產能厭氧菌群高通量定量分析平台

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行政院國家科學委員會補助專題研究計畫

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成 果 報 告

□期中進度報告

產能厭氧菌群高通量定量分析平台 計畫類別：■ 個別型計畫 □ 整合型計畫 計畫編號：NSC 97－2211－E－006－038－MY3 執行期間： 97 年 08 月 01 日至 100 年 07 月 31 日 計畫主持人：吳哲宏 助理教授 共同主持人：曾怡禎 副教授 計畫參與人員： 徐茂軒、陳薇羽 成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：■精簡報告 □完整報告 本成果報告包括以下應繳交之附件： □赴國外出差或研習心得報告一份 □赴大陸地區出差或研習心得報告一份 ■出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份 □國際合作研究計畫國外研究報告書一份 處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、列管計畫及下列 情形者外，得立即公開查詢 □涉及專利或其他智慧財產權，□一年□二年後可公開查詢 執行單位：國立成功大學環境工程學系 中 華 民 國 99 年 07 月 08 日

中文摘要

一項稱為階層寡核甘酸引子延伸(Hierarchical Oligonucleotide Primer Extension, HOPE)新型定性定量分子生物技術的成熟發展，使複雜環境生物樣本中微生物社群結構 可以進行高通量的分析。本研究為了建立HOPE 分析甲烷菌群結構的高通量平台，針對 目前已知31 屬之甲烷菌的 16S rRNA 序列分成三大類進行核甘酸引子設計，經測試與最 佳化實驗條件成功獲得12 組不同階層專一性的引子。然後，測試 9 種處理工業廢水的厭 氧污泥，結果顯示Methanosarcinales 目的甲烷菌群的 16S rRNA 基因豐富度佔所有古細 菌的65.9%以上，以中溫型的 Methanosaeta、Methanosarcina 以及 Methanomethylovorans 分別為不同系統中主要優勢的甲烷菌群。本研究發展的HOPE 分析平台可有效地提供反 應槽厭氧污泥中甲烷菌群結構的定性定量分析，此技術可應用於研究不同厭氧生物環境 中甲烷菌的生態。 關鍵字: 甲烷菌、定量分析、階層引子延伸、微生物社群分析

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英文摘要

In this study, a newly developed molecular method called hierarchical oligonucleotide primer extension, HOPE was optimized to qualitatively and qualitatively analyze methanogenic Archaea in the sludge from anaerobic reactors treating industrial wastewaters. In total, twelve oligonucleotide primers with specificity at the various hierarchical levels were designed and successfully applied in the HOPE assays to detect the methanogens frequently observed in the anaerobic sludge. The results showed that the detected methanogens by the developed HOPE assay could cover an abundance of at least 65.9% in the domain Archaea present in 9 different sludge samples. It was further observed that the methanogenic populations in the order Methanosarcinales were highly abundant, in which members in the genera of (mesotrophic) Methanosaeta、Methanosarcina or Methanomethylovorans were the predominant methanogenic populations in the respective anaerobic sludge from bioreactors. The HOPE assay can provide fast analysis for the methanogens in engineered ecosystems and may be applicable for samples from other environments.

Keywords: Methanogens, Quantitation, Hierarchical Oligonucleotide Primer Extension, Microbial Community Analysis

一、 前言

在厭氧環境甲烷菌利用有機物降解過程之代謝產物如氫氣或乙酸產生甲烷，常與其 他厭氧菌群形成共營(syntrophic)的生態而影響有機物的分解效率，因此監測甲烷菌的菌 群結構與菌群大小有助於提升厭氧處理程序的效能。近二十年來，分子生物技術的成熟

發展，提供快速分析甲烷菌群多樣性的平台。例如反應槽污泥樣本提取總DNA 後，利

用聚合酶鍊鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)複製 16S rRNA 標記基因，然後建立 選殖基因庫(cloning library)並進行親緣樹之分析，序列鑑定結果可得知污泥中主要菌群 的身分；根據已有或自行建立的基因序列資料庫設計寡核酸引子或探針，進行螢光原位 雜合(Fluorescence in situ Hybridization)或即時定量聚合酶鍊鎖反應(real-time quantitative PCR)等定量分析，可測定污泥中特定菌群的豐富度 (圖 1)。然而，生物樣本進行選殖基 因庫分析時需要消耗相當多的人力與時間，雖然提供微生物基因序列訊息，但不適用於 大量樣本數的研究。不僅如此，目前普遍用於菌群定量之分生技術亦存在專一性不足、 分析通量偏低等缺點。因此，發展簡易、快速及高通量之定性定量分析技術是必要的。

最近，一項稱為階層寡核甘酸引子延伸(Hierarchical Oligonucleotide Primer Extension, HOPE)[1]的新型定性定量方法被開發出來，發展成為高通量環境菌群之分析平台。此方 法的分析原理是根據16S rRNA 基因序列資訊，針對多種微生物分類階層設計不同長度 之專一性寡核甘酸引子，在含有帶不同螢光染劑的雙去氧核甘酸(dideoxynucleotides)溶液 的DNA-聚合酶熱循環反應過程，當引子黏合至互補 DNA 序列後，聚合酶將只能延伸出 一個螢光性鹼基，因此酵素反應能非常專一性地根據目標基因序列進行引子的標籤化， 然後利用DNA 定序儀測定產物中含有螢光性鹼基的引子種類與螢光強度，測得的多階 層引子種類代表目標菌群的親源資訊；根據階層引子的螢光強度，則進一步可計算目標 菌群之相對豐度[2]。當 HOPE 實驗操作條件完成最佳化後，只需要不到一天的分析時 間，即可了解環境樣本中目標菌群之身分與不同階層下的相對豐度(圖 1)。 本研究主要目的是發展適合厭氧生物反應槽中甲烷菌群定性定量的HOPE 分析方 法。我們先針對生物系統中已知普遍存在之甲烷菌群設計不同階層之寡核酸引子，並進 行實驗條件的最佳化，然後以九種生物反應槽污泥中之甲烷菌群為對象，測試HOPE 分 析方法的可行性。 Universal approach Sample DNA

extraction PCR Cloning and sequencing

Qualitative analysis

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二、 材料與方法

2.1 樣本收集與污泥 DNA 萃取

本研究收集9 種處理工業廢水的厭氧污泥，包含來自處理對苯二甲酸廢水之實廠

UASB (3)、處理紙廠廢水之實廠 UASB (1)、處理 LCD 廢水之實廠 UASB(4)、以及處理 對甲基苯甲酸之實驗室規模反應槽。污泥經過清洗、酵素消化及冷凍解凍後以酚-氯仿法

萃取DNA，然後以酒精沉澱法回收 DNA[3]。

2.2 聚合酶鍊鎖反應 (Polymerase chain reaction, PCR)

每一PCR 反應液含 1 到 50ng 之 genomic DNA、1x 緩衝液、0.8mM 之 dNTP、2.5U

之DNA polymerase (Takara)及引子對 A109F (5’-ACKGCTCAKTAACACGTGGG-3’)及

1492R(5’- AAGTGGTAACAAGGTARCCGTA-3’)，PCR 程式包含 20 到 25 個熱循環，於 95℃下將 DNA 變性 90 秒，接著引子黏合溫度為 52℃反應 60 秒，最後引子延伸反應於 72℃作用 90 秒(TProfessional Standard Gradient 96, Biometra)。

2.3 HOPE 階層引子

首先，從silva 網站下載甲烷菌 16S rRNA 序列資料庫(http://www.arb-silva.de/)，然後

利用軟體ARB 設計不同階層甲烷菌之專一性引子。在此所設計之引子黏合長度皆控制

在17~22 nt，G/C 比例為 50%到 65%。為增加引子的分離效率，在某些引子的 5’端增加

長度不超過24 nt 的無意義序列以改變其在電泳中的移動性。

2.4 階層寡核甘酸引子延伸技術(Hierarchical Oligonucleotide Primer Extension, HOPE)

每一HOPE 反應液總體積為 5μl，其中包含 2.5μl 的 SNaPshot premix 試劑 (Applied

Biosystem)，1 ng 的 DNA 模板及 15 pmol 的混合引子，其中 SNaPshot premix 含有 AmpliTaq DNA polymerase、緩衝溶液及螢光標記之 ddNTP。HOPE 熱循環之程序為 20 個循環之變 性反應(95℃，10 秒)，引子黏合(60℃，20 秒)，引子延伸(72℃，30 秒)。在引子延伸反

應之後，接著加入1U 的 shrimp alkaline phosphatase (Roch Applied Science, Germany)，於

37℃培養 60-90 分鐘，並於 75℃培養 10 分鐘中止反應[1]。

2.5 毛細管電泳

適當稀釋HOPE 之產物混和 0.3μl 之 Gene Scan Liz size leader (Applied Biosystem)及

10 μl 的 Hi-Di formamide (Applied Biosystem)後，即進行毛細管電泳片段分析，包含變性 (60℃)、樣本注射(2.1 kV, 40 s)及毛細管電泳分離 (15 min)，所得螢光訊號以儀器配備之

軟體GeneMapper 進行分析。

2.6 HOPE 產物相對豐富度之計算

延伸引子之濃度關係，如下： 其中Cq為未知被延伸引子之濃度，Cstd為已知標準品被延伸引子之濃度。 校正因子(C.Fa-b)為利用參考菌株之 PCR 產物所得之引子 A 與引子 B 螢光強度之比 值，Aa代表被延伸引子A 之螢光強度(波鋒面積)，Ab代表被延伸引子B 之螢光強度。 三、 結果與討論 3.1 階層寡核酸引子設計 根據16S rRNA gene 資料庫，目前已被分離出之甲烷菌群分類為五個目，分別為

Methnobacteriales、Methanococcales 、Methanomicrobiales 、Methanosarcinales 及 Methanopyrales，這些甲烷菌只能利用單碳、乙酸、氫氣等簡單基質，並廣泛存在於高溫 極端環境、底泥、土壤、動物與昆蟲腸胃道及環工生物反應槽中，其中除了在 Methanosacinales 的成員中有可利用醋酸、甲酸及甲基團之甲烷菌外，在其他目的甲烷菌 群皆只能利用氫氣、二氧化碳與甲酸等基質。在本篇研究，針對厭氧生物反應槽中之常 見之甲烷菌群進行偵測。 在厭氧生物反應槽中，必須有甲烷菌之存在才能避免氫氣及醋酸的累積，以維持發 酵反應之效率。常見利用氫氣的甲烷菌群通常是在Methanomicrobiales 及 Methanobacteriales 兩個目下，而 Methanosarcinales 目則有常見的利用醋酸之甲烷菌群。 本研究針對Methanosarcinales 目及 Methanomicrobiales 目的甲烷菌設計 12 組專一性引 子。設計之引子將甲烷菌群分為三個階層，第一層所有之古細菌，第二層為目，第三層 為屬，HOPE 分析時分成兩個引子套組，第一組(tube1)專門針對 Methanosarcinales 目及 以下的屬進行偵測，第二組(tube2)則針對 Methanomicrobiales 目及以下的屬的甲烷菌分

析。第一組有七組引子，包含ARC911-mod、MSMX859-mod、MS537-mod、MML419、

MX802、MXM407 及 MXT390-mod，分別偵測古菌界、Methanosarcinales 目、

Methanosarcina、Methanomethylovorans、Methanosaeta 屬、以及在 Methanosaeta 屬的中

溫型及高溫型兩群。另一方面，第二組分別以引子Arc911-mod、MG1197-mod、

F2SC660-mod、SMPP1252-mod、GMG266 及 F3SC979-mod 偵測古菌界、

Methanomicrobiales 目、Methanoculleus、Methanoplanus 及 Methanolacina 、

Methanogenium 及 Methanofollis 屬的成員。在設計引子時，將非目標菌群之錯位配對的

7 圖 2 HOPE 定性定量分析甲烷菌群的階層引子設計 3.2 HOPE 平台最佳化 利用參考菌株之PCR 產物為模板，進行兩引子套組中分別六至七組引子的最佳化， 其中包括專一性測試、靈敏度測試及多通量分析最佳化，結果如圖3。如圖顯示，每個 引子都可正確延伸出與設計相符的螢光顏色，螢光強度亦足夠，有相當好的偵測靈敏度， 且每個波峰皆可分離且互無干擾，代表多通量分析之可行性，由此可知，所設計之引子 套組可有效偵測不同階層之甲烷菌群。 1000 2000 3000 4000 b SMPP1252‐mod MG1197‐mod GMG266 F3SC979‐mod F2SC660‐mod ARC911‐mod 1000 2000 3000 4000 a MSMX859‐mod MML419 MX802 MXM407 MXT390‐mod ARC911‐mod MS537‐mod Fig. 3 (a)引子套組 1 利用標準品進行波峰之分離及螢光強度測試。(b)引子套組 2 利用 標準品進行波峰之分離及螢光強度測試。

3.3 以 HOPE 實測厭氧污泥甲烷菌群結構 在定性偵測方面，在9 種厭氧污泥樣本中皆偵測到屬於 Methanosacinales 目的甲烷菌 群，屬於Methanomicrobiales 目的成員則在反應槽中皆佔 15.4 % 以下。文獻中指出，反 應槽中利用氫與甲酸之甲烷菌群主要被分類在Methanomicrobiales 目及 Methanobacteriales 目，然而只有在少數的反應槽中可以偵測到少量的 Methanomicrobiales 目的甲烷菌[5]。以 HOPE 定量分析取自處理工業廢水反應槽 9 種厭氧污泥的結果顯示， 本研究設計的引子所偵測厭氧污泥中的甲烷菌群佔古細菌16S rRNA 基因數量的 65.9 % 以上，分析結果如圖4 顯示。根據在階層目之分析結果，HOPE 定量數據顯示 Methanosarcinales 目是厭氧污泥中絕對優勢的甲烷菌，其豐富度佔了古細菌 16S rRNA 基因數量6%~98%，但利用氫氣之 Methanomicrobiales 目並沒有被偵測到，這表示反應 槽中多為利用含甲基單碳化合物及乙酸之甲烷菌群，其他利用氫氣或甲酸之甲烷菌群則 為少數。 對苯二甲酸製程廢水之有機組成多為乙酸及苯環類化合物，其實廠UASB 的處理功 能相當良好，廢水TOC 去除率可達 79%以上，且污泥已呈顆粒化型態；處理對甲基苯 甲酸之實驗室規模反應槽之植種污泥來自對苯二甲酸製程廢水實廠UASB，厭氧污泥在 以對甲基苯甲酸為單一碳源的情況下亦有很好的TOC 去除率。在這些系統的厭氧污泥 中，優勢的Methanosarcinales 目之甲烷菌群數量有 81%以上是 Methanosaeta 屬的成員， Methanosaeta 為利用乙酸當作單一碳源產生甲烷之甲烷菌屬，多優勢於操作良好系統之 顆粒化汙泥[6]。 另一方面，取自LCD 廢水之實廠 UASB_B 系統，污泥中的 Methanosarcina 屬的甲烷菌 卻佔Methanosarcinales 目總 16S rRNA 基因數量的 93.7%以上。文獻中指出

Methanosarcina 屬多存在於連續攪拌式反應槽(continuously stirred-tank)中[7]，鮮少優勢

於UASB，但在此兩個反應槽中卻看到不同之情況，這可能是因為 Methanosarcina 屬的

細胞生長速率較 Methanosaeta 屬的快速，而且其可利用之基質種類也較為廣泛(如甲酸、 氫氣或含胺基單碳化合物)；在此系統的進流 LCD 廢水中主要成分是四甲基氫氧化銨 (tetramethylammonium hydroxide, TMAH)，可能是造成污泥中 Methanosarcina 屬甲烷菌 數量上優勢的原因之一。

再者，在另一個LCD 廢水之實廠 UASB_A 的處理系統，污泥中優勢甲烷菌群卻截然不

同。其中一個樣本中Methanosacinales 目的甲烷菌佔古細菌 16S rRNA 基因數量的 77.1

%，但 Methanosarcinales 目中的 Methanosaeta 屬只佔 49.3%，HOPE 分析結果並未偵測 的其他屬的甲烷菌如 Methanosarcina 或 Methanomethylovorans，這顯示了剩下 50.7%的

9 Methanosaeta 屬的豐富度卻只佔 Methanosarcinales 目的 66.2%，其他厭氧污泥常見之甲 烷菌屬皆無法被偵測到，所以在紙廠UASB 顆粒污泥尚存在 34.8%的甲烷菌屬是超出本 研究所設計的引子可偵測範圍。另外，處理對苯二甲酸廢水之實廠UASB 污泥樣本中也 有類似的情形，例如，污泥中46.6%的 Methanosaeta 屬成員為中溫型，剩下的 53.4%之 Methanosaeta 屬成員可能是未被鑑定種，無法被引子偵測到。由於現有公開基因庫中缺 乏相關的序列資料，為了解這些未知之甲烷菌群，應進一步深入研究。 四、 初步結論 本研究初步建立厭氧生物反應槽污泥中甲烷菌群快速定性定量的分析方法，HOPE 分析法可以有效、專一地快速偵測污泥樣本中甲烷菌群之相對豐富度。分析9 個污泥樣 本結果顯示了83%之甲烷菌群都是在 Methanosarcinales 目的成員，以 Methanosaeta、 Methanosarcina、Methanomethylovorans 三個屬的菌群分別在不同厭氧污泥系統中佔優

勢，且HOPE 分析結果可知紙廠廢水之實廠 UASB 顆粒污泥與 LCD 廢水之實廠 UASB_A

處理系統污泥可能含有超出本研究偵測範圍的Methanosarcinales 菌群。未來，除了這些 甲烷菌，我們將增加偵測嗜氫甲烷菌群的引子數目，以及HOPE 分析法可應用於各類廢 水系統甲烷菌群之監測分析。 0 20 40 60 80 100 1 2 3 4 5 6 7 8 9 R el a ti v e A b u n d a n ce (% ) Sample MX MS859 MG1197 0 20 40 60 80 100 1 2 3 4 5 6 7 8 9 R el a ti v e A b u n d a n ce (% ) Sample MX802 MXM407 MXT390-mod MS537-mod MML419 a. b. 圖4 針對 Methanosarcinales 目設計之引子組分析 9 種污泥樣本之結果。(a)以偵測古細 菌之ARC911-mod 為參考引子，獲得的 Methanosarciales 目之甲烷菌群相對豐富度；(b) 以偵測Methanosarcinales 目之 MSMX859-mod 為參考引子，獲得的甲烷菌群數量佔 Methanosarcinales 目之相對豐富度。樣本 1 為處理紙廠廢水之實廠 UASB 污泥；2、3 為 處理LCD 廢水實廠 UASB_A 不同日期採樣之污泥，4、5 為處理 LCD 廢水之實廠 UASB_B 不同日期採樣之污泥；6、7、8 為處理對苯二甲酸廢水之實廠 UASB 顆粒污泥，9 為處 理對甲基苯甲酸之實驗室規模反應槽污泥。 五、 工作目標執行情形及差異分析 本研究計畫自九十八年執行一年後，已完成環境樣本及甲烷生成菌標準菌株收集，

並進行DNA 的萃取，續以 PCR 複製樣本中微生物之 16S rRNA 基因。接著，在九十九 年度經過一年的執行，針對31 屬的甲烷菌，設計不同的核酸探針，進行 HOPE 此技術 平台之最佳化，其中包括核甘酸引子專一性測試、多通量分析最佳化及靈敏度測試，最 佳化完成之兩套引子組亦成功應用於9 個污泥樣本的分析，實際進度符合預定進度之要 求。 六、 參考文獻

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7. 徐茂軒，發展一套甲烷生成菌群定性定量之新型分生技術，成功大學碩士論文，台

南，2010。

8. 吳哲宏、徐茂軒、曾怡禎，利用階層寡核甘酸引子延伸(HOPE)技術定性定量分析石 化廢水厭氧生物處理系統中甲烷菌群結構，第13屆海峽兩岸環境保護研討會，重慶， 四月23-25，2010。