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行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告
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居住於台灣之中國人其 CYP3A4 基因多樣性之發生率：於使用 Nifedipine 及 Simvastatin 之臨床運用（2/2）
Population Incidence of Genetic Polymorphism in CYP3A4 among Chinese People Living at Taiwan: Clinical Application in Usage of Nifedipine and Simvastatin.
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計畫類別：□個別型計畫 □整合型計畫 計畫編號：NSC 90-2314-B-006-092
執行期間：90 年 08 月 01 日至 91 年 7 月 31 日
計畫主持人：賴明亮 共同主持人：
計畫參與人員：黃金鼎、林敏雄、吳達仁、游新、盧豐華、張智 仁、
陳志弘、劉秉彥
本成果報告包括以下應繳交之附件：
□赴國外出差或研習心得報告一份
□赴大陸地區出差或研習心得報告一份
□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份
□國際合作研究計畫國外研究報告書一份
執行單位：國立成功大學附設醫院神經部
中 華 民 國 91 年 10 月 22 日
行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
居住於台灣之中國人其 CYP3A4 基因多樣性之發生率：於使用 Nifedipine 及 Simvastatin 之臨床運用（2/2）
Population Incidence of Genetic Polymorphism in CYP3A4 among Chinese People Living at Taiwan: Clinical Application in Usage of Nifedipine and Simvastatin.
計畫編號：NSC 90-2314-B-006-092
執行期限：90 年 8 月 1 日至 91 年 7 月 31 日
主 持 人：賴明亮 醫師 成大醫學院 神經學科 計畫參與人員：
一、中文摘要
單 點 基 因 多 樣 性 (single nucleotide polymorphisms, SNPs) 是造成個體間用藥 差異的主要原因。不論是在新藥開發或藥 物臨床治療的觀點上，個體間藥物代謝基 因多樣性的差異將會導致個體間對藥物產 生不同的藥效反應，是 pharmacogenomics 的重要課題。CYP3A 是 P450 (CYP) 家族 中最重要的次家族，它佔整體肝臟 CYPs 30%、胃腸道的 70%，與約 60% 臨床用藥 的代謝相關聯。人體中最重要的 CYP 基因 為 CYP3A4 、 CYP3A5 、 CYP3A7 以 及 CYP3A43。其中最為重要的 CYP3A4 主分 佈 於 小 腸 中 ， 為 人 體 腸 道 中 最 主 要 的 CYP ， 同 時 也 是 媒 介 最 多 藥 物 代 謝 的 酵 素，大約包含 40 %的臨床用藥。臨床藥物 治 療 中 預 先 瞭 解 這 些 用 藥 個 體 者 之 CYP3A4 基因的多樣性，再決定其藥物治療 策略與劑量，即能避免嚴重的副作用、達 到預期的治療效果，也能避免醫療資源不 當的浪費。計劃中，我們收集了 610 位國 人個體樣本，抽取其 genomic DNA，在服 用降壓劑 Nifedipine (Adalat) 及降血脂劑 Simvastatin (Zocor)，的中風患者群中我們 也分離其血清，且建立專一性篩選 CYP3A4 及 CYP3A5 重要 SNPs 之 oligo-DNA 微陣 列 晶 片 (oligo-DNA microarray) 平 台 技 術。我們欲將運用這一生物晶片在這 610 位國人個體樣本進行檢測，藉此瞭解居住 於台灣之中國人其 CYP3A4 基因多樣性。
關鍵詞：細胞色素 P450、基因多樣性、
Nifedipine (Adalat)、Simvastatin (Zocor) 、 生物晶片
Abstr act
Single nucleotide polymorphisms, SNPs are important cause of the interindividual variability in drug use. From the process of drug discovery or treatment of view, such variation in population can result in clinically significant differences in drug toxicities and response. Human cytochrome P450s (CYPs) are large superfamily that plays a vital role in the biotransformation of variety of xenobiotics as well as endobiotics. The CYP3A subfamily composed of CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, and CYP3A43 in humans is of special importance because it accounts for as much as 30% of total liver and 70% of gastrointestinal tract cytochrome P450 content. In this project, we anticipate that understanding the most important SNPs and incidence of the CYP3A4 gene polymorphism. Using a large collection of 610 human blood samples and oligonucleotide DNA microarray, we use these methods by a wide margin screen these SNPs and will rapid to obtain an individual genetic profile of CYP3A4 polymorphism among Chinese people living at Taiwan.
Moreover, it may provide information useful to the selection of dosage regimen for an individual and clinically treatment.
Keywor ds: CYP3A4, Polymorphism, Nifedipine (Adalat), Simvastatin (Zocor), Biochip
二、緣由與目的
瞭解國人 CYP3A4 基因多樣性之發生 率，不論是在新藥開發過程或臨床藥物治 療中都是十分必要的。新藥開發過程中，
勢必經過初步的人體試驗階段，所以預先 瞭解這些自願受試者們藥物代謝相關基因 的基因型態 (genetic profile) 顯得額外重 要，如此一來才能正確性的評估其藥物的 療效與毒理反應。甚至還需要在不同族群 間進行同樣的藥物評估工作，確實的將基 因多樣性 (polymorphisms) 的因素考量進 去。所以，針對媒介 40%臨床藥物代謝機 制的 CYP3A4 [1] 運用 SNPs 微陣列晶片 藉其高效率、能大規模與相當的精確性來 達到此一目的是我們的主要目標。藥物治 療仍佔臨床治療上的百分之七十，而現今 大部 份的 用藥 依據 仍多以 trial-and-error 的模式進行，通常都無法在第一次就達到 最佳的治療效果，對於劑量的判定上仍以 體重、年齡或體表面積概略性的加以評 估，往往忽略是因為這些個體存有基因多 樣性以致對藥物產生不同藥效反應的原 因，所以始終都無法在這些存有基因多樣 性的個體上精確性的發揮藥物最佳效果。
不但可能錯失這些個體的第一治療時機，
亦 造 成 許 多 醫 療 資 源 不 當 的 浪 費 。 在 oligo-DNA 微陣列生物晶片的應用之下，讓 我們可以在短時間內窺探這些個體相當多 的基因 SNPs，對於他們在臨床用藥上將有 莫大的幫助，甚至可以免除掉許多繁雜的 TDM (therapeutic drug monitoring)。臨床藥 物治療中預先瞭解這些用藥個體者之藥物 代謝相關基因的基因型態再決定其藥物治 療策略與劑量，即能避免嚴重的副作用、
達到預期的治療效果，也能避免醫療資源 不當的浪費。我們欲將這一個生物晶片充 份的運用到臨床檢測上且成為我們篩檢與
釐清國人 CYP3A4 基因多樣性個體重要的 有力工具。運用這個生物晶片來檢測那些 藥物常規治療無效的個體將可以解釋出其 治療失敗的原因，藉此亦能瞭解那一些 CYP3A4 SNPs 才是造成這些特異體質個體 對藥物代謝產生差異的主要因素。更深入 瞭解國人 CYP3A4 基因多樣性之發生率將 有助於藥物發展的應用以及臨床治療策 略，藉此提升國人的用藥品質。
此外，早期對於 CYP3A4 的個體差異 研究，都一直無法得到很直接的證據，甚 至被認為個體間並沒有基因多樣性存在。
直到近年來多方面的研究後，已有越來越 多的 SNPs 被證實，有分怖於調控區的 [2]，也有我們在中國人族群編碼區中所發 現的 [3]。在另一方面，CYP3A 基因家族 的表現一般被認為主要受制於轉錄層次 (transcriptional level) ， 包 括 alternative splicing，transcription factor regulation (如 SXR) 等，所以CYP3A 基因家族的活性是 整體表現後所呈現的結果 [4]，包括主要的 CYP3A4 及 CYP3A5，所以除了 CYP3A4 的基因多樣性之外，CYP3A5 與 SXR 的基 因多樣也仍須受到關注。至今已有三例 SXR 的基因多樣性被描述 [5]，但經原論文 的實驗證實後發現其表現並不影響 CYP3A 這些酵素的正常反應。但在 CYP3A5*3C 的 例子中，已有文獻證實這個位於 intron 3 剪 接位置的 A/G SNP 是造成 95% Caucasian 個體、73%中國人個體、71%日本個體、70%
韓國個體及 23% African American 個體呈 現 low expressors (LE) 的 主 要 原 因 [6]。所以我們也將 CYP3A5*3C 的基因多 樣性收入實驗中，排除並瞭解個體 CYP3A5 代 謝 的 影 響 性 藉 以 正 確 判 定 個 體 真 受 CYP3A4 基因多樣性的影響評估。
三、結果與討論 1. 樣本收集工作
在個體基因庫的建立上，我們收集 610 名 國人個體 20 c.c.的全血，抽取 genomic DNA 庫存之，以供應後續檢測。此外，在服用 降血壓劑 Nifedipine (Adalat)及降血脂劑 Simvastatin (Zocor)的中風患者群中我們也
已分離其血清，分析其體內藥物濃度，以 待訂定基因型態後對照解釋使用。屆時這 些受試者其 CYP3A4 基因的重要 SNPs 及 CYP3A5*3C 將被加以檢測分型。
2. Oligo-DNA 微陣列晶片
為了訂定 CYP3A4 基因型 (genotyping) 的方便性我們目的將 CYP3A4 基因重要的 SNPs，而先以 CYP3A4*4 及 CYP3A5*3C 為例，將這些 SNPs 以 3 端對偶基因專一性 引 子 (3’-allele-specific primer) 點 製 於 nylon membrane 為固體載體的載體上形成 immobilized primer [7,8]，在適當的黏合溫 度 與 DNA polymerase (lack 3’ to 5’
exonuclease active) 存在及 dNTP (為標定 訊號 來源) 為材料下進行引子延展反應 (primer extension)，藉由 3’端對偶基因專一 性引子高度特異的與模板股配對的正確性 與否及有無訊股或訊號之強弱來斷定其基 因型，其訊號來源我們選擇放射線同位素 (如 alfa-[32P] dATP) 來標定之。藉由微陣列 晶片分析的大規模性、高效率性、相當的 準確性、分析速度快、一次實驗就可獲得 整體性數據與使用樣品及試劑少等特性，
我們將運用這個研發出的 SNPs 微陣列晶 片在 610 個體上進行 CYP3A4 基因多樣性 的篩檢。此外也因為有越來越多的 CYP3A4 SNPs 陸續被證實出來，超出原本計畫開始 時所預測的個位數 SNPs，直至目前為止至 少已有 23 例的 CYP3A4 SNPs 被明確的證 實 [9]。所以在篩選工作上將呈現倍數性的 增加，這也是必須藉由 Oligo-DNA 微陣列 晶片進行篩選工作的原因，能在一晶片上 同時判定越多的 CYP3A4 SNPs 將更有助於 完成 610 位個體的篩檢工作。計劃執行過 程中，我們已針對專一性篩選 CYP3A4 及 CYP3A5 重要 SNPs 之 oligo-DNA 微陣列晶 片 (oligo-DNA microarray) 平台技術建立 完 整 ， 更 藉 由 我 們 曾 篩 選 出 的 基 因 型 CYP3A4*4 A/A 及 A/G，CYP3A5*3C A/A、
A/G 及 G/G 已確定此技術的準確性與可行 性。
(1) 標定訊號與晶片載體
螢光物質如 Cy-3 (green)、Cy-5 (red)
是目前最常見的標定材質，其偵測限制 (detection limits) 約為 3.6x107 copy [10]，必 須以 glass slide 為載體，其 immobilized primer 的量相較於 nylon membrane 為載體 的 array 約少 3-5 倍量，需要藉用螢光掃瞄 器 來 判讀數據 (如 GenePixTM)。呈 色 法 (colorimetric) 如 beta-gal 其偵測限制約為 3.5x107 [11]。放射線同位素 (radio-isotope) 如 alfa-[32P] dATP、alfa-[33P] dATP 其偵測 限 制 約 為 2.5x107 [12] ， 也 以 nylon membrane 為載體，再藉由 Imaging Plate (IP) 在 image system (如 FLA-5000、Typhoon 9410) 呈 像 後 判 讀 結 果 或 以 X-ray film autoradiographic 執行之。在標定訊號上我 們選用偵測限制最佳的放射線同位素來達 到 我 們 標 定 的 需 求 ， 載 體 材 質 選 用 superaldehyde 之 nylon membrane (UltraBindTM)。合成 3 端對偶基因專一性引 子的同時，我們將每個引子的 5 端接上 (CH2)6-NH2 的 修 飾 ，以便能共價鍵結於 Superaldehyde 之載體上形成 Oligo-DNA 微 陣列晶片，屆時 immobilized primer 是以直 立式在載體上 (圖一)，更能增加對偶基因 專一性引子與模板股間的雜交反應。
(2) 3 端對偶基因專一性引子的設計 限定長度約 70mer，Tm 值在 65~70
‘C，針對一 SNPs 以 10 個 3 端對偶基因專 一性引子來檢測之 [13,14]，這些引子包括 sense 與 antisense 兩方向，也有充當 positive control (如第 1、6 號引子) 與 negative control (即 mismatch primer) 者，也有具 reconfirmation 的引子存在 (如第 3、5、8、
10 號) (圖二)，最重要的是這些 3 端對偶基 因專一性引子可能因自行的折疊或互補而 形成 self-priming 的結果，這些引子將會造 成偽陽性反應 (pseudo positive) 大大干擾 SNPs 的檢測判定，所以必須先進行一組 blank test 先排除掉這些容易 self-priming 之 引子 (圖三) 。一 SNP 以十個 3 端對偶基 因專一性引子來檢測即能部分性的克服這 些問題，如 sense 方向引子容易 self-priming 則尋求 antisense 方向引子來彌補。
(3) Oligo-DNA 微陣列晶片產製過程
將 20 uM (約 1x1013) 合成好 5 端接有 (CH2)6-NH2 修飾之 3 端對偶基因專一性引 子 ( 約 70mer Tm 值 68’C) 加 上 等 倍 modified microarray tracking buffer (5 mg/ml filtered bromophenol blue 3ml、100%
glycerol 2ml、500 mM EDTA 20ul、100%
DMSO 4ml、H2O up to 10 ml) 總體積約 15 ul，將各個不同 SNPs 引子分裝於 96 或 384 well plate，以 diameter 200-500 um、pitch 400-1000 um 在 BioSpotTM Arrayer (Digital Gene) 點製晶片。初點製完成的晶片須經 7% casein (in 1X PBS) 與 NaBH4 solution (50 mg NaBH4 in 15ml PBS and 5ml EtOH) 在室溫環境與 UltraBindTM membrane 形成 共價結合反應後方才完成。
(4) Oligo-DNA 微陣列晶片品質判定 TdT label，藉著 terminal transferase 並 加 入 任 一 種 hot dNTP ( 常 用 dATP 或 dUTP，因酵素對其標定效率較佳) 為材料 在 37’C 反應 30 分鐘再 70’C inactive 10 分 鐘後即能將訊號壘接於 immobilized primer 之 3 端上 (約可標定上 100-200 mer)，通常 能用來判斷先前引子濃度的換算或打點過 程的品質是否良好 (圖四)。
(5) 複 合 式 PCR 增 幅 反 應 (Multiplex-PCR)
為增加樣本檢測的效率與方便性，我 們 也 發 展 每 個 基 因 的 multiplex-PCR 方 法，能在一次 PCR 反應中獲取多數的片段 [15]，以減少 PCR 反應的次數也可以減少 DNA polymerase 的開銷。Multiplex-PCR 一 般能穩定的做到 6 個 plex，就是能在一次 PCR 反應中同時增幅出 6 段預得的基因片 段，其困難度在於引子與引子之間不當的 相互雜交問題 (cross hybrid)，所以預先篩 選能一同進行 PCR 反應的引子是相當重要 的，除了能事先運用電腦軟體 (如 oligos) 來 預 測 引 子 間 的 相 互 情 形 之 外 ， trial-and-error 的預試驗仍是可行方法，但 容易耗費不少試劑。相對之下如果能有越 多的引子供選擇與組合則可能可以增加更 多成功的機率。
(6) 超長 PCR 增幅反應 (extra long PCR) 本計劃主要以 CYP3A4 為主偵測對 象，因為它即牽涉到約 40%的臨床用藥，
是藥物代謝基因中最受重視的一環；然而 CYP3A 次家族的成員間 (如 CYP3A4 與 CYP3A5) 的 基 因 序 列 相 似 度 極 高 ( 達
~80% identiy)，所以必須謹慎的設計引子，
避免增幅到其他非預期的同家族他基因。
我們尋求超長 PCR 增幅反應 (extra long PCR) 來避開這些問題，利用市售超長 PCR 增幅反應專用之 DNA polymerase 能增幅出 將 近 >30kb 之 片 段 ( 如 rTth DNA polymerase XL, ABI)。如以CYP3A4 為例，
基 因 經 超 長 PCR 增 幅 反 應 準 確 的 將 CYP3A4 約 27kb 片段增幅出來 (亦將模板 股達增幅效果)，再經 ApoI 及 NspI 限制 酵素在此 27kb 片段中切下形成片段化反應 (fragmention)平均片段為 300 bp 左右且不 影響 SNPs 存在部位，如此同時解決了避免 同家族中他基因相互干擾、一次 PCR 容括 所以預檢測之 SNPs、模板股事先達增幅 (>1x1015) 及模板股小片段化的問題 (設計 如圖五)。
(7) CYP3A4*4 基因型檢測 (見圖六) 根據先前發表論文，我們在 120 位中 國 人 族 群 中 以 SSCP 技 術 結 合 autosequencing 確認所篩選到之CYP3A4*4 (352 A to G, I118V change) SNP ，除了 A/A 野 生 型 之 外 ， 我 們 亦 篩 選 到 A/G 的 heterologous 個體，所以也利用這些個體樣 本 進 行 Oligo-DNA 微 陣 列 晶 片 primer extension 檢測反應。上圖中為已知其基因 型態個體再經微陣列晶片確認分析的結 果，在 blank test 組中可以發現 CYP3A4*4 晶片上的 sense 方向第 2 引子及 antisense 方向第 7 引子會有 self-priming 情形，但其 它 3 端對偶基因專一性引子尚能準確性的 將基因型態鑑別出來 (如 A/G type 之第 4,5,9,10 點訊號較 A/A 為強)。所以同樣的，
會有 self-priming 情形之 3 端對偶基因專一 性引子將被移除在檢測 CYP3A 基因型的
晶片上，藉由其他引子來檢定 CYP3A4*4。
(8) CYP3A5*3C 基因型檢測 (見圖六) 根據先前研究，我們以 PCR-RFLP 方 法 預 在 中 國 人 族 群 瞭 解 CYP3A5*3C (6981A to G intron 3 splicing site defect) 分 怖情形的實驗裡，篩選到 CYP3A5*3C SNP 的三種基因型，所以先利用這些個體樣本 進 行 Oligo-DNA 微 陣 列 晶 片 primer extension 檢測反應。上圖中為各個已知其 基因型態個體再經微陣列晶片確認分析的 結 果 ， 在 blank test 組 中 可 以 發 現 CYP3A5*C 晶片上的 sense 方向 3 端對偶基 因專一性引子會有 self-priming 情形 (詳見 實驗方法)，但其 antisense 方向之 3 端對偶 基因專一性引子將能準確性的將基因型態 鑑別出來。所以會有 self-priming 情形之 sense 方向 3 端對偶基因專一性引子將被移 除在檢測 CYP3A 基因型的晶片上，只藉由 antisense 方向引子來檢定CYP3A5*3C。
四、計畫成果自評
計畫中，我們共收集了 610 位國人個 體樣本，建立了其 genomic DNA 庫並在服 用 Nifedipine 及 Simvastatin (受 CYP3A 所 代謝) 的中風患者群中分離其血清偵測其 藥物血中濃度供基因檢測後數據對照使 用。能瞭解 CYP3A4 及其他相關基因 (如 CYP3A5) 的基因型態 (genetic profile)，不 論是在藥物發展過程或臨床藥物治療中都 是十分必要的。我們也已建立專一性篩選 CYP3A4 及 CYP3A5 重 要 SNPs 之 oligo-DNA 微 陣 列 晶 片 (oligo-DNA microarray) 平台技術。我們欲將這一個生 物晶片充份的運用到臨床檢測上且成為我 們篩檢與釐清國人個體差異重要 SNPs 的 有力工具。運用這個生物晶片來檢測那些 藥物常規治療無效的個體，將可以解釋出 其治療失敗的原因。最終目標為將 SNPs 晶片廣泛應用於藥物發展以及臨床治療 上，開發出可以個體化用藥的工具及新藥 品投與的技術。
五、參考文獻
[1] Shimada T, Yamazaki H, Mimura M, Inui Y, Guengerich FP. Interindividual variations in human liver cytochrome P450 enzymes involved in the oxidation of drugs, carcinogens and toxic chemicals. J.
Pharmacol. Exp. Ther. 1994; 270: 414-23.
[2] Rebbeck TR, Jaffe JM, Walker AH, Wein AJ, Malkowicz SB. Modification of clinical presentation of prostate tumors by a novel genetic variant in CYP3A4. J. Natl. Cancer.
Inst. 1998; 90: 1225-9.
[3] Hsieh KP, Lin YY, Cheng CL, Lai ML, Lin MS, Siest JP, Huang JD. Novel mutations of CYP3A4 in Chinese. Drug Metab. Dispos. 2001; 29(3): 268-73.
[4] Marth G, Yeh R, Minton M, Donaldson R, Li Q, Duan S, Davenport R, Miller RD, Kwok PY. Single-nucleotide polymorphisms in the public domain: how useful are they?
Nat. Genet. 2001; 27(4): 371-2.
[5] Zhang J, Kuehl P, Green ED, Touchman JW, Watkins PB, Daly A, Hall SD, Maurel P, Relling M, Brimer C, Yasuda K, Wrighton SA, Hancock M, Kim RB, Strom S, Thummel K, Russell CG, Hudson JR Jr, Schuetz EG, Boguski MS. The human pregnane X receptor: genomic structure and identification and functional characterization of natural allelic variants. Pharmacogenetics 2001; 11(7): 555-72.
[6] Hustert E, Haberl M, Burk O, Wolbold R, He YQ, Klein K, Nuessler AC, Neuhaus P, Klattig J, Eiselt R, Koch I, Zibat A, Brockmoller J, Halpert JR, Zanger UM, Wojnowski L. The genetic determinants of the CYP3A5 polymorphism.
Pharmacogenetics 2001; 11(9): 773-9.
[7] Erdogan F, Kirchner R, Mann W, Ropers HH, Nuber UA. Detection of mitochondrial single nucleotide polymorphisms using a
primer elongation reaction on oligonucleotide microarrays. Nucleic Acids Res 2001; 29(7):
E36.
[8] Pastinen T, Raitio M, Lindroos K, Tainola P, Peltonen L, Syvanen AC. A system for specific, high-throughput genotyping by allele-specific primer extension on microarrays. Genome Res 2000;10(7):1031-42.
[9] http://www.imm.ki.se/CYPalleles/
updated 16 Aug. 2002.
[10] Schena M, Shalon D, Heller R, Chai A, Brown PO, Davis RW. Parallel human genome analysis: microarray-based expression monitoring of 1000 genes. Proc Natl Acad Sci U S A 1996; 93(20): 10614-9.
[11] Chen JJ, Wu R, Yang PC, Huang JY, Sher YP, Han MH, Kao WC, Lee PJ, Chiu TF, Chang F, Chu YW, Wu CW, Peck K.
Profiling expression patterns and isolating differentially expressed genes by cDNA microarray system with colorimetry detection.
Genomics 1998; 51(3): 313-24.
[12] Bernard K, Auphan N, Granjeaud S, Victorero G, Schmitt-Verhulst AM, Jordan BR, Nguyen C. Multiplex messenger assay:
simultaneous, quantitative measurement of expression of many genes in the context of T cell activation. Nucleic Acids Res 1996; 24(8):
1435-42.
[13] Huber M, Mundlein A, Dornstauder E, Schneeberger C, Tempfer CB, Mueller MW, Schmidt WM. Accessing single nucleotide polymorphisms in genomic DNA by direct multiplex polymerase chain reaction amplification on oligonucleotide microarrays.
Anal Biochem 2002; 303(1): 25-33.
[14] Huber M, Losert D, Hiller R, Harwanegg C, Mueller MW, Schmidt WM.
Detection of single base alterations in
genomic DNA by solid phase polymerase chain reaction on oligonucleotide microarrays. Anal Biochem 2001; 299(1):
24-30.
[15] Henegariu O, Heerema NA, Dlouhy SR, Vance GH, Vogt PH. Multiplex PCR: critical parameters and step-by-step protocol.
Biotechniques 1997; 23(3): 504-11.
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