孤挺花組織培養苗量化繁殖技術簡介

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(1)生物技術孤挺花組織培養苗量化繁殖技術簡介. 孤挺花組織培養苗量化繁殖技術簡介農試所生技組陳威臣夏奇鈮曹進義. 一、前言. 孤挺花 (Hippeastrum hybridum Hort.) 原產於熱帶中南美州，主要分佈於巴西、祕. 魯、墨西哥、智利及阿根廷，為石蒜科 (Amaryllidaceae) 多年生鱗皮鱗莖花卉，又名百枝蓮、石蒜花及喇叭花，栽培品種之花朵色彩鮮豔碩大，具有多樣花色與花型變化，極常應用於盆花、切花及花壇植物，深受歐、美、日等國消費者喜愛。台灣的孤挺花種球供應多從荷蘭進口，近年來國內公民營單位也陸續推出新品種，但在推廣初期常面臨種苗不敷供應之困境，此一問題亟待解決。孤挺花種苗可利用有性繁殖之種子播種，以及無性 (營養) 繁殖之分球、切割、雙鱗片或組織培養等方式，其中組織培養法具有繁殖倍率高、生產週期短、可週年生產等優點，對於種苗數量不足的新品種而言，是快速量產種苗的有效方法。農業試驗所自2015年起執行孤挺花種苗繁殖相. 關計畫，已建立「台農1號」( ' Tainung No.1' )、「紅獅」( ' Red Lion' )及「千禧之星」( ' Blossom Peacock' ) 組培苗生產體系，茲將其組培苗繁殖方式簡介如下，作為新品種孤. 挺花種苗生產之參考應用。. 二、孤挺花組織培養苗量化繁殖技術孤挺花組織培養苗量化繁殖技術可分為四個階段：(一) 無菌組培苗建立階段、. (二) 組培苗增殖階段、(三) 組培苗生長階段及 (四) 組培苗出瓶馴化與鱗莖養成階段。. 首先說明培植體取得與其消毒方法，藉以建立無菌組培苗；其次探討培植體大小、細胞分裂素及穀胱甘肽 (glutathione) 等對組培苗增殖的影響；接著針對蔗糖、活性炭與巴克素及液固態培養方式，進行其對組培苗的生長影響研究。最後介紹出瓶苗馴化方式，並利用穀胱甘肽噴施處理促進出瓶苗之生長。. (一) 無菌組培苗之建立階段將孤挺花「紅獅」成熟鱗莖去除葉片、基盤、鱗皮及兩層鱗片後，將其十字縱切成1/4鱗莖，而後切除上半段鱗片，留下帶有部分鱗片與短縮莖之下半段，利用1.2%次. 作者：陳威臣助理研究員連絡電話：04-23317326 18. －農業試驗所技術服務季刊．2020年9月．123期－.

(2) 生物技術養於含有0.2 mg L-1 TDZ與0.2 mg L-1 NAA. 適當大小後進行初代培養 (圖一)。比較. 之 MS培養基，培養達8週與12 週時進行. 植體消毒效率，結果顯示來自上半部短. 1.4苗，源自三種組培鱗莖大小之培植體. 「台農1號」上半部或下半部短縮莖之培縮莖之培植體汙染率顯著較低；此外，取自上、下部位短縮莖之培植體於含有1 mg L 苯甲基腺嘌呤 (benzylamino purine, -1. 調查，結果顯示每一培植體可形成 1.1-. 間並無顯著差異，但以源自9 mm鱗莖之. 培植體生長最快，在培養8週後其組培苗. 具有最大鱗莖，而持續培養達12 週時，. BA) 與0.1 mg L 萘乙酸 (α-naphthalene. 則源自6 mm 與 9 mm 鱗莖之培植體間已. 後，分別約有 57% 與 37% 之培植體形成. 理。綜合上述結果，顯示以1/4鱗莖作為. -1. acetic acid, NAA) 之 MS培養基培養8週. 無顯著差異，但兩者仍顯著大於3mm處. 發根組培苗，每培植體約可得1.2苗，且. 培植體的組培苗增殖效果較佳，但其組. 「台農1號」、「紅獅」及「千禧之星」. 者為小；此外，若培植體來自於較大鱗. 無菌組培苗，作為後續試驗的基礎材. 莖材料，可在較短培養時間內，即獲得. 料。. 具有較大鱗莖之組培苗。圖二為「台農. (二) 組織培養苗之增殖階段. 1 號」源自不同大小鱗莖之 1/4 鱗莖培植. 每苗約有3-4條根。利用上述方法已建立. 孤挺花組織培養苗量化繁殖技術簡介. 氯酸鈉 (NaOCl) 溶液消毒後，再橫切成. 培苗之鱗莖大小會較1/2鱗莖培植體所得. A. 培植體大小對組培苗增殖的影響：選. 體，在培養8週與12週後，組培苗增殖與. 取「紅獅」直徑約8 mm之組培鱗莖，以. 生長的情形。. 整顆鱗莖或1/2鱗莖為培植體，培. 養於含有1 mg L-1 BA與0.1 mg L-1 NAA之 MS培養基，結果顯示1/2. 鱗莖培植體之每一鱗莖平均可形成2-3苗，而整顆鱗莖培植體僅形. 成1苗。以「千禧之星」1/2 或1/4. 組培鱗莖作為培植體，培養於含有0.2 mg L-1 賽本隆 (thidiazuron,. TDZ) 與0.2 mg L-1 NAA之MS培養. 基，兩種培植體之組培苗誘導率均達 100%，但以 1/4 鱗莖處理平. 均每一鱗莖可誘得4.4苗，顯著高. 於1/2鱗莖處理之2.0苗。利用「台. 農1號」直徑約為 3、6 及 9 mm 組. 培鱗莖之1/4鱗莖作為培植體，培. 圖一、利用孤挺花「紅獅」成熟鱗莖建立無菌組織培養苗之情形。(A) 採自田間並洗淨後之成熟鱗莖、(B) 除去葉片、莖基盤及兩層鱗片後對切之1/2鱗莖、(C)切除1/4 鱗莖之上半部鱗片、(D) 上述材料經消毒並且切片後，將帶有短縮莖與鱗片基部之培植體，接種於125-mL三角瓶進行培養。. －農業試驗所技術服務季刊．2020年9月．123期－. 19.

(3) 生物技術孤挺花組織培養苗量化繁殖技術簡介. B. 細胞分裂素 (BA與TDZ) 對組培苗增殖的影響：利用「紅獅」與「千禧之星」. 直徑約8 mm組培鱗莖之1/2鱗莖培植體，探討BA對組培苗增殖效率之影響，結果. 顯示兩品種均以2 mg L-1 BA處理較佳。. 而以「紅獅」1/4鱗莖培植體培養於含有不同濃度BA或TDZ 與0.2 mg L NAA組 -1. 合之 MS 培養基，結果顯示 BA 或 TDZ 處理對組培苗增殖之影響並無顯著差異，但其中以0.1 mg L-1 TDZ處理之組培苗增. 殖率最高，經8週培養後可獲得11.6苗，. 可作為新品種種苗量化之用 (表一)。. C. 穀胱甘肽 (glutathione) 對組培苗增殖的影響：利用直徑約7-8 mm之「紅獅」. 與「千禧之星」組培鱗莖為材料，探討穀胱甘肽對組培苗增殖之影響。結果顯示「紅獅」1/4 鱗莖於 65.0μM 還原態穀胱甘肽 (reduced glutathione, GSH) 或 32.5 μ M 氧化態穀胱甘肽 (oxidized. glutathione, GSSG) 溶液中振盪培養2小時. 後，取出接種於1 mg L-1 BA與. 0.1 mg L NAA之MS培養基， -1. 於照光環境下培養8週後，每一鱗莖可誘得約 12.3 苗最佳；但. 在黑暗環境下，則所有處理不具促進效果。此外，將「千禧之星」1/4鱗莖培養於含有不同濃度 GSH 或 GSSG 之液態培養基中，振盪培養 4、8 及12 週後. 調查組培苗增殖情形，結果顯圖二、源自孤挺花「台農1 號」不同大小鱗莖之培植體，其組培苗增殖與生長之情形。以鱗莖直徑約3 mm (A1, B1)、 6 mm (A2, B2) 及9 mm (A3, B3) 組培苗之1/4鱗莖為培植 -1 -1 體，培養於含有0.2 mg L TDZ與0.2 mg L NAA之MS 培養基，培養達8週 (A1, A3) 與12週 (B1, B3) 後，組培苗之增殖與生長情形。Bars = 1 cm。表一、BA與TDZ濃度對孤挺花「紅獅」1/4鱗莖組培苗增殖之影響 BA. TDZ. -1. NAA. – – – (mg L ) – – –. 組培苗/鱗莖 (No.). -. -. 0.2. 1.8 ± 0.2 b. 7.2 ± 0.8b. 2. -. 0.2. 2.2 ± 0.3 ab. 8.8 ± 1.2ab. 1. 4. -. -. -. 0.1. -. 0.4. -. 20. 組培苗/培植體 (No.). 0.2. 0.2. 0.2. 0.2. 0.2. 0.2. 2.1 ± 0.4 ab. 2.1 ± 0.3 ab 2.9 ± 0.3 a. 2.2 ± 0.4 ab. 2.1 ± 0.4 ab. 8.4 ± 1.6ab. 8.4 ± 1.2ab. 11.6 ± 1.2a. 8.8 ± 1.6ab. 8.4 ± 1.4 ab. 示65.0μM GSH在4週之短期培養有助於提高組培苗增殖率，而在延長培養時間至12 週時，. 則以65.0μM GSH與162.5μM. GSSG處理具有較高之增殖率。. 綜合上述結果，顯示以 1/4 鱗莖培養於含有適量 TDZ. 與 NAA 之 MS 培養基中對組培. 苗增殖效果較佳；此外，將1/4. 鱗莖培植體以65.0μM GSH 或. 32.5μM GSSG溶液浸泡2小時. 候進行固態培養，或是將 1/ 4 鱗莖培養於含有65.0μM GSH. －農業試驗所技術服務季刊．2020年9月．123期－.

(4) 生物技術段)，而後再將未經切割之叢生芽苗團塊. 週，皆可促進組培苗之增殖效率。. 作為培植體，直接繼代於相同組成之固. (三) 組織培養苗之生長階段. 態培養基中培養8週 (第二階段)，結果顯. A. 蔗糖與活性炭對組培苗生長的影響：. 示液固態兩階段培養對於組培苗鮮重、. 孤挺花組織培養苗量化繁殖技術簡介. 或162.5 μM GSSG液態培養基中培養12. 葉數及根數的增加具有明顯之效果 ( 表. 利用直徑約2-4 mm之「台農1號」組培鱗莖於含有不同蔗糖與活性炭濃度組合培. 二)。. 養基中培養，結果顯示當培養基不含活. C. 巴克素對組培苗增殖與生長的影響：. 性炭時，以1.5%與3%蔗糖處理對組培苗. 利用直徑約10 mm「紅獅」與「千禧之. 生長較有利，而 6% 與 9% 蔗糖處理對組. 星」鱗莖培養於含有不同濃度巴克素 (paclobutrazol, PBZ) 液態培養基中，結. 培苗生長有抑制作用；但是當培養基含. 果顯示，對照組鱗莖培養至 8 週時，部. 有2 g L-1 活性炭時，則是以3%與6%蔗糖處理顯著較1.5%與9%蔗糖處理有較高之. 分組培苗出現褐化現象，建議繼代培養. 組培苗鮮重。後續利用直徑約3-5 mm之. 間隔時間不宜超過8週。「紅獅」組培鱗. 配1-2 g L-1 活性炭之處理組合，對於提高. 顯著高於對照組，但 PBZ 處理間並無顯. 莖在50-75 mg L-1 PBZ培養條件下，根數. 組培鱗莖進行試驗，結果顯示6%蔗糖搭組培苗之鱗莖直徑與鮮重最為有利。顯示適當提高蔗糖濃度並添加適量活性炭的培養基組合，對於組培苗之鱗莖直徑、鮮重及根數而言，具有顯著之協同增效作用 (圖三)。. B. 液固態兩階段培養方式對組培苗增殖與生長的影響：利用直. 徑約5 mm之「台農1 號」組培鱗莖，培養於含有1 mg L-1 BA與 0.1mg L. -1. NAA 之液. 態或固態 MS 培養基. 中培養 8 週 ( 第一階. 圖三、蔗糖與活性炭濃度組合對孤挺花「台農1號」組培苗生長之影 -1 -1 響。以直徑約3-5 mm之組培鱗莖培養於含有1mg L BA、0.1mg L NAA、不同蔗糖濃度 (1.5、3、6、9%) (A、B、C、D) 及不同活性炭濃 -1 度 (0、0.5、1.0、2.0g L ) 之MS 培養基中，培養達10週時組培苗之生長情形。Bars＝2cm。表二、液固態兩階段培養方式對孤挺花「台農1號」組培苗生長之影響鱗莖直徑. 組培苗鮮重. 葉數. 根數. (mm). (g). (No.). (No.). 固態-固態. 8.6 ± 0.5 a. 1.3 ± 0.2 b. 1.8 ± 0.2 b. 7.4 ± 0.6 b. 液態-固態. 9.0 ± 0.2 a. 2.2 ± 0.1 a. 2.5 ± 0.1 a. 9.9 ± 0.4 a. 培養方式. －農業試驗所技術服務季刊．2020年9月．123期－. 21.

(5) 生物技術孤挺花組織培養苗量化繁殖技術簡介. 著差異。然而，「千禧之星」鱗莖在25-. 之試驗，結果顯示，若將 PBZ 濃度降低. 75 mg L PBZ處理下，根系生長受到抑. 至5 mg L-1 時，則有促進組培苗鱗莖增大. L PBZ處理則較對照組具有顯著較短與. 示，以6%蔗糖並添加1-2 g L-1 活性炭的. 較寬的葉片。後續進行另一組濃度較低. 培養基組合，對於組培苗之鱗莖直徑、. -1. 制，且隨著濃度提高根數減少，而75 mg -1. 與發根的效果 (圖四)。綜合上述結果顯. 鮮重及根數而言，具有顯著的促進效果。此外，液固態兩階段培養方式可顯著提高組培苗鮮重、葉數及根數。將組培鱗莖培養於含有5 mg L-1 PBZ之MS培養基，也具有促進組培苗之鱗莖增大與發根的效果。. (四) 組培苗之出瓶馴化與鱗莖養成階段 A. 組培苗之出瓶馴化：將組培瓶苗出. 瓶洗淨後，剪去部分的葉片與根部，留有約2 cm葉片與1 cm根系，先以免賴得 (benomyl) (50%可濕性粉劑) 1,000倍溶液. 浸泡 30 分鐘，取出晾乾後進行種植。利. 用混合介質 (泥炭苔：蛭石：珍珠石=2：. 圖四、巴克素對孤挺花「紅獅」與「千禧之星」組培苗生長與發根之影響。「紅獅」(A) 與 -1 「千禧之星」(B) 培養於含有1 mg L BA、0.2 -1 -1 mg L NAA、6%蔗糖及2g L 活性炭，並分 -1 別添加0、5、10及20 mg L 巴克素 (P0、P1、 P2及P3) 之MS固態培養基，培養達8週後組培苗之生長情形。Bars＝5 cm。. 1：1；v/v/v)，在28±4℃之溫室環境下栽. 培，結果顯示，「千禧之星」與「紅獅」之出瓶苗均可達100%存活率 (圖五)。 B. 穀胱甘肽 (glutathione) 對出瓶苗生長的影響：利用「紅獅」與「千禧之. 星」出瓶苗為材料，探討穀胱甘肽 (glutathione) 對組培苗瓶外生長之影響。. 結果顯示「紅獅」具有鱗莖直徑約 12. mm 之出瓶苗在栽培第 9 週開始以不同. 濃度 GSH 或 GSSG 溶液噴施處理，而後. 每 4 週噴施一次，共處理 5次，於停止噴圖五、孤挺花「紅獅」與「千禧之星」組培苗種植於混合介質 (泥炭苔：蛭石：珍珠石 2：1： 1；v/v/v)，於溫室環境栽培達2週 (A)、6週 (B) 及18週 (C、D) 之生長情形。 22. 施 7 週後，調查植株生長情形；結果以. 162.8μM GSSG處理之鱗莖直徑27.4 mm. 與總鮮重 36.3 g 顯著高於其他處理，顯. 示特定濃度之 GSSG 具有促進出瓶苗生. －農業試驗所技術服務季刊．2020年9月．123期－.

(6) 生物技術. 出瓶苗經殺菌劑溶液浸泡30分鐘並晾乾後，以混合介質種植後於溫室環境下生. 長，具有高存活率且植株後續生長狀況良好。此外，利用162.8μM GSSG溶液對出瓶苗進行噴施處理，更對其鱗莖養成. 孤挺花組織培養苗量化繁殖技術簡介. 長的效果 (圖六 )。綜合上述結果，顯示. Mottallebi Azar, and K. Mashayekhi.. 2015. Micropropagation of Hippeastrum. hybridum. Cumhuriyet Univ. Faculty ,. Sci. J. (CSJ) 36:594–605.. Siddique, M. N. A., J. Sultana, N. Sultana,. and M. M. Hossain. 2007. Ex vitro. establishment of in vitro produced. 具有促進之效果。. plantlets and bulblets of Hippeastrum. 四、結語. (Hippeastrum hybridum). Int. J. Sustain.. 台灣目前栽植之孤挺花種球多由國外進口，在各試驗改良場與業者的努力下，已陸續推出許多優良品種，在推廣初期常面臨種苗不足的窘境需加以克服。本文針對孤挺花組織培養的初代培養、組培瓶苗增殖與出瓶苗馴化養成之. Crop Prod. 2:22-24.. Sultana, J., N. Sultana, M. N. A. Siddique,. A. K. M. A. Islam, M. M. Hossain, and T.. Hossain. 2010. In vitro bulb production in. Hippeastrum (Hippeastrum hybridum). J.. Central European Agri. 11: 469-474.. 相關技術進行介紹，提供育種者或種苗業者於種苗量產之參考應用。此外，能整合新品種、種苗量產技術及病原微生物檢測技術，進行無病原健康組培種苗生產，作為優質種球養成之基礎，將更進一步提升國產孤挺花產業之競爭力。. 五、參考文獻陳威臣、曹進義、吳姿穎、夏奇鈮。2019。培植體大小、蔗糖及活性炭對孤挺花組培苗增殖與生長之影響。台灣農業研究 68：137–147。. Amani, S. H., H. Zarei, A.. 圖六、孤挺花「紅獅」出瓶苗於不同穀胱甘肽處理條件下，在溫室生長達32週之植株。大苗 (Large；直徑約12 mm) 與小苗 (Small；直徑約8 mm) 以混合介質 (泥炭苔：蛭石：珍珠石 = 2：1：1，體積比) 種植8週後開始處理，每4週噴施純水 (Control)、GSH (162.8、325.7及651.4μM；GSH-a, -b, -c) 或 GSSG (81.4、162.8及325.7μM；GSSG-a, -b, -c)，共噴施5次，停止施用7週後調查與拍照；每處理3重複，每重複5株，每15株噴施50 mL穀胱甘肽溶液。Bars = 10 cm。. －農業試驗所技術服務季刊．2020年9月．123期－. 23.

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