行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告
氧化性低密度脂蛋白之結構及其臨床應用研究(1/3)
計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC92-2314-B-002-088- 執行期間： 92 年 02 月 01 日至 93 年 01 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學醫學院內科 計畫主持人： 李源德 共同主持人： 張博淵，周綠蘋，李啟明，王水深，許秀卿 計畫參與人員： 陳靜宜, 葉修足 報告類型： 精簡報告 報告附件： 國際合作計畫研究心得報告 處理方式： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 92 年 11 月 28 日
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行政院國家科學委員會專題研究計畫執行報告
氧化性低密度脂蛋白之結構及其臨床應用研究 (1/3)
Study on the Structure of Ox-LDL and Its Clinical Application (1/3)
計畫編號：NSC 92-2314-B002-088 執行期限：92 年 2 月 1 日至 93 年 1 月 31 日 主 持 人：李源德 教授 執行機構及單位名稱：國立台灣大學醫學院內科 電子信箱：ytlee@ha.mc.ntu.edu.tw.一、緣由與目的
許多研究結果證實，低密度脂蛋白的氧化和粥狀硬化的形成以及
惡化程度密切相關，如何從氧化性低密度脂蛋白的氧化性修飾結構
中，去尋找出具有專屬特性之生物標誌，是揭開粥狀硬化啟始機制及
對應方針的不二法門。關於低密度脂蛋白上的脂質氧化，已有許多研
究報告，然而對於低密度脂蛋白結構上的蛋白成分變化所知不多，脂
質氧化的形成與堆積可藉由不飽和脂質之過氧化粒子產生來分析，相
對地，低密度脂蛋白結構上的原脂蛋白，則具有化學性狀多樣性，再
經過氧化性修飾之後，將提供更多的專屬生物標誌，是研究生物體內
氧化性低密度脂蛋白性狀的重要課題。本計劃即是針對此種氧化性修
飾結構做進一步探討，以期對粥狀硬化的初始步驟和進程做深入了
解，並為治療預防工作提供指標。
二、初步結果
目前我們已採集從外科開刀手術取下之血管粥狀硬塊，且已從硬
塊中萃取出低密度脂蛋白，經分析其成份組成為蛋白質佔 19.8±
1.6%、三酸甘油酯 3.8±1.2%、膽固醇為 12.1±3.2%、酯化膽固醇為 13.6
±2.4%、磷脂質為 51.5±3.2%。進一步分析其蛋白質成分中已受氧化
的部位，我們利用 2.4-dinitrophenylhydrazine (DNPH)化合物與蛋白質
作用與否來探尋受氧化的部分。如圖一所示，可以找到可能受氧化的
部分在於區分 5、6、7，將此區分再經由 matrix-assisted laser-desorption
ionization time-of-flight (MALDI-TOF)質譜分析(圖二)，可得可能受氧
化的胜太質量，如表一所示。當將低密度脂蛋白中的原脂蛋白 B
100以梯度電泳分離出(圖三)，進行 in-gel digest，再行質譜分析如圖四所
示可得可能的氧化部分如表二所示。這些氧化部分的發現將有助下一
階段的探索分析。
三、承續之研究工作
本研究將持續探討受修飾的胺基酸種類與其鍵接結構，特別是目
前進度已發現的可能胜太部位，將就這些胜太區類以 Q-TOF 質譜儀
來輔助到定胜太序列、質量。由於分析物的含量為 nanogram 範籌，
將尋求層析串聯質譜儀的分析方式來解決，順利完成即定目標，指日
可待。
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Table 1. The possible peptide site of oxidative modification for DNPH-treated LDL Mass (m/z) Fraction 5 512.9153; 537.0244; 551.9941; 552.9992; 568.9724;572.9630; 573.9607; 574.9831; 698.0545; 699.0513; 700.0531;709.0213; 714.9749; 728.9782; 731.0018; 746.9750; 867.0237; 887.0146; 1043.0096; 1053.1359; 1069.0407 and 1085.0219 Fraction 6 1374.9931 Fraction 7 529.0261; 551.0115; 572.9975 and 573.9963
Table 2. The possible peptide site for oxidative modification of apo B100.
Mass (m/z) Position 726.3893 1636-1642 1045.6040 2626-2634 1139.5367 101-110 1632.8380 718-732 1833.9745 3508-3524
1a
1b
Figure 1a and 1b. HPLC of DNPH-treated LDL tryptic peptides separated by reverse
phase chromatography. 3a: LDL extracted from atheroma without DNPH. 3b: LDL
extracted from atheroma with DNPH. -4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0.0 1.0 2.0 3.0 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 min 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 -4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0.0 1.0 2.0 3.0 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30. 0 ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
5 A B C D 499.0 699.4 899.8 1100.2 1300.6 1501.0 Mass (m/z) 0 2.8E+4 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % Int e ns it y Voyager Spec #1[BP = 529.0, 28043] 529.0239 551.0111 530.0249 699.0838 537.0587 528.0218 527.0264 572.9885 643.0769 713.0409 536.0522 665.0481 509.0381 575.0098 663.0643 731.0180 798.0516 903.0300 1037.1216 1117.0915 1230.4358 1375.1152 499.0 699.4 899.8 1100.2 1300.6 1501.0 Mass (m/z) 0 2.8E+4 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % In te n s it y Voyager Spec #1[BP = 715.0, 27961] 715.0185 699.0478 730.9883 537.0254 574.9779 698.0525 714.0183 700.0568 536.0300 709.0045 568.9692 746.9620 538.0277 886.9938 1053.0864 573.9614 728.9556 906.9955 1052.0781 566.9856 669.0047 760.9423 846.0432 929.9913 1102.0269 1266.0371 1390.1469 543.0489 616.2835 768.3066 997.3027 1179.0223 499.0 699.4 899.8 1100.2 1300.6 1501.0 Mass (m/z) 0 2.0E+4 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % In te n s it y Voyager Spec #1[BP = 699.1, 19661] 699.0512 715.0279 552.9992 731.0018 537.0245 698.0544 550.9767 687.0428 716.0314 572.9629 887.0145 728.9782 568.9726 710.0220 536.0264 888.0291 706.9949 531.0116570.9718 694.0531 907.0060 1069.0394 902.9826 1084.0178 666.0481 743.9723 1241.0310 569.9815 639.4281 726.4324 824.3033 905.9939 980.0326 1065.0138 1161.5291 1246.0348 1342.9387 1421.0138 540.1567 499.0 699.4 899.8 1100.2 1300.6 1501.0 Mass (m/z) 0 1.9E+4 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % In te n s it y Voyager Spec #1[BP = 664.9, 18939] 664.9497 702.8962 524.9307 665.9497 678.9356 716.8771 544.9252 647.9468 528.9198 706.8974 842.9076 523.9310 1056.8547 737.8602 648.9406 843.9263 916.8348 507.9497 576.8819 1068.2304 727.8380 983.7430 1167.7377 1251.7821 1384.2579 654.4703 810.3484
E
F
Figure 2. a: mass spectra of LDL without DNPH treatment from fraction 5. b: mass spectra of LDL with DNPH treatment from fraction 5. c: mass spectra of LDL without DNPH treatment from fraction 6. d: mass spectra of LDL with DNPH treatment from fraction 6. e: mass spectra of LDL without DNPH treatment from fraction 7. f: mass spectra of LDL with DNPH treatment from fraction 7.
499.0 699.4 899.8 1100.2 1300.6 1501.0 Mass (m/z) 0 3.7E+4 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % In te n s it y Voyager Spec #1[BP = 551.0, 37314] 551.0115 529.0261 575.0155 537.0611 573.9963 699.0983 715.0694 530.0305 698.0950 588.9677 549.0128 700.0879 570.9990 577.0136 716.0750 507.0474 643.0793 730.0370 543.0109556.0865 634.0737644.9696 743.9988 815.5900 887.0199 961.3420 1076.0842 1202.9345 1281.0017 1362.5296 499.0 699.4 899.8 1100.2 1300.6 1501.0 Mass (m/z) 0 2.4E+4 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % In te n s it y Voyager Spec #1[BP = 731.0, 23686] 730.9740 574.9638 552.9829 714.9979 708.9947 699.0264 537.0107 886.9767 714.0009 715.9987 590.9325 887.9808 724.9705 551.9754 744.9525 864.9914 558.9884 669.0028 737.9680 867.0091 938.8997 1084.9848 1242.0237 528.9692 595.3677 1062.9931 1426.1193 1146.4676 1317.4010 963.1395 665.0146 770.9498 1233.1068
7
Figure 3. Apo B-100 in 4-20% gradient gel. Lane 1: marker, lane2: plasma LDL for positive control, lane 3: LDL from atheroma with DNPH treatment, lane 4 and 5: LDL
extracted from atheroma without treatment. Each lane was loaded 10µg protein.
4a 900 1120 1340 1560 1780 2000 Mass (m/z) 0 6830.1 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % In te n s it y Voyager Spec #1=>BC=>NR(2.00)[BP = 568.1, 10002] 1427.5062 1435.4721 1459.4824 1106.4148 1267.4929 1791.6140 1649.5822 1437.4768 1198.5352 1586.5230 1461.4826 1130.3818 1833.5967 1922.6278 1209.4862 1588.5155 1269.5311 1384.5556 1475.4834 1761.6633 1095.4204 1924.6704 1560.5483 1651.5810 1108.3981 1200.4881 1793.6247 4b 900 1120 1340 1560 1780 2000 Mass (m/z) 0 3356.6 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % In te n s it y Voyager Spec #1=>BC=>NR(2.00)[BP = 656.0, 8707] 1198.5070 1791.5871 976.2917 1130.3531 1106.3684 1760.6372 1241.4396 1337.4533 1459.4428 1267.4801 1095.3903 1132.3465 923.4050 1427.4794 1209.4427 954.0300 939.0560 1243.4815 1339.4594 1588.5088 1171.3559 1274.5196 1449.6200 1793.5776 1065.9141 1134.3469 1461.4554 1586.4447 941.3136
Figure 4a and 4b. 2a: mass spectra of apo B-100 without DNPH treatment. 2b: mass spectra of apo B-100 with DNPH treatment.
1 2 3 4 5
Apo B-100 177.6
81.2
