中草藥之成分研究及生理活性天然物衍生物之合成(III)

行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告

中草藥之成分研究及生理活性天然物衍生物之合成(3/3)

計畫類別： 個別型計畫

計畫編號： NSC93-2113-M-006-001-

執行期間： 93 年 08 月 01 日至 94 年 07 月 31 日 執行單位： 國立成功大學化學系（所）

計畫主持人： 吳天賞

報告類型： 完整報告

報告附件： 出席國際會議研究心得報告及發表論文 處理方式： 本計畫可公開查詢

中 華 民 國 94 年 10 月 31 日

行政院國家科學委員會補助專題研究計畫 █ 成 果 報 告

□期中進度報告

（計畫名稱）

中草藥之成分研究及生理活性天然物衍生物之合成 I~III

計畫類別：„ 個別型計畫 □ 整合型計畫

計畫編號：

執行期間： 91 年 8 月 1 日至 94 年 7 月 31 日

計畫主持人：

共同主持人：

計畫參與人員：

成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：□精簡報告 █完整報告

本成果報告包括以下應繳交之附件：

□赴國外出差或研習心得報告一份

□赴大陸地區出差或研習心得報告一份

█出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份

□國際合作研究計畫國外研究報告書一份

處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、

列管計畫及下列情形者外，得立即公開查詢

□涉及專利或其他智慧財產權，□一年□二年後可公開查詢

執行單位：國立成功大學化學系

中 華 民 國 94 年 10 月 31 日

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目錄

中文摘要……… 3

英文摘要……… 4

ㄧ、前言……… 5

二、研究目的及文獻探討……… 5

三、研究方法………13

四、結果與討論………15

五、論文發表………30

六、計畫成果自評………31

附錄： 出席國際學術會議心得報告………32

發表之論文………35

3

中文摘要：

由見血封喉樹皮分離得到66 個化合物，其中 30 個為天然界首次分離得到的新化合物；

由Eurycoma longifolia 根部分離得到 47 個化合物，其中 2 個為天然界首次分離得到的新化

合物；由三葉鼠尾共分離得到50 個化合物，其中 14 個為新化合物。由大葉楠分離得到17

個化合物，其中7 個為天然界首次分離得到的新化合物，且有 6 個新化合物為新骨架之化

合物；由黃柏葉部分離得到30 個化合物，其中 3 個為天然界首次分離得到的新化合物；由

日本黃柏葉部共分離得到29 個化合物，其中 1 個為新化合物。由山梔子(Gardenia

jasminoides Ellis)果實共分離得到 32 個化合物，其中 3 個為首次發現之新化合物。山梔子與 水梔子(G. jasminoides Ellis var. grandiflora Nakai)的成分相近，可相互代用。另外也分離得 到藏紅花素，顯示山梔子與水梔子可作為名貴藥材番紅花活性成分的替代來源。由台灣黃 柏（Phellodendron amurense var. wilsonii）根部共分離得到 35 個化合物，其中 1 個為新化合 物，而3 個為首次從天然界分離得到之化合物。由虎頭柑(Citrus kotokan Hayata)新鮮果皮分

離得到24 個化合物，其中 3 個為天然界首次分離得到的新化合物。

除此之外，則利用合成的方法，進行一系列化合物的研究，由ㄚ啶酮衍生物 1 的製備由 2 與 3 為起始物，成功合成出化合物 6。另外，丹參酮衍生物的半合成，則由丹參酮 I(1) / IIA(2) 為起始物，成功合成出 salviamine-A (3), -B (4)及 isosaviamine-B (6), -C (8)。以及含有 camphanoyl 取代基的香豆素衍生物(11)，已經被證實具有相當高的抗 HIV 活性。這一類化 合物的合成已被廣泛的探討，並建立了產率不錯的合成路徑。本研究合成更具水溶性的化 合物(12)及其衍生物(13)，並測試其抗癌活性，以嘗試尋求發現新的抗癌藥物。

關鍵詞：見血封喉；Eurycoma longifolia；三葉鼠尾；大葉楠；黃柏；日本黃柏；山梔子；

水梔子；台灣黃柏；虎頭柑；丹參酮；ㄚ啶酮；香豆素衍生物；抗HIV 活性

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Abstract:

Fractionation and chromatographic purification of the methanol extract of the stem bark of Antiaris toxicaria (Pers.) Lesch. afforded thirty new and thirty-six known

compounds. Forty-seven constituents were isolated from the roots of Eurycoma longifolia. Our of which, two were reported from natural sources for the first time.

Fourteen new and thirty-six known compounds were isolated from Salvia trijuga Diels.

Fractionation and chromatographic separation of the methanol extract of Persea

japonica Sieb. yield ten compounds, among which one compound found to be new and six compounds with novel skeleton. Thirty metabolites were isolated from the leaves of Phellodendron amurense. Among these, three were reported from natural sources for the first time. One new and twenty-eight known compounds were purified from Phellodendron japonica. Thirty-two compounds including three new compounds were isolated from the fruits of Gardenia jasminoides Ellis. This study also indicated that G.

jasminoides Ellis var. grandiflora Nakai could substitute for G. jasminoides Ellis because of their similar constituents. Besides, we also obtained crocins from G.

jasminoides Ellis. This result revealed that G. jasminoides Ellis and G. jasminoides Ellis var. grandiflora Nakai could be an instant source of crocins. Fractionation and a series of chromatographic separation of the methanol extract of the roots of Phellodendron amurense var. wilsonii afforded thirty-five compounds. Among them, phellocoumarin A is new and three compounds were isolated from natural sources for the first time. Three new compounds together with twenty-one known compounds were characterized from the fruit peels of Citrus kotokan Hayata. Further, Acridone derivative 1 was synthesized from 2 and 3. We have been synthesizing 6 successfully. Diterpene alkaloids,

salviamine-A (3), -B (4) and isosaviamine-B (6), -C (8), were synthesized successfully from the coupling of savianone I (1) / IIA (2) with amines. A coumarin derivative (11) which contained camphanoyl substitution was confirmed to possess excellent anti-HIV activity. This analog was discussed extensively and the synthetic route was established well with moderate yield. In this research, (12) and (13) were planned to be synthesized.

Since they possessed high hydrophilic functions, they may have more potential to become commercial drug.

Keywords: Antiaris toxicaria, Eurycoma longifolia, Salvia trijuga, Persea japonica, Phellodendron amurense, Phellodendron japonica, Gardenia jasminoides, Phellodendron amurense, Citrus kotokan, Camphanoyl substitution. Acridone, Diterpene alkaloids, Camphanoyl substitution, Coumarin derivatives, Anti-HIV activity.

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一、前言

製藥產業是高附加價值、跨領域科技結合的高科技產業，歐、美、日等國政 府均能體認製藥工業對經濟與國民健康的重要性，故其製藥工業均是蓬勃發展。

世界各國因工業發達所造成的環境污染，幾乎使每一個國家的癌症發生率和死亡 率都節節升高，世界衛生組織預測二十一世紀癌症將是人類第一殺手，也是每一 個國家最嚴重的挑戰。因此抗癌藥物是一個值得探討的目標，另外腸病毒、肝炎 及登革熱等在台灣地區，每年都有相當數量的病例；九十二年初爆發的嚴重急性 呼吸道症候群（SARs）不但引發全世界恐慌，也造成數百人死亡，在台灣地區也 留下許多人心中永遠的傷痕。其後雖疫情未擴大，但在今年初台灣和廣東仍有零 星案例發生，且世界衛生組織（WHO）也發布有新型變種病毒的可能，更加重再 度爆發另一波流行擴散的可能性。目前現有醫療僅能給予固醇類藥物，歐美等醫 療先進國家迄今尚無有效的治療及預防藥物。這數種病毒感染疾病是衛生單位現 今極為重要的防治工作，國內在這些方面的基礎研究雖已有很好的成果，但目前 為止，尚無對抗病毒的有效藥物，因此開發抗病毒感染症藥物，也是當務之急。

本計畫目的是希望從台灣產植物、民間藥和中草藥中分離出抗癌與抗病毒活 性或具有其他生物活性的成分，希望於最短期間內分離出活性很強之化合物，提 供合成化學家與藥物化學家作為新藥開發之先導藥物，並發展成具有臨床使用價 值的抗癌與抗病毒新藥。另外，也著手利用合成的方法，進行ㄚ啶酮衍生物的製

備，丹參酮衍生物的半合成，以及具有抗HIV 活性的香豆素衍生物的合成。

二、研究目的及文獻探討

見血封喉為桑科植物見血封喉，又名加布，剪刀樹，箭毒木，分布於雲南南部 和廣東(海南)；印度， 中南半島，馬來西亞也有。生海拔 1000 公尺以下的山地常 綠闊葉林中。樹汁含有劇毒，會引起人畜中毒而死亡，常塗抹於箭尖，用於狩獵 之途⁽¹⁾。全株具有心臟毒性，用於催吐劑與催乳劑；種子主治熱病⁽²⁾。從文獻上，

我們發現本植物之成分，大多以含強心配醣體衍生物為主^(3-13)，另外亦含一些

prenylaurone⁽¹⁴⁾、chalcone⁽¹⁵⁾、flavanone⁽¹⁵⁾ 及 dihydrochalcone^(16-18)型化合物。其藥

理及動物試驗發現其乙醇抽出物具有強心作用，升高血壓，增加心血流輸出量⁽²⁾，

對狗餵食會造成催吐作用，大劑量時，造成心律不整與心室纖維顫動 ⁽²⁾，抗癌作

用⁽¹⁹⁾及5-lipoxygenase 抑制作用⁽¹⁹⁾等活性。此外，其對青蛙的LD50為0.8 mg/kg，

而α-antiarin 對貓的致死量為 0.107- 0.160 mg/kg⁽²⁰⁾。因此，為推動心血管疾病的新 藥開發，所以希望能更進一步了解本植物的化學成分與藥效。

Eurycoma longifolia 為 Simaroubaceace 科植物，由成分研究顯示其具有抗瘧

疾、抗潰瘍、抗發熱的活性，以及具有細胞毒性^(21-30)。東南亞一帶常用於男性壯

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陽之用。其主要成分為β-carboline、二萜類、squalene 型的三萜類等^(31-33)，如 9-methoxycanthin-6-one, 9-methoxy-canthin-6-one-N-oxide, 9-hydroxycanthin-6-one, 9-hydroxycanthin-6-one-N-oxide, eurycomanone, eurycomanol, eurycomalactone, longilene peroxide, eurylene, 14-deacetyl- eurylene, teurilene, glabrescol。為了開發具 有抗癌活性的藥物，因而著手進行本植物的化學成分與藥理作用之研究。

丹參為唇形科丹參屬之植物,常見之中藥商品, 主要為唇形科植物丹參的根, 多數為野生而四川以栽培為主, 主產於四川, 山西, 河北, 江蘇, 安徽等地, 其中 以四川產的質量最好. 本屬植物除丹參外, 中華誌所記載之替代品共有 15 種, 均 廣泛的應用於去瘀活血, 月經不調, 心煩失眠等方面, 藥理作用及臨床應用發現 本屬植物普遍存在之隱丹參酮(Cryptotanshinone)與丹參酮(Tanshinone)具有擴張 冠狀動脈增加血流量的作用, 臨床上已有丹參注射劑, 片劑或其他劑型用作治療 冠 心 病, 對 心 絞 痛 , 心 肌 梗 塞 和 心 肌 損 害 有 一 定 療 效^(34,35)另 外 隱 丹 參 酮 (Cryptotanshinone)與丹參酮(Tanshinone), 二氫丹參酮(Dehydrotanshinone), 丹參 酸甲酯(Methyltansinonate), 異丹參酮(Isotanshinone), 丹參新酮(Miltirone)等對敏 感 及 耐 藥 的 金 黃 色 葡 萄 球 菌 均 有 較 強 的 抗 菌 效 用, 臨 床 證 明 以 丹 參 酮 (Tanshinone)為主要成分的片劑, 油膏劑治療化膿性扁桃腺炎, 外耳道炎症及腫 痛骨隨炎以及其他由金黃色葡萄球所引起的病患皆有較好的效果. 丹參的水浸

液在試管內對一些皮膚真菌也有不同程度的抑制作用⁽³⁶⁾, 藥理試驗對小白鼠有

鎮靜安定的效果, 臨床用於治療神經性衰弱, 失眠⁽³⁷⁾, 此外丹參在治療因血吸蟲 病所引起的肝脾腫大有一定的效果⁽³⁸⁾, 文獻上對於本屬植物的研究以丹參為主, 並發現其中含有隱丹參酮(Cryptotanshinone)與丹參酮(Tanshinone)，二氫丹參酮 (Dehydrotanshinone)，丹參酸甲酯(Methyltansinonate)，異丹參酮(Isotanshinone)，

丹參新酮(Miltirone)等菲昆類化合物，其中隱丹參酮(Cryptotanshinonate)為抗菌的 主要成分⁽³⁹⁾，本次的研究擬對同屬不同種的三葉鼠尾(Salvia trijuga Diels)進行其 成分與藥理活性之研究。文獻上尚無關於本植物之研究，本次擬對本植物之氯仿 層，水層進行研究，期望能有活性強的成分之發現並開發為有用之醫藥品.

大葉楠(Persea japonica)為樟科常綠喬木，主要分佈於日本、南韓、台灣。

本植物於台灣主要分佈於海拔2300 公尺以上山區。研究發現其主要含有生物鹼

與木質素，且具有抗癌、抗氧化的活性^(40-45)。盧^(40-41)的研究發現了兩個主要的生 物鹼，L-(-)-N-norarmepavine 與 dl-coclaurine。其後的研究則陸續發現了一些具有 細胞毒性的木質素，如machilusol A, C, D, E 與 Linderanolide E, 以及一些具有抗 氧化活性的木質素，如(-)-acuminatin, (-)-isoguaiacin and meso-dihydroguaiaretic acid。

黃柏（Phellodendron amurense）為芸香科（Rutaceae）植物⁽⁴⁶⁾，黃柏對於麻醉 動物靜脈及腹腔注射，具有顯著持久的降壓作用。另據黃柏對於孑孓、家蠅有殺

滅作用^(47-48)。且多數黃柏內含生物鹼，以小蘗鹼（berberine），小蘗鹼在體外試驗

對於精金黃色葡萄球菌，肺炎球菌，白喉桿菌，草綠色鏈球菌，痢疾桿菌等均有

抗菌作用⁽⁴⁹⁾。此外黃柏也有清熱，燥熱，瀉火，解毒之效。治熱痢，消渴，黃疸，

痿躄，夢遺，淋濁，痔瘡便血，赤白帶，骨蒸勞熱，目赤腫痛，口舌生瘡，瘡瘍 腫毒。臨床運用於治療流行性腦脊髓膜炎，細菌性痢疾，肺炎，肺結核，肝硬化，

急結膜炎，耳部濕疹，慢性化膿性中耳炎，慢性上頷竇炎，滴蟲性陰道炎。基於 本植物之多重藥效，因而引發我們對黃柏成分及生理活性產生興趣，故著手進行 本研究，以其了解其所含有之成分及生理活性，進而達到開發新藥的目地。本植 物由過去的研究發現主要含有Berberine alkaloid、Aporphine alkaloid、Flavonoid、

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Triterpenoid、Limonoid 等^(50-68)。另一方面，為了解其它黃蘗屬植物之化學成分與 藥理性質之差異，且由於對於日本黃柏(Phellodendron japonica)的文獻報導較少，

我們擬同時進行日本黃柏葉部之化學成分研究，以利於新醫藥品之開發，並希望 能由本研究中取得更詳細之化學分類依據。

山梔子與水梔子，為茜草科植物山梔子(Gardenia jasminoides Ellis)與水梔子 (Gardenia jasminoides Ellis var. grandiflora Nakai)的果實。山梔子又名山枝子、山黃 梔、黃梔子，主產於華南一帶，水梔子又名大花梔子、馬牙梔、建梔，是梔子的 偽品，一般當色素與香料使用。具有解熱、去黃疸、鎮靜、止血、降壓、抗菌、

消炎等作用。主治濕熱性黃疸、急性傳染性肝炎、血清性肝炎、燒傷感染、發熱、

咳血、心中煩熱，夜睡不安、流行性角結膜炎，尿道炎、痔瘡熱痛等。含 gardenoside⁽⁶⁹⁾、geniposide⁽⁶⁹⁾、gardoside⁽⁶⁹⁾、crocetin⁽⁷⁰⁾、crocin⁽⁷¹⁾、crocin

glucoside⁽⁷²⁾、rutin⁽⁷¹⁾等。果皮中含熊果酸(ursolic acid)⁽⁷³⁾。藥理活性方面：(1)梔子 水或醇抽取物能促進膽汁分泌⁽⁷⁴⁾。Crocin、crocetion 及 geniposide 能促進膽汁分泌

亢進作用^{(75, 76)}。Genipin 能促進鈉離子從肝細胞到毛細膽管之輸送，而促進膽汁分

泌⁽⁷⁴⁾。(2) geniposide 在消化管內加水分解，作用於大腸產生下痢作用⁽⁷⁴⁾。對天竺 鼠離體小腸有抗乙醯膽素作用、抗毒扁豆鹼(pilocarpine)作用、抗組織胺作用、抗 serotonin 作用⁽⁷⁴⁾。(3) 有鎮靜⁽⁷⁷及抗惊^(78-80)、降溫作用^{(76, 77)}及鎮痛作用⁽⁸¹⁾。(4) 有 降血壓活性^(81-83)，低分子量成分能刺激內皮細胞增殖而修復血管內膜⁽⁸⁴⁾。(5) 梔子 水或醇抽取物對金黃色葡萄球菌、腦膜炎雙球菌、卡他球菌及多种皮膚真菌有抑

制作用^(85-87)。水煎劑能殺死鉤端螺旋体⁽⁸⁸⁾及血吸蟲成蟲⁽⁸⁹⁾。而梔子水提取物之急

毒性甚小^(81,90)，引發的過敏反應亦不明顯⁽⁷⁴⁾。為了瞭解梔子的活性與成分關係，

並評估山梔子與水梔子的可替代性，所以選擇山梔子與水梔子作為第二年的研究 題材。

台灣黃柏(Phellodendron amurense var. wilsonii Hayata et Kanehira)為芸 香科(Rutaceae) 黃蘗屬(Phellodendron)植物，東亞地區共 10 種，台灣僅此一種

(91)。自生於台灣中央山脈海拔一千八百至二千五百公尺之間，如太平山，阿里

山，翠峰等地之森林內，為落葉性喬木。黃柏對於麻醉動物靜脈及腹腔注射，

具有顯著持久的降壓作用。另據黃柏對於孑孓、家蠅有殺滅之作用。且多數黃 柏內含生物鹼，以小蘗鹼(berberine)最常見，小蘗鹼在體外試驗對於金黃色葡 萄球菌，肺炎球菌，白喉桿菌，草綠色鏈球菌，痢疾桿菌等均有抗菌作用。此 外黃柏也有清熱，燥濕，瀉火，解毒之效。治熱痢，消渴，黃疸，痿躄，夢遺，

淋濁，痔瘡便血，赤白帶，骨蒸勞熱，目赤腫痛，口舌生瘡，瘡瘍腫毒。臨床 應用於治療流行性腦脊髓膜炎，細菌性痢疾，肺炎，肺結核，肝硬化，急結膜

炎，耳部濕疹，慢性化膿性中耳炎，慢性上頷竇炎，滴蟲性陰道炎⁽⁹²⁾。基於本

植物之多種藥效及提高本省產植物之經濟價值，引發我們對台灣黃柏之化學成 分及生理活性產生興趣，故擬著手探討台灣黃柏之化學成分與藥理作用，希望 能從本植物的研究結果提供其化學成分的重要資訊且提供化學分類之依據。並 期能了解其所含有之成分及生理活性，進而達到開發醫藥資源之目的。本植物 之化學成分研究於1955 年 H. Y. Hsu⁽⁹³⁾等分離得到 berberine., 1962 年 S. T. Lu⁽⁹⁴⁾ 等由樹皮分離得到 oxyberberine, 1976 年 W. N. Wu⁽⁹⁵⁾等由樹皮分離得到

columbamine, jatrorrhizine, magnoflorine, palmatine, thalphenine, 1979 年 T. S.

Wu⁽⁹⁶⁾由樹葉分離得到 phellamurin, amurensin. 本經中將黃柏列為中品，來源多 種，本研究室以完成同屬植物台灣黃柏(Phellodendron amurense var. wilsonii Hayata et Kanehira)、淨禿黃柏( Phellodendron chinense var. glabriusculum

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Schneid )、川黃柏( Phellodendron chinense Schneid )和關黃柏((Phellodendron amurense )之葉部化學成分研究。為進一步了解台灣黃柏根部的化學成分及其化 學分類，擬進行本植物根部之化學成分與藥理活性研究。

虎頭柑(Citrus kotokan Hayata)為芸香科植物虎頭柑 Citrus kotokan Hayata 的成

熟果實，產於台灣之灌木，多栽培於新竹園圃之灌木⁽⁹⁷⁾。虎頭柑之乾燥果皮常當

作陳皮使用，用為祛風、健胃與祛痰劑。文獻記載中，陳皮性辛苦、溫。其功效 為理氣、調中、燥濕與化痰，主治胸腹脹滿、不思飲食、嘔吐嗝逆、咳嗽痰多，

亦解魚、蟹毒。而柑橘屬植物中含有的hesperidin 能使兔耳灌流量增加，可拮抗腎 上腺所引起的血管收縮；對被飼以”致血栓塞”及”致動脈粥狀硬化”的飲食的大白 鼠，能延長其存活時間。methylhesperidin 對豚鼠、家兔的腸管、氣管、子宮極大 白鼠胸部主動脈片均有鬆弛作用，但作用較弱，為papaverine 的 1/100 以下。此外，

柑橘屬植物中的furocoumarin 有抗炎作用，methylhesperidin 對微血管的通透有抑 制作用，並能防止蛇毒引起的出血，另對結紮幽門所引起的大白鼠潰瘍，有明顯 的抗潰瘍作用，與vitamin C 及 K 合用能增加其效力，口服則無效，給大白鼠腹腔 注射，迅速表現利膽作用，vitamin C 及 K 亦能增強其效力⁽⁹⁸⁾。由於長期以來致力 於活性成分之研究，且文獻中僅有兩篇報導發表虎頭柑之成分為limonene ⁽⁹⁹⁾、 xanthyletin ⁽¹⁰⁰⁾、β-sitosterol ^{(99, 100)}、stigmasterol ⁽¹⁰⁰⁾。因此為詳細探討其成分與藥 理活性之關係，而著手進行其成分分離與藥理活性測試。

另外，ㄚ啶酮衍生物多為具有生理活性的化合物，如acronycine 具有抑制 nucleoside transport 及藉由對細胞分裂的干擾而導致 binucleation 進而達到其抑制 leukemic HL-60 癌細胞的活性⁽¹⁰¹⁾。在本實驗室先前的天然物成分研究中，曾分離 得到一具有抗癌活性潛力的ㄚ啶酮衍生物(1)，因此計畫合成此一化合物(如下列 scheme) ⁽¹⁰²⁾，並測試其抗癌活性及評估其各衍生物合成的可能性，嘗試尋求發現 新的抗癌藥物。

CO2H

N OCH3 BnO

H OCH3

OCH3 O O Cu, Cu₂O

K₂CO₃ diglyme OCH3

O

O OCH3

I BnO

OCH3 CO2H NH2 +

2 3 4

SOCl₂ Py.

toluene (1)

N O

CH3 HO

OCH3

OCH3

OCH3 O

O Pd / C

H₂

N O

CH3 BnO

OCH3

OCH3

OCH3 O O CH₃I NaH / THF N

O

H BnO

OCH3

OCH3

OCH3 O

(2) piperazine, O Et 3N

(3) H + work-up 5

7 6

N O

CH3 HO

OCH3 OH

OCH3 OH OH

H⁺

1

除此之外，對於丹參屬植物的成分研究中發現的一系列的新型二萜類生物 鹼，由於其類型特殊且含量不多以致於對於藥理測試有所限制。且由於文獻上並 沒有類似的化合物的發表，因此為求能廣泛的探討此類化合物的生合成路徑、藥 理活性及其相關的光譜資料，因此擬著手於本研究中所得到的一些二萜類生物鹼 之半合成探討。合成路徑如下列scheme 所示。所得的化合物(9)、(10)與 oxazole 環上具有不同取代基的各種衍生物將可被廣泛的探討此類化合物的生合成路徑、

9

藥理活性及詳細的光譜資料。

O O O

+ EtNH₂ sealed tube C₆H₆ 130℃

O O N

O N O

+

8 9 10

四.具有抗 HIV 活性的香豆素衍生物的合成

含有camphanoyl 取代基的香豆素衍生物(11)，已經被證實具有相當高的抗 HIV 活性^{(103, 104)}。這一類化合物的合成已被廣泛的探討，並建立了產率不錯的合成

路徑^{(105, 106)}。本研究計畫利用這些合成方法，合成更具水溶性的化合物(12)及其衍

生物(13)，並測試其抗癌活性，以嘗試尋求發現新的抗癌藥物。合成路徑如下所示。

H₂N NH₂

RCOCH₂COOEt

H₂N N

H O

R

1) 3-chloro-3-methylbut-1-yne

2) N,N-diehtylaniline N N O H H

14 15 16

利用化合物(16)進一步 dihydroxylation，並接上 camphanoyl 取代基，則可得到

具有抗HIV 活性的香豆素衍生物。若進一步將 C 環上的氮原子置換成其他取代

基，則可使此類化合物更具水溶性，將更具有發展為新藥的潛力。

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三、研究方法:

研究共分二類：

(A) 成分之研究 i. 研究材料:

(a)見血封喉之成分研究

(b)Eurycoma longifolia 之成分研究 (c)三葉鼠尾之成分研究

(d)大葉楠 (e)黃柏 (f)日本黃柏

(g)山梔子及水梔子 (h)台灣黃柏

(i)虎頭柑 ii. 藥理試驗 成分研究

a：研究材料：採集或委託採集的見血封喉之樹皮、Eurycoma longifolia、三葉鼠 尾、大葉楠、黃柏、日本黃柏、山梔子及水梔子、台灣黃柏、及虎頭柑分別陰乾 後粉碎之。

b：陰乾粉碎後，再以乙醇浸泡，熱迴流萃取數次，經減壓濃縮除去溶劑，所得 之粗抽物分別以氯仿與水進行分配萃取，每次抽取之氯仿層合併於減壓濃縮下得 氯仿層抽出物，水層再與正丁醇進行分配萃取，減壓濃縮後得到較高極性的正丁 醇粗分配層及水層抽出物，分別得到氯仿層、正丁醇層及水層抽出物。

c：分離：把各分配層及抽出物分別以 SiO2，Al2O3，Florisil，Polyamide，Sephadex LH-20，G-10 或 C-18 等層析材料當固定相進行層析分離並配合 MPLC，CTLC，

Prep. TLC 和 HPLC 進行細分盡可能把各種成分(含微量成分)分離出.而高極性的 部分則利用各種逆相層析配合分離之(Sephadex LH-20，G-10，C18，C8，Diaion HP-20，Active Carbon，Cellulose， Polyamide 等)

d：構造研究：以各種光譜儀器測定(UV，IR，NMR，MS，X-ray，CD，ORD 等) 或半合成做進一步確認。

藥理試驗:

把分離得到之含量較多或構造已確定的化合物進行初步的藥理篩選研究(委託 其它研究機構測定)，包括抗癌和抗 HIV(高醫吳永昌教授,美國北卡大學李國雄教 授)、抗血小板凝集(台大鄧哲明教授)、抗心律不整(台大蘇銘嘉教授)、抗高血壓(國 防顏茂雄教授，中國醫藥學院蔡輝彥教授)、抗發炎及消腫(榮總王繼平博士)等。

採用本方法的原因：

a.成分研究：以此方法進行可以將各種成分均獲取不至於受制於傳統分離方法(如 生物鹼分離法，僅能獲得生物鹼且不含配醣體).而高極性部分逆相層析的使用亦 較貼近傳統中藥用水煎服的方法，可確實得到有用的化合物，且此等分離法均保 持在中性狀態，故植物之原成分大致上不會改變或水解，對其成分之觀點較易掌 握，且完成後較易解明其相關性。

b.藥理實驗：從粗抽取物開始追蹤各種藥理作用，較易成功的分離出活性成分，

又合成物進行藥理試驗可發現其活性而達到開發新醫藥資源的目標。

14

(B) 合成衍生物之研究 ㄚ啶酮衍生物的合成研究

依照下列scheme 合成化合物(1)，並測試化合物(1)，(5)，(6)，(7)之抗癌活性 及各衍生物合成的可能性及其抗癌活性，嘗試尋求發現新的抗癌藥物。

CO2H

N OCH3 BnO

H OCH3

OCH3 O O Cu, Cu₂O

K₂CO₃ diglyme OCH3

O

O OCH3

I BnO

OCH3 CO2H NH2 +

2 3 4

SOCl₂ Py.

toluene (1)

N O

CH3 HO

OCH3

OCH3

OCH3 O

O Pd / C

H₂

N O

CH3 BnO

OCH3

OCH3

OCH3 O O CH₃I NaH / THF N

O

H BnO

OCH3

OCH3

OCH3 O

(2) piperazine, O Et 3N

(3) H + work-up 5

7 6

N O

CH3 HO

OCH3 OH

OCH3 OH OH

H⁺

1

Salviamine 與 Isosalviamine 衍生物的合成研究

O O O

+ EtNH₂ sealed tube C₆H₆ 130℃

O O N

O N O

+

8 9 10

由研究中發現本屬植物中含有大量的二萜類化合物(丹參酮 I 與 IIA)，因此我 們推演化合物(9)，(10)與其衍生物的可能生合成路徑為由這些鄰二萜類化合物與 胺基酸經由偶合，脫酸或再氧化等反應生成。因此著手進行此類化合物之半合成。

而由文獻搜尋所發現利用phenanthraquinone 類的化合物來合成含 oxazole 環的化合 物之方法與考量試劑的取得與反應的方便性及反應條件的限制等考量，所以選擇 利用上述的流程圖，以此合成方法來合成此類的化合物。經由逆向拆解，我們發

現所分離得到的這些二萜生物鹼可以經由丹參酮I 或 IIA 與胺類衍生物反應得到。

由於丹參酮I 與 IIA 在本屬植物中的含量較為豐富，因此決定由此二化合物為起始

物進行合成。

具有抗HIV 活性的香豆素衍生物之合成

本研究計畫利用如下列流程圖所示的合成方法，合成更具水溶性的化合物(12) 及其衍生物(13)，並測試其抗癌活性，以嘗試尋求發現新的抗癌藥物。合成路徑如 下所示。

15 O

O O

O O O O

O

O O O

11 12

O

O O

O O O O

O

N N O

H H

O

O O

O O O O

O

N N O

H R

13

H₂N NH₂

RCOCH₂COOEt

H₂N N

H O

R

1) 3-chloro-3-methylbut-1-yne

2) N,N-diehtylaniline N N O H H

14 15 16

化合物(12)及其衍生物(13)可經由利用化合物(16)進一步 dihydroxylation，並 接上camphanoyl 取代基，則可得到具有抗 HIV 活性的香豆素衍生物。若進一步

將 C 環上的氮原子置換成其他取代基，則可使此類化合物更具水溶性，將更具

有發展為新藥的潛力。

四、結果與討論 A: 成分研究

1. 由見血封喉樹皮分離得到66 個化合物，其中 36 個已知化合物經光譜分析確認 其化學結構為vanillic acid, p-hydroxybenzoic acid, β-sitosterol, 2, 4,

6-trihydroxy-5-metoxyacto-phenone, 6-acetoxy-2, 4-dihydroxyacetophenone, vanillin, syringic aicd, koaburaside,

O¹-(4-acetoxy-3-methoxybenzoyl)-O²,O³,O⁴,O⁶-tetraacetyl-β-D-glucopyranose, 2,3,4,6-tetraacetyl-3,4,5,trimethoxyphenyl-β-D-glucoside, (+)-marmesin, decursinol, (R)-peucedan-ol, oxypeucedanin hydrate, periplorhamnoside, eripalloside,

strophanthidol, convallatoxal, cannogenol, strophanthidin, convallatoxin, strophathojavoside, desglucocheirotoxin, strophalloside, convalloside

glucostrophalloside, cheirotoxin, malayoside, antiarigonin, α-antiarin, antialloside, toxicarioside B, β-antiarin, uridine, xanthine, adenosine,

3-hydroxy-5-methoxy-benzalacetophenone。另外，antiarin-A、-B、-C、-D、-E、(3S,

16

4R)-hydroxymellein、anticarin-A、-B、antiaroside-A、-B、-C、-D、-E、-F、-G、

-H、-I、-J、-K、-L、-M、-N、-O、-P、-Q、-R、-S、antiarotoxinin-A、-B 及 isoflantin-A

等30 個為天然界首次分離得到的新化合物。

2. 由Eurycoma longifolia 根部分離得到 47 個化合物，經光譜分析確認其化學結構 為13β, 21-dihydroxyeurycomanol, 5α, 14β, 15β-trihydroxyklaineanone, β-sitosterol, stigmasterol, scopoletin, p-hydroxybenzaldehyde, methyl β-carboline 1-carboxylate, 4, 5-dimethoxy-canthin-6-one, eurycomalactone, 6-dehydroxylongilactone,

laurycolactone B, 6-hydroxy-5, 6-dehydro-eurycomalactone, syringic aldehyde, 9-methoxycanthin-6-one, canthin-6-one, eurylene, 2,

4′-dihydroxy-3′methoxy-acetophenone, laurycolactone A, 6α-hydroxyeurycomalactone, 10-methoxycanthin-6-one,

8-hydroxy-9-methoxycanthin-6-one, 9, 10-dimethoxycanthin-6-one, 5-methoxycanthin-6-one, fraxidin, n-pentyl β-carboline-1-propionate, 3-hydroxy-1-(4′-hydroxy-3′-methoxyphenyl)-propan-1-one, lariciresinol,

9-hydroxycanthin-6-one, 5-hydroxymethylcanthin-6-one, canthin-6-one-3N-oxide, 5-hydroxymethyl-9-methoxycanthin-6-one, 1-hydroxy-9-methoxycanthin-6-one, longilactone, 9-methoxycanthin-6-one 3N-oxide, 14, 15β-dihydroxyklaineanone, 5, 6-dehydroeurycomalactone, vanillic acid, protocatechuic acid, syringic acid,

β-sitosterol glycoside, stigmasterol glycoside, 4-hydroxy-5-methoxycanthin-6-one, β-carboline-1-pro-pionic acid, 7-methoxy-β-carboline-1-propionic acid, sodium syringate, sodium p-hydroxybenzoate, nicotinic aicd,。其中 13β,

21-dihydroxyeurycomanol, 5α, 14β, 15β-tri-hydroxyklaineanone 為天然界首次分離 得到之化合物。

3. 由 三 葉 鼠 尾 共 分 離 得 到 50 個 化 合 物 ， 經 光 譜 分 析 確 認 其 化 學 結 構 為 cryptotanshinone, tanshinone Ⅱ A, tanshinone I, methyltanshinoate, 1,2-dihydrotanshinone, miltrione, di-hydrotanshinone I, tanshinone VI , nortanshinone, dehydrotanshinaldehyde, isosalviamine-A, 6,7-dehydroroyleanone , 12-deoxy-6,7-dehydroroyleanone, salviatrinone-A, isotanshinone I, salviatrinone-B, salviatrinone-C, danshenshinkun B, tanshinlactone, salvipisone, ferruginol,

17

danshenspiroketalactone,1,2,6,7,8,9-hexahydro-1,6,6-trimethylfuro[3,2-c]naphth[2,1-e]

oxepine-10,12-dione, salviatrinone-D, salviatrinone-E, salviatrinone-F, danshenshinkun C, salvipisoate, neocryptotanshinone, 1-hydroxysalvipisone, salviatrinone-G, 1-oxosalvipisone, salviatrin-one-H, salviatrinone-I, militionone, danshen-shinkun A, salvialide A, sugiol, salviatrinone-J, 11,14-dihydroxy-8,11,13-abietatrien-7-one , abieta-8,11,13-trien-7-one, isomanool, nor-salvioside, salviatrinone-K, salviatrinone-L, salviatrinone-M, salviatrinone-N, cryptoaceta-

lide, epicryptoacetalide, isosalviamine-B。 其中 salviatrinone-A~-N 等 14 個化合物 為新化合物。

4. 由大葉楠分離得到 11 個化合物，其中 10 個已知化合物經光譜分析確認其化學 結構為 γ-eudesmol, carissone, γ -selinene, isoboldine, corytuberine,

(+)-epi-syringaresinol, ‚β-sitosterol, stigmasterol, ‚ β -sitosteryl glucoside, and stigmasteryl glucoside。另外， machikusanolide-A, machikusanolide-B,

machikusanolide-C, machikusanolide-D, machikusanolide-E, machikusanolide-F 等 6 個為首次發現的新骨架化合物；machikusanol 為天然界首次分離得到的新化合物。

5. 由黃柏葉部分離得到 30 個化合物，經光譜分析確認其化學結構為 umbelliferon，

esculetin，phellodenol A，scopoletin，demethylsuberosin，(R)-(+)-7-hydroxy-6-

（2-hydroxy-3-methyl-3-butenyl）coumarin，scoparone，xanthyletin， skimmin，

phellodenol-F，phellodenol-G，amurensin，kaempferol-3-O-β-D-galactoside，

quercetin-3-O-β-glucoside，hexandraside E，quercetin，kaempferol，

kaempferol-3-O-β-D-glucoside，phellamurin，flavaprenin 7,4′-diglucoside，

p-hydroxybenzaldehyde，methylparaben，p-hydroxybenzoic acid，anisaldehyde，methyl p-anisate， sodium（2R）3-phenyllactate，methyl caffeate， ferulic acid，lupenone，

2-acetyl-5-methoxyfuran。其中 phellodenol-F，phellodenol-G，phellodenol-H 為天然 界首次分離得到之化合物。

6. 由日本黃柏葉部共分離得到 29 個化合物，經光譜分析確認其化學結構為：

phellamurin，amurensin，quercetin，phellodensin-F，phellodensin-A，phellodensin-B，

6'''-O-acetylamurensin 等 7 個 Flavonoids 化合物； umbelliferone，scopoletin，

scoparone，columbianetin，esculetin 等 5 個 Coumarins 化合物； benzoic acid，vanillic acid，p-hydroxybenzoic acid，methylparaben，methyl p-anisate，p-hydroxycinnamic acid， methyl caffeate，methyl p-hydroxycinnamate，p-hydroxybenzaldehyde 等 9 個 Benzenoids 化合物； lupenone，3-epilupeol，friedelin，β-sitosterol 等 4 個 Triterpenoids 化合物； N-p-coumaroyl-tyramine，N-trans-cinnamoyltyramine 等 2 個 Amide 類化 合物及rutaecarpine，indole-3-carbaldehyde 等 2 個 Alkaloids 化合物。其中

6'''-O-acetylamurensin 為天然界首次分離得到之新化合物，而 columbianetin，

N-p-coumaroyltyramine，N-trans-cinnamoyltyramine，3-epilupeol 等四個化合物為本 屬植物首次分離得到。

7. 由山梔子(Gardenia jasminoides Ellis)果實共分離得到 32 個化合物，分別為

18

geniposide, genipin-gentiobioside, 6’’-p-coumaroyl genipin gentiobioside,

6’’-O-caffeoyl genipin gentiobioside, geniposidic acid, 6-methoxygeniposidic acid methyl ester, 4,7-bis-hydroxymethyl-1,4a,5,7a-tetrahydro-cyclopenta[c]pyran-1-ol, scandoside methyl ester, gentiobiosyl sufranate, 3,4-dicafferoyl quinic acid,

3-O-cafferoyl quinic acid, 3-O-cafferoyl-4-coumaroyl quinic acid,

3-O-cafferoyl-4-O-sinpoyl quinic acid, 3,4-dicafferoyl-2-(3-methylglutaroyl) quinic acid, 3-O-cafferoyl quinic acid methyl ester, octadecanoic acid methyl ester,

cis-11-octadecenoic acid methyl ester, 9,12-octadecadienoic acid methyl ester, glycerol,

D-mannitol, myo-inositol, scopoletin, β-sitosterol, stigmasterol, β-sitosterol glucoside, α-crocin, β-crocin, crocin-1, crocin-2, crocin-3, crocin-4, crocetin mono-glucosyl ester。其中 6’’-O-caffeoyl genipin gentiobioside,

4,7-bis-hydroxymethyl-1,4a,5,7a-tetrahydro-cyclopenta[c]pyran-1-ol, gentiobiosyl sufranate 為首次發現之新化合物。另外水梔子(G. jasminoides Ellis var. grandiflora Nakai)在預試驗時發現與山梔子的成分極為相近，因而著手進行山梔子與水梔子的

成分分析比較。由HPLC 層析圖可看出兩者相差不大，而其低極性成分也由 GC-MS

分析發現主要成分均為hexadecanoic acid methyl ester, 9-octadecenoic acid methyl ester, 9,12-octadecadienoic acid methyl ester, n-hexadecanoic acid,

9,12-octadecadienoic acid 及 squalene，顯示山梔子與水梔子的成分相近，應可相互

代用。由山梔子所分離得到的化合物以geniposide 為主要成分，另外也分離得到

藏紅花素α-crocin, β-crocin, crocin-1, crocin-2, crocin-3, crocin-4, crocetin

mono-glucosyl ester 等，顯示山梔子與水梔子可作為名貴藥材番紅花活性成分的替 代來源。

8. 由乾燥的台灣黃柏（Phellodendron amurense var. wilsonii）根部共分離得到 44 個化合物，其中35 個化合物確定其化學結構為 berberine, oxyberberine,

13-hydroxy-8-oxoberberine, berberrubine, chilenine, dictamnine, γ- fagarine, skimmianine, haplopine, robustine, isoplatydesmine, 1-methyl-2-dodecyl- 4(1H)-quinolone, canthin-6-one, noroxyhydrastinine, thalifoline, N-methyl-6,7- dimethoxyisoquinolone, methyl anhydroberberillate, anhydroberberillic acid, scopoletin, fraxidin, 7-geranyloxy-6-methoxy-coumarin, phellocoumarin- A, p-hydroxybenzaldehyde, methylparaben, vanillin, methyl p-hydroxycinnamate,

4-methoxy-trans-cinnamic acid, methyl ferulate, 3-hydroxy-4- methoxycinnamic acid, methyl isoferulate, 3-[p-(3-methyl-2-butenyloxy)phenyl]-1- propanol, limonin, obacunone, β- sitosterol, glyceryl 1-butcosanate。其中 phellocoumarin A 為首次報 導之新化合物，而13-hydroxy-8-oxoberberine, methyl anhydroberberillate 與 anhydroberberillic acid 則為首次從天然界分離得到之化合物。由過去的研究顯示莖 皮所含之化學成分主要有protoberberine 型生物鹼、furoquinoline 型生物鹼及 canthinone 型生物鹼。本研究結果發現根部所含之化學成分除上述生物鹼外，尚分 離得到quinolone 及 isoquinolone 型生物鹼，顯示根部所含之化學成分雖與莖皮有

部份雷同，但亦有其相異之處，兩者間無法相互代用。由berberine 開環之化合物

為首次由本屬植物得到，根據此研究成果推測，berberine 除以往之生合成路徑外，

尚有如下圖之代謝途徑，本推論之建立使berberine 之生合成途徑更加完備。

9. 將新鮮之虎頭柑果實皮部切碎，經甲醇熱迴流萃取後，共分離得到 24 個化合 物，其中21 個化合物經與文獻比對確定為 scutellerin tetramethyl ether, 4′-hydroxy-5, 6, 7, 3′-tetramethoxyflavone, 3, 5, 7, 8, 3′, 4′-hexamethoxyflavone, quercetagetin

19

hexamethyl ether, 3′, 4′, 5, 6, 7-pentamethoxyflavone, tetra-O-methylisoscutellarein, 7-hydroxy-5, 8, 3′, 4′-tetramethoxyflavone, 5-hydroxy-3, 7, 8, 3′,

4′-pentamethoxyflavone, 5, 7, 8, 3′, 4′- pentamethoxyflavone, 4′-hydroxy-3, 5, 6, 7, 3′-pentamehtoxyflavone, isomeranzin, meranzin hydrate, marnin, 5-[(6′, 7′-

dihydroxy-3′, 7′-dimethyl-2-octenyl)oxy]psoralen, nomilin, limonin, hesperidine, narirutin, methyl vanillate, β-sitosterol, 及 β-sitosteryl glucoside。另有 3 個新化合物 經光譜分析，確認為：3-hydroxy-5, 6, 7, 4′-tetramethoxy- flavone, kotokanin-A, 及 kotokanin-B。

20

見血封喉之新化合物：

R1 R2 R3 R4

CH3 OH H β-D-antiarosyl CH3 OH H β-D-glucosyl-(1→

4)- β-D-antiarosyl CH2OH H H β-D-glucosyl-(1→

4)- α-L-rhamnosyl CHO OH H α-L-rhamnose CHO OH H β-D-glucosyl-(1→

4)- α-L-rhamnosyl COOH H H α-L-rhamnose COOglc. H H α-L-rhamnose COOglc. OH H ^H

COOH OH H α-L-rhamnose COOH OH OH α-L-rhamnose

R 1

O O

OH R 2

R₄O

R 3

O O

O

OH

OH O

R 4

R 1 R 2 R 3

O O

O

OH

OH O

O OH

R 1 = R 2 = R 3 = R 4 = H

R ₁ = , R ₂ = OH , R ₃ = OCH₃ , R ₄ = H R 1 = , R 2 = OCH3 , R 3 = OCH3 , R 4 = H R 1= , R 2 = OH , R 3 = OCH3 , R 4 =

O

O O

OH OO

OH HO

OH CH2OH

O HO

OH H3CO

OH O O

OH O OH

CH3

21

COOH OH OH β-D-antiarose OH OH H α-L-rhamnose OH OH H β-D-antiarose OH OH OH α-L-rhamnose OH OH OH β-D-antiarose H OH H α-L-rhamnose

H H H α-L-rhamnose

OH OH H β-D-antiarose

Eurycoma longifolia 之新化合物：

HO OH

OH HO CH₂OH

CH3

OH OH O

O O OH

O OH

OH OH

O O

HO OH

OH HO

OH HO HO

OH

O OH

OH

O O

OH

CH₂OH OH

OH HO O

OH

OH

O OH O

22

三葉鼠尾之新化合物：

大葉楠之新化合物：

O O

OH

O

O O

O

O O

O

O OH

OAc

O

O OH

O O

O

O OH

O O

O

O O O

O O

O H

COOCH₃

O O

O H

COOCH₃

O

O O OHO

O O

O O

O O

O

O O

23

大葉楠之新骨架化合物：

黃柏葉部之新化合物：

日本黃柏葉部之新化合物：

O O

HO HO

OH

OOH glcO O O

CH₂OH

O O

HO glcO

OH HOCH₂(CH₂)₈

O

OH

OH H

OH HOCH₂(CH₂)₈

O

OH

OH H

OH CH₃(CH₂)₈

O

OH

OH H

OH CH₃(CH₂)₈

O

OH

OH H

OH CH(CH₂)₇

O

OH

OH H

H₂C

OH CH(CH₂)₇

O

OH

OH H

H₂C

O

O OH

OH O

OH O

OH OH OH

AcOH₂C

24

山梔子之新化合物：

台灣黃柏根部之新化合物：

虎頭柑之新化合物：

O

Odiglc

O

OH OH

HO

O COOCH₃

O

HO glc glc O

O

OH OH

O O

H₃CO

O

OCH₃

O

O N

OCH₃

OCH₃ O

HO

O

O N O

H₃CO O

O

OCH3

OCH₃

O

O N O

HO O

O

OCH₃

OCH₃

O

O OCH₃ H₃CO

H3CO

OCH₃

OH

O O

H₃CO

O

O

O O

O

O OH

OH

OH OH

25

Minutes

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Volts

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

Volts

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Detector A - 2 (254nm)

GJE-M-W GJE-M-W001

Detector A - 2 (254nm) GJE-W-W GJE-W-W001

圖 山梔子與水梔子的 HPLC 分析圖

N⁺ OH^-

OCH3 OCH3

berberine (1) O

O N

OCH3 OCH3

8-oxyberberine (2) O

O OH N

OCH3 OCH3 O

O O

N

OCH₃ OCH3 O

O O

oxidation

epoxidation O

13-hydroxy-8-oxoberberine (156) N

OCH3 OCH3 O

O O

HO N

OCH₃ OCH3 O

O O

HO HO

oxidative cleavage

O

O N O

HO O

O

OCH3

OCH3

anhydroberberillic acid (168) methylation

O

O N O

H₃CO O O

OCH3

OCH3

methyl anhydroberberillate (167) solvation

hydration dehydration

圖 berberine 之代謝途徑