利用隔絕式恆溫聚合酶連鎖反應及恆溫式圈環形核酸增幅技術快速鑑定平滑白眼鮫及污斑白眼鮫

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國立臺灣大學生命科學院漁業科學研究所碩士論文

Institute of of Fisheries Science College of Life Science

National Taiwan University Master Thesis

利用隔絕式恆溫聚合酶連鎖反應及恆溫式圈環形核酸增幅技術快速鑑定平滑白眼鮫及污斑白眼鮫 Fast identification of Carcharhinus falciformis and C.

longimanus by insulated isothermal PCR and loop- mediated isothermal amplification

韓尚融

Shang-Jung Han 指導教授：蕭仁傑博士 Advisor: Jen-Chieh Shiao, Ph.D

中華民國107年7月

July 2018

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致謝

一切的故事，大概都是一罐八寶粥開始的。從暑假就出海採樣然後差點引發國際事件，到後來機器設備的問題，讓我換了兩次題目，也就這樣踏入鯊魚和分生的領域。一個沒有分生背景的我能夠完成這份研究，真的要感謝太多太多人了，最需要感謝就是帥氣的蕭仁傑老師，給我研究的方向，還有包容我各種壓底線的習慣跟實驗上的失誤，謝謝老師一路以來的指導，辛苦老師了!還有宏安學長，沒有學長前面的基礎，我也沒有辦法這麼快的進入狀況進行實驗。

大姊也是，不只平常在實驗室照顧我，也在實驗操作上提供我許多眉眉角角，

度過那段很崩潰的 Data 難產的日子。謝謝我的口委們，陳老師、韓老師和莊老師，你們的建議讓我知道研究的不足，也讓這篇論文有更好的方向。最令我難忘的就是研究室的大家了，允信學長各種令人無言的點子，瘋狂的行為真的很厲害；謝瑀 tone 調跟我最合，不論是鄉民梗還是 youtuber 都只有妳懂，有個懂自己梗的人在旁邊真的很開心哇哈哈，是個知心好友呢；許蓁跟我是 426 小劇場的編劇拍檔，一搭一唱的吵鬧程度是蕭老闆認證的哈哈，要對自己好一點啦好不好；人如其生日的阿錞，一起撐過這段時間的好戰友，雖然我們偶爾會互相傷害，有這樣有趣的朋友我真的是上輩子燒了好香得到的呵呵；書妤最愛鯊魚，以後就叫做鯊妤女神好了，沒有妳的話我大概會變碩三生，萬分的感謝；

多當了我兩年學弟的子群，要好好加油不要步上我的後塵啊；人生有巨大轉變的庭宏，雖然日子過得很爽，研究要好好做喔。這些日子留下的回憶真的有太多太多，謝謝大家容忍我各種爛梗，花式魔音穿腦、活動推坑還有快要江郎才盡、但是真的很敢做的整人計畫，大家沒有討厭我真的太讓人感動了。還有海研所的 Eric、Bill、Vianney、Sebastian 陪我打球，中山組一起上台北的昱嘉、

柏揚、泓瑋、文勤、武哥還有精神同在的阿銀、ccliaw，謝謝大家的支持與陪伴，伴我度過這兩年瘋狂的日子。感謝爸爸媽媽妹妹還有在台北的親戚們在背後的支持，讓我無後顧之憂的來台北生活，最後是玉婷，這兩年謝謝妳的照顧啦，謝囉!

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摘要

平滑白眼鮫(Carcharhinus falciformis)與污斑白眼鮫(C. longimanus)主要分布於全 球熱帶海洋水域，因為遭受大量的捕撈，族群量已經明顯下降，目前已被漁業署分別列入三大洋區的禁捕物種。物種鑑定是漁業管理的必要條件，有鑑於鯊魚釣獲後經常在漁船上處理過魚身，以至於無法從外觀判定種類，使用生命條碼技術鑑定物種通常需要 1 至 2 週才能得知結果，可能緩不濟急，因此本研究針對平滑白眼鮫與污斑白眼鮫開發快速檢驗方法，設計物種專一性引子及探針，透過隔絕式恆溫聚合酶連鎖反應(iiPCR)以及恆溫式圈環形核酸增幅技術(LAMP)開發快篩方法，搭配快速萃取 DNA 套件，及手持式設備或乾浴槽，在 1 小時內完成檢測。

共 81 個樣本於實驗室進行 iiPCR 檢測，真陽性率(目標物種判定為陽性結果)為 71%、真陰性率(非目標物種判定為陰性結果)為 100%。65 個樣本使用凍乾試劑搭配 DNA 快速萃取套件於實驗室模擬或現場操作進行檢測，真陽性率為 89%、

真陰性率為 93%。70 個樣本於實驗室進行 LAMP 檢測，真陽性率為 61%、真陰性率為 100%。11 個樣本於實驗室模擬現場操作條件搭配 DNA 快速萃取套件進行 LAMP 檢測，真陽性率為 100%、真陰性率為 50%。根據測試結果，本研究開發的 iiPCR 與 LAMP 兩項檢測皆具備於現場操作的條件，然而，不論是 iiPCR 或是 LAMP 檢測對非目標物種都會有偽陽性的結果出現，兩項檢測皆非常靈敏容 易受汙染可能是造成此現象的原因之一，另外是紅肉丫髻鮫(Sphyrna lewini)在 iiPCR 檢測中因 DNA 序列與目標物種相似而有極高的機會出現偽陽性。儘管有些許偽陽性的狀況，但 iiPCR 及 LAMP 的檢測時間短以及操作簡單等特性很適合漁業管理者作為現場初步的快速篩檢工具，提升執法效率。

關鍵字：鯊魚、分子生物檢測、隔絕式恆溫聚合酶連鎖反應、恆溫式圈環形核酸增幅技術

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Abstract

Identifing shark species at the landing site has been difficult when the sharks were dissected with key diagnostic features being removed. Molecular approaches such as DNA barcoding and qPCR methods can identify shark species but the experimental process is time consuming and have to be carried out in molecular labs. Therefore, more rapid and reay-to-use method is warranted in order to simplify the process of identifying certain shark species on-site. Insulated isothermal PCR (iiPCR) and loop-mediated isothermal amplification (LAMP) were used in this study to identify silky shark (Carcharhinus falciformis) and oceanic whitetip shark (C. longimanus) by designing species-specific TaqMan probes and primers. Shark DNA were simply extracted for the amplification of mitochondrial NADH dehydrogenase subunit 2 (ND2) gene within 30- 60 min in either an iiPCR portable device (Micro POCKIT^TM) or a dry bath. 81 samples were tested by iiPCR assay in the laboratory with sensitivity (true positive rate) 71%

and specificity (true negative rate) 100% , respectively while 65 samples were tested in the harbor using lyophilized reagent with sensitivity 89% and specificity 93%. 70 samples were tested by LAMP assay in the laboratory with sensitivity 61% and specificity 100%, while 11 samples were tested by LAMP assay using fast DNA extraction kit to stimulate operating in the harbor with sensitivity 61% and specificity 100%. According to the result, iiPCR and LAMP assay developed in this study are suitable to operate on-site. Although some misjudgment might because of two assays are too sensitive that little cross containmination will lead to false positive result, characteristics such as time-saving, portable, user friendly make iiPCR and LAMP assays useful tools for fishery manager to check shark species on-site.

Keywords : shark, molecular assay, insulated isothermal PCR, loop-mediated

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圖目錄

圖 1、本研究流程圖。 ... 36

圖 2、DNA Barcoding 流程圖。... 37

圖 3、利用 Real-time PCR 模擬 iiPCR 反應，平滑白眼鮫螢光訊號結果。 ... 38

圖 4、利用 Real-time PCR 模擬 iiPCR 反應，污斑白眼鮫螢光訊號與平滑白眼鮫結果比較。 ... 39

圖 5、利用 Real-time PCR 模擬 iiPCR 反應，鋸鋒齒鮫螢光訊號結果。 ... 40

圖 6、利用 Real-time PCR 模擬 iiPCR 反應，白邊鰭白眼鮫螢光訊號結果。 . 41 圖 7、利用 Real-time PCR 模擬 iiPCR 反應，薔薇白眼鮫螢光訊號結果。 ... 42 圖 8、利用 Real-time PCR 模擬 iiPCR 反應，黑邊鰭白眼鮫螢光訊號結果。 . 43

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圖 9、利用 Real-time PCR 模擬 iiPCR 反應，沙拉白眼鮫螢光訊號結果。 ... 44

圖 10、利用 Real-time PCR 模擬 iiPCR 反應，紅肉丫髻鮫螢光訊號結果。 ... 45

圖 11、利用 Real-time PCR 模擬 iiPCR 反應，丫髻鮫螢光訊號結果。 ... 46

圖 12、利用 Real-time PCR 模擬 iiPCR 反應，淺海狐鮫螢光訊號結果。 ... 47

圖 13、利用 Real-time PCR 模擬 iiPCR 反應，深海狐鮫螢光訊號結果。 ... 48

圖 14、利用 Real-time PCR 模擬 iiPCR 反應，灰鯖鮫螢光訊號結果。 ... 49

圖 15、利用 Real-time PCR 模擬 iiPCR 反應，貓公鯊螢光訊號結果。 ... 50

圖 16、利用 Real-time PCR 模擬 iiPCR 反應，尖頭七鰓鯊螢光訊號結果。 ... 51

圖 17、利用 Real-time PCR 模擬 iiPCR 反應，蝠鱝螢光訊號結果。 ... 52

圖 18、使用 WarmStart® LAMP Kit 進行 Real-time PCR 模擬 LAMP 反應，平滑白眼鮫螢光訊號結果 1。 ... 53

圖 21、使用 WarmStart® LAMP Kit 進行 Real-time PCR 模擬 LAMP 反應，污斑白眼鮫螢光訊號結果與平滑白眼鮫比較 1。 ... 56

圖 24、使用 WarmStart® LAMP Kit 進行 Real-time PCR 模擬 LAMP 反應，鋸鋒齒鮫螢光訊號結果與平滑白眼鮫比較 1。 ... 59

圖 25、使用 WarmStart® LAMP Kit 進行 Real-time PCR 模擬 LAMP 反應，鋸鋒齒鮫螢光訊號結果與平滑白眼鮫比較 2。 ... 60

圖 26、使用 WarmStart® LAMP Kit 進行 Real-time PCR 模擬 LAMP 反應，白邊鰭白眼鮫螢光訊號結果與平滑白眼鮫比較。 ... 61

圖 27、使用 WarmStart® LAMP Kit 進行 Real-time PCR 模擬 LAMP 反應，薔薇白眼鮫螢光訊號結果與平滑白眼鮫比較。 ... 62

圖 28、使用 WarmStart® LAMP Kit 進行 Real-time PCR 模擬 LAMP 反應，黑邊鰭白眼鮫螢光訊號結果與平滑白眼鮫比較。 ... 63

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圖 29、使用 WarmStart® LAMP Kit 進行 Real-time PCR 模擬 LAMP 反應，污翅白眼鮫螢光訊號結果與平滑白眼鮫比較。 ... 64 圖 30、使用 WarmStart® LAMP Kit 進行 Real-time PCR 模擬 LAMP 反應，紅肉丫髻鮫螢光訊號結果與平滑白眼鮫比較。 ... 65 圖 31、使用 WarmStart® LAMP Kit 進行 Real-time PCR 模擬 LAMP 反應，丫髻鮫螢光訊號結果與平滑白眼鮫比較。 ... 66 圖 32、使用 WarmStart® LAMP Kit 進行 Real-time PCR 模擬 LAMP 反應，淺海狐鮫螢光訊號結果與平滑白眼鮫比較 1。 ... 67 圖 33、使用 WarmStart® LAMP Kit 進行 Real-time PCR 模擬 LAMP 反應，淺海狐鮫螢光訊號結果與平滑白眼鮫比較 2。 ... 68 圖 34、使用 WarmStart® LAMP Kit 進行 Real-time PCR 模擬 LAMP 反應，淺海狐鮫螢光訊號結果與平滑白眼鮫比較 3。 ... 69 圖 35、使用 WarmStart® LAMP Kit 進行 Real-time PCR 模擬 LAMP 反應，深海狐鮫螢光訊號結果與平滑白眼鮫比較 1。 ... 70 圖 36、使用 WarmStart® LAMP Kit 進行 Real-time PCR 模擬 LAMP 反應，深海狐鮫螢光訊號結果與平滑白眼鮫比較 2。 ... 71 圖 37、使用 WarmStart® LAMP Kit 進行 Real-time PCR 模擬 LAMP 反應，灰鯖鮫螢光訊號結果與平滑白眼鮫比較。 ... 72 圖 38、使用 WarmStart® Colormetric LAMP Kit 以實驗室條件(使用 LabTurbo 萃取 DNA 樣本)測試結果。 ... 73 圖 39、使用 WarmStart® Colormetric LAMP Kit 以實驗室條件(使用 Chelex Resin 萃取 DNA 樣本)測試結果 1。 ... 74 圖 40、使用 WarmStart® Colormetric LAMP Kit 以實驗室條件(使用 Chelex Resin 萃取 DNA 樣本)測試結果 2。 ... 75 圖 41、使用 WarmStart® Colormetric LAMP Kit 以實驗室條件(使用 Chelex Resin 萃取 DNA 樣本)測試結果 3 。 ... 76 圖 42、使用 WarmStart® Colormetric LAMP Kit 以現場檢測條件(使用 Kaneka Easy DNA Extraction Kit Version 2 快速萃取 DNA 樣本)測試結果 1。 ... 77 圖 43、使用 WarmStart® Colormetric LAMP Kit 以現場檢測條件(使用 Kaneka Easy DNA Extraction Kit Version 2 快速萃取 DNA 樣本)測試結果 2。 ... 78 圖 44、使用 WarmStart® Colormetric LAMP Kit 以現場檢測條件(使用 Grind’n

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圖 45、使用 Loopamp DNA Amplification Kit 以現場檢測條件(使用 Kaneka Easy DNA Extraction Kit Version 2 快速萃取 DNA 樣本)測試結果(螢光)。 .... 80 圖 46、使用 Loopamp DNA Amplification Kit 以現場檢測條件(使用 Kaneka Easy DNA Extraction Kit Version 2 快速萃取 DNA 樣本)測試結果(自然光)。 81

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表目錄

表 1、Fish DNA Barcoding 引子表 (Holmes et al. 2009)。 ... 82

表 2、鯊魚新鮮肌肉樣本採集。 ... 83

表 3、漁業署觀察員新鮮肌肉樣本採集。 ... 84

表 4、海大莊守正教授提供酒精保存肌肉樣本。 ... 85

表 5、零售店乾魚翅樣本採集。 ... 86

表 6、自 NCBI 取得 28 種鯊魚物種 mtDNA 全長序列及 ND2 基因的 Accession number。 ... 87

表 7、iiPCR 物種專一引子與探針對其他物種序列的變異點數。 ... 89

表 8、iiPCR 反應單獨使用 CfP 以實驗室條件(使用 Chelex Resin 萃取的 DNA 樣本)測試結果及各訊號中目標物種與非目標物種之比率。... 91

表 9、iiPCR 反應單獨使用 CfP 以現場檢測條件(使用 Grind’n Go 及 Kaneka Easy DNA Extraction Kit Version 2 快速萃取的 DNA 樣本)測試結果及各訊號中目標物種與非目標物種之比率。 ... 92

表 10、反應單獨使用 ClP 以實驗室條件(使用 Chelex Resin 及 Labturbo 萃取的 DNA 樣本)測試結果及目標與非目標物種各訊號比例。 ... 93

表 11、iiPCR 反應單獨使用 ClP 以現場檢測條件(使用 Grind’n Go 快速萃取的 DNA 樣本)測試結果及目標與非目標物種各訊號比例。 ... 94

表 12、iiPCR 反應混和使用 CfP 及 ClP 以實驗室條件(使用 Chelex Resin 及 Labturbo 萃取的 DNA 樣本)測試結果及目標與非目標物種各訊號比例。 ... 95

表 13、iiPCR 反應混和使用 CfP 及 ClP 以現場檢測條件(使用 Grind’n Go 快速萃取 DNA 樣本)測試結果及目標與非目標物種各訊號比例。 ... 96

表 14、iiPCR 反應混和 CfP 及 ClP 凍乾試劑以條件(使用 Chelex Resin 萃取 DNA 樣本)測試結果及目標與非目標物種各訊號比例。 ... 97

表 15、iiPCR 反應混和 CfP 及 ClP 凍乾試劑以現場檢測條件(使用 Grind’n Go 快速萃取 DNA 樣本)測試結果及目標與非目標物種各訊號比例。 ... 99

表 16、iiPCR 反應 CfP 凍乾試劑以實驗室條件(使用 Chelex Resin 及 Labturbo 萃取 DNA 樣本)測試結果及目標與非目標物種各訊號比例。 ... 100

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表 17、iiPCR 反應 CfP 凍乾試劑以現場檢測條件(使用 Grind’n Go 及 Kaneka Easy DNA Extraction Kit Version 2 快速萃取 DNA 樣本)測試結果及目標與非

目標物種各訊號比例。 ... 101

表 18、iiPCR 極限濃度測試結果。 ... 102

表 19、LAMP 物種專一引子各黏合區變異點數。 ... 103

表 19 (續) ... 104

表 21、LAMP 各引子與目標序列相對位置。 ... 105

表 22、WarmStart® LAMP Kit 以實驗室條件(使用 Chelex Resin 及 LabTurbo 萃取 DNA 樣本)測試結果及目標與非目標物種各訊號比例。 ... 106

表 23、WarmStart® Colormetric LAMP Kit 以實驗室條件(使用 Chelex Resin 及 LabTurbo 萃取 DNA 樣本)測試結果及目標與非目標物種各訊號比例。 ... 107

表 24、WarmStart® Colormetric LAMP Kit 以現場檢測條件(使用 Grind’n Go 及 Kaneka Easy DNA Extraction Kit Version 2 快速萃取 DNA 樣本)測試結果及目標與非目標物種各訊號比例。 ... 108

表 25、Loopamp DNA Amplification Kit 以現場檢測條件(使用 Kaneka Easy DNA Extraction Kit Version 2 萃取 DNA 樣本)測試結果及目標與非目標物種各訊號比例。 ... 109

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附錄目錄

附錄 1、行政院農委會漁業署有關鯊魚鰭不離身相關法規及鰭不離身、鰭綁

身示意圖。 ... 110

附錄 2、TaqMan probe 運作原理，qPCR 反應示意圖。 ... 111

附錄 3、PCR in Rayleigh-Be’nard Convection cell (Krishnan et al. 2002)。 ... 112

附錄 4、iiPCR 反應原理圖(改自瑞基海洋)。 ... 113

附錄 5、LAMP 反應原理圖。 ... 114

附錄 6、Grind’n Go DNA 快速萃取套件操作流程。 ... 115

附錄 7、R –Tube。 ... 116

附錄 8、iiPCR 凍乾試劑套件組。 ... 117

附錄 9、本研究實際於宜蘭南方澳魚市場及屏東東港魚市場現場進行 iiPCR 檢測。 ... 118

附錄 10、魚市場採樣時，樣本易受汙染之情況。 ... 119

附錄 11、WarmStart® LAMP Kit 利用白色焦磷酸鎂沉澱判斷反應結果(取自 NEW ENGLAND BioLab)。 ... 120

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壹、前言

1.1 研究對象

鯊魚是海洋的頂層掠食者，沿岸、大洋到深海都有牠們的蹤跡，是海洋生態系中不可缺少的魚類。人類利用鯊魚的歷史相當久遠，現今的利用方式也非常多元，除了肉、皮、內臟以及魚鰭可供食用外，鯊魚皮被製成比牛皮更強韌的皮革，

鯊魚肝油中的鯊烯 (squalene），可添加在汽油中做為抗凍劑，也可以做為保濕劑被廣泛的應用在保養品中，近年鯊魚軟骨中的軟骨素更被提煉出來作為保健食品

1，可見鯊魚的經濟價值以及人類對其的依賴。平滑白眼鮫 (Silky shark, Carcharhinus falciformis Müller & Henle, 1839)及污斑白眼鮫(C. longimanus Poey,

1861)分類上皆屬於動物界，脊索動物門，軟骨魚綱，板鰓亞綱，白眼鮫目，白眼鮫科，白眼鮫屬，分布在全球熱帶及亞熱帶海域，大西洋、太平洋、印度洋都有牠們的蹤跡，通常在遠洋生活，有時也會出現在海岸附近，具遷移及洄游的習性，

曾經是遠洋區數量最豐富的鯊魚之一(www.fishbase.org/)。

臺灣為世界第四大捕鯊國，年捕獲量僅次於印尼、印度以及西班牙，也是第二大的鯊魚肉出口國跟第五大魚翅出口國。根據漁業署漁業統計年報的資料，白眼鮫屬的鯊魚為鯊魚類產值第三高的魚種，年產量約 1510 噸，僅次於鋸鋒齒鮫 (Blue shark, Prionace glauca Linnaeus, 1758) 及灰鯖鮫 (Shortfin mako, Isurus oxyrinchus Rafinesque, 1810)，捕獲方式以鮪延繩釣的混獲(bycatch)為主。

國內最主要的沿岸和近海鯊魚漁業港口—南方澳漁港的資料顯示，自 1989 年至 2011 年間，該漁港的平滑白眼鮫的捕獲量有明顯下降的情形 (Joung et al., 2013)。全球的捕獲量方面，平滑白眼鮫被捕獲量僅次於鋸鋒齒鮫排名第二(Oliver et al., 2015)，在全球最大的魚翅市場—香港魚翅市場排名第三的魚翅來源(Clarke et al., 2006)，根據單位努力漁獲量(Catch Per Unit Effort, CPUE)資料的分析，平滑

1 國立海洋科學博物館-海洋知識+：鯊魚輓歌（莊，2002）

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白眼鮫在東太平洋、中西太平洋以及大西洋都有族群下降的趨勢，綜合多項研究，

全球平滑白眼鮫族群在過去三個世代下降了 47-54% (Rigby et al., 2017)。

污斑白眼鮫曾與平滑白眼鮫及鋸鋒齒鮫被描述為三個最豐富的鯊魚物種 (Compagno, 1984, Taniuchi, 1990, Bonfil, 1994, Castro et al., 1999)，捕獲方式以鮪延繩釣及流刺網為主，在 1950 年代被描述為墨西哥灣數量最多的鯊魚(Wathne, 1959, Bullis, 1961)，且遍布整個太平洋及大西洋溫帶及熱帶水域(Mather and Day, 1954, Strasburg, 1957)，甚至在數量過多造成鮪延繩釣魚獲的損害而一度被視為嚴重問題(Bullis and Captiva ,1955, Backus et al., 1956, Wathne, 1959)。然而，在近期的研究中指出，這種曾經在深度 180 公尺以下，水溫高於 20 °C 時無所不在的鯊魚，現在只有偶爾被記錄到 (Baum and Myers, 2004, Domingo, 2004)。根據 1992 年至 2000 年美國遠洋延繩釣的資料分析，在西北及中西大西洋地區族群量下降了 70%( Baum et al., 2003)

面對族群量下降，世界各國政府及學者近年來正積極研究鯊魚的族群狀況以及制訂相關的限制鯊魚漁業政策，國際自然保護聯盟(International Union for Conservation of Nature and Natural Resources)發布的 IUCN 紅色名錄於 2017 年將平滑白眼鮫由近危物種 (Near Threatened Species) 上修為易危物種 (Vulnerable Species)。污斑白眼鮫則是在 2006 年就被列為易危物種，但目前仍需資料的更新。

被列為易危物種表示該物種可能因受到棲地破壞或過度捕捉等影響，而在未來可能有滅絕風險(Rigby et al., 2017, Baum et al., 2015)。瀕臨絕種野生動植物國際貿易公約(Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora)也在 2017 年 10 月 4 日將平滑白眼鮫列入公約附錄二，污斑白眼鮫則是在 2012 年就被列入附錄二。被列入附錄二代表此物種目前數量稀少，雖未必遭致滅種之威脅，但除非嚴格管制其貿易並防止有礙其生存之利用，否則未來仍有遭致滅種之可能的物種，不論輸出及輸入都應提出許可證，惟其許可證之核發有一定條件。我國漁業署也配合聯合國大會於 2007 年時提出的鰭不離身政策，五大

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鮪類區域性漁業管理組織(RFMOs, Regional fisheries management organisations)也規範鯊魚漁獲物須全魚利用、鯊魚身與鯊魚鰭應同時同批轉載及卸運，且在運抵首次進入之港口時，鰭身重量比例應<5%。中西太平洋漁業委員會(WCPFC, Western and Central Pacific Fisheries Commission)、大西洋鮪類資源保育委員會 (ICCAT, International Commission for the Conservation Tuna Commission)、美洲熱帶鮪魚委員會(IATTC, Inter American Tropical Tuna Commission)以及印度洋鮪類委員會(IOTC, Indian Ocean Tuna Commission)在大西洋、東太平洋、中西太平洋和印度洋發布了污斑白眼鮫的禁捕令，平滑白眼鮫則是在大西洋和中西太平洋禁捕。

1.2 鯊魚漁獲物之鑑種困難度

鯊魚漁獲物的處理方式根據保存方式及船隻有所不同，早期因較無保育觀念，

大部分漁民在外海便將鯊魚鰭割下，與魚體分開保存，甚至將魚體直接拋棄於海中。自 2012 年漁業署開始推動鰭不離身政策，以冰鮮方式保存的鯊魚漁獲物鯊魚鰭應自然連附於鯊魚身，不得將魚鰭自魚身完全割離(鰭連身)，若以冷凍方式保存，總噸位 100 噸以上的漁船鯊魚漁獲物應鰭連身，總噸位未滿 100 噸的漁船鯊魚漁獲物其魚鰭處理應鰭連身，或將背鰭、胸鰭綁附於鯊魚身(鰭綁身)(附錄 1)，

尾鰭得另外存放；鯊魚尾鰭應與鯊魚身同時同批轉載或卸魚，且尾鰭與鯊魚身數量應相符。

冷藏保存的鯊魚，污斑白眼鮫雖可透過外型鑑種，但以平滑白眼鮫來說，與其他許多白眼鮫屬的鯊魚外觀極度相似，即便是富有經驗的漁民或是觀察員，也難以靠外觀來判定正確的物種；冷凍保存的鯊魚漁獲物，不論是鰭連身或鰭綁身的方式通常都會將頭部進行切除，使得許多外觀特徵被移除或破壞使得形態鑑種較困難或無法進行。上述幾項原因皆不利於漁業管理者針對禁捕鯊魚物種之監管。

2015 年 10 月歐洲聯盟(European Union)將我國列入打擊非法、未報告、不受規範(Illegal, Unreported, Unregulated, IUU)漁業不合作第三國警告名單，俗稱黃牌

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警告，認為臺灣對於 IUU 漁業的管制不足，至今仍未解除黃牌警告。最著名的順德慶 888 號事件，便是漁船被綠色和平組織(GREENPEACE)查獲違反多項漁業規範，其中就有鯊魚割鰭棄身的違法行為，也代表臺灣對鯊魚漁獲物的管理需要有更強力的作為。

1.3 利用分子生物技術鑑種

分子生物學技術進行鑑種的研究已行之有年，此方法主要利用個別物種特有的分子標記來取代傳統的形態特徵。常使用的分子標記為粒線體 DNA (mtDNA)，

mtDNA 較核 DNA (nuclear DNA)簡單，演化速率較 nuclear DNA 快，使得種間差異較大，也因為動物的 mtDNA 在複製時不會進行重組，且普遍為母系遺傳，能相對減少種內之差異，讓 mtDNA 比 nDNA 更適合作為分子標記。Ward et al.

(2008)，選定 COI 基因做為軟骨魚鑑種的分子標記，針對 210 種軟骨魚物種粒線體 COI 基因做親緣關係分析，其中僅有兩物種無法在親緣關係樹中被分開，證實利用 COI 基因作為生命條碼來鑑定軟骨魚物種之準確度高達 99%以上。

漁業署自 2012 年起也以生命條碼技術，針對無法由外觀辨識種類的新鮮魚翅以及市面販售之魚翅產品進行檢驗，做為後續管理措施之科學依據。現行的生命條碼技術檢測方式離現場實作及即時檢測還有一段距離，其原因有以下幾點:

第一，此項檢測方式諸多步驟皆需要完整的實驗室儀器及設備來完成，如藥品的配置需要微量吸管；DNA 的萃取需要乾浴槽與離心機；聚合酶連鎖反應(PCR)及 PCR 產物的純化需要熱循環儀；PCR 產物的確認需要做膠、電泳槽，上述設備都不適合脫離實驗室環境。第二，整個檢測流程耗時過長、步驟多，自採樣、DNA 萃取、PCR 反應、PCR 產物確認、PCR 產物純化、定序到最後的資料庫比對，

總共有七個步驟要完成，加上樣本運送回實驗室的路程以及定序所需的時間，總共要耗費 3-5 天的時間。第三，實驗的操作以及結果的判讀皆需要受過相關訓練，

具有分子生物學背景的人員來進行較妥當，避免誤判結果導致錯誤的管理行為。

以上這些，都是使得生命條碼技術無法脫離實驗室環境及快速得知結果的原因。

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1.4 分子生物學物種專一快速篩檢技術

即時聚合酶鏈鎖反應(Quantitative real time polymerase chain reaction, qPCR)是於 PCR 反應中加入螢光染劑，針對每一個循環的反應產物進行螢光訊號的即時偵測並記錄下來的方法，因為其測範圍廣、靈敏度高、準確、專一以及快速的特性，此方式已被廣泛使用在各類疾病的專一性檢測(Paul et al., 2015)。TaqMan Probe 技術是選取 PCR 兩引子之間的一段序列作為探針，並在探針 5’-端標記上螢光基團，3’-端標記上相應的淬滅基團，這時因兩基團距離相當接近，構成螢光能量傳遞的關係，儀器便偵測不到螢光信號，在每一循環的黏合(Annealing)過程中，探針便可與模板互相結合，在下一步的延伸(Extension)過程中，Taq 酶的 5’- 外切酶活性可以將探針的 5’-端分解掉，使螢光基團跟淬滅基團分離，螢光能量無法傳遞釋放出來，儀器便偵測到螢光訊號，理論上每合成一次新鏈就會有一次螢光訊號的釋放(Hiyoshi et al., 1994) (附錄 2)。針對目標物種設計物種專一性的探針，進行 qPCR 反應便可以透過螢光訊號達到偵測之閥值時所對應的循環數(Ct 值)來辨別測試樣本是否為目標物種，也因為此方式非常靈敏，就算樣本的序列與探針只有一個鹼基的差異(mismatch)也可以成功區別出來。

qPCR 比起生命條碼技術可以省下非常多的時間，因為其不需要進行 DNA 定序的步驟，直接透過訊號便可以在反應結束後進行結果的判定，省下了做後續純化、跑膠步驟的時間，只需約 2-3 小時便可得知結果。但此檢測方式仍不適合用做現場快篩，原因有下列幾點:第一: qPCR 反應儀分為兩部分，下半部的熱循環系統以及上半部的光學偵測部件，其中光學偵測部件非常的靈敏，故移動過後就必須重新進行校正才能開始重新測試，並不適合頻繁的移動。第二，此檢測方式儘管可以省去許多反應完成後的許多步驟，但仍需要一些較簡易的實驗室設備進行操作如微量吸管、乾浴槽等，加上 qPCR 反應儀價格十分昂貴，使得應用此方式成本較高昂，不太適合大規模在每個漁獲物上岸點設置。第三，此檢測方式仍

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需受過訓練的人員操作，且還是需要具分子生物學背景的人進行結果的判讀。以上幾點都使 qPCR 技術無法用於現場快篩。

隔絕式恆溫聚合酶連鎖反應(insulated isothermal PCR, iiPCR)是以 Rayleigh- Be’nard Convection cell 式熱對流進行的 PCR 反應(Krishnan et al. 2002)為基礎，

由瑞基海洋生物科技股份有限公司（GeneReach Biotechnology Corp.)進行優化並開發一系列設備(POCKIT)與試劑上市販售，適合現場進行且靈敏的專一性檢測技術。Rayleigh-Be’nard Convection cell 是藉由在毛細管的兩端進行溫度控制，頂端為 61 °C，底端為 97 °C，利用兩端之溫度差異於毛細管中形成熱對流循環(附錄 3)，在直徑 1.6mm 的毛細管中會出現單一由上端到下端的單一循環。iiPCR 以此方式為基礎，利用毛細管底部的單一熱源加熱產生熱對流，底部溫度為 95 °C，

頂部溫度約為 60 °C，反應溶液在毛細管中循環的過程中，便會經歷連續的溫度變化來完成 PCR 的變性(denature)、黏合(annealing)、延伸(extension)三個反應階段達到核酸擴增的目的(附錄 4)。iiPCR 反應使用物種專一性的 TaqMan Probe 並在手持式裝置 Micro POCKIT，在 30-45 分鐘內完成反應並得知結果。此方法自 2012 年開發完成後，已被應用在許多項目如蝦類中白點病病毒(Tsai et al., 2014)、

雞肉中的沙門氏桿菌(Tsen et al., 2013 )以及登革熱病毒(Tsai et al., 2018)的檢測。

恆溫式圈環形核酸增幅技術(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 是由 Notomi et al. (2000)開發，利用 Bst DNA 聚合酶，一種由嗜熱脂肪芽孢桿菌 (Bacillus stearothermophilus)純化出的酵素，這種酵素具有 5’端到 3’端的 DNA 聚 合酶活性和 5’端到 3’端的外切酶活性但不具有 3’到 5’端的外切酶活性，可以在 合成新的 DNA 鏈時同時解離雙股 DNA 模板的氫鍵，使 Bst DNA 聚合酶具有置 換 DNA 鏈的特性，加上其耐熱性，讓 DNA 放大可以在恆溫約 60 至 65 °C 進行下進行。LAMP 反應需要三組引子進行，分別為外引子組(outer primer)、內引子組(inner primer)、以及環引子組(loop primer)，在序列上由 5’端至 3’端有 B3、B2、

B1、LB、LF、F1、F2、F3 總共 8 個黏合區。外引子組由 F3 以及 B3 兩條序列組

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成、內引子由 F2 加上 F1 互補序列 F1c 以及 B2 加上 B1 互補序列 B2c 組成，環引子組由 LF 及 LB 組成。反應總共分為三個階段，分別是環型構造形成、循環擴增反應、伸長及回收反應。環型構造形成時，以 Forward 方向為例，先由內引 子利用 Bst DNA 聚合酶的特性，由 5’端將 DNA 解旋，直接在模板 F2c 區黏合後 進行複製，複製完成後再由外引子於模板 F3 區黏合併進行複製，同時將先前由內引子複製出的單股序列解旋下來，此時內引子上的 F1c 彎曲與複製出的序列 F1 區進行黏合，形成一個環狀結構(Loop)，此單股序列也由另一方向外引子與內引子進行相同步驟，於單股序列兩端形成環型結構，稱作啞鈴型結構。循環擴增反應時，由內引子與環上 F2c 區進行黏和併進行複製，之後由反方向進行相同步驟，完成啞鈴型結構序列自我循環複製。伸長及回收反應則是啞鈴型結構在進行循環擴增反應時，在複製階段時由前後兩方向的內引子黏和後複製，將產物長度不斷伸長。環引子則是在環型結構上進行黏合輔助反應進行(Nagamine et al., 2002)，根據前人研究可以將 LAMP 反應所需時間減少三分之一。經過這三個階段的反應後，便會形成大量的啞鈴型構造以及伸長過後各種不同大小的產物，達到 DNA 放大的效果(附錄 5)。LAMP 反應由於不需要經過升溫降溫的過程，使得反應所需的時間大幅下降，可在 30 至 60 分鐘內完成反應，也不需要過於複雜的實驗室設備，只要簡易的乾浴槽便可進行操作。針對目標物種設計物種專一的引子組進行檢測，LAMP 反應快速、需求低以及靈敏度高的特性很符合快速檢測的需求，也已經被廣泛使用在各領域檢測細菌(Goto et al., 2010)，寄生蟲(Hamburger et al., 2013)甚至是鳥類的性別(Centeno-Cuadros et al., 2017)和肉類的物種檢測 (Cho et al., 2014)。

1.5 研究目的

依據各項前人研究結果顯示平滑白眼鮫以及污斑白眼鮫處於受威脅的狀態，

鯊魚漁獲物上岸時的處理方式使得外觀型態鑑種不易，目前的檢測時程過長，不利漁業管理者進行監督等工作，再加上近年來國際社會對臺灣打擊 IUU 非法漁

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業的壓力，針對禁捕鯊魚物種的簡易快速檢測技術之重要性正日漸提升。本研究利用隔絕式恆溫聚合酶連鎖反應以及恆溫式圈環形核酸增幅技術，針對目標物種設計物種專一的探針以及引子組，並先於實驗室用 qPCR 以較複雜、嚴謹的方式測試探針及引子組對目標物種的專一性，再使用手持式裝置 Micro POCKIT 以及乾浴槽進行 iiPCR 和 LAMP 檢測，最後使用凍乾試劑和 DNA 快速萃取套件於現場或模擬現場狀況進行測試(圖 1)。目的為建立一套具有高靈敏度、高專一性、

檢測時間短且能在野外或現場使用的物種快篩檢測。研究成果將有助於海關、漁業署等稽查單位用於檢測鯊魚漁獲物，達到維護資源永續並打擊非法漁業的目的。

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貳、材料方法

2.1 鯊魚樣本採集與處理 DNA 萃取

本研究自 2016 年起，透過漁業署觀察員的協助以及由國立臺灣海洋大學環漁系莊守正正教授提供自漁船上或漁港，取得之目標物種平滑白眼鮫及污斑白眼鮫新鮮肌肉樣本，以及自台東成功新港、宜蘭南方澳漁港以及屏東東港所採集非 目標物種之新鮮肌肉樣本，包含同為白眼鮫屬的白邊鰭白眼鮫(C. albimarginatus Rüppell, 1837)、薔薇白眼鮫(C. brevipinna Müller & Henle, 1839)、黑邊鰭白眼鮫 (C. limbatus Müller & Henle, 1839)、灰色白眼鮫(C. obscurus Müller & Henle, 1839) 以及沙拉白眼鮫(C. sorrah Müller & Henle, 1839)；同為白眼鮫目的紅肉丫髻鮫 (Sphyrna lewini Griffith & Smith, 1834)和丫髻鮫(S. zygaena Linnaeus, 1758) 另外 也採集了鋸鋒齒鮫、灰鯖鮫、長臂灰鯖鮫(I. paucus Guitart Manday, 1966)淺海狐 鮫(Alopias pelagicus Nakamura, 1935)深海狐鮫(A. superciliosus Lowe, 1841)以及其 他在臺灣較常見的鯊魚及軟骨魚，所有新鮮肌肉樣本皆置於-20°C 保存。除肌肉樣本外，漁業觀察員也有提供黑邊鰭白眼鮫、薔薇白眼鮫以及沙拉白眼鮫的乾魚翅樣本；酒精保存肌肉樣本則是由國立臺灣海洋大學環漁系莊守正正教授提供，

包括薔薇白眼鮫、灰色白眼鮫、灰鯖鮫、鼬鮫(Galeocerdo cuvier Péron & Lesueur, 1822)、深海狐鮫、淺海狐鮫、紅肉丫髻鮫以及丫髻鮫。另外也有自乾翅市場購得的乾魚翅樣本。

本研究利用 Chelex Resin (Bio-Rad, USA)、LabTurbo Genomic DNA extraction kit (TAIGEN, TW)、Kaneka Easy DNA Extraction Kit Version 2 (Kaneka, JP)以及 Grind’n Go DNA Extraction Set (GeneReach Biotechnology Corp. TW)共 4 種不同方法將採集的各魚種組織樣本進行 DNA 萃取。其中 Chelex Resin 和 Labturbo 這兩種萃取方式耗時較長，但所獲得的 DNA 品質較佳，故本研究於實驗室使用這兩個方法萃取的 DNA 進行測試以及檢測。Kaneka Easy DNA Extraction Kit Version

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2 以及 Grind’n Go 則是屬於 DNA 快速萃取套件，步驟簡單，可在 10 分鐘內完成 DNA 萃取。本研究使用這兩種萃取方式於現場或模擬現場操作時進行檢測，達到現場快速檢測的目標

Chelex Resin 其原理見於 (Walsh et al.,1991)，流程參考 (Holmes et al., 2009) 並調整。方法如下: 剪取肌肉組織 1 mm³置於 1.5 ml 的離心管中，加入 298 μl 10% Chelex Resin 溶液及 2 µl 10 mg ml^-1 proteinase K 混和均勻，以 65 °C 乾浴作用 3-4 小時，爾後升溫至 98 °C 半小時，以 12000 rpm 離心 2 分鐘後，取上清液得到粗純化之 DNA，保存於-20°C 冰箱。

LabTurbo Genomic DNA extraction 按照製造商 TAIGEN 提供的實驗流程進行，方法如下: 剪取肌肉組織 1 mm³置於 1.5 ml 的離心管中，加入 300 µl LTLbuffer 以及 30 µl Proteniase K 混和均勻，以 65 °C 作用 3-4 小時，以 12000 rpm 離心 5 分鐘後取 220 µl 上清液，上機完成 DNA 萃取。

Kaneka Easy DNA Extraction Kit Version 2 其原理見於 (Truett et al. 2000)，流程參考製造商提供之步驟並調整。方法如下:剪取肌肉組織約 5-8 mm³置於 1.5 ml 的離心管中，加入 50 μl 的 A 試劑溶液並混和均勻，以 98 °C 乾浴作用 8 分鐘，

加熱作用後置於冰上冷卻，帶溶液冷卻後加入 7 μl 的 B 試劑溶液並混和均勻，

並以 5000 rpm 離心 5 分鐘，得到上清液及粗萃取之 DNA，保存於 4°C 冰箱。

Grind’n Go DNA Extraction Set 的流程依照製造商提供之步驟進行，方法如下:剪取體積約 1 mm³ 的肌肉樣本，置入位於套件的底部的樣本管後，將研磨器插入含有樣本的樣本管，左右旋轉確認研磨器與樣本管確實扣緊後將研磨器與樣本管一起拉出套件，再將研磨器與樣本管穿破套件正面的封膜，用力壓緊直到發出”喀”一聲，確認兩者緊密結合使樣本浸入套件內層中藍色的強鹼性溶液，破壞細胞膜使 DNA 釋出。旋轉研磨器 20 次以上將樣本磨碎後，將套件上下顛倒數次使套件內層強鹼性溶液與外層中無色的強酸性溶液混和直至強鹼性溶液酸鹼中和呈無色為止，獲得中性的粗萃 DNA(附錄 6)。

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11

2.2 樣本之鑑種

本研究除除了由海洋大學莊守正教授提供之樣本外，未知物種的樣本皆使用生命條碼技術(Ward et al. 2008)進行鑑種，利用聚合酶連鎖反應(PCR)針對粒線體 COI 基因進行放大，使用的五條引子(表 1)參考前人研究(Holmes et al., 2009)，

PCR 反應條件經調整後如下: 12.5 µl Taq DNA Polymerase 2x Master Mix RED、

10 µM forward primer 1 µl、10 µM backward primer 1 µl、DNA 萃取液 1 µl、二次水 9.5 µl。PCR 反應流程為: 先升溫至 94 °C 維持 4 分鐘，再以 94 °C，30 秒、

53 °C，30 秒、72 °C，1 分鐘之條件重複 35 個循環，而後停留在 72 °C 維持 7 分鐘，最後降溫至 4 °C。

本研究純化 DNA 使用的是 Rapid PCR Clean Up Enzyme Set (NEW ENGLAND BioLabs Inc, UK)，參考該套件所提供之實驗步驟: 於 1.5 ml 的離心管中加入 5 µl PCR 反應後的產物，再加入 Exonuclease 1，rSAP 各 1 µl 加入並混和均勻，於 37

°C 下靜置 5 分鐘，再以 80 °C 加熱 10 分鐘即完成。

核酸序列分析使用 DNA 毛細管自動電泳儀定序(automated DNA sequencing)，

將欲分析之 DNA 利用 Perkin-Elmere 公司的 Bigdye TM terminator cycle sequence ready reaction kits 進行 PCR 反應，PCR 的反應時間與溫度為：96℃加熱 2 分鐘，

再以 96℃、30 秒，51℃、30 秒，60℃、4 分鐘的條件下反應 30 個循環，最後中止於 4℃。加入百分之百酒精及 3M 醋酸鈉冰浴沈澱 10 分鐘，於室溫 13000 rpm 離心 15 分鐘，移去上清液後，再以 70%酒精清洗沉澱物 2 至 3 次，以 55℃烘乾後加入 template suppression reagent 並在沸水中加熱 2 至 3 分鐘，放入冰中降溫。

將產物吸入 PE tube 中再以 ABI PRISMTM 310 GENETIC ANALYZER 進行 DNA 序列分析。定序所獲得的 DNA 序列與 BOLD System 線上資料庫 (http://www.boldsystems.org)進行比對，以相似度高於 99%作為同物種判定標準，

判斷該樣本真實物種(圖 2)。

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2.3 隔絕式恆溫聚合酶連鎖反應(iiPCR)物種專一引子及螢光探針之設計

iiPCR 引子與 TaqMan Probe 設計時，需符合下列條件: 反應擴增子長度為 70- 150 bp，引子的條件為: GC 比需再 45-60 %之間，Melting temperature(Tm)需在 56- 60 °C 之間，避免連續 4 個 G 或 C，引子不可與探針重複避免形成二聚體於序列 3’端的最後五個含氮鹼基須包含 1-3 個 G 或 C；TaqMan Probe 條件為: 長度須小於 30 bp，GC 比須在 40-80%之間，TM須高於引子 10 °C 以上，5’端的第一個含氮鹼基不可為 G ，避免連續四個 G 。本研究自 NCBI (National Center for Biotechnology Information)線上資料庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)盡可能取得 包含白眼鮫屬(Carcharhinus)、丫髻鮫屬(Sphyrna)、狐鮫屬(Alopias)、鯖鮫屬(Isurus) 共 30 種鯊魚的 ND2 以及 mtDNA 全長的 DNA 序列，以 MEGA6(Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0)軟體進行序列的對齊(Alignment)與整理。

TaqMan Probe 設計建議長度須小於 30 bp，整理好的序列先用肉眼目視的方式尋找 30 bp 內變異點數較多較適合的區間作為設計 TaqMan Probe 的目標區間，

又 iiPCR 擴增子建議長度為 70-150 bp，故以 TaqMan Probe 目標區間為中心，取前後各 200 bp 序列使用 Beacon Designer™ 8 軟體進行 TaqMan probe 設計。由 Beacon Designer™ 8 給出的引子與探針選項中，選取平滑白眼鮫與各物種變異點位置與數目最多以及條件符合的選項，並使用 Primer Express 3.0 預測不同物種於探針上的ΔTm (melting temperature) 大小，綜合評估後設計出具物種專一性的引子與 TaqMan Probe。本研究也使用鎖核酸技術(Locked Nucleic Acid, LNA™)，

將探針上具物種間 mismatch 位點之核甘酸的五碳糖上之二號氧原子與四號碳原子之間，加上亞甲基橋 (O2', C4'-methy-lene bridge)，該特徵能使雙股構型更加穩定，可提高 Tm 值，以達到在該位點更高的鑑別力 (Koshkin et al., 1998)。

為確認非目標物種樣本與設計好的 TaqMan Probe 實際上有多少變異點，本

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13

計模板，以擴增子包括整段 iiPCR 擴增子、與其他非目標物種變異點數較少的原則進行設計及篩選，設計可針對大部分鯊魚物種的 iiPCR 擴增子區段放大的引子。

2.4 隔絕式恆溫聚合酶連鎖反應(iiPCR)條件

本研究使用可攜式裝置 Micro POCKIT (GeneReach Biotechnology Corp. TW) 系統進行 iiPCR 反應，Micro POCKIT 系統有下列幾項特性，第一，操作十分簡單，反應程序已內建於系統中，開始反應只須按一個按鈕，無須進行任何的設定及操作。第二，可手持，體積約為 15.2*6.3*5 cm³，重量約 380 g，內有充電式電池，充滿電後只少可進行五次檢測。第三，對使用者十分友善，完成檢測後，系統自動將反應後螢光訊號強度除以反應前螢光訊號強度求得一數值，分析數值大小後以四種不同訊號直接顯示於螢幕上，分別代表以下意義： “＋”表示數值>1.3，

呈陽性反應，判定為目標物種；”－”代表數值 < 1.2，呈陰性反應，判定為非目標物種；”？”表示 1.2 < 數值 <1.3，代表無法判定是否為目標物種；”！”表示數值過低或過高，代表操作或儀器失誤。Micro POCKIT 使用的反應管為 R-tube (附錄 7)，是底部裝有一銅環的毛細管，反應時由機器加熱銅環進行反應，完成一次檢測約須 30 分鐘。本研究參考瑞基海洋提供之資料找到的理想反應條件如下: 2X Low-salt iiPCR Buffer 25 μl、10 μM forward primer 2.5 μl、10 μM backward primer 2.5 μl、10 μM TaqMan Probe 0.2 μl、ddH2O 15.8 μl、 5U iiPCR Taq DNA Polymerase 2 μl 以及 DNA 萃取液 2.0 μl。每次一實驗皆有進行 non-template control，確保反應沒有汙染。

2.5 驗證引子與 TaqMan Probe 之物種專一性

本研究利用 Real-Time PCR 對設計之 iiPCR 引子與 TaqMan Probe 物種之專一性進行測試，根據螢光訊號的強度以及訊號超越閥值的循環數(Ct 值)判定為陽性或陰性結果，以此驗證引子與 TaqMan Probe 區別目標物種的能力。反應條件

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與 iiPCR 反應相同，反應流程則模擬 iiPCR 反應中反應物於毛細管中循環時所經歷的溫度變化並加上一個 Hotstart 流程使反應更容易進行，反應流程如下: 95 °C 5 分鐘，再以 95 °C 10 秒、62°C 30 秒條件反應 40 個循環。每次實驗皆有進行 non-template control，確保反應沒有汙染。

2.6 iiPCR 凍乾試劑測試

本研究實驗委託臺灣瑞基海洋生技公司，以測試出最好的反應條件將試劑製作成冷凍乾燥試劑套件，利用冷凍乾燥技術，將試劑冷凍至-80 °C 後再抽真空將水分去除成為粉末狀的凍乾試劑，這個過程不會傷害到其分子結構，也更利於保存，克服藥劑不易運送至現場及儲存的困難。冷凍乾燥試劑套件包含一管凍乾試劑粉末、一管 Premix Buffer。操作時取 Premix Buffer 約 50 µl 加入凍乾試劑分末管中進行回溶。並以特製 loop 沾取 DNA 萃取液加入回溶好的試劑中，DNA 的加入量約為 2 µl。並搭配 Kaneka Kaneka Easy DNA Extraction Kit Version 2 以及 Grind’n Go DNA Extraction Set 兩種 DNA 快速萃取套件測試，並實際於魚市場操作測試。每次實驗皆有進行 non-template control，確保反應沒有汙染。

2.7 偵測極限濃度測試

本研究利用 Chelex Resin 萃取目標物種平滑白眼鮫樣本共 10 個，由濃度 1 ng µl^-1連續稀釋三次達 0.1 ng µl^-1、0.01 ng µl^-1、0.001 ng µl^-1，自行配製藥劑進行測試，找到兩種試劑的偵測極限濃度。每次實驗皆有進行 non-template control，確保反應沒有汙染。

2.8 恆溫式圈環型核酸增幅反應(LAMP)物種專一引子之設

計

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15

LAMP 引子設計須符合下列條件: 黏合區 F1c 及 B1c 的 TM值須在 65 °C 左右，黏合區 F3、F2、B3 及 B2 的 TM值須在 60 °C 左右，Loop primer 的 TM值則必須在 65 °C 左右。在 LAMP 引子的設計上，引子兩端的穩定度也是很重要的一環，產物與反應物的自由能差(ΔG)需小於等於-4 kcal mol^-1。引子的 TM值須在 40-65%，以 50-65%為佳，也須避免引子產生二次結構。最後是引子間的距離，

F2 的 5’端到 B2 的 5’端距離建議為 120-160 bp、F2 的 5’段置 F1c 的 5’端距離建議為 40-60 bp、F3 的 3’端到 F2 的 5’端距離建議為 0-60 bp。本研究利用前述自 NCBI 線上資料庫取得並整理好的鯊魚 DNA 序列，利用線上 LAMP 引子設計軟體 PrimerExplorer V5 (https://primerexplorer.jp/e/index.html)設計引子，設計時找尋於 180 bp 中具有最多變異點的區間作為 F2 至 B2 的條件進行設計，並以 TM值、

穩定度以及變異點數目篩選出具物種專一性的引子組。

2.9 恆溫式圈環形核酸增幅反應(LAMP)條件

本研究測試比較三種不同的 LAMP 反應套件，分別是可利用螢光與濁度判讀結果的 WarmStart^® LAMP Kit (BioLabs, UK)、利用酸鹼指示劑顏色判讀結果的 WarmStart^® Colormetric LAMP Kit (BioLabs, UK) 以及利用螢光判讀結果的 Loopamp DNA Amplification Kit (Eiken, JP)。

WarmStart^® LAMP Kit 參考套件提供之反應條件如下: WarmStart LAMP 2X Master Mix 12.5 μl、LAMP 10X Primer Mix 2.5 μl、LAMP Fluorescent Dye 0.5 μl、

DNA 萃取液 1-5 μl，以 ddH2O 補足至 25 μl。LAMP Primer Mix (LAMP primer mix 10X)中各引子濃度為 FIP 16 μM、BIP 16 µM、F3 2 μM、B3 2 μM、LoopF 4 μM、LoopB 4 μM。反應流程利用 Real-Time PCR 機 IQ5 (Bio-Rad Laboratory, Hercules, CA)於 65°C 30 秒共 120 個循環，於每個循環測量螢光訊號，若為陽性反應，將有肉眼可見的白色焦磷酸鎂沉澱出現。

WarmStart^® Colormetric LAMP Kit 參考套件提供之反應條件如下: WarmStart^® Colormetric LAMP 2X Master Mix 12.5 μl、LAMP 10X Primer Mix 2.5 μl、DNA 萃

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取液 1-5 μl，以 ddH2O 補足至 25 μl，反應使用乾浴槽將反應物置於 65 °C 下 30- 60 分鐘。結果利用肉眼判讀，若為陽性反應物將呈黃色、若為陰性反應物顏色不變仍為桃紅色。

Loopamp DNA Amplification Kit 參考套件提供之反應條件如下: 2X reaction Mix 12.5 μl、LAMP 10X Primer Mix 2.5 μl、Fluorescent Detection Reagent 1.0μl、

Bst polymerase 1.0 μl、DNA 萃取液 1-5 μl，以 ddH²O 補足至 25 μl。LAMP 引子混和液(LAMP primer mix 10X)中各引子濃度為 FIP 16 μM、BIP 16 µM、F3 2 μM、

B3 2 μM、LoopF 8 μM、LoopB 8 μM。反應流程利用 Real-Time PCR 機 IQ5 於 65°C 30 秒共 120 個循環，於每個循環測量螢光訊號，根據螢光訊號強弱判讀反應是否為陽性。每次實驗皆有進行 non-template control，確保反應沒有汙染。

叁、結果

3.1 樣本採集狀況以及 DNA 序列資料

本研究總共自宜蘭南方澳漁港、屏東東港和台東成功新港採集新鮮鯊魚肌肉樣本，利用 DNA Barcoding 生命條碼技術確認，樣本包括平滑白眼鮫、薔薇白眼鮫、黑邊鰭白眼鮫、白邊鰭白眼鮫、鋸鋒齒鮫、紅肉丫髻鮫、丫髻鮫、淺海狐 鮫、深海狐鮫、灰鯖鮫、貓公鯊(Centrophorus niaukang Teng, 1959)、尖頭七鰓 鮫(Heptranchias perlo Bonnaterre, 1788)及蝠鱝總計 13 種共 133 個樣本(表 2)。

由漁業署觀察員提供之新鮮肌肉樣本則包括平滑白眼鮫、污斑白眼鮫、丫髻鮫、灰鯖鮫、長臂灰鯖鮫、深海狐鮫以及鋸鋒齒鮫總計 7 個物種共 69 個樣本 (表 3)。酒精保存的樣本由海洋大學莊守正教授提供，種類有薔薇白眼鮫、灰色白眼鮫、淺海狐鮫、深海狐鮫、灰鯖鮫、紅肉丫髻鮫、丫髻鮫以及鼬鮫總計 8 個物種共 19 個樣本(表 4)。自乾貨市場取得的乾翅樣本則有黑邊鰭白眼鮫、

薔薇白眼鮫及沙拉白眼鮫三個物種共 10 個樣本(表 5)。自 NCBI 資料庫所下載

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白眼鮫、大鼻白眼鮫(C. altimus Springer, 1950)、黑印白眼鮫(C. amblyrhynchos Bleeker, 1856)、短尾白眼鮫(C. brachyurus Günther, 1870)、薔薇白眼鮫、杜氏白 眼鮫(C. dussumieri Müller & Henle, 1839)、直翅白眼鮫(C. galapagensis

Snodgrass & Heller, 1905)、公牛白眼鮫(C. leucas Müller & Henle, 1839)、黑邊鰭 白眼鮫、槍頭鮫(C. macloti Müller & Henle, 1839)、烏翅白眼鮫(C. melanopterus Quoy & Gaimard, 1824)、灰色白眼鮫、高鰭白眼鮫(C. plumbeus Nardo, 1827)、

沙拉白眼鮫、紅肉丫髻鮫、丫髻鮫、八鰭丫髻鮫( S. mokarran Rüppell, 1837)、

窄頭丫髻鮫(S. tiburo Linnaeus, 1758)、小眼丫髻鮫(S. tudes Valenciennes,

1822) 、丁字丫髻鮫(Eusphyra blochii Cuvier, 1816)、鋸鋒齒鮫、淺海狐鮫、深 海狐鮫、狐鮫(A. vulpinus Bonnaterre, 1788)、灰鯖鮫、長臂灰鯖鮫總計 28 種共 89 條粒線體ND2 基因或整段粒線體基因，線上代碼(accession code)如附表(表 6)。

3.2 iiPCR 物種專一性引子與探針設計

本研究利用 BeconDesigner 針對平滑白眼鮫以及污斑白眼鮫粒線體 ND2 基因 設計物種專一的引子與 TaqMan Probe ，引子 CfF 序列為 5’- CTAGCCCCATTTGCTATTTTGC - 3’，其他物種對此引子的變異點約 1-6 個、引子 CfR 序列為 5’ - CTCCTCATCCTCCAATGATTGT - 3’，其他物種對此引子的變異點約 0-7 個。螢光探針 TaqMan Probe CfP 序列為 5’ - CATCCCCTACTCAACCCTAACT - 3’，其他物種對此探針的變異點約 2-12 個。

經比對過後挑選出鑑別度較高的位點利用鎖核酸技術(LNA)設計後序列為 5' - A+CA+TCCC+C+T+ACT+CAACCC+TAAC+T - 3' (+為 LNA 之位點)。其中污斑白眼鮫對 CfP 的變異點只有 2 個，代表在 iiPCR 反應中，CfP 對污斑白眼鮫將較不具有區別度，預期的結果可能呈陽性反應，而污斑白眼鮫也是臺灣禁捕的物種。

為將污斑白眼鮫同時列為目標物種，另外在以污斑白眼鮫的 CfP 黏合區的序列製作成物種專一探針 ClP，其序列為 5’ - ATATCCCCTACTCAACCCCAACT - 3’，

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其他物種對此探針的變異點約 2-12 個(表 7)。此探針也利用 LNA 技術增加鑑別率，序列為 5’ – A+TA+TCCC+C+T+ACT+CAACCC+CAAC+T - 3’(+為 LNA 位點)。為確認非目標物種 DNA 序列與 iiPCR 引子及探針實際的變異點數目，針對非目標物種 iiPCR 擴增子區段所設計的引子 PgF 序列為 5’ - ACCACCCACGAGCAGTAGAA - 3’ ，引子 PgR 序列為 5’ - TGCGATTGATGAGTAGGCTAGG - 3’。

3.3 iiPCR 物種專一性引子與探針測試

本研究利用針對平滑白眼鮫設計出的物種專一性引子 CfF、CfR 及探針 CfP 對目標物種及非目標物種模擬 iiPCR 反應條件進行 Real-time PCR 檢測，檢測的樣本包括 4 尾平滑白眼鮫、3 尾污斑白眼鮫、1 尾白邊鰭白眼鮫、4 尾薔薇白眼鮫、2 尾黑邊鰭白眼鮫、7 尾沙拉白眼鮫、3 尾鋸鋒齒鮫、3 尾紅肉丫髻鮫、12 尾丫髻鮫、1 尾灰鯖鮫、1 尾淺海狐鮫、2 尾深海狐鮫、7 尾貓公鯊以及 3 尾蝠鱝。實驗結果顯示: 平滑白眼鮫螢光訊號超越閥值時相應的循環數 Ct 值約為 29，相對螢光訊號(relative fluorescence units, RFU 值)最終可達 1200 左右(圖 3 )，污斑白眼鮫 Ct 值約為 30，RFU 值可達 600 左右(圖 4)，鋸鋒齒鮫 Ct 值結果約為 29、但 RFU 值只有 450 左右(圖 5)，其餘非目標物種皆無明顯上升的螢光訊號(圖 6-圖 17)。

3.4 iiPCR 反應條件測試

本研究利用 iiPCR 技術，使用手持式裝置 MicroPOCKIT，在實驗室條件下使用 LabTurbo、Chelex Resin 萃取的 DNA 進行測試；在現場檢測或模擬現場檢測條件下使用 Grind’n Go 以及 Kaneka Easy DNA Extraction Kit Version 2 萃取的 DNA 進行測試。單獨或混合使用兩條 TaqMan Probe CfP 與 ClP 進行目標物種平滑白眼鮫與污斑白眼鮫的物種快速篩檢測試。單獨使用 CfP 在實驗室條件下

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共 81 個樣本接受測試，出現 17 個陽性結果、59 個陰性結果及 5 個無法判定的”?”訊號。17 個陽性結果中有 12 個來自目標物種，真陽性率(檢測呈陽性反應時，真實為目標物種的比率)，為 71%，偽陽性結果來自薔薇白眼鮫及黑邊鰭白眼鮫；59 個陰性結果全來自非目標物種，真陰性率(檢測呈陰性反應時，真實為非目標物種的比率)為 100%(表 8)。單獨使用 CfP 在現場檢測條件下共 7 個樣本接受測試，出現 4 個陽性結果、2 個陰性結果及 1 個無法判定的”?”訊號。4 個陽性結果皆來自目標物種，真陽性率為 100%；2 個陰性結果中有 1 個來自目標物種平滑白眼鮫，真陰性率為 50% (表 9)。單獨使用 ClP 在實驗室條件下共 37 個樣本接受測試，出現 6 個陽性結果、22 個陰性結果及 9 個無法判定的”?”訊號。6 個陽性結果中有 5 個來自目標物種，真陽性率為 83%，1 個偽陽性結果來自薔薇白眼鮫；22 個陰性結果皆來自非目標物種，真陰性率為 100%；9 個無法判定的”?”訊號皆來自紅肉丫髻鮫(表 10)。單獨使用 ClP 在現場檢測條件下共 14 個樣本接受測試，出現 9 個陽性結果及 5 個陰性結果。9 個陽性結果僅 3 個來自目標物種，真陽性率為 33%，偽陽性結果來自紅肉丫髻鮫及鋸鋒齒鮫；5 個陰性結果有 4 個來自非目標物種，真陰性率為 80%，偽陰性結果來自目標物種平滑白眼鮫(表 11)。混合使用 CfP 及 ClP(TaqMan Probe 總加入量不變)在實驗室條件下共 49 個樣本接受測試，出現 24 個陽性結果、23 個陰性結果及 2 個無法判定的"?"訊號。24 個陽性結果中有 22 個來自目標物種，真陽性率為 92%，偽陽性結果來自薔薇白眼鮫及紅肉丫髻鮫；23 個陰性結果皆來自非目標物種，真陰性率為 100%；無法判定結果的”?”訊號來自淺海狐鮫及深海狐鮫(表 12)。混合使用 CfP 及 ClP 在現場檢測條件下共 43 個樣本接受測試，出現 37 個陽性結果、3 個陰性結果及 3 個無法判讀的”?”訊號。37 個陽性結果中有 34 個來自目標物種，真陽性率為 92%，偽陽性結果來自薔薇白眼鮫和紅肉丫髻鮫；3 個陰性結果皆來自非目標物種，真陰性率為 100%；無法判定結果的”?”訊號來自污斑白眼鮫、黑邊鰭白眼鮫及紅肉丫髻鮫(表 13)。

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3.5 iiPCR 凍乾試劑測試

本研究委託瑞基海洋生技公司製作兩組凍乾試劑，一組混合 CfP 與 ClP 兩種探針、另一組則單使用 CfP 製作，使用手持式裝置 MicroPOCKIT，在實驗室條件下使用 LabTurbo、Chelex Resin 萃取的 DNA 進行測試；在現場檢測或模擬現場檢測條件下使用 Grind’n Go 以及 Kaneka Easy DNA Extraction Kit Version 2 萃取的 DNA 進行測試。混合 CfP 與 ClP 的凍乾試劑在實驗室條件下共 125 個樣本接受測試，出現 41 個陽性結果、79 個陰性結果及 5 個無法判定的”?”訊號。41 個陽性結果中僅 7 個來自目標物種，真陽性率僅 17% ，共 8 個物種出現偽陽性結果；79 個陰性結果中有 78 個來自非目標物種，真陰性率為 99%，

無法判定的”?”結果則來自黑邊鰭白眼鮫、灰色白眼鮫、鋸鋒齒鮫及紅肉丫髻鮫 (表 14)。混合 CfP 與 ClP 的凍乾試劑在現場檢測條件下共 108 個樣本接受測試，出現 71 個陽性結果、29 個陰性結果及 8 個無法判定的”?”訊號。71 個陽性結果中有 33 個來自目標物種，真陽性率為 46% ，共 6 個物種出現偽陽性結果；29 個陰性結果中有 28 個來自非目標物種，真陰性率為 97%，偽陰性結果來自目標物種污斑白眼鮫；有 5 個物種出現無法判定的”?”結果(表 15)。

CfP 凍乾試劑在實驗室條件下共 40 個樣本接受測試，出現 30 個陽性結果、

10 個陰性結果。30 個陽性結果中有 22 個來自目標物種，真陽性率為 73%，偽陽性結果來自紅肉丫髻鮫及深海狐鮫；10 個陰性結果皆來自非目標物種，真陰性率為 100%。(表 16)。CfP 凍乾試劑在現場檢測條件下共 65 個樣本接受測試，出現 37 個陽性結果、27 個陰性結果及 1 個無法判定的”?”訊號。37 個陽性結果中有 25 個來自目標物種，真陽性率為 68% ，偽陽性結果主要來自紅肉丫髻鮫；27 個陰性結果皆來自非目標物種，真陰性率為 100%；1 個無法判定的”?”結果來自紅肉丫髻鮫(表 17)。

3.6 iiPCR 偵測極限濃度測試

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本研究將目標物種的 DNA 以體積 2 µl，最高濃度 1 ng µl^-1 做 3 個階梯式的濃度稀釋(1, 0.1, 0.01, 0.001 ng µl^-1)，10 個目標物種平滑白眼鮫的樣本在每個濃度進行 iiPCR 檢測，在濃度 1 ng µl^-1 及 0.1 ng µl^-1 濃度時，10 個樣本都成功偵測呈陽性反應。在濃度 0.01 ng µl^-1時有 7 個樣本呈陽性、2 個樣本呈陰性、1 個樣本出現”?”訊號。在濃度 0.001 ng µl^-1時僅有 2 個樣本出現”?”訊號，其餘 7 個樣本皆呈陰性。故訂定 0.01 ng µl^-1 為 iiPCR 檢測的偵測極限濃度(表 18)。

3.7 LAMP 物種專一性引子設計

本研究利用 Primer Explorer V5 線上軟體設計出的六條引子序列如下，外引子 CfF3 序列為 5’ - GGACTTATCTTGTCAACCTGA - 3’其他物種對此引子的變異點約 1-7 個；外引子 CfB3 序列為 5’ - GAGGTTAAGTAGGGTCAGG - 3’其他物種對此引子的變異點約 1-7 個；內引子 CfFIP 由黏合區 F1c 及 F2 所組成，其序列為 5’ - TGATTGTTGAGAGAATTCCAAGAGAGCCCCATTTGCTATTTTGC - 3’其他物種對黏合區 F1c 的變異點約 1-8 個、對黏合區 F2 的變異點約 1-6 個；內引子 CfBIP 由黏合區 B1c 及 B2 所組成，其序列為 5’ - TGAGGAGGACTAAATCAAACACAAT-ATTGTGATTATTCATCCGAGG – 3’，其他物種對黏合區 B1c 的變異點約 1-6 個、對黏合區 B2 的變異點約 1-5 個；環引子 CfLF 序列為 5’ - GGGTTGAGTAGGGGATGTAATTGG - 3’，其他物種對此引子的變異點約 2-10 個；環引子 CfLB 序列為 5’ – TCTAGCCTACTCATCAATCGCAA - 3’其他物種對此引子的變異點約 0-5 個。6 條引子總共 8 個黏合區，其他物種的變異點總數約 15-46 個(表 20)，各引子與目標序列黏合區的相對位置如圖所示(表 21)。

3.8 LAMP 反應條件測試

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本研究利用 WarmStart^® LAMP Kit、WarmStart^® Colormetric LAMP Kit 以及 Loopamp DNA Amplification Kit 在實驗室條件下使用 LabTurbo、Chelex Resin 萃取的 DNA 進行測試；在現場檢測或模擬現場檢測條件下使用 Grind’n Go 以及 Kaneka Easy DNA Extraction Kit Version 2 萃取的 DNA 進行測試。

WarmStart^® LAMP Kit 在實驗室條件下共 40 個樣本接受測試，出現 14 個陽性結果及 26 個陰性結果，14 個陽性結果中有 9 個來自目標物種平滑白眼鮫，6 個樣本 Ct 值小於 30、RFU 值約 20000 以上，2 個樣本的 Ct 值分別是 40 以及 50、RFU 值約 15000 以及 10000(圖 18-20)；5 個偽陽性結果皆來自污斑白眼鮫，Ct 值約在 20-30 之間(圖 21-圖 23)真陽性率為 64%；26 個陰性結果皆來自全部 10 個非目標物種，皆無螢光訊號出現(圖 24-圖 37)，真陰性率為 100%(表 22)。

WarmStart^® Colormetric LAMP Kit 在實驗室條件下共 30 個樣本接受測試，

出現 24 個陽性結果及 6 個陰性結果。24 個陽性結果中 14 個來自目標物種，真陽性率為 58%，偽陽性結果來自污斑白眼鮫及淺海狐鮫(圖 38-圖 41)。6 個陰性結果皆來自非目標物種，真陰性率為 100%(表 23)。WarmStart^® Colormetric LAMP Kit 在現場檢測條件下共 18 個樣本接受測試，全部樣本皆呈陰性結果，

可能的情況見於討論(圖 42-圖 44)。

Loopamp DNA Amplification Kit 在現場檢測條件下共 11 個樣本進行測試，

出現 7 個陽性結果及 4 個陰性結果 (圖 45-圖 46)，7 個陽性結果皆來自目標物種，真陽性率為 100%；4 個陰性結果中有 2 個來自非目標物種，真陰性率為 50%，有 2 個偽陰性結果(表 25)。

肆、討論

4.1 iiPCR 探針與引子的設計與檢測

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本研究針對目標物種，平滑白眼鮫所設計的 iiPCR TaqMan probe 螢光探針 CfP，與非目標物種的變異點數要 5 個以上，於 iiPCR 反應中才有區別性，經比對結果，CfP 對 6 個物種的 DNA 序列變異點數小於 5 個，分別是直翅白眼鮫 4 個、公牛白眼鮫 4 個、灰色白眼鮫 4 個、高鰭白眼鮫 4 個、紅肉丫髻鮫 4 個以及黑邊鰭白眼鮫 3 個(表 7)，除紅肉丫髻鮫與目標物種同為白眼鮫目

(Carcharhiniformes)外其餘皆同為白眼鮫屬的物種。

在 Real-time PCR 實驗中，目標與非目標物種很容易透過螢光訊號的強度以及 Ct 值進行判定。目標物種平滑白眼鮫以及污斑白眼鮫也可以透過此方式區分出來，說明 CfP 探針對於目標物種平滑白眼鮫具有足夠的專一性(Tm 值)，可用於平滑白眼鮫的物種快篩，儘管在 iiPCR 反應中對污斑白眼鮫可能沒有分辨的能力，但仍可在 Real-time PCR 實驗中進行區別(圖 4)。針對污斑白眼鮫設計的 ClP 對 11 個物種的 DNA 序列變異點數小於 5 個，分別是大鼻白眼鮫 3 個、鈍吻白眼鮫 4 個、薔薇白眼鮫 4 個、直翅白眼鮫 2 個、公牛白眼鮫 4 個、黑邊鰭白眼鮫 3 個、槍頭白眼鮫 3 個、灰色白眼鮫 2 個、鉛灰白眼鮫 2 個、紅肉丫髻鮫 3 個以及丁字丫髻鮫 4 個。ClP 與 CfP 之間只有 2 個位點有差異(表 7)，由此可預測到在單獨使用 ClP 時，對非目標物種的偽陽性率會提升，因此從實用性的角度考量，只單獨使用針對平滑白眼鮫的探針 CfP，並且將污斑白眼鮫列入目標物種，是個務實可行的辦法。

本研究最初目標是設計可在全球通用的物種專一引子及 TaqMan Probe，但實際設計上仍無法避免因種內序列差異而造成的偽陽性結果。未來若能針對會在臺灣上岸的鯊魚物種進行優化，撇除掉臺灣不會捕到的鯊魚另外進行引子及 TaqMan Probe 的設計，可更降低誤判的機率。

4.2 利用 Micro POCKIT 裝置進行 iiPCR 鯊魚物種快篩

iiPCR 用於平滑白眼鮫與污斑白眼鮫物種檢測快篩時，在實驗室條件下使用 Chelex Resin 或 LabTurbo 萃取的 DNA 樣本，在較穩定的狀況下進行測試，不

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論是單獨使用 CfP 或 ClP 還是混合使用 CfP 及 ClP 兩條探針，真陽性率皆為 100%，代表這兩種探針遇到目標物種平滑白眼鮫與污斑白眼鮫時判定為陽性機率很高，出現偽陰性機率相當低。然而，對非目標物種的真陰性率在單獨使用 CfP 時為 86%，出現”?”訊號的比例則佔 7%，其中以薔薇白眼鮫出現最多偽陽性結果(4 尾樣本)以及”?”訊號(1 尾樣本)。

本研究於測試時先參考瑞基海洋公司所提供之反應條件，10 µM 螢光探針加入量為 0.5 µl，但薔薇白眼鮫持續出現偽陽性訊號後嘗試調降螢光探針之加入量，發現加入量為 0.2 µl 時，薔薇白眼鮫出現偽陽性的狀況下降、僅 1 尾樣本出現”?”訊號，與此同時針對目標物種的偵測依然穩定。故之後皆使用此反應條件進行測試。薔薇白眼鮫與 CfP 之 DNA 序列變異點數目為 6，理論上不容易出現偽陽性結果，為確認 CfP 的專一性，使用 PgF 以及 PgR 引子進行 PCR 反應 並加以定序，確認該個體於 ND2 基因目標區域的序列，經比對 DK160119-8 樣 本與 CfP 變異點數僅有 4 個，推測應為種內序列差異造成，也解釋了此樣本容易出現偽陽性結果。紅肉丫髻鮫、黑邊鰭白眼鮫樣本經過 CfP 加入量調降後也沒有再出現”?”訊號。單獨使用 ClP 時，對非目標物種的真陰性率僅 69%，出現”?”訊號的比例達 28%，且全是紅肉丫髻鮫所發生的情況，此情況也是透過調降 ClP 加入量至 0.2 µl 後趨於穩定。混合使用 CfP 及 ClP 時，對非目標物種的真陰性率為 85%，可推測調降 ClP 加入量有助於降低偽陽性反應或”?”訊號的機率。

DNA 快速萃取套件不論是 Grind’n Go 還是 Kaneka Easy DNA Extraction Kit Version 2 原理皆是透過鹼性溶液將細胞破壞釋出細胞核內的 DNA，再以酸性溶液進行中和得到中性的 DNA 萃取物，不論在 DNA 的濃度及品質皆低於

LabTurbo 以及 Chelex Resin 所萃取的 DNA。因此使用快速萃取套件有可能在 iiPCR 反應中造成對目標物種的偵測率下降，但在使用 Grind’n Go 及 Kaneka Easy DNA Extraction Kit Version 2 套件的實驗中，不論是單獨使用還是混合使用