行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
Stenotrophomonas maltophilia L1、L2 基因表現機制之 探討及 L1、L2 蛋白受質特性分析
研究成果報告(精簡版)
計 畫 類 別 ： 個別型
計 畫 編 號 ： NSC 97-2320-B-039-028-
執 行 期 間 ： 97 年 08 月 01 日至 98 年 07 月 31 日 執 行 單 位 ： 中國醫藥大學醫學檢驗生物技術學系
計 畫 主 持 人 ： 楊翠青
計畫參與人員： 碩士級-專任助理人員：黃奕瑋
碩士班研究生-兼任助理人員：黃奕瑋 碩士班研究生-兼任助理人員：林昕潔 碩士班研究生-兼任助理人員：黃紹晟 大專生-兼任助理人員：林凱旋
大專生-兼任助理人員：蔡欣妤
處 理 方 式 ： 本計畫可公開查詢
中 華 民 國 98 年 10 月 16 日
行政院國家科學委員會補助專題研究計畫 行政院國家科學委員會補助專題研究計畫 行政院國家科學委員會補助專題研究計畫
行政院國家科學委員會補助專題研究計畫 成 果 報 告成 果 報 告成 果 報 告成 果 報 告
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□期中進度報告期中進度報告期中進度報告期中進度報告
Stenotrophomonas maltophilia L1、L2 基因表現機制之探討及 L1、L2 蛋
白受質特性分析 計畫類別: 個別型計畫 □ 整合型計畫 計畫編號：NSC 97－2320－B －039 －028－
執行期間：2008 年 8 月 1 日至 2009 年 7 月 31 日
計畫主持人：楊翠青 共同主持人：
計畫參與人員：黃奕瑋,黃紹晟,林瑜姿,林昕潔
成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：精簡報告 □完整報告
本成果報告包括以下應繳交之附件：
□赴國外出差或研習心得報告一份
□赴大陸地區出差或研習心得報告一份
□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份
□國際合作研究計畫國外研究報告書一份
處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、列 管計畫及下列情形者外，得立即公開查詢
□涉及專利或其他智慧財產權，□一年□二年後可公開查詢
執行單位：中國醫藥大學醫學檢驗生物技術學系
附件一
目 目 目
目 錄 錄 錄 錄
前言 p.3 研究目的 p.3 文獻探討 p.4 研究方法 p.6 結果與討論 p.7 參考文獻 p.11 計畫成果自評 p.19
前言 前言 前言 前言::::
Stemptrphomonas maltophilia 在最近幾年已成為一重要的院內致病菌株。 因為其染色體可產 生至少兩種 β-lactasmases (L1 及 L2)，所以使得 S. maltophilia 對大部分的 β-lactam 型的抗 生素已產生抗藥性。目前為止，許多的研究報導都指出: L1 及 L2 基因的表現為誘發性，且 β-lactam 類型的抗生素為其誘發子。 最近，S. maltophilia K279a 的基因體定序工作正在進行 中，由其部分已知的序列中發現: 位於 L2 基因上游，有一調控基因 ampR。類似 S.
maltophilia L2 及其上游 ampR 基因的基因組裝曾在多種菌株的 AmpC β-lactamase 的調控 系統中被報導。 AmpC 基因的調控方式已被研究較為清處，ampC 基因的表現受到三種調控 蛋白的調控，分別為 AmpR, AmpG, AmpD。 在已知的 S. maltophilia K279a 的基因體序列中，
可發現 S. maltophilia 亦有三個類似 ampR, ampD 及 ampG 的基因存在。如果能明白 L1、
L2 基因的表現機制，則應可以調控蛋白作為治療策略的合適標的物。此成果報告主要為探討 AmpR 蛋白對菌體 L1 及 L2 β-lactamases 活性表現的調控角色。
研究目的 研究目的 研究目的 研究目的::::
S. maltophilia 的 L1 及 L2 基因的表現為誘發性 (inducible)，非持續性 (constitutive)，
而 β-lactam 類的抗生素為其誘發子 (inducer)。 1989, Roster 及 Mett 的研究指出：利用單一 的 β-lactam 當 inducer，L1 及 L2 可同時被誘發 (coinducibility)。 但在 Akova 等人的研 究中曾報導一 S. maltophilia 突變株其有異常高值的 L2 活性，但 L1 的活性並無明顯上 升；此現象似乎暗示著 L1 與 L2 活性的表現可能有不同的調控方式。 既然 L1、L2 基因 為誘導表現型基因，所以可以推測菌體內應有些轉錄調控因子受到誘導因子 (inducer) 的誘 導而表現，進而控制 L1、L2 因子的基因的表現。 如果能瞭解 L1 及 L2 如何受到 inducer 的誘導而表現其活性， 則可以阻止 L1 及 L2 的表現做為藥物設計的標的 (target)，抑制 L1 及 L2 的表現，再輔以一般的 β-lactam 治療，則有機會控制 S. maltophilia 的感染。
文獻探討 文獻探討 文獻探討 文獻探討::::
參考文獻的報導發現，細菌體內的 β-lactamase 基因有兩種來源：一為內源性基因，亦 即染色體上的基因 (chromosomal-mediated)； 一為外源性基因，如來自質體(plasmid) 或跳躍 子 (transposon)。 S. maltophilia 內的 L1、L2 基因是屬於染色體上的基因。與 L1、L2 一樣 同屬 染 色體 基因的 β-lactamases 亦在 多種菌 體中 被 報導 ，如 Pseudomonas aeruginosa 、 Burkholderia cepacia、Morganella morganii、Hafnia alvei、Ochrobactrum anthropi、Serratia marcescens、Xanthomonas campestris、 Laribacter hongkongensis。 分析文獻中此類菌體的 β-lactamases 基因常具有以下特徵：(1) 若其活性的表現為誘導式(inducible)，則此菌體內有 一 ampR 基因，且此基因與誘發性 β-lactamase 活性有關。 (2) 若其活性的表現為持續型 (constitutive)，則此菌體內無 ampR 基因。 (3)若此菌體有 ampR 基因，其 ampR 基因常位於 β-lactamase 基 因 之 上 游 ， 但 ampR 基 因 走 向 與 β-lacamase 基 因 方 向 相 反 。 此 種 AmpR-β-lactamase 基因組成的調控組裝在很多革蘭氏陰性菌中被發表，但依其特徵的差異有 兩種不同的型式。
第一種型式為 AmpR-AmpC 調控組裝，可見於 Citrobacter freundii OS60、Enterobacter cloacae 55、Acinetobacter、Pseudomonas aeruginosa。 此型的 β-lactamase (AmpC) 屬於 Ambler’s 分類 class C，Bush’s 分類 group 1 型。 此型的調控機制被研究的最清楚，共有四 個基因參與 induction 的調控，分別為 ampD, ampE, ampG 及 ampR。其主要機制分述如下:
(1) 當沒有 β-lactam 抗生素時 (no inducer)，AmpR 基因會 constitutive expreesion，所表現的 AmpR 蛋白會結合在 ampR 與 ampC 基因的 intergenic region，而影響 ampC 表現，所以在 沒有 inducer 時，AmpR 為一 repressor，抑制 ampC 表現 (菌體沒有 β-lactamase 活性)。
(2) 當 β-lactam 型的抗生素(inducer) 進入細菌之 periplasma 中時，會抑制 periplasma 中的 UDP-MurNAc-pentapeptide 合 成 murein ， 所 以 過 多 的 UDP-MurNAc-pentapeptide 在 periplasma 中被分解成 1,6-anhydromuropeptides。 AmpG 為一 transmembrane protein，其可 將 1,6-anhydromuropeptides 送至 cytosol 中。1,6-anhydromuropeptides 為活化 AmpR 的重要 ligand，其可改變 AmpR repressed condition (relieve the repressed state of AmpR)，而使得 ampC
基因可表現，菌體表現 β-lactamase 活性。 所以 AmpG 對菌體 β-lactamase 活性的 induction 為一 positive regulator。
(3) AmpD 為一 cytosol protein，其為一 N-acetyl-anhydromuramyl-L-alanine amidase，其可水 解 1,6-anhydromuropeptides，使得 induction 不發生，所以 AmpD 對菌體 β-lactamase 活性的 induction 為一 negative regulator。
(4) AmpE 為一 tansmembrane protein，在諸多菌體中，ampE 與 ampD 形成一 operon。 但 依目前的研究報導，AmpE 與 β-lactamase 的 induction 似乎沒有具體的相關性。
第二種型式為 AmpR-Class A β-lactamase 調控組裝。此計畫所研究的菌體 S. maltophilia 之 L2 基因即屬 AmpR-ClassA β-lactamase 調控組裝。目前已有兩株 S. maltophilia 菌株 (R551-3 及 K279a) 的基因體序列可供參考。基因體序列搜索的結果發現，S. maltophilia 菌 體中有一個 ampR homologue，兩個 ampD homologues 及一個 ampG 基因。此型的調控機制 尚未被研究得很清楚。
研究方法 研究方法 研究方法 研究方法::::
(A) 不同菌種間不同菌種間不同菌種間不同菌種間 AmpR-ββββ-lactamase 調控組裝之演化分析調控組裝之演化分析調控組裝之演化分析調控組裝之演化分析
(1) 從 NCBI 資料庫中搜索不同菌種具有 ampR-β-lactamase 組裝的 DNA 序列 (2) 以 bioinformatics 分別分析不同菌種之 AmpR, IG region 及 L2 之相關性
(B) AmpR 對對對對 L1 βββ-lactamase 基因表現所扮演的角色β 基因表現所扮演的角色基因表現所扮演的角色 基因表現所扮演的角色
(1) 構築 S. maltophilia KH 之 KH∆L2 mutant 及 KH∆RL2 之 double mutant。
(2) 比較 KH∆L2 及 KH∆RL2 在有 inducer 及無 inducer 情形下所表現的 β-lactamase 活 性之比較分析
(C) AmpR 對對對對 L2 βββ-lactamase 基因表現所扮演的角色β 基因表現所扮演的角色基因表現所扮演的角色基因表現所扮演的角色
(1) 構築 S. maltophilia KH 之 KH∆R 及 KH∆L1 mutants
(2) 比較 KH∆R 及 KH∆L1 在有 inducer 及無 inducer 情形下所表現的 β-lactamase 活 性之比較分析
(D) AmpR autoregulation 的評估的評估的評估的評估
可由下列實驗的設計，瞭解 AmpR 是否有 autoregulation 的現象
KH(pKHR xylE174L2)及 KH∆RL2(pKHR xylE174L2) 在有 inducer 及無 inducer 情形下 所表現的 C23O 活性之比較分析
結果與討 結果與討 結果與討
結果與討論論論論: : : :
(A) 不同菌種間不同菌種間不同菌種間不同菌種間 AmpR-ββββ-lactamase 調控組裝之演化分析調控組裝之演化分析調控組裝之演化分析調控組裝之演化分析
共搜索 9 株 ampR-ampC module 菌株及 8 株 ampR-class A β-lactamase module 菌 株。其 β-lactamase 蛋白之演化分析如圖 1(A), AmpR 蛋白之演化分析如圖 1(B), ampR-β-lactamase intergenic region (IG) 之比對分析呈現於圖 2。
Fig. 1. Dendrograms showing the relationships of L2 and AmpR proteins of S. maltophilia KH to the related β-lactamases and AmpR proteins. The dendrogram is constructed by using the amino acid sequences from the assayed proteins. The bootstrap numbers at the branch points refer to 1000 replications. The species with a class A β-lactamase are underlined and the other are the type of AmpC β-lactamases. (A) Dendrogram of chromosomally encoded class C and class A β-lactamases.
The number in each bracket denotes the identity between the indicated β-lactamase and L2 of S.
maltophilia KH. (B) Dendrogram of chromosomally encoded AmpR proteins. The number in each bracket denotes the identity between the indicated AmpR and AmpR of S. maltophilia KH.
Fig. 2. Alignment of the ampR-β-lactamase IGs with that of S. maltophilia KH. The start codon and promoters (-10 and -35 regions) for ampR genes are boxed, and those for L2 genes are shaded. The putative LysR binding motif for AmpR binding is underlined. The strains marked with asterisks indicate the type of ampR-class A β-lactamase module and the other strains are the type of ampR-ampC system.
(B) AmpR 對對對對 L1 βββ-lactamase 基因表現所扮演的角色β 基因表現所扮演的角色基因表現所扮演的角色 基因表現所扮演的角色
分析 KH∆L2 及 KH∆RL2 在有 inducer 及無 inducer 情形下所表現的 β-lactamase 活性 (表一)
Table 1. The β-lactamase activity and C23O activity of E. coli and S. maltophilia harboring different recombinant plasmids
所以, AmpR 對 L1 β-lactamase 基因表現所扮演的角色: 不論在有無 inducer 的情況下, AmpR 對 L1 基因的表現為正調控。
(C) AmpR 對對對 L2 β對 βββ-lactamase 基因表現所扮演的角色基因表現所扮演的角色基因表現所扮演的角色基因表現所扮演的角色
分析KH∆R 及 KH∆L1 在有 inducer 及無 inducer 情形下所表現的 β-lactamase 活性 (表 一)
Table 1. The β-lactamase activity and C23O activity of E. coli and S. maltophilia harboring different recombinant plasmids
所以, AmpR 對 L2 β-lactamase 基因表現所扮演的角色: 不論在無 inducer 的情況下, AmpR 對 L2 基因的表現為負調控。在有 inducer 的情況下, AmpR 對 L2 基因的表現為 正調控。
(D) AmpR autoregulation 的評估的評估的評估的評估
分析KH(pKHR xylE174L2)及 KH∆RL2(pKHR xylE174L2) 在有 inducer 及無 inducer 情形下 所表現的 C23O 活性之比較分析 (表一)。
Table 1. The β-lactamase activity and C23O activity of E. coli and S. maltophilia harboring different recombinant plasmids
所以 所以
所以所以,,,, AmpR 沒有沒有沒有 autoregulation 的現象沒有 的現象的現象的現象。。。。
參考文獻 參考文獻 參考文獻 參考文獻::::
已發表刊物:
Cheng-Wen Lin, Yi-Wei Huang, Rouh-Mei Hu, Kai-Hung Chiang, Tsuey-Ching Yang*. 2009.
The role of AmpR in the regulation of L1 and L2 β-lactamases in Stenotrophomonas maltophilia.
Research in Microbiology. 160:152-158.
學生畢業論文:
Stenotrophomonas maltophilia 的 ampR-L2 組裝之特性分析。黃奕瑋。中國醫藥大學醫學檢驗 生物技術學系碩士班。2009,1 月。
計畫成果自評 計畫成果自評 計畫成果自評 計畫成果自評::::
本計畫執行情形順利。除了其中幾個突變株的構築改變策略外, 其他大部份皆依照計畫書所 設計內容執行。成果已發表於學術性期刊 Research in Microbiology.
