利用高效液相層析儀鑑別含細辛中藥製劑之方法研究

前 言

1993 年比利時學者發現服用含有馬兜鈴 酸（ristolochic acid）之減肥藥造成婦女腎衰 竭後⁽¹⁾，引起各國對中草藥安全性之重視。世 界各地的相關病例研究陸續指出這類中國草 藥腎病變（Chinese herbs nephropathy）主要與 服用了含有馬兜鈴酸藥物有關⁽²⁾。馬兜鈴酸是 具有腎毒性與致癌性之物質^(3-6)，因此，法國、

英 國、比 利 時、澳 大 利 亞、奧 地 利、西 班 牙、美國、埃及、日本、菲律賓及馬來西亞 等國家已禁止使用含馬兜鈴酸之產品以為因 應。

馬兜鈴酸是馬兜鈴科(Aristolochiaceae)植 物含有的成份，含馬兜鈴酸中藥材主要為馬 兜 鈴 屬 之 關 木 通、廣 防 己、青 木 香、天 仙

藤、馬兜鈴與細辛屬之細辛等。上述馬兜鈴 屬之中藥材含有大量之馬兜鈴酸，故2003 年 11 月 4 日行政院衛生署公告禁用廣防己、青 木香、關木通、馬兜鈴、天仙藤等五種含馬 兜鈴酸之中藥材⁽⁷⁾及含有上述五種中藥材之製 劑，禁止製造、輸入、並註銷其藥品許可證

(8)，全面禁止使用這類藥材與相關製劑。至於 細辛屬藥材細辛，在台灣比起上述馬兜鈴科 的中藥材是更為廣泛地使用於中藥製劑處方 中，但基於細辛僅含微量馬兜鈴酸⁽⁹⁾，且需為 醫師處方始可使用，故2004 年 2 月 27 日行 政院衛生署公告「細辛中藥材暨其製劑之相 關管理規定」⁽¹⁰⁾，而未禁止使用細辛及其製 劑。

「細 辛 中 藥 材 暨 其 製 劑 之 相 關 管 理 規 定」主要規範內容為：細辛中藥材之藥用部

利用高效液相層析儀鑑別含細辛中藥製劑之方法研究

盧芬鈴 秦 玲 黃坤森 林秀珍 林雅姿 張華軒 鄭淑晶 黃秋羽 黃成禹 林哲輝

第三組

摘 要

本計畫選擇小青龍湯等八種含細辛之中藥製劑，建立其高效液相 層析法，以用於市售製劑中馬兜鈴酸之鑑別。經實驗結果顯示，八種 處方使用C-18 之層析管，以 0.05mol/L NaH2PO4(H3PO42mL)： CH3CN

= 65：35 及 0.05mol/L NaH2PO4(H3PO42mL)：MeOH：CH3CN = 55：

10：35 二種移動相，其分離效果良好。檢量線之相關係數均為 0.999 以上，而aristolochic acid I 在儀器之最低檢出量及製劑中之最低檢出 量分別為3.742 ng 及 3.792 ng，八個處方之添加回收率則介於 95.5%

~ 107.8%之間。

關鍵詞：馬兜鈴酸、高效液相層析法、鑑別、中藥製劑

位由全草改用根部，並以日本藥局方第十四 版記載之HPLC/UV 方法分析⁽¹¹⁾後未檢出馬兜 鈴酸，始得供製造及調劑。另製劑方面，含 細辛之濃縮製劑，製程以水煎煮方式製造；

傳統製劑（丸、散、膏、丹）、內服及外用 液劑，細辛原料藥材應經水煎煮，或採用單 味濃縮細辛製劑，再與其他原料藥材合併製 造。

本局為因應衛生署有關細辛中藥材暨其 製劑相關管理規定之公告，故於93 年度選擇 小青龍湯等八種含細辛之中藥製劑，自行配 製濃縮製劑及傳統方劑，建立其高效液相層 析法，以運用於市售製劑中馬兜鈴酸之鑑 別。

材料與方法

一、材料：

檢體來源：自台北市藥局購買小青龍湯 等八件中藥製劑。

自配濃縮製劑及傳統製劑每日量均以下 列處方組成及分量配製：

1. 小青龍湯濃縮製劑處方（基準方，單 位為克）

麻黃4.0 白芍 4.0 五味子1.5 乾 薑4.0 炙甘草 4.0 桂枝 4.0 半夏 4.0

細辛1.5

2. 川芎茶調散濃縮製劑處方（基準方，

單位為克）

白芷2.0 甘草 2.0 羌活 2.0 荊芥 4.0 川芎4.0 細辛 1.0 防風 1.5 薄荷 8.0

3. 獨活寄生湯濃縮製劑處方（基準方，

單位為克）

獨活3.0 寄生 2.0 杜仲 2.0 牛膝 2.0

細辛2.0 秦艽 2.0 茯苓 2.0 桂心 2.0 防風2.0 川芎 2.0 人參 2.0 甘草 2.0 當歸2.0 白芍 2.0 生地黃 2.0 4. 九味羌活湯濃縮製劑處方（基準方，

單位為克）

羌活3.0 防風 3.0 蒼朮 3.0 細辛 1.0 川芎 2.0 白芷 2.0 生地黃2.0 黃芩2.0 甘草 2.0 生薑 3.0 蔥白 3.0 5. 麻黃附子細辛湯濃縮製劑處方（基準

方，單位為克）

麻黃8.0 炮附子 5.0 細辛 8.0 6. 射干麻黃湯濃縮製劑處方（基準方，

單位為克）

射干1.5 麻黃 4.0 細辛 1.5 紫菀 3.0 半夏4.0 五味子 1.0 生薑 4.0 大棗 2.0 7. 清上蠲痛湯濃縮製劑處方（基準方，

單位為克）

當歸2.0 川芎 2.0 白芷 2.0 細辛 0.6 羌活2.0 防風 2.0 菊花 1.0 蔓荊子 1.0 蒼朮 2.0 麥門冬 2.0 獨活 2.0 甘草0.6 黃芩 3.0 生薑 3.0

8. 大秦艽湯濃縮製劑處方（基準方，單 位為克）

秦艽2.5 石膏 2.5 當歸 1.5 白芍 1.5 川芎1.5 生地黃 1.5 熟地黃 1.5 白 朮1.5 茯苓 1.5 甘草 1.0 黃芩 1.5 防風1.5 羌活 1.5 獨活 1.5 白芷 1.5 細辛1.0

標準品：

Aristolochic acid 對照用標準品 A ( Sigama ，I：40%；II：56%)。

Aristolochic acid 對照用標準品 B ( Sigama ，I：38%；II：58%)。

試藥：甲醇、乙 採 HPLC 級，磷酸、

磷酸二氫鈉（NaH2PO4）均採試藥級。

二、儀 器 裝 置：高 效 液 相 層 析 儀：Agilent 1100。

溶媒傳送系統：Agilent 1100 series 檢測器：Agilent 1100 series 自動注射裝置：Agilent 1100 series 三、實驗方法：

高效液相層析法之條件：

層析管：Ace 3C18，3µm，4.6 mm 15 cm (或同級品)。

層析管溫度：30℃

移動相：

0.05mol/L NaH2PO4(H3PO42mL) 註 1：

CH3CN = 65：35

(2)0.05mol/L NaH2PO4 (H3PO4 2mL)：

MeOH：CH3CN = 55：10：35

註1：取 7.8g NaH2PO4和H3PO42 mL 加水至1000 mL。

流速：1.0mL/min 檢測波長：400 nm 儀器檢出量：

精確稱取Aristolochic acid 標準品 A 1.90 mg（含馬兜鈴酸 I 為 0.760mg），以 70%

甲 醇 稀 釋 調 配 成 一 系 列 濃 度：9.5、

4.75、2.375、1.1875µg/mL，以高效液相 層析儀分析之，選擇以訊號雜訊比為3：

1 時之濃度，作為儀器最低檢出濃度。

檢量線之製作：

精確稱取Aristolochic acid 標準品 B 4.99 mg（含馬兜鈴酸 I 為 1.896mg），以 75%

甲醇溶解，並定容至50mL，使成含馬兜 鈴酸 I 為 37.9 µg/mL，供作標準儲備溶 液。再以75%甲醇稀釋調配成一系列濃 度之溶液，依序含馬兜鈴酸I： 37.92、

18.96、9.48、4.74、2.37、1.185µg/mL 之 標準品溶液。分別取不同濃度之標準品 溶液10µL，注入高效液相層析儀分析，

以標準品之濃度為X 軸，波峰面積為 Y 軸，製作標準曲線，並求出線性迴歸方 程式（Y=mX+b）及相關係數。

檢液之配製：

1. 自配濃縮製劑：依一、材料中所列八 種中藥處方組成及分量，分別稱取一 日 量 全 處 方 藥 材 粗 末，加 二 十 倍 量 水，煮沸時間至少三十分鐘，煎煮至 半量，趁熱以紗布過濾，收集濾液至 已知重量濃縮用茄形瓶中，減壓濃縮 至 乾，於 乾 燥 器 內 放 置 四 小 時 後 秤 重。加 入 相 當 於 浸 膏 半 量 重 之 澱 粉 量，混合均勻即成濃縮製劑檢品，取 上述檢品，加入75%甲醇 25mL，超音 波振盪 30 分鐘，過濾，殘渣再加入 75%甲醇 25mL，超音波再振盪 30 分 鐘，過濾，合併上述濾液，減壓濃縮 至乾，以75%甲醇定容至 10mL，再以 75%甲醇調整濃度為 50mL 含 2g 細辛 藥材，供作檢液。

2. 自配空白濃縮製劑：稱取一日量全處 方藥材粗末，細辛藥材除外，依 1.法 配製之，供作空白檢液。

3. 市售濃縮製劑：取濃縮製劑約 5.0g，

精確稱定，加75%甲醇 25mL，超音波 震盪抽取30 分鐘，過濾，殘渣再加入 75%甲醇 25mL，超音波再振盪 30 分 鐘，過濾，合併上述濾液，減壓濃縮 至乾，以75%甲醇定容至 10mL，再以 75%甲醇調整濃度為 50mL 含 2g 細辛 藥材，供作檢液。

4. 自配傳統製劑（散）：依一、材料中

所列八種中藥處方組成及分量稱取一 日量全處方藥材粗末，混合均勻即成 傳 統 製 劑 檢 品，加 75% 甲 醇 約 100mL，超音波震盪抽取 2 小時，過 濾，以少許75%甲醇洗殘渣，合併上 述濾液，減壓濃縮至乾，以75%甲醇 定容至10mL，再以 75%甲醇調整濃度 為50mL 含 2g 細辛藥材，供作檢液。

5. 自配空白傳統製劑(散)：稱取一日量全 處方藥材粗末，細辛藥材除外，依4.

法配製之，供作空白檢液。

添加回收實驗：

小青龍湯等八個處方，分別取(四)之 2.檢 液各四份，其中一份為空白對照組，另 外三份分別加入 Aristolochic acid 標準 品，使其 Aristolochic acid I 之濃度分別 為7.58、9.48、11.38µg/mL，以高效液相 層析儀分析，求其添加回收率。

檢體檢出量：

小青龍湯等八個處方，分別取(四)之 2.檢 液各三份，分別加入Aristolochic acid 標 準品，使其Aristolochic acid I 之濃度分 別為0.1896、0.3792、0.5688µg/mL，以 高效液相層析儀分析之，選擇以訊號雜 訊比為3：1 時之濃度，作為檢體之最低 檢出濃度。

結果與討論

一、馬兜鈴酸於高效液相層析儀之最低 檢出量：

取Aristolochic acid 標準品 A 1.90mg，用 75%甲醇稀釋調配成一系列濃度：9.5、4.75、

2.375、1.1875µg/mL，注入量為 10µL，分別 注入高效液相層析儀，然後觀察訊號雜訊 比，結果Aristolochic acid Ⅰ於高效液相層析

儀之最低檢出濃度為0.3742µg/mL，換算為最 低檢出量為3.742 ng。

二、分析成分之線性關係：

分析Aristolochic acid I 對照標準品，在 濃度1.185 37.92 µg/mL 範圍內，其線性迴歸 方程式及相關係數（r²）分別為下列所示： 二 種分析方法均顯示有良好的線性關係。

方法 ：y = 12.7608x + 2.4935，r²= 0.99994 方法 ：y = 12.7865x + 0.6765，r²= 0.99992

三、高效液相層析法條件之探討：

選擇市面上較常見含有細辛藥材之處方 計八種，依實驗方法(四)之步驟模擬配製濃縮 製劑及其空白液、傳統製劑及其空白液，再 依實驗方法(一)之 HPLC 方法條件分析之，選 擇在馬兜鈴I、II 成分相同滯留時間處均未受 到其他成分干擾之方法為其檢驗方法。其結 果顯示：HPLC 方法(1)分析小青龍湯、川芎 茶調散、獨活寄生湯、九味羌活湯、麻黃附 子細辛湯、清上蠲痛湯、大秦艽湯等七種處 方均得到良好分離效果，以獨活寄生湯為 例，如圖一。

由於射干麻黃湯於上述HPLC 方法(1)中 仍有干擾，將 HPLC 方法(1)調整 0.05mol/L NaH2PO4(H3PO42mL)及 CH3CN 比例，再添 加 MeOH 即可得到良好的分析結果，如圖 二。

上述八種處方以日本藥局方第十四版所 記載⁽¹¹⁾細辛藥材的檢測馬兜鈴酸方法檢測，於 馬兜鈴I、II 成分相同滯留時間處均有其他成 分干擾，於是將移動相比例修改，層析管改 為粒子大小為3µm，長度縮短為 15cm，即可 得到上述無干擾結果。

四、馬兜鈴酸在製劑中之添加回收率：

小青龍湯等八個處方，其空白檢液中添 加三個不同濃度 Aristolochic acid Ⅰ，以高效

液相層析儀分析，計算其添加回收率，結果 如表一所示，八個處方之添加回收率介於 95.5% ~ 107.8%，相 對 標 準 偏 差 為 0.19~

2.03%。

五、馬兜鈴酸I 在製劑中之最低檢出量：

小青龍湯等八個處方，其空白檢液中，

分別加入Aristolochic acid 標準品後，使其 Ar- istolochic acid I 之濃度分別為 0.1896、0.3792、

0.5688µg/mL，以高效液相層析儀分析之，選 擇以訊號雜訊比為3：1 時之濃度，結果馬兜 鈴酸I 在八個處方中最低檢出濃度均為 0.3792µ g/mL，換算為最低檢出量為 3.792 ng。

表一：中藥製劑中Aristolochic acid I 之添加回收率

Prescription Adding(µg/mL) Recovery(%)*(Mean I S.D.) R.S.D.(%)

小青龍湯 7.58 99.8 0.011 1.14

9.48 95.7 0.007 0.77

11.38 99.2 0.004 0.45

川芎茶調散 7.58 96.9 0.020 2.03

9.48 99.0 0.007 0.73

11.38 99.4 0.019 1.91

獨活寄生湯 7.58 99.7 0.018 1.78

9.48 99.4 0.009 0.91

11.38 95.4 0.005 0.52

九味羌活湯 7.58 100.0 0.006 0.65

9.48 99.2 0.013 1.29

11.38 99.6 0.007 0.67

麻黃附子細辛湯 7.58 99.3 0.015 1.51

9.48 95.5 0.007 0.76

11.38 98.1 0.010 1.06

清上蠲痛湯 7.58 107.8 0.017 1.58

9.48 103.5 0.008 0.82

11.38 104.9 0.005 0.46

大秦艽湯 7.58 99.1 0.013 1.33

9.48 98.8 0.005 0.54

11.38 99.2 0.007 0.70

射干麻黃湯 7.58 99.1 0.004 0.43

9.48 96.7 0.002 0.19

11.38 95.5 0.010 1.05

* N = 3

圖一：獨活寄生湯之HPLC 圖譜-0.05M NaH2PO4(H3PO42mL)： CH3CN = 65：35

標準品 濃縮劑型 濃縮劑型空白 傳統劑型 傳統劑型空白 市售製劑

圖二：射干麻黃湯之HPLC 圖譜-0.05M NaH2PO4(H3PO42mL)：MeOH： CH3CN = 55：10：35

標準品 濃縮劑型 濃縮劑型空白 傳統劑型 傳統劑型空白 市售製劑

六、細辛藥材雖然為馬兜鈴科植物，但 其馬兜鈴酸含量比其它同科植物，如關木 通、廣防己、青木香等之含量要低，而細辛 全草是以葉部含量較高，而Aristolochic acid I 含量又比Aristolochic acid II 多。另日本藥局 方第十四版檢驗方法記載是以標準品 Aristo- lochic acid I 做比對，故本計畫內檢量線之製 作、最低檢出量及添加回收率試驗均只以Ar- istolochic acid I 檢驗之。

七、依衛生署九十二年十一月四日公告

「細辛中藥材暨其製劑之相關規定」⁽¹⁰⁾，細辛 中藥材藥用部位由全草改為根部，並依公告 之檢驗規格及方法檢驗合格後，始得供製造 及調劑，而含細辛製劑中濃縮製劑，製程須 以水煎煮方式製造；而傳統製劑（丸、散、

膏、丹）內服及外用液劑，則其細辛原料藥 材應經水煎煮，或採用單味濃縮細辛製劑，

與其他原料藥材合併製造，成品均得依廠內 既定之 HPLC 檢驗方法檢驗合格後，始得販 售。而含細辛之市售產品一旦經檢出馬兜鈴 酸者，係依藥事法相關規定論處。為因應此 公告，本計畫建立二種 HPLC 分析方法，可 利用在小青龍湯等八種含細辛中藥製劑之檢 驗，以防止此類情形發生。

參考文獻

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7. 行政院衛生署。九十二年十一月四日署授 藥字第0920002350 號公告。

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10.行政院衛生署。九十二年十一月四日署授 藥字第0930000756 號公告。

11.The Japanese Pharmacopoeia，fourteenth edi- tion，p1303，2001。

High Performance Liquid Chromatography Identification Stu- dy on Aristolochic Acid in Traditional Chinese Medicinal Pre-

scriptions Containing Asiasarum Heterotropoides

FEN-LING LU，LING CHIN，KUEN-SEN HUANG ， SHION-JANE LIN，YA-TZE LIN，HUA-SHENG CHANG，

SHU-CHING CHENG，CHIU-YU HUANG，

CHENG-YU HUANG AND JER-HUEI LIN

Division of Pharmacognosy

ABSTRACT

A high performance liquid chromatography (HPLC) method for the identification of aristolochic acid in traditional Chinese medicinal prescritions containing Asiasarum heterotropoides was established.

The prescription included Sheau-Qing-Long-Tang (小青龍湯)、Chuan-Chyong-Char-Tyau-Saan (川芎茶 調散)、Dwu-Hwo-Jih-Sheng-Tang (獨活寄生湯)、Jeou-Wey-Chiang-Hwo-Tang (九味羌活湯)、Ma- Hwang-Fuh-Tzyy-Shih-Shin-Tang (麻黃附子細辛湯)、Ching-Shang-Jiuan-Tong-Tang (清上蠲痛湯)、

Dah-Chyn-Chyou-Tang (大秦艽湯) and Yeh-Gan-Ma-Hwang-Tang (射干麻黃湯)。The samples were analyzed using the HPLC method on a Ace 3C18 column and were detected at 400nm with 0.05mol/L Sodium Biphosphate（2mL Phosphoric acid） and acetonitrile(65：35)， 0.05mol/L Sodium Biphosphate

（2mL Phosphoric acid） and methanol and acetonitrile (55：10：35) as the mobile phase at a flow rate of 1.0ml/min。The linear coefficient of regression equation of all were more than 0.999，the detection limit of Aristolochic acid I for instrument and samples were 3.742 ng and 3.792 ng respectively，the recoveries of eight samples were 95.5% ~ 07.8%。

Key Words : Aristolochic acid、HPLC、Identification、Chinese Medicinal Prescriptions