分子的 photo induced isomerization。這類具 cyanine 結構 的染料，一直被應用於 photography、光儲存媒介、以及雷射染料中，其溶液中之光穩定性， 特別是 photo-isomerization 一直是人們有興趣的題目。但由於 DiI 是室溫中單分子螢光實驗 的先鋒，其在高分子薄膜中的光穩定性非常良好，因此並未有人注意到其 photo-isomerization 之變化。最近有人在類似結構中(Cy5)，進行實驗及理論模擬(1)，他們的結果說明這類分子 可 以 具 有 一 些 穩 定 的 異 構 物 (isomers) ， 而 且 這 些 異 構 物 具 有 類 似 的 能 階 與 oscillator strength，換言之， 不 同 異 構 物 可 以 在 實 驗 中 被 有 效 的 光 激 發 而 產 生 螢光。在我們的觀 察中，分子改變了 光偏振方向時，其 對 應 之 螢 光 輻 射 衰 變 速 率 (decay rates) 也 隨 之 不 同。這些證據支持 這 觀 察 到 的 變 化 是 來 自 於 photo-isomerizatio n.。 此外，我們發展測 量 單 一 分 子 之 暫 態 螢 光 生 命 期 的 能力，右圖顯示另 一 個 分 子 的 結 果，包括螢光暫態 強度變化，螢光生 命期，螢光異向性 等資訊。若僅得到 其中某項資訊，則
我們恐怕很難可以從這得到具體結論，但由於這是單一分子所得到的同時性訊息，因此我 們可以斷言，在觀測期 間約第 31 秒期間，分子 僅 變 化 其 on-off blinking 行為，而保持著 相 同 的 lifetime 與 anisotropy，因此表示其 發 生 了 triplet state quenching 現象，僅改變 其發生在 off states 的機 會，其後分子在 72 秒後 又回復原先的表現，顯 現這是個可逆的 triplet state quenching 反應。 此外，如右圖顯示另一 分子的結果。在光激發 過程中，約略第 28 秒 時，同時改變光強度， 螢光生命期，與螢光異 向性等參數。這顯示分 子在這些過程中變化成 為另一種不同型態，因 此 即 有 可 能 是 進 行 photo-isomerizatio 的反 應。 此外，我們還結合了可同時進行 HBT 測量的分 析，左圖顯示一個光點的結果，其中的 HBT 結果 顯示 NC/NL值約為 0.5，這表示偵測的光點位置蒿 含兩個螢光分子。
結合上述例子，說明我們所發展的系統，結合螢光暫態強度，螢光生命期，螢光異向性， 及 HBT 結果等。這些結合，使得我們有能力追蹤上述這般稀少發生的光變化過程，以及分 析它們。
References:
1. Huang Z., Ji D., Xia A., Koberling F., Patting M., Erdmann R., J. Am. Chem. Soc. 127, 8064 (2005)
出席國際學術會議心得報告
計畫編號 NSC 94-2112-M-110 -014 - 計畫名稱 單分子螢光技術應用於奈米結構之型態與性質之研究(3/3) 出國人員姓名 服務機關及職稱 中山大學 材料光電工程學系 助理教授 徐瑞鴻 會議時間地點 2006.03.13 ~ 03.17, Baltimore, U.S.A.會議名稱 APS March Meeting
發表論文題目 Probe single cyanine dye molecules' photo isomerization
一、參加會議經過
這次 APS March meeting 在美東 Baltimore 舉行, 報告安排在 3/13, 第一天下午, 進行 口頭報告, 被安排在 Sunny Xie 學生之邀請演講之後. 由於今年的 March Meeting, 許多關 於 Single Molecule Studies 的報告, 本 section 即列入 focus section 中, 有許多聽眾, 我也從 其他演講者學習到許多新知及技術, 並與一些與會人士進行交流.
除了本 section 外, 許多關於 single molecules 的 sections, 也安排一些這領域重要人士進行 邀請演講. 也因此格外覺得不枉此行.
此外, 利用到美東難得行程, 到 Atlanta 拜訪 Prof. Robert Dickson,及參觀他實驗室.
二、與會心得
難得赴美參加會議, 但因安排於第一天議程中報告, 加上學期中忙碌, 未能將結果 充分向與會人士溝通, 是較可惜的事. 但因 single molecules 是本次會議中重點, 有許多 相關報告, 也使得我有機會向一些與會人士請益. 例如學習到從單分子螢光光子的訊號 中, 取出它的隨時間變化的螢光生命期等重要資訊, 便是從與會人士請益中啟發得來的.
此外, 參訪 Prof. Dickson 實驗室, 及與他 group 人員會談也是這次的重要收穫之一. 我也在他 group 中, 分享一些我們新近的成果.
