行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告
轉殖 proteinase inhibitor II 基因增進水稻之抗蟲能力
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計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC91-2313-B-002-322-執行期間： 91 年 08 月 01 日至 92 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學農藝學系暨研究所 計畫主持人： 劉麗飛 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢中
華
民
國 92 年 5 月 29 日
轉殖 proteinase inhibitor II 基因增進水稻之抗蟲能力
Pr oteinase Inhibitor II Gene Tr ansfer to Rice
Plants for Insect Resistance
計畫編號：NSC 91-2313-B-002-322
執行期限：91 年 8 月 1 日至 92 年 7 月 31 日
主持人：劉麗飛 國立台灣大學農藝系
計畫參與人員：周書旭 國立台灣大學農藝系
一、 中文摘要 本 計 畫 的 目 標 是 將 馬 鈴 薯 塊 莖 PinII（proteinase inhibitor）基因，轉殖到 水稻中。以期干擾水稻害蟲的生長發育， 增加水稻的抗蟲能力。目前利用農桿菌法 轉殖到水稻品種台農 67 號及台梗 9 號，水 稻台農 67 號及台梗 9 號已進行四次轉殖， 其中兩次轉殖皆是利用台農 67 號，已得到 七個獨立的轉殖水稻系統（T0），轉殖效 率為 1.88%、0.03%，其他的材料正在進行 水稻植株再生的過程。得到的轉殖株已進 行 PCR 測定，初步確定轉殖結果，正進行 Southern 鑑定。另一方面，利用 BAPNA 測定轉殖株葉片的 PI 活性，其 PI 活性比 未轉殖株約高 3.5 ~ 9 倍。 關鍵詞：水稻、基因轉殖、PI 基因、抗蟲。 Abstr actIn this project, proteinase inhibitor II (pinII) gene, from potato tuber, were
transferred to rice plant for increasing the
insect resistant ability of rice plant. PinII
gene was driven by its original PinII
promoter, which causes gene expression only when plant is attacked by insects, therefore will not interfere the plant normal growth. The constructed gene was transferred to rice TNG67 and TK9 by Agrobacterium method.
At present transformation has been done four times. Seven independent T0 lines were
obtained from TNG67. More T0 lines will be
obtained soon. PI activities of each T0 plants
were detected by BAPNA method and showed 3.5 ~ 9 folds higher than that of non-transgenic plants.
Keywor ds: Rice, Gene transfer, Proteinase inhibitor (PI), insect resistant
二、緣由與目的 水稻為亞洲地區最主要的糧食物，但 蟲害對水稻的產量與品質都造成極大損失 過去多以化學性藥劑來控制蟲害，易對環 境及消費者健康造成威脅；而傳統抗蟲育 種過程繁復漫長，因此目前已利用基因轉 殖的方法來快速選育抗蟲新品種（1,2）。早期 轉殖是利用 Bacillus thuringiensis (Bt) 基 因，並且已經推出轉殖商業品種。但是 Bt 易使害蟲產生具抗性的新小種，並可能危
害人体健康，因此目前已改為轉殖
proteinase inhibitor(PI)基因(3)。PI 可抑制昆
蟲的內臟腔蛋白質分解酵素的活性，造成 昆蟲體內某些必需胺基酸的缺乏，使生長 發育受限包括進食習慣、生長速度、世代 數等等(3,4,5,6)。但並不會完全殺死昆蟲而使篩 選壓力過大，產生新的抗性小種。是植物 本身天然的優良抗蟲基因。此蛋白質經加 熱後即受破壞，因此可避免轉殖基因對生 態環境及人類健康的影響。由文獻顯示， 已有愈來愈多轉殖不同種類 PI 基因的轉殖 菸草、馬鈴薯、蕃茄、萵苣等作物(7,8,9,10)。 因此本計畫的目標是嘗試轉殖馬鈴薯塊莖 pinII 基因，構築係利用 PinII 本身的啟動 子，使其在受昆蟲攻擊時大量表現，以免 影響水稻之正常生長。轉殖方法擬採用農 桿菌法以期提高基因表現效率，轉殖水稻 擬繁殖至 T4代，各世代分別進行轉殖基因 鑑定，PI 活性分析，及抗蟲測試等，預期 此項研究真正可以應用於育種程序中，得 到抗蟲的水稻優良新品種。 三、結果與討論 本計畫執行至今已經完成質體構築 並進行四次轉殖。在轉殖質體方面已構築 好在雙偶體 pCAMBIA1300， pin 基因 則採用其本身之啟動子，其特點為受 wounding 調控，避免影響水稻之正常生 長；pin 基因兩側不加或加入 MAR(matrix attachment region)序列，預期 MAR 序列將
可控制單一拷貝基因插入水稻染色体組， 並提高基因表現量。此外篩選基因採用 hygromycin 抗性。共計構築兩種質體，其 中 pJDW25 不含 MAR 序列，質體大小約 12Kb，pJDW25M 含 MAR 序列，質體大 約 14kb，質體構築示於圖一。 圖一、 PinII 基因質體構築 基因構築完成後即進行農桿菌殖，係 採用水稻胚誘導之癒合組織，與農桿菌共 培養後再將農桿菌殺死清除，癒合組織則 以 hygromycin 進行篩選，得到之抗性癒合 組織移到分化培養基誘導植株再生，此為 轉殖株 T0世代。目前已針對水稻品種台農 67 號及台梗 9 號等進行四次轉殖，其中兩 次轉殖利用台農 67 號已得到 7 個獨立的轉 殖水稻系統(T0)。轉殖效率1.88％以及 0.03 ％（表一），目前正努力轉殖中，以得到更 多轉殖株。T0水稻已盆栽種植於溫室中， 生長情況正常，並已開始採收 T1種子。 表一、 水稻轉殖 PinII 基因之篩選結果 品種 感染 癒合 組織 數目 抗Hyg 的癒合 組織 轉殖 系的 數目 轉殖 植株 數目 a 轉殖 效率 (%) PJDW25 (TNG67) 212 72 4 9 1.88 pJDW25 (TK9) 242 98 0 0 0 PJDW25 (TNG67) 852 218 3 3 0.03
a 轉殖效率= 轉殖系的數目 / 感染癒合組織數目 得到的 T0轉殖株分別針對轉殖的 PinII 基因進行 PCR 測定，初步已確認轉 殖結果，目前正進行各世代的 Southern 測 定，以便鑑定轉殖基因拷貝數及遺傳穩定 性。另一方面，利用 BAPNA 測定轉殖株 葉片的 PI 活性。未轉殖株的葉片 PI 活性 平均 0.15 ug/mg-protein，而轉殖株的 PI 活性約高出未轉殖株約 3.5 ~ 9 倍，其中 H2 的 PI 活性最高可達 1.04 ug/mg-protein (圖二) 。 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 TN G6 7 D1 D3 D4 D5 E1 E2 F1 G1 H1 H2 P IN ( u g/ mg -pr o te in ) 圖二、 轉殖水稻葉片 PI 活性測試 四、計畫成果自評 本計畫進行順利，已完成基因構築， 且利用農桿菌轉殖法，將質體轉殖於水稻 台農 67 號及台梗 9 號品種中，但因台梗 9 號轉殖效率不如台農 67 號，目前只得到台 農 67 號轉殖株，分別具有不同的 PI 活 性，部分植株已收到 T1種子。此外正努力 改善培養條件以提高台梗 9 號轉殖效率， 預期將可得到更多轉殖株。 五、參考文獻
1. Estruch J, Carozzi NB, Desai N, Duck NB, Warren GW, Koziel MG. 1997. Transgenic plants : An emerging approach to pest control. Nature Biotech 15, 137-141.
2.Girard C, Le Metayer M, Bonade-Bottino M, Pham-Delegue MH, Jouanin L. 1998. High level of resistance to proteinase inhibitors may be conferred by proteolytic cleavage in beetle larvae. Insect Biochem Mol Biol 28, 229-37.
3. Gutierrez-Compos R, Torres-Acosta JA, Saucedo-Arias LJ, Gomez-Lim MA. 1999. The use of cysteine proteinase inhibitors to engineer resistance against potyviruses in transgenic tobacco plants. Nat Biotechnol 17, 1223-6.
4. Koiwa H, Bressan RA, Hasegawa PM. 1997. Regulation of protease inhibitors and plant defense. Trends in Plant Sci 2, 379-384.
5. Mu HM, Liu SJ, Zhou WJ, Wen YZ, Zhang WJ, Wei RX. 1999.
Transformation of wheat with insecticide gene of arrowhead proteinase inhibitor by pollen tube pathway and analysis of
transgenic plants. I Chuan Hsueh Pao 26, 634-42
6. Pechan T, Ye L, Chang YM, Mitra A, Lin L, Davis FM, Williams WP, Luthe DS. 2000. A unique 33-kD cysteine proteinase
accumulates in response to larval feeding in maize genotypes resistant to fall armyworm and other lepidoptera. Plant Cell 12, 1031-40.
7. Schuler TH, Poppy GM, Kerry BR. 1998.
Insect-resistant transgenic plants. TIBTECH 16, 168-75.
8. Tamayo MC, Rufat M, Brovo JM, San Segundo B. 2000.Accumulation of a maize proteinase inhibitor in response to wounding and insect feeding, and characterization of its activity toward digestive proteinases of
Spodoptera littoralis larvae.
9. Urwin PE, McPherson MJ, Atkinson HJ. 1998.Enhanced transgenic plant resistance to nematodes by dual proteinase inhibitor constructs.Planta 204, 472-9.
10. Yeh KW, Lin MI, Tuan SJ, Chen YM, Lin CY, Kao SS. 1997.Sweet potato (Ipomoea batatas) trypsin inhibitors expressed in transgenic tobacco plants confer resistance against Spodoptera litura. Plant Cell Reports 16, 696-699.
