I. 即時定量聚合酶連鎖反應（Real-time

(1)

分子生物學應用

1

劉佩芬老師高雄醫學大學

生物醫學暨環境生物學系

(2)

主題介紹

I. 即時定量聚合酶連鎖反應（Real-time

quantitative PCR, RT-PCR/Q-PCR/RT-QPCR) II. 報告基因分析 (Reporter gene assay)

III. 核糖核酸干擾 (RNA interference, RNAi)

2

(3)

I. 即時定量聚合酶連鎖反應 (Q-PCR)

3

(4)

上課內容

• 聚合酶連鎖反應(PCR)

• Q-PCR原理

• Q-PCR步驟

• Q-PCR反應混合物

• TaqMan Probe(探針)& SYBR Green(染料)

• 使用的儀器/系統

• 如何避免Q-PCR錯誤

• Q-PCR應用

4

(5)

聚合酶連鎖反應

(Polymerase Chain Reaction, PCR)

5

(6)

6

Kary B. Mullis: for his invention of the

polymerase chain reaction (PCR) method.

Michael Smith: for his fundamental

contributions to the establishment of

oligonucleotide-based, site-directed

mutagenesis and its

development for protein

studies.

(7)

• 這是一種基於聚合酶鏈反應(PCR) 的技術。

• 將反應放入機器中，該機器使用相機或檢測器實時監測觀察並螢光反應檢。

• 檢測分子產生的螢光，隨著反應的進行，該分子增加。

• 可以定量相對少量的PCR產物。

7

Q-PCR 原理

(8)

8

中心法則

https://zh.wikipedia.org

成熟RNA修飾

https://commons.wikimedia.org/

(9)

9

Mol Cell Proteomics. 2016 Aug;15(8):2525-36.

信使RNA (mRNA) 反轉錄成為互補 DNA (cDNA) 的流程

reverse transcriptase (反轉錄酵素)

(10)

10

Q-PCR步驟

mRNA

(11)

11

June 2020 Missouri Medicine 117(3)

https://www.youtube.com/watch?v=wBrNbbAIAFo

a. 變性-高溫用於將雙鏈DNA「熔化」

成單鏈，並鬆動單鏈DNA中的二級結構。通常使用DNA聚合酶可以承受的最高溫度（通常為95°C）。如果範本GC含量高，可以增加變性時間。

b.復性-在復性過程中，互補序列有 機會雜交，因此使用基於引物的計算熔融溫度（Tm）的適當溫度（低於引物Tm的5°C）。

c. 延伸-在70-72°C時，DNA聚合酶 的活性是最佳的，引物延伸以高達每秒100個鹼基的速率發生。當即時螢光定量PCR中的擴增子很小時，該步驟通常與使用60°C作為溫度的復性步驟相結合。

變性

復性

延伸

或 SYBR Green

(12)

12

https://www.youtube.com/watch?v=wUDysO8bFbA

SYBR Green

Q-PCR反應混合物

(13)

• 每個Q-PCR 都包含一個螢光報告分子（例如 TAQMAN® 探針或 SYBR® GREEN染料），用於監測 PCR 產物的積累。

• 隨著靶擴增子數量的增加，螢光團發出的螢光量也隨之增加。

• 為使用Q-PCR 進行基因表達研究而開發的兩種類型的化學物質是：

(1) SYBR Green 染料 (2) TaqMan Probe 探針

13

TaqMan Probe(探針)& SYBR Green(染料)

(14)

(1) SYBR GREEN 染料

• 這是一種染料，當它在 DNA的微小凹槽處非特異

性結合時，會發出突出的螢

光信號。

• 也可以使用其他螢光染料，如溴化乙錠(EtBr)或吖啶橙

(Acridine Orange)，但SYBR Green更適合用於其更高的信號強度。

• SYBR Green比TaqMan Probe更受歡迎，因為它可以提供有關每個擴增周期的資訊以及有關TaqMan Probe無法獲得的熔化溫度的資訊。

• 然而，與TaqMan Probe相比，其缺點是缺乏特異性。

14

(15)

15

(16)

(2) TaqMan Probe 探針

• 它是一種水解探針，帶有染料，通常在其5端有螢光素（FAM），並且在寡核苷酸的3端附著一個淬滅

劑四甲基羅丹明（TAMRA）。

• 在正常情況下，探針保持盤繞在自身上，使螢光染料靠近淬滅劑，從而抑制或淬滅染料的螢光信號。

• 當聚合酶在延伸階段開始合成新的 DNA鏈時，它通過5'末端核酸酶活性導致探針降解，螢光素與淬滅劑

分離，從而產生螢光信號。

• 隨著該過程的繼續，在每個迴圈中，

信號分子的數量增加，導致螢光的增加，這與靶標的擴增呈正相關。

16

(17)

https://www.youtube.com/watch?v=ob3teCrpgxY

17

(18)

18

(19)

19

Evidence-based Complementary and Alternative Medicine 2012(3):656025

mRNA

一管全部反應完

(20)

20 August 2018 Journal of Physics Conference Series 1073(3):032068

•Enzyme

•Buffer(s)

•Cofactor - Magnesium chloride (MgCl

₂

), is the most common.

Sometimes MgSO

₄

is used with particular enzymes.

•dNTP

•Primers

•Template DNA (if all samples will be uniform)

•Nuclease-free or PCR-grade water PCR MASTER MIX COMPONENTS

mRNA

分兩管反應完

1 ^st

2 ^nd

(21)

21

(22)

常用哪種儀器/系統

22

（1） ABI系統

https://www.thermofisher.com/tw/zt/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-instruments/quantstudio-systems/models/quantstudio-3-5.html https://www.thermofisher.com/tw/zt/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-instruments/quantstudio-systems/accessories.html

Quantstudio systems

1,3,5,6,7

(23)

分光螢光計

23

樣品

激發發射

(24)

24

https://youtu.be/K5flNp46wxo 實驗材料

https://www.youtube.com/watch?v=1uh2ZxZJtgs

(25)

程式設置

https://www.fishersci.se/shop/products/quantstudio-5-qpcr-system-1/15731248 ²⁵

(26)

26 26

26

Amplification plots are displayed with the ability to drill down to a subset of sample wells.

10-Log dynamic range sensitivity

數據分析

(27)

27

(28)

28

(29)

29

(30)

30

（2） Bio-Rad系統

(31)

https://www.youtube.com/watch?v=wUDysO8bFbA

31

程式設置

(32)

32

(1) 核糖核酸品質

• 是成功製備cDNA並執行高效且可重複的Q-PCR的最關鍵步驟。

• RNA對RNA酶的降解非常敏感，在核酸分離步驟中必須小心處理。降解或污染的RNA會對Q-PCR實驗的效率和產量產生負面影響。

• 您的實驗室工作台、移液器和吸頭必須不含 RNase，提取的 RNA 必須儲存在不含 RNase 的溶液中。

• 當您使用分光光度計評估RNA純度時，260和280nm

（A260/280）處的吸光度比應在1.8-2.0的範圍內。如果較低，則可能表明樣品被苯酚或蛋白質污染。

如何避免Q-PCR錯誤

(33)

(2) 預混液與表格使用

• 使用預混液可大幅減少實驗變異性，從而減少孔間和樣品間差異來提高再現性。

• 在執行Q-PCR實驗時最好事先製作一張準備要加入每項試劑的清單與樣品相對位置表格。

33

(34)

(3) 控制組

• Q-PCR測定時，適當的控制組是很重要的。

• 應該包括一個缺乏cDNA的陰性對照組，可以檢測表面或試劑的交叉污染。

• 也需要一組反轉錄的陰性對照組，其中沒有逆轉錄酶，如果觀察到產品，表明您的樣品受到DNA污染。

34

(35)

(4) 參考基因

• 內源性對照基因的擴增可以解釋起始cDNA的數量或質量的差異，以及RNA製備方法或cDNA合成的差異。

• 可靠的參考基因是指其表達量不受實驗變數的影響，並且在樣品條件的相關生理狀態之間沒有差異的基因。

35

(36)

36

Q-PCR 應用

(37)

37

World J Gastroenterol. Sep 21, 2019; 25(35): 5300-5309

（1）基因表達分析-例如病人正常細胞與癌細胞基因表現差異

(38)

38

Doctorsgate GmbH

（2）微生物檢測量

(39)

39

(40)

（3) 基因食品檢測

Abigayle French

40

(41)

41

(42)

42

(43)

II. 報告基因分析

(Reporter gene assay)

43

(44)

上課內容

• 基因表現調節

• 什麼是報告基因分析

• 常見的報告基因

• 報告基因分析的應用

44

(45)

45

中心法則

https://zh.wikipedia.org

DNA→ RNA

National Human Genome Research Institute

基因表現調節

(46)

46

DOI:10.13140/RG.2.2.10102.34889

啟動子 (Promoter)

(47)

47

(48)

什麼是報告基因分析

• 報告基因分析主要為報告基因的啟動子活性的測量。

• 報告基因是把啟動子DNA序列和報告基因DNA序列的融合。

• 報告基因可以為酵素或螢光物。

48

https://www.youtube.com/watch?v=PD_6JU3NayE

(49)

常見的報告基因

49

• β-葡萄糖醛酸酶（ β-glucuronidase , GUS）

• β-半乳糖苷酶（ β-galactosidase, LacZ）

• 鹼性磷酸酶 (ALP)

• 氯黴素乙醯轉移酶（CAT）

• 綠色螢光蛋白（GFP）

• 螢光素酶 (luciferase)

(50)

WHAT ARE THE 4 MAIN QUALITIES OF A GOOD REPORTER GENE?

1. EASILY OBSERVABLE

2. CAN TOLERATE ADDITIONS OF AMINO ACIDS TO THE N OR C TERMINUS WITHOUT LOSING FUNCTION

3. IT'S EASY TO ASSAY ITS FUNCTION

4. ONLY FUNCTIONAL IN A PARTICULAR REGION OF THE CELL.

50

(51)

51

（1）β-葡萄糖醛酸酶（GUS）

Frontiers in Plant Science 6(295) · May 2015

doi: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0159875.g004

Susan Jean Karcher

(52)

52

（2）β-半乳糖苷酶（LacZ）

(53)

53

（3）鹼性磷酸酶 (ALP)

December 2010Procedia - Social and Behavioral Sciences 2(2):5507-5511

(54)

54

Alkaline Phosphatase (ALP)

December 2010Procedia - Social and Behavioral Sciences 2(2):5507-5511

(55)

（4）氯黴素乙醯轉移酶（CAT）

https://slideplayer.com/slide/11837566/

chloramphenicol (CAM)

https://www.youtube.com/watch?v=eW3a-vXFZOI 同位素

55

(56)

56

(CAM)

(CAT)

(57)

57

生物發光反應與螢光反應

DOI:10.1007/978-3-319-30648-3_69-1

(58)

58

(59)

59

https://zh.wikipedia.org/

（5）綠色螢光蛋白（GFP）

(60)

60

（6）螢光素酶 (Luciferase)

https://www.youtube.com/watch?v=PD_6JU3NayE

(61)

61

2008年10月8日，瑞典皇家科學院在瑞典首都斯德哥爾摩宣布，

日本科學家下村修、美國科學家馬丁‧查爾菲和美籍華裔科學家錢永健獲得2008年諾貝爾化學獎。

今年得獎的三人代表在「綠色螢 光蛋白(GFP)」研究上的三個不同 時期。下村脩是這種蛋白的發現 者，查爾菲辨識出基因，錢永健 則開發出能釋放更強光線、色彩 更多樣化的蛋白變形，讓研究者 能以不同顏色標示不同蛋白，並 看到彼此交互作用。

http://oldsue2008.blogspot.com/2008/12/2008-gfp.html

(62)

62

(63)

雙報告書檢測

63

https://www.promegaconnections.com/dual-reporter-assays/

(64)

64

https://www.youtube.com/watch?v=yQXdpwZmwnA

雙螢光素酶®報告檢測

(65)

65

報告基因分析的應用

• 分析基因調控

• 分析miRNA靶標

• 分析核受體信號傳導

• 研究蛋白質相互作用

• 高通量篩選

(66)

（1）分析基因調控

66

(67)

Nature Reviews Genetics(2019) 67

(68)

68

Yoshihiro Ohmiya

(69)

（2）分析MiRNA靶標

⚫ MICRORNA（MiRNA）是短RNA，與轉錄本3′UTR 中的靶標相互作用，導致MRNA降解或抑制翻譯。

⚫ 觀察MiRNA介導的效應需要一個在較弱的啟動子的控 制下的報告者，以便可以觀察到基因表達的細微變化。

69

Methods Mol Biol. 2014;1095:135-46.

(70)

70

(71)

71

Front Genet. 2019 Aug 28;10:756.

(72)

（3）分析核受體信號傳導

⚫ 關鍵是一個優化的PGL4載體，其中包含9個重複的GAL4 UAS，一個最小的啟動子和LUC2P螢光素酶基因（PGL4.35）。

⚫ 製備兩個含有雌激素受體配體結合域（PBIND-ER∝）或糖皮質激素受體配體結合域（PBIND-GR）

的PFN26A載體。

⚫ 用載體、培養和檢測轉染細胞。 ⁷²

(73)

73

https://zh.wikipedia.org/wiki

（4）研究蛋白質相互作用

(74)

74

Renilla luciferase control responsive luciferase vector

(75)

75

The final activity is measured as firefly luciferase activity normalized by internal Renilla luciferase activity.

March 2015Cancer Science106(6)

（5）高通量篩選

(76)

76

April 2017 Scientific Reports 7(1):525

(77)

77

(78)

78

(79)

79

III. 核糖核酸干擾 (RNAi)

(80)

上課內容

⚫

RNAi原理

⚫

誰發現了RNAi

⚫

RNAi技術

⚫

RNAi的應用

80

(81)

RNAi原理

81

• 雙鏈RNA（dsRNA）由RNase III家族成員Dicer處理，產生21-23nt小干擾 RNA。

• siRNA由稱為RNA誘導的沉默複合物

（RISC）的多組分核酸酶操縱。

Nordic BioSite

siRNA

(82)

82

克雷格·梅洛

誰發現了RNAi

安德魯·菲爾

(83)

動物模型-線蟲

⚫

RNAi最初被發現於秀麗隱桿線蟲 ( Caenorhabditis elegans, C. elegans )。

⚫

觀察到雙鏈RNA（dsRNA）在沉默標靶基因表達方面比單獨使用反股

RNA (anti-sense RNA)有效10倍。

83

(84)

84

小干擾 RNA (siRNA)。具有 2 個核甘酸， 3' 末端突出端的 dsRNA 可激活 RNAi，導致 mRNA 以依賴於靶 mRNA 的互補結合的序列特異性方式降解。

小干擾 RNA (small interfering RNAs, siRNAs)

https://www.gene-quantification.de/si-rna.html

(85)

小髮夾RNA

(short hairpin RNA, shRNA)

85

短髮夾 RNA (shRNA) 包含一個環結構，該環結構被加工成 siRNA，

並且還導致 mRNA 以依賴於靶 mRNA 的互補結合的序列特異性方式降解。

https://horizondiscovery.com

(86)

小分子核糖核酸（microRNA, miRNA)

86

DOI: 10.3389/fneur.2015.00245

小分子核糖核酸

（miRNA），是真核

生物中廣泛存在的一

種長約21到23個核苷

酸的RNA分子，可調

節其他基因的表現

(87)

RNAi相關技術

87

1. siRNA化學合成

Carlos Melendez-Pena

(88)

88

⚫

靶向任何序列的合成siRNA可以通過化學合成製備

⚫

在哺乳動物細胞中，siRNA在敲低靶基因表達方面的有效性範圍（50-95%）

⚫

siRNA的有效性取決於標靶序列

(89)

1.低至中等GC含量（30-50%）。

2. 無內部重複或回文。

3. 在感應鏈的位置 3 處存在 A。

4. 在感應鏈的位置 19 處存在 A。

5. 在感測鏈的位置 19 處沒有 G 或 C。

6. 在感應線的位置 10 處存在 U。

7. 感應鏈位置 13 處沒有 G。

8. 在感應鏈的 15-19 位置至少有 3 個 A/US。

89

siRNA 設計

(90)

90

DOI:10.15171/apb.2017.072 Corpus ID: 25124047

(91)

91

靶向miRNA活性的不同方法

August 2017 Advances in Clinical and Experimental Medicine 26(5):868-874

(92)

92

Transl Neurodegener. 2017; 6: 30. https://www.youtube.com/watch?v=UuicPthdT70

2. siRNA轉染

(93)

Springer 2010. 95-117p. 93

3. shRNA轉染

(94)

94

http://rnai.genmed.sinica.edu.tw/index

(95)

95

(96)

96

4. siRNA篩選

arrayed RNAi screen

pooled RNAi screen

(97)

97

SITOOLS BIOTECH BLOG

(a) Pooled RNAi 篩選庫

(98)

98

Comb Chem High Throughput Screen. 2008 Mar;11(3):175-84.

(99)

(100)

100

arrayed RNAi 篩選庫由單獨的 siRNA 或 shRNA 試劑組成，這些試劑針對不同的基因並放置在多孔板的每個孔中

Nat Methods. 2005 Dec;2(12):967-73.

(b) arrayed RNAi 篩選庫

(101)

Methods of Cancer Diagnosis, Therapy, and Prognosis101

(102)

siRNA可以將HIV水準降低30-50倍!!!

102

RNAi的應用

(103)

103

(104)

104

Nanomedicine (Lond). 2008 Dec; 3(6): 761–776.

(105)

105

I. 即時定量聚合酶連鎖反應 （Real-time

分子生物學應用

劉佩芬老師 高雄醫學大學

生物醫學暨環境生物學系

主題介紹

I. 即時定量聚合酶連鎖反應 （Real-time

quantitative PCR, RT-PCR/Q-PCR/RT-QPCR) II. 報告基因分析 (Reporter gene assay)

III. 核糖核酸干擾 (RNA interference, RNAi)

I. 即時定量聚合酶連鎖反應 (Q-PCR)

上課內容

• 聚合酶連鎖反應(PCR)

• Q-PCR原理

• Q-PCR步驟

• Q-PCR反應混合物

• TaqMan Probe(探針)& SYBR Green(染料)

• 使用的儀器/系統

• 如何避免Q-PCR錯誤

• Q-PCR應用

聚合酶連鎖反應

(Polymerase Chain Reaction, PCR)

Kary B. Mullis: for his invention of the

polymerase chain reaction (PCR) method.

Michael Smith: for his fundamental

contributions to the establishment of

oligonucleotide-based, site-directed

mutagenesis and its

development for protein

studies.

• 這是一種基於聚合酶鏈反應(PCR) 的技術。

• 將反應放入機器中，該機器使用相機或檢測器 實時監測觀察 並螢光反應檢。

• 檢測分子產生的螢光，隨著反應的進行，該分子增加。

• 可以定量相對少量的PCR產物。

Q-PCR 原理

中心法則

https://zh.wikipedia.org

成熟RNA修飾

https://commons.wikimedia.org/

信使RNA (mRNA) 反轉錄成為互補 DNA (cDNA) 的 流程

reverse transcriptase (反轉錄酵素)

Q-PCR步驟

mRNA

mRNA

https://www.youtube.com/watch?v=wBrNbbAIAFo

變性

復性

延伸

https://www.youtube.com/watch?v=wUDysO8bFbA

Q-PCR反應混合物

• 每個Q-PCR 都包含一個螢光報告分子（例如 TAQMAN® 探 針或 SYBR® GREEN染料），用於監測 PCR 產物的積累。

• 隨著靶擴增子數量的增加，螢光團發出的螢光量也隨之增加。

• 為使用Q-PCR 進行基因表達研究而開發的兩種類型的化學物 質是：

(1) SYBR Green 染料 (2) TaqMan Probe 探針

TaqMan Probe(探針)& SYBR Green(染料)

(1) SYBR GREEN 染料

性結合時，會發出突出的螢

(2) TaqMan Probe 探針

劑四甲基羅丹明（TAMRA）。

分離，從而產生螢光信號。

https://www.youtube.com/watch?v=ob3teCrpgxY

mRNA

一管全部反應完

•Enzyme

•Buffer(s)

•Cofactor - Magnesium chloride (MgCl

), is the most common.

Sometimes MgSO

is used with particular enzymes.

•dNTP

•Primers

•Template DNA (if all samples will be uniform)

•Nuclease-free or PCR-grade water PCR MASTER MIX COMPONENTS

mRNA

分兩管反應完

1 st

2 nd

常用哪種儀器/系統

（1） ABI系統

Quantstudio systems

1,3,5,6,7

分光螢光計

I. 即時定量聚合酶連鎖反應（Real-time

劉佩芬老師高雄醫學大學

I. 即時定量聚合酶連鎖反應（Real-time

• 將反應放入機器中，該機器使用相機或檢測器實時監測觀察並螢光反應檢。

信使RNA (mRNA) 反轉錄成為互補 DNA (cDNA) 的流程

• 每個Q-PCR 都包含一個螢光報告分子（例如 TAQMAN® 探針或 SYBR® GREEN染料），用於監測 PCR 產物的積累。

• 為使用Q-PCR 進行基因表達研究而開發的兩種類型的化學物質是：

1 ^st

2 ^nd

激發發射

• 是成功製備cDNA並執行高效且可重複的Q-PCR的最關鍵步驟。

• RNA對RNA酶的降解非常敏感，在核酸分離步驟中必須小心處理。降解或污染的RNA會對Q-PCR實驗的效率和產量產生負面影響。

• 您的實驗室工作台、移液器和吸頭必須不含 RNase，提取的 RNA 必須儲存在不含 RNase 的溶液中。

（A260/280）處的吸光度比應在1.8-2.0的範圍內。如果較低，則可能表明樣品被苯酚或蛋白質污染。

• 使用預混液可大幅減少實驗變異性，從而減少孔間和樣品間差異來提高再現性。

• 在執行Q-PCR實驗時最好事先製作一張準備要加入每項試劑的清單與樣品相對位置表格。

• 應該包括一個缺乏cDNA的陰性對照組，可以檢測表面或試劑的交叉污染。

• 也需要一組反轉錄的陰性對照組，其中沒有逆轉錄酶，如果觀察到產品，表明您的樣品受到DNA污染。

• 內源性對照基因的擴增可以解釋起始cDNA的數量或質量的差異，以及RNA製備方法或cDNA合成的差異。

• 可靠的參考基因是指其表達量不受實驗變數的影響，並且在樣品條件的相關生理狀態之間沒有差異的基因。

（1）基因表達分析-例如病人正常細胞與癌細胞基因表現差異

• 報告基因分析主要為報告基因的啟動子活性的測量。

• 報告基因是把啟動子DNA序列和報告基因DNA序列的融合。

• 報告基因可以為酵素或螢光物。

• β-葡萄糖醛酸酶（ β-glucuronidase , GUS）

• 氯黴素乙醯轉移酶（CAT）