行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中精簡報告
多不飽和脂肪酸之純化與結構脂質之合成(2/3)
計畫類別： 個別型計畫
計畫編號： NSC91-2214-E-011-008-
執行期間： 91 年 08 月 01 日至 92 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣科技大學化學工程系
計畫主持人： 朱義旭
報告類型： 精簡報告
處理方式： 本計畫可公開查詢
中 華 民 國 92 年 5 月 12 日
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多不飽和脂肪酸之純化與結構脂質之合成(2/3) Pur ification of Polyunsatur ated Fatty Acids
And Synthesis of Str uctur ed Lipid 計劃編號： NSC 91-2214-E-011-008 執行期限 91 年 8 月 1 日至 92 年 7 月 31 日
主持人：朱義旭 執行機構：臺灣科技大學 單位名稱：化工系
計劃中文摘要：
本計畫第二年研究主要是以脂解酵素催化之酯化反應濃縮由第一年計畫經兩 階段低溫溶劑法所得 93.9%之 GLA。結果發現在以脂解酵素 Lipozyme IM 催化下 進行與正丁醇之選擇性酯化反應時，可將 GLA 含量提昇至 99.1%。此選擇性酯 化反應之回收率為 81.6%，是以總回收率（兩階段低溫溶劑法加上選擇性酯化反 應）為 72.8%。
關鍵詞：選擇性酯化反應、GLA、琉璃苣油
Abstr act ：
In the 2nd year project, FFA that contains 93.9% GLA (obtained from saponified borage oil by two-stage low temperature solvent crystallization) was subjected to selective esterification reaction with n-butanol catalyzed by immobilized lipase Lypozyme IM. Under optimum conditions, GLA content can be raised from 93.9%
to 99.1% with a corresponding recovery of 81.6% (total recovery 72.8%).
Keywor ds：Selective Estification、GLA、Borage Oil
計劃的緣由與目的：
近數十年來濃縮 PUFA 的方法最主要的有尿素包埋法（Wanasundara and Shahidi, 1999）、 超臨界流體萃取法（Walker et al., 1999）、高效能液相層析法（Yamamura and Shimomura, 1997）、硝酸銀溶液萃取法(Teramoto et al., 1994)及酵素反應法
（Shimada et al., 1997）等。本計劃第一年採用兩階段低溫溶劑結晶法，濃縮皂化 琉璃苣油所得 FFA 中的 GLA，可將 GLA 由 23.4%提高至 93.9%，回收率達 86.0%。
Rahamatullah et al. (1994)經由酵素催化選擇性酯化反應，可將琉璃苣油所含之 GLA 提升到約 90%。要得到含高純度 PUFA 的 FFA 或甘油酯，常需多個酵素反 應串聯進行(Shimada et al. 1998; Shimada et al. 1997)，除反應步驟多、產率低之 外，也常存在酸及酯之分離問題。Shimada et al. (1998)以酵素反應（包括水解及 兩次酯化反應）、短徑蒸餾及尿素包埋等串聯之程序，將含 45.1%GLA 之 FFA 純 化至 GLA 含量達 98.6%，但是回收率只有 49.4%。本研究（第二年計畫）以第一 年計畫研究所得含 93.9%GLA 之 FFA 為基質，利用 Lipozyme IM 脂解酵素催化 FFA 與正丁醇之酯化反應，目的是得到高純度之 GLA (> 99%) ，同時得到高回收 率。
實驗步驟
選擇性酯化反應：
將經低溫濃縮所得富含 GLA 之 FFA 與正丁醇溶於己烷中，配成 FFA 與丁醇濃 度都是 100 mM 之己烷溶液。在反應溫度下預熱 30 分鐘後，加入 20 mg Lipozyme 進行反應，在不時間取樣，以 GC 分析產物脂肪酸之組成。
反應產物中脂肪酸(FFA)之組成：
1. 取 100 µL 上層液，加入 100 µL 含 20 mM tridecanoic acid (C13:0)之己烷溶液作 內標準物及 400 µL 1 N 之 KOH 將脂肪酸轉化成脂肪酸之鉀鹽。
2. 將上述溶液振盪、離心後，取 200 µL 下層水溶液，加入 100 µL 12N HCl 還原 FFA。加入己烷將 FFA 萃取至己烷相。
3. 將溶液離心，取 200 µL 上層己烷溶液。以氮氣吹乾後，加入 100 µL 氯仿及 100 µL TMSH 試劑。於 50℃下反應 2h 將 FFA 轉化成 FFA 之甲基酯後，取 1 µL 注 入 GC 分析脂肪酸之組成。
結果與討論 醇鏈長之影響：
以脂解酵素催化選擇性酯化反應來濃縮 FFA 中之 GLA 時，最常使用之醇為正 丁醇及月桂醇。在有機溶劑下，酯化反應速率常隨一級醇碳數之增加而減少。醇 鏈長對選擇性酯化反應之影響如圖一所示，若使用丁醇，在反應 40 分鐘時，GLA 含量可達 99.1%，回收率達 81.6%。
圖一 FFA 與醇之選擇性酯化反應時，醇鏈長對 GLA 含量及回收率之影響。反應條件：Lipozyme IM = 20 mg，溫度 = 37℃，FFA conc. = Alcohol conc. = 100 mM，溶劑 = 己烷，反應體積 = 5 mL，
轉速 = 600 rpm，己烷及醇均先以分子篩除水。(□,■) = Ethanol，(○,●) = 1-Butanol，(△,▲) = 1-Hexanol，(▽,▼) = 1-Octanol，(◇,◆) = 1-Decanol，(☆,★) = 1-Dodecanol。空心符號：GLA content，實心符號：GLA yield。
溫度之影響：
圖二為溫度對酯化反應之影響，由結果可知 GLA 含量達 99%所需時間以 37℃
0 20 40 60 80 100 120
92 93 94 95 96 97 98 99 100
GLA recovery (%)
GLA content (area%)
Reaction time (min)
30 40 50 60 70 80 90 100
95 96 97 98 99 100
GLA content (area%)
60 70 80 90 100
GLA recovery (%)
4
時為最短，且此時回收率為最高，可達 81.6%。
圖二 FFA 與丁醇之選擇性酯化反應時，溫度對 GLA 含量及回收率之影響。反應條件除溫度及 醇為丁醇外，其餘條件與圖一相同。(□,■) = 25℃，(○,●) = 37℃，(△,▲) = 50℃。空心符號：
GLA content，實心符號：GLA yield。
溶劑之影響：
由圖三可知，以己烷為溶劑時，GLA 之含量為最高且所需之反應時間最短。
回收率則以在極性最低之異辛烷(Log P = 4.5)中最低，己烷次之，其餘溶劑則差 異不大。
圖三 FFA 與丁醇之選擇性酯化反應時，溶劑對 GLA 含量及回收率之影響。反應條件除醇為丁醇 及溶劑不同外，其餘條件與圖一相同。(□,■) = Isooctane (Log P = 4.5)，(○,●) = Hexane (Log P
=3.5)，(△,▲) = Xylene (Log P = 3.1)，(▽,▼) = Toluene (Log P = 2.5)，(◇, ◆) = Benzene (Log P = 2.0)。空心符號：GLA content，實心符號：GLA yield。
丁醇濃度之影響：
如圖四所示，在反應時間為 40 分鐘、丁醇濃度 100 mM (butanol/FFA = 1/1 mol/mol)時，可得最高 GLA 含量(99.1%)，但是回收率卻為最低(81.6%)。
圖四 FFA 與丁醇之選擇性酯化反應時，丁醇濃度對 GLA 含量及回收率之影響。反應條件除醇 為丁醇、丁醇濃度及反應時間為 40 min 外，其餘條件與圖一相同。□：GLA content，■：GLA yield。
水含量之影響：
酵素與水分子間之非共價作用力如靜電力、疏水性作用力及氫鍵等，使得酵 素分子具有催化功能之構形，故酵素必須有水以維持其活性(Rupley and Careri 1991)。圖五為以 Lipozyme 脂解酵素催化選擇性酯化反應來濃縮 FFA 中之 GLA 時，起始含水量對 GLA 含量及回收率之影響。由結果可知，在反應 40 分鐘時，
0 20 40 60 80 100 120
92 93 94 95 96 97 98 99 100
GLA content (area%)
Reaction time (min)
20 30 40 50 60 70 80 90 100
GLA recovery (%)
50 100 150 200 250
95.0 95.5 96.0 96.5 97.0 97.5 98.0 98.5 99.0 99.5 100.0
GLA content (area%)
Butanol concentration (mM)
75 80 85 90 95 100
GLA recovery (%)
溶劑及醇事先均以分子篩除水可得最佳之 GLA 含量及產率。
圖五 FFA 與丁醇之選澤性酯化反應時，起始水含量對 GLA 含量及回收率之影響。除水含量及 醇為丁醇外，其餘反應條件與圖一相同。 (□,■)=分子篩除水，(○,●) = 1% H2O w/w (水重/反 應物重)，(△,▲) = 2% H2O w/w，(▽,▼) = 3% H2O w/w。空心符號：GLA content，實心符號：
GLA yield。
表一為皂化琉璃苣由油所得 FFA，經兩階段低溫溶劑結晶法濃縮後，再經選 擇性酯化反應後 FFA 之組成。經兩階段低溫溶劑結晶法濃縮，可將皂化琉璃苣 油所得 FFA 中之 GLA 由 23.4%提升到 92.1%，回收率為 89.3%；再經選擇性酯 化反應後，GLA 濃度可達 99.1%，回收率達 81.6%。兩階段低溫溶劑結晶法加上 選擇性酯化反應之總回收率仍高達 72.8%。
結論
將以第一年研究所得含 93.9%GLA 之 FFA 為基質，利用 Lipozyme IM 脂解酵 素催化 FFA 與正丁醇之酯化反應，可將 GLA 提昇至 99.1%，回收率達 81.6%。
是以結合第一及第二年之研究結果，可將皂化琉
表一 Borage Oil-FFA 濃縮前及濃縮後的脂肪酸組成
Content (area%) Fatty Acid
FFAIa FFAIIb FFAIIIc
16:0 10.34±0.14 0.07±0.01 0.04±0.01
18:0 3.61±0.03 0.02±0.01 0.02±0.01
18:1 15.89±0.06 1.05±0.04 0.09±0.02 18:2 37.28±0.08 6.71±0.13 0.65±0.12 GLA 23.35±0.07 92.09±0.13 99.13±0.15
0 20 40 60 80 100 120
92 93 94 95 96 97 98 99 100
GLA recovery (%)
GLA content (area%)
Reaction time (min)
30 40 50 60 70 80 90 100
6
20:1 4.25±0.05 0.06±0.13 0.06±0.01
22:1 3.16±0.16 NDd ND
24:1 2.12±0.09 ND ND
GLA
recovery (%) - 89.28±1.20 81.58±2.20
Overall GLA
recovery (%) 89.28±1.20 72.83±1.97
a: 琉璃苣油皂化所得之 FFA。
b: FFAI 經兩階段濃縮後之 FFA。第一階段濃縮：溶劑 = 氰化甲烷，溶劑 = 250 mL，FFA = 4 g，
貯存時間 = 48 h，操作溫度 = -40℃。第二階段濃縮：溶劑 = 30%氰化甲烷 + 70%丙酮，溶劑
= 110 mL，FFA = 1 g，貯存時間 = 24 h，操作溫度 = -80℃。
c: FFAII 經選擇性酯化反應後所得之 FFA。反應條件：Lipozyme IM = 20 mg，溶劑 = 己烷(以分 子篩除水)，丁醇 = 100 mM (以分子篩除水)，FFA = 100 mM，溫度 = 37 ℃，反應體積 = 5 mL，
轉速 = 600 rpm，反應時間 = 40 min。
d: not detected.
璃苣油所得 FFA 中之 GLA 由 23.4%提昇至 99.1%，回收率達 72.8%。
參考文獻
Rahmatullah, M.S.K.S., V.K.S. Shukla and K.D. Mukherjee, J Am. Oil Chem. Soc., 71, 563-567 (1994)
Rupley, J.A. and G. Careri, Adv. Protein Chem., 3, 37-172 (1991)
Shimada, Y., A. Sugihara, H. Nakano, T. Kuramoto, T. Nagao, M. Gemba and Y.
Tominaga, J. Am. Oil Chem. Soc., 74, 97-101 (1997).
Shimada, Y., A. Sugihara, Y. Minamigawa, K. Higashiyama, K. Akimoto, S. Fujikawa, S. Komemushi and Y. Tominaga, ibid, 75, 1213-1217 (1998).
Teramoto, M., H. Matsuyama, N. Ohnishi, S. Uwagawa and K. Nakai, Ind. Eng.
Chem. Res., 33, 341-345 (1994).
Walker, T. H., H. D. Cochran and G. J. Hulbert, J. Am. Oil Chem. Soc., 76, 595-602 (1999).
Wanasundara, U. N. and F. Shahidi, Food Chem. 65, 41-49 (1999).
Yamamura, R. and Y. Shimomura, J. Am. Oil Chem. Soc., 74, 1435-1440 (1997)
計劃成果自評
本計畫為三年期計畫之第二年，主要目的是利用脂解酵素催化之酯化反應將第一 年研究所得 FFA 中之 PUFA 提高至 90%以上。截至目前(五月初)為止，除了亞麻 油中濃縮 ALA 尚未達成預定目標(>90%)之外，從琉璃苣油中濃縮 GLA 及從單 細胞油中濃縮 AA（或 DHA）效果都很好。GLA 及 AA（或 DHA）之純度分別 可達 99%及 95%，且回收率都超過 70%。第一年及第二年計畫之成果已發表一 篇，另一篇已被接受：
Ju, Y.H. and T.C.Chen “High purity γ-linolenic acid from borage oil fatty acids’, J.
Am. Oil Chem. Soc., 79,1, 29-32 (2002)
Vali, S.R., H.Y. Sheng, and Y.H. Ju* “An efficient method for the purification of Arachidonic acid from fungal single-cell oil (ARASCO)”, J. Am. Oil Chem. Soc., accepted
