行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告
五氯酚及硫氫基化合物在多步驟化學致癌實驗模式的角色
探討(1/2)
計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC91-2320-B-006-091- 執行期間： 91 年 08 月 01 日至 92 年 07 月 31 日 執行單位： 國立成功大學工業衛生科暨環境醫學研究所 計畫主持人： 王應然 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢 中 華 民 國 92 年 5 月 19 日第一章 緒論 第一節、研究動機： 五氯酚（Pentachlorophenol, PCP）自 1936 年起被大量的使用在工業上，長 期的濫用結果導致 PCP 在環境中廣泛流布，為環境中重要的污染物之一。 流行病學調查結果顯示：PCP 的暴露與白血病及惡性淋巴腺癌有關(1)，動 物實驗中亦觀察到 PCP 會誘發小鼠產生血管肉瘤、腺瘤及肝臟腫瘤 (2)。而 由齧齒動物及人類肝臟酵素代謝的研究中指出：PCP 會被代謝成四氯對苯 二酚（Tetrachlorohydroquinone, TCHQ）(3)。在 TCHQ 代謝的過程中會自 發性的產生 superoxide 及 tetrachlorosemiquinone，此二者屬於活性氧物種 （Reactive oxygen species, ROS）會攻擊細胞的 DNA 造成損傷。尤其是 TCHQ 已被證實會經由 organic Fenton reaction 產生氫氧自由基（hydroxyl radicals）(4)。過去研究中也顯示：在人類表皮細胞中發現，TCHQ 會造成 DNA 直接的損傷，而這與 TCHQ 所產生的 ROS 有關(5)。 而由過去的兩階段化學致癌動物模式中去比較 PCP 及 TCHQ 的促癌能 力中發現：PCP 促癌的能力高於 TCHQ（unpublish data） 。推測是因為在 TCHQ 毒性作用下，細胞傾向於進行細胞凋亡（apoptosis），導致 DNA 受 損的細胞不易生存下來，形成新的啟始癌細胞（initiated preneoplastic cells），所以 TCHQ 促癌的能力會低於 PCP。然而，TCHQ 藉由何種途徑 導致細胞凋亡的路徑仍不清楚，有待於進一步的釐清。
第二章 文獻探討
第一節、五氯酚（pentachloropenol） 五氯酚是一種固狀、針狀結晶體，有獨特的酚味。此化合物的水溶 性低，但可溶於酒精、醚類、丙酮、苯及鹼性溶液，在工業上最重要的 用途是木材的保存，其可以防止細胞及黴菌的破壞並停止衰敗，除了此 項功能之外，五氯酚亦被用來做為殺蟲劑，由於五氯酚具有穩定的物化 特性、不溶水性及價格便宜等優點，因此，自 1936 年起即被大量使用於 工業上，平均年產量曾高達 25,000 噸(6)，而長期濫用的結果造成五氯酚 在環境中廣泛分佈，主要透過食物鏈的方式進入人體之中(7)，在美國有 超過 70﹪的人體內可以偵測到 PCP 的存在(8)，為重要的環境污染物。 五氯酚在職業暴露上的吸收大部分經由呼吸道吸入及皮膚吸收(9)。在 毒性方面：五氯酚在人體的最小致死劑量約 29mg/kg(10)。因為五氯酚具 有致癌及致畸胎的危險[Dimich-Ward, 1996 #10435]，所以美國環境保護 署（Environmental Protection Agency, EPA）在 1984 年就要求在可能接觸 到皮膚、食物、水及動物的產品上只能使用濃度小於 5﹪的五氯酚(11)。 第二節、四氯對苯二酚（tetrachlorohydroquinone, TCHQ） 由齧齒動物及人類肝臟酵素代謝的研究中指出：肝臟中的細胞酵素 P450 會將 PCP 代謝成四氯對苯二酚（Tetrachlorohydroquinone, TCHQ） (3)。TCHQ 在體內會與其他化合物鍵結，並以 TCHQ-glucuronide 與 TCHQ-sulfate 的形式排出。在 TCHQ 代謝的過程中又會自發性的產生超 氧自由基（superoxide, O2 ˙－ ）及 tetrachlorosemiquinone（TCSQ）。超氧自 由基轉變成過氧化氫的過程中，若同時存在銅離子或鐵離子時，就會進 一步導致氫氧自由基（hydroxyl radical,˙OH ）的形成。而 TCHQ 已被 證實在過氧化氫的存在下，會經由 organic Fenton reaction 產生氫氧自由基(4)；而最近 TCSQ 亦被報導，在 TCHQ 所造成的基因毒性中，其重要 性遠高於氫氧自由基(12)。因此，以 TCHQ 的形態代謝會增加細胞活性 氧物種（reactive oxygen species, ROS ）的生成量，造成細胞的氧化性壓 力或氧化性傷害增加。過去研究中也顯示：在人類表皮細胞中發現， TCHQ 會造 DNA 直接的損傷，而這與 TCHQ 所產生的 ROS 有關(5)。 P C P在細胞致突變測試結果顯示並不會造成基因突變及 DNA 損傷 (6)，而在人類膀胱癌細胞中也發現 PCP 並不會誘發細胞凋亡(13)。但 TCHQ 卻不然；TCHQ 會造成人類纖維母細胞及中國倉鼠卵細胞（ CHO） 產生 DNA 單股斷裂(14, 15, 16)，抑制 CHO 細胞之生長(14)及增加 V79 中國倉鼠細胞之微核數目(17)，及造成小鼠肝臟 DNA 形成 8-hydroxy-2， -deoxyguanosine（8-OHdG）(18)。
第三節、活性氧物種（reactive oxygen species, ROS）
ROS 包含許多衍生自氧的化學反應分子(19)，這些分子具有高反應 的特性，例如：hydroxyl radical、superoixde、hydrogen peroxide。而細 胞內的 free radicals，是指帶有不成對電子的小分子量分子；通常 ROS 與 free radical 這兩個名詞可互相通用。Free radicals 和 ROS 很容易與大 多數的 biomolecules 反應，而啟動一連串的連鎖反應，進一步形成新的 free radical；為了停止此連鎖反應，新形成的 free radical 必須和另一個 free radical 反應，去除不成對的電子；另一個停止連鎖反應方法是與 free radical scavenger 反應。細胞內常見的 ROS 有 superoixde、hydroxyl radical、hydrogen peroxide、nitric oxide；而細胞內也有一些 enzymatic antioxidant system 會清除 ROS，例如：superoxide dismutase（SOD）、 glutathione peroxidase、catalases。
ROS 因為具有高反應的特性，所以容易與體內的巨分子結合造成傷 害，因此具有造成 toxic、mutagenic 及 carcinogenic 的能力，以 DNA 為
例，在過去就有報告指出 ROS 具有致突變性(20)，主要由於其具有改變 DNA 結構的能力，例如：切斷 DNA、影響 DNA-protein 之間的 cross link、 造成 purines 的氧化，而假使 DNA repair 系統無法修補 ROS 對 DNA 所 造成的改變，則在 DNA 複製的過程中就會製造出不正常配對的 DNA， 即一般所謂的 mutation。而此項結果可以用來部分解釋個體暴露到氧化 性壓力後，進而生成癌症的原因之一。
另一方面，ROS 也會造成細胞進行 apoptosis(21)，除了因為 ROS會 造成 DNA 損傷之外，ROS 還會增加 mitochondria 的通透性使 cytochrome c 釋出，並且還會導致細胞內鈣離子濃度增加，及其他的一些影響 (22)。 歸納以上結果可知，ROS 會造成細胞基因上的損傷，此受損的細胞 會遭遇兩種情況，一則會啟動 apoptosis 的機轉，走上自殺一途；否則此 受損的細胞將帶著錯誤的 DNA 序列繼續複製、繁殖，最終形成癌症 (23)。所以細胞是否會演變成腫瘤細胞，就端看此兩條路徑之間的平衡。 第四節、細胞凋亡（Apoptosis） 多細胞生物發育的過程不單只是細胞增殖而已，就現今的角度來看 成長的要件還包含精密調控之下的細胞死亡。細胞死亡（cell death）和 細胞生長、細胞分化一樣，是生命週期中不可或缺的重要過程，生物體 可以藉此將體內細胞維持在一個恆定的狀態。對於細胞如何死亡，過去 並無太多學者重視。早期對於細胞死亡的瞭解僅止於 necrosis（細胞壞 死）的概念，也就是細胞受到外在因素（高溫、缺氧、局部缺血）影響 而導致細胞膜受到傷害，細胞外液不斷進入細胞，最後導致細胞漲破瓦 解，這樣的結果會導致細胞內容物如溶菌酵素（lysozyme）大量釋出， 引起發炎反應並對附近的細胞組織造成二次傷害。另一種有別於細胞壞 死的死亡的方式，即為細胞凋亡（ apoptosis）。在胚胎與個體發育和組織 修補的過程中，為了移除老化及不必要的細胞，在不傷害鄰近細胞的條
件之下，細胞凋亡為細胞走向死亡的最佳途徑。近年來，於活體外的研 究中指出，許多化學物品、放射性物質照射、活性氧物種、病毒感染… 等，接會引起細胞凋亡。凋亡細胞首先會與鄰近的細胞分離、或自培養 皿底面脫離，細胞體積減小而密度增加，接著染色體開始凝聚於核膜周 圍（chromosome condensation），此時會活化去氧核糖核酸內切 ? （DNA endonuclease）而導致 DNA 呈 180~200 bp 或其倍數的 DNA 片段，最後 細胞逐漸形成不規則外型而分離成為含有部分胞器的較小單位，稱為凋 亡小體（apoptotic bodies）在生物體內，則可被鄰近的細胞所辨認並加 以吞噬。(24-32) 4.1.1 p53蛋白 在細胞生長週期中 p53 扮演著負向調控的角色，當 p53 活化時會使 細胞週期停在 G1 phase。而當細胞暴露於具基因毒性的物質，進而導致 雙股 DNA 受損時，p53 蛋白便會開始活化、累積(33)。證據顯示，於 p53-null mice 的實驗中發現，因 DNA 損傷而導致的細胞凋亡過程中， p53 扮演著決定性的地位(34)。當細胞暴露於放射線之下，細胞中的 p53 蛋白會增加，而這些細胞不是呈現 G1 phase arrest 的現象，就是進行細 胞凋亡(35)。 4.1.2 Bcl-2 蛋白及 Bax 蛋白 Bcl-2 蛋白可以保持 Mitochondria 的完整，有著決定細胞生存或死 亡的重要功能，其中一項功能即是降低細胞中 ROS 的含量(36)，此外 Bcl-2 亦被發現具有維持 Mitochondria 膜電位的穩定、調節 Mitochondria 內鈣離子的平衡(37)，因為 Bcl-2 蛋白具有這些功能，因此 Bcl-2 蛋白 可以抑制 cytochrome c 從 Mitochondria 釋出，阻止細胞進行細胞凋亡。 Bax 蛋白是屬於 Bcl-2 家族成員之一，與 B cl-2 蛋白不同的是，Bax 蛋
白具有 pro-apoptosis 的功能，在過去的研究中發現，在體外培養的細胞 中直接加入 Bax 蛋白，則可導致 cytochrome c 從 Mitochondria 釋出(38)。
4.1.3 cytochrome c、caspase 9、caspase 3
如前述，在一般正常狀態下， cytochrome c 存在於 Mitochondria 內， 不存於細胞質中，而在 Mitochondria 膜的通透性增加時，cytochrome c 會從 Mitochondria 釋出，並藉著與 dATP 及 apoptotic protease-activating factor1 (Apaf-1) 的結合來活化下游的 caspase 9。
緊接著活化的 caspase 9 caspase 3，進行細胞凋亡(39)。 第五節、抗氧化劑（Antioxidants） 細胞內會進行許多複雜的反應來維持其正常的生理功能，通常這些 反應涉及許多訊號傳遞，一般所知的訊號傳遞方式即是 ligant-receptor 之間的結合，另一方面訊號的傳遞往往與電子的傳遞有關；如之前所 述，ROS 帶有不成對的電子，所以正常狀態下，ROS 具有活化轉錄因子 調節基因表現、調控細胞生長，發育及老化的功能；但大量的 ROS 可能 會造成細胞訊息傳遞途徑的變化，引起細胞遭受氧化性傷害；而細胞內 有一套內生性的抗氧化機制來維持氧化及還原之間的平衡，這些內生性 的抗氧化劑包括 Superoxide dismutase（SOD）、 Catalase、Glutathione 等 等；除此之外，細胞內還有一種 thioredoxin 系統，具有維持氧化還原之 間平衡的能力(40, 41)。許多疾病的產生，導致於細胞遭受到氧化性壓 力，所以抗氧化劑在臨床上也具有治療的功用。
5.1.1 Lipoic acid (LA)，dihydrolipoic acid（DHLA）
Lipoic acid 是一種天然的抗氧化劑，與 Mitochondria 的氧化還原反 應有關；其具有高還原能力，可經由獲得一個電子而還原成 dihydrolipoic
acid（DHLA）(42)。Lipoic acid 亦具有還原其他抗氧化劑的能力，例如： Glutathione、ascorbate、vitamin E(43)。正常生理情況下，在血中 Lipoic acid 的濃度為 1-25 ng/ml 且絕大部分是以還原態---DHLA 的形式存在的(44)。 Lipoic acid 可藉由食物而由腸胃道吸收；於體外培養 Jurket T-lymphocytes 及新生兒的纖維母細胞中發現，在 medium 加入 Lipoic acid，經過 2 小時， 發現 medium 中 DHLA 的含量增加了數倍之多(45)
因為 Lipoic acid 具有改變氧化還原平衡的能力及降低氧化性壓力所造 成的損傷，因此在臨床上可用來治療因酒精中毒所引起的肝病變及因為毒 菇、金屬、四氯化碳造成的肝毒性(42) 。最近也發現，經由餵食年老的老 鼠 Lipoic acid，可以改善因 Mitochondria 所引起的氧化性壓力(46)。
5.1.2 Captopril
Captopril 一般認為是一種血清擴張轉換? 的抑制劑
（angiotensin-converting enzyme inhibitor），可溶於水，具有清除氫氧自由 基的功能。過去曾發現因其具有抗氧化的能力，所以可以保護心臟因為缺 血再灌流（ischemia-reperfusion）而造成的氧化性損傷(47)。於 1995 年也 曾被發現具有 metal-binding 的特性，可以改變鐵和銅 pro-oxidant 的能力 (48)。
5.1.3 penicillamine
penicillamine是一種 metal chelator，在過去的研究中曾發現它可以用 來抑制，因為感染所引發的紅血球氧化性壓力的上升 (49)；在 2000 年 Lciek 等人的研究中指出，在人類紅血球中，penicillamine 與 Captopril 皆可用來 抑制因氫氧自由基攻擊而誘發的脂質過氧化（lipid peroxidation）(50)。
5.1.4 meso-2,3-dimercaptosuccinic acid（DMSA）
D M S A亦是一種 metal chelator，它是第一種被政府當局同意用於治 療孩童鉛中毒的用藥，主要是因為 DMSA 可以抑制因鉛中毒所誘發的氧化 性傷害(51)。然而，在 2000 年亦有研究中指出，DMSA 不能清除因
第三章 研究目的
1、研究在高劑量 TCHQ 作用下導致小鼠纖維母細胞毒性效應之詳細 機制探討與研究。
2.研究不同抗氧化劑抑制低劑量 TCHQ 對小鼠纖維母細胞所造成的 基因毒性。
第四章 研究材料與方法
第一節 研究材料
（一）藥品試劑：
I、下列產品購自美國 Sigma 公司
Acrylamine；Bis-acrylamine；Leupeptin；Aprotinin，KCl；HEPES； NP-40；NaCl；SDS；Phenol；Tween-20；Amido Black；propidium iodide； DCFH-D；DMSO；NaH2PO4；NaHCo3；Agarose；penicilamine； 2,3-Dimercaptosuccinic Acid；lipoic acid；dihydrolipoic acid；captopril Ⅱ、下列產品購自德國 E.Merck 公司
Methanol；Chloroform；Ethanol；Isopropanol；Acetic Acid；NaOH Ⅲ、下列產品購自美國 Bio-Rad 公司
Protein assay dye reagent；BSA；2-Mercaptoethanol；TEMED；Prestained SDS-PAGE standard；40% bis-Acrylamide
Ⅳ、下列產品購自 GIBCOBRL 公司
DMEM medium；Penicillin-Stretomycine；Trypsin-EDTA；FBS Ⅴ、下列產品購自 Corning 公司
1 0公分培養皿；15 ml 離心管；50 ml 離心管 VI、下列產品購自 Santa Cruz Biotechnology 公司 p53 antibody；BAX antibody；
VII、下列產品購自 Transduction 公司 B c l-2 antibody
（二）常用儀器
倒立式顯微鏡：OLYMPUS CK40 細胞培養箱 CO2 Incubater：NUAIR
無菌操作台 Lamina Flow：智勤
漩渦震盪器：Digisystem Lab. Instrument 烘箱 Oven：智勤
蓋格計數器 Geiger Counter：Mini Monitor Series 900;Morgan 振盪水浴槽：YIHDER 加熱攪拌器：Corning 高轉速離心機：Beckman GS-15R 低轉速離心機：HERMLE 水平式電泳槽：Biometra 電源供應器(Power Supply)：Biometra SDS-PAGE 電泳槽：Biometra 酸鹼測定儀 pH meter：Cyber Scan pH510 超音波震盪器：Branson 5210
高壓殺菌器：Tomin Medical Equipment 天平：JADEVER
-70℃冰櫃：NUAIR 硝化纖維紙：Millipore
流氏細胞分析儀：Becton Dickinson (FACS)
分光光度計 Spectrophotometer：Beckman Du640B 試管恆溫槽：Thermolyne 離心式真空乾燥機：TAKA （三）常用溶液： Ⅰ、蛋白質萃取溶液：lysis buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.0，140 mM NaCl，3 mM MgCl2) 0.5% NP-40、2 mM PMSF、1% aprotinin、5 mM DTT Ⅱ、SDS-PAGE electrophoresis buffer：
25 mM Tris-HCl、250 mM glycine、0.1% SDS 溶於去離子水，調整 pH 值至 8.3
Ⅲ、Transfer buffer：(for Western blotting)
25 mM Tris base、192 mM glycine、20% methanol 溶於去離子水，調整 pH 值至 8.3
Ⅳ、Loading buffer：
100 mM Tris pH6.8、200mM DTT、4% SDS、0.2% bromophenol blue、 20% glycerol
Ⅴ、Phosphate-buffered saline (PBS)：
每公升含 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4 溶於去離子水，調整 pH 值至 7.4
Ⅵ、TBST：
10 mM Tris pH7.5、100 mM NaCl、0.1% Tween-20 Ⅶ、Western blotting 受質溶液：
第二節 研究方法 （一）細胞培養
NIH3T3 小鼠纖維母細胞培養於含 10﹪FCS-DMEM 的培養皿中，（內 含 10U/ml penicillin；100μg/ml steptomycin；0.25μg/ml Amphotericin B 及 2 mM 的 L-gluramaine），將培養皿置於 37℃，濕度 98﹪，含 5﹪CO2 的 培養箱中，細胞長滿後將培養液抽乾先以 PBS 清洗細胞表層二次，再加入 1 ml 0.05﹪Trypsin-0.02﹪EDTA，將細胞打下再加入 5 ml 的培養液將細胞 均勻沖散，依實驗目的不同，均勻分配到不同的培養皿中。 （二）細胞氧化性壓力偵測分析 一、試劑 2 , 7-dichlorodihydrofluorescein diacetate（DCFH-DA）10ml 0.25﹪Trypsin-EDTA DMSO 二、操作方法 (1) 培養細胞 1×106至 60mm 培養皿，培養至 7～8 分滿。添加 5ml 培養液 及 2.5μl 之 10mM DCFH-DA(對照組加等體積的 DMSO)。於 37℃下培 養 1 小時。 (2) 加入欲處理的藥物，處理適當時間。收集培養液中的懸浮細胞至 15ml 離心管中。以 Trypsin-EDTA 切下貼在培養皿上的細胞，與懸浮細胞一 起收集至 15ml 離心管中。以 1500rpm 離心 5 分鐘。去除上清液，再加 入 1ml PBS 洗滌細胞。 (3) 以 1500rpm 離心 5 分鐘。去除上清液，此時殘餘約 100μl 的 PBS 與沈 澱物，彈散細胞並加入 869μl PBS 再懸浮細胞，以 1000μl 之微量吸 管抽吸 40 次打散細胞，並將細胞吸至試管中。
(4) 每支試管加入 4μl 的 Propidium Iodide(final 40μg/ml)，緩和搖勻細胞
液，將試管放入避光盒中。混合均勻，用細胞流體分析儀 (flow cytometer) 分析細胞氧化性壓力之變化。
（三）DNA 萃取及瓊膠電泳偵測細胞凋亡
一、試劑
DNA lysis buffer：10mM EDTA＋50mM Tris-HCl+0.5﹪sarkosyl Proteinase K RNase A Phenol chloroform Chloroform Ethidium bromide Aga rose 二、操作方法 （1）DNA 萃取 細胞經過藥物處理於適當的時間點刮下，以 2500rpm，離心 5 分鐘， 並以 PBS 清洗兩次後依細胞的量加入 DNA lysis buffer，將細胞打散 後再加入 Proteinase K 混合均勻，置於 50℃培養 3 小時至 12 小時後 加入 RNase A 並以 50℃培養 20 分鐘。加入與 lysis buffer 等量的 chloroform，均勻混合 3-5 分鐘後以 20℃離心 12000rpm，5 分鐘， 取上清液；之後再加入與 lysis buffer 等量的 pheonl chloroform 重複 之前加完 chloroform 的步驟，最後取得含 DNA 片段的上清液即可 做為瓊膠電泳分析。
（2）瓊膠電泳偵測 DNA 片段
時間約為 30 分鐘。電泳結束後將 gel 置於 ethidium bromode 溶液中 緩慢搖晃，使 ethidium bromode 充分進入 gel 中結合 DNA。染色完 畢後將 gel 置於水中沖洗，使 gel 中未與 DNA結合的 ethidium bromide 游離洗出，退染後的 gel 即可在紫外光盒觀察或照相。
（四）細胞存活率偵測分析（MTT assay）
一、試劑
3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyl tetrazolium bromide（MTT） 1 0﹪SDS UV visible Spectrophotometer 二、操作方法 （1） 細胞經過加藥處理之後，去除上清液，用 PBS 清洗二次，吸掉 PBS 再加入 0.7ml/ well MTT 水溶液，放在 37℃細胞培養箱中培 養 4 小時之後，再加入 10﹪SDS 溶解細胞內粒腺體中去氫? 將 MTT 轉換所形成的藍紫色結晶，放入細胞培養箱中培養 12-16 小時。 （2） 經過 12-16 小時候，從細胞培養箱中將 plate 取出，每一個 well 中取出 200μl 的藍紫色水溶液，加入 96well plate 中，再以 ELISA reader 設定波長 570nm 讀取其吸光值，定義控制組的吸光值為 100﹪，實驗組相對於控制組之比值即為相對之細胞存活率。
（五）細胞基因毒性偵測分析（Comet assay）
一、試劑
low melting point agarose NaCl Na2EDTA Trizmabase NaOH Triton X-100 DMSO Tris-base EtBr 二、操作方法 （1）製備電泳膠 1. 先把玻片洗淨擦乾，拿一小燒杯製備第一層膠（ normal melting point agarose）總量為 20ml，1﹪，用 PBS 泡製。
2. 在收細胞之前先製備第二層膠（low melting point agarose）總 量為 20ml，0.5﹪，用 PBS 泡製；先放在 37℃水浴，待細胞以 trypsin 打下後使用。實驗所需細胞濃度為 1×106/ml，細胞依所
需濃度均勻沖散，取 10μl 至另一 0.5ml 的 eppendorf 中，再加 入製備好的第二層膠 75μl，混合均勻後滴在第一層膠上，蓋 上蓋玻片，放置 10~15 分鐘等其凝結。
3. 第三層膠（low melting point agarose）製備條件與第二層膠相 同。待第二層膠凝結後，取下蓋玻片，滴上第三層膠，蓋上蓋 玻片，放置 10~15 分鐘等其凝結。第三層膠凝結後取下蓋玻片， 泡在 lysing solution 中至少一小時以上。
4. lysing solution 的製備：
使用前，須再加入 1﹪Triton X-100，10﹪DMSO。
（2）電泳
1. 從 lysing solution 中取出玻片後，用 pH 值 7.5 的 0.4 M tris沖 洗一次，小心的置入電泳槽中，先在電泳液中泡置 1 小時候， 再用 25mv 電泳 40 分鐘。 2. 電泳液泡製：現泡 NaOH 0.3 M，EDTA 1 mM ，pH 值要調到 大約 13 左右。 （3）染色觀察 1. 電泳結束後，關閉電源，小心的取出玻片，用 pH 值 7.5 的 0.4 M tris 沖洗一次，接著再用 0.4 M 的 tris 浸泡三次，每次 5 分鐘。 小心從染缸中取出玻片，把多餘的 tris 擦乾。拿至暗處用 2μ g/ml ，75μl 的 EtBr 染色，蓋上蓋玻片，靜置 2 分鐘即可用螢 光顯微鏡觀察結果。
2. EtBr stock solution：20μg EtBr 溶於 1ml ddH2O 中，為 10 倍，
使用時稀釋至 1 倍。
（六）Mitochondrial transmembrane potential 之偵測分析
一、試劑 3’3-dihexyloxacarbocyanine (DiOC6) 10mM 二、操作方法 146.1g NaCl 37.2g Na2EDTA 1.2g Trizmabase 8g NaOH pH 值為 10，總量為 1L， 用 ddH2O 泡製，室溫下 最多可儲存六個月。
(1)培養細胞 1×106至 10cm 培養皿，培養至 7～8 分滿。添加 10ml 培 養液及 2.5μl 之 10mM DiOC6 (對照組加等體積的 DMSO)。於 37℃下培養 15 分鐘。 (2)加入欲處理的藥物，處理適當時間。收集培養液中的懸浮細胞至 15ml 離心管中。以 Trypsin-EDTA 切下貼在培養皿上的細胞，與懸浮細胞 一起收集至 15ml 離心管中。以 1500rpm 離心 5 分鐘。去除上清液，再加 入 PBS 清洗細胞。 (3)以 1500rpm 離心 5 分鐘。去除上清液，加入 1ml 的 PBS，再以 pipetman 抽吸 40 次打散細胞，並將細胞吸至試管中。用細胞流體分析儀(flow cytometer)分析 Mitochondrial transmembrane potential 之變化。
（七）西方墨點法 一、細胞總蛋白之萃取 （1）試劑：lysis buffer（新鮮泡製） 10mM Tris pH7.0 140mM NaCl，3mM MgCl2 0.5﹪NP40 1.2mM PMSF 1﹪aprotinin 5mM DTT BSA 蛋白濃度測定組 （2）操作步驟 將細胞培養在 10cm 培養皿至八分滿，經處理後於特定時間，離心取 細胞沉積，用 PBS 反覆清洗離心二次，加入 0.5ml 的萃取溶液，並以 pipetman 抽吸作充分的混合使細胞完全的溶解，將此 cell lysate 吸到
1.5ml 的 eppendorf tube 中，用 vortex 振盪之，然後冰浴 30 分鐘，再 離心 30 分鐘（12,000rpm），取上清液，並用 BSA 蛋白測定試劑組來 測量蛋白的濃度，萃取液保存在-70℃冰箱，直到下次取用前。 二、SDS-PAGE （1）鑄膠的配方 Resolving gel（12﹪）： ddH2O 1 1 . 2 m l 2 . 5 m l 3.0M Tris-H C l p H 8 . 9 6.0ml Acrylamide 40﹪ 0 . 2 m l 10﹪Ammoniun persulfat e 100μl T E M E D 2 0μl Stacking gel： ddH2O 3.935ml 1.5M Tris-H C l p H 6 . 8 0.625ml Acrylamide 40﹪ 0.5ml 10﹪ S D S 50μl 10 ﹪Ammoniiun persulfate 50μl TE M E D 1 0μl （2）操作步驟 將 電 泳片 裝 置 在電 泳 槽 上（ 電 泳 片下層 為Resolving gel， 上 層 為 Stacking gel），並填滿電泳緩衝液，等待蛋白質樣本的填入。取 50 μg（或 30μg）的蛋白樣本，加入三分之一體積的 SDS/protein loading buffer，95℃ denature 5分鐘後，放在 4℃冷卻，再將蛋白質樣本加 到每個 well 中，以 60mA 電流量進行電泳分離，適當時間後，停止 電泳並進行蛋白質樣本的轉印。 三、蛋白質樣本之轉印
（1）試劑與材料
電泳印槽（electrotransfer tank） 電源供應器
3 MM paper
electrophoresis buffer
Hybond-PVDF transfer membrane （2）操作方法
裁一張與 gel 相等面積的 Hybond-PVDF membrane，先以 metoanol 浸濕活化，連同兩張 3 MM paper 放入 electrophoresis buffer 中浸濕， 操作時，重疊的順序由下由上分別為 3MM paper，PVDF membrane， SDS-PAGE gel，3MM paper，並且使用玻棒小心的排除夾在其中的 氣泡，放入轉印槽中，將轉印槽置入 4℃冰櫃中，確保轉印時溫度 不會過熱，以 1200mA 轉印 2 小時。
四、免疫墨點法 （1）試劑 1×TBST
Blockin g solution：5﹪low fat milk、0.002﹪NaN3
Primary antibody、Secondary antibody NBT/BCIP
（2）操作方法
從轉印槽中取出 membrane，加入 20ml Blocking solution，置於 37℃ 烘箱中平搖 1 小時，加入 Primary antibody 於 4℃冰箱中平搖
overnight，第二天從冰箱中取出，再置入 37℃烘箱中平搖 40 分鐘。 取出，以 1×TBST 15ml 清洗三次，每次五分鐘。加入 Secondary antibody 於室溫平搖 2 小時，再使用 1×TBST 15ml 清洗三次，每次 五分鐘。最後加入 500μl NBT/BCIP 避光呈色，待呈色後以 ddH
終止反應。
（八）Caspase 活性分析 一、試劑
Lysis Buffer：25mM HEPES pH7.5、5mM MgCl2、5mM EDTA、5mM DTT、2mM PMSF、10μg/ml pepstain A 及 10μg/ml leupeptin 二、操作方法： 細胞處理藥物適當時間後，以 policeman 刮下細胞，並以 1×PBS 沖洗 盤面，之後加入適量 lysis buffer，以 12000rpm 離心 5 分鐘。上層即 為所待分析蛋白。取 50μg 蛋白質與 50μM 的受 Ac-DEVD-AMC 或 Ac-YVAD-AMC，於 30℃下作用 1 小時。由螢光光譜儀 (excitation:360nm；emission:460nM)偵測 AMC 釋放的程度即可得知 caspase 的活性。
NIH/3T3 cell
TCHQ
DNA Fragment
ROS
Mitochondria Membrane Potential
Protein Expression
Antioxidants
第六章 實驗結果
第一節、Tetrachlorohydroquinone（TCHQ）造成 3T3 細胞形態上的改變 將 3T3 細胞各以 1.5×106/ml 培養於 10 cm 的 culture dish 中，每盤加 入 10ml 培養液，持續培養兩天，待細胞長至八分滿後，在顯微鏡下觀察 發現，左圖為正常 3T3 細胞，細胞形態完整並貼附於培養皿底部，右圖為 加入 TCHQ 50μM 作用 8 小時後細胞的形態，細胞明顯受到 TCHQ 的毒 性而導致細胞本體萎縮，細胞與細胞彼此之間的空隙增加，甚至已漂浮起 來，由此圖形可顯示，TCHQ 的確會對小鼠纖維母細胞具有毒性。 第二節、TCHQ 引起 3T3 細胞凋亡 細胞死亡的方式主要分為兩種：細胞壞死（necrosis）及細胞凋亡 （apoptosis）；當細胞受到大量毒性物質刺激或處於不利的狀況，例如缺 氧、缺血、或劇烈的溫度變化時，細胞膜通透性改變使細胞脹大進而死亡， 即一般所謂的細胞壞死。另一種有別於細胞壞死的死亡形式，即是細胞凋 亡，是一種伴隨特殊型態及分子特徵的主動性細胞死亡過程，其形態學上 的特徵為染色體及細胞質的濃縮（ chromatin, cytoplasmic condensation），在 生化上的特徵則為細胞內核酸切? （endonuclease）活化而將 DNA 切成 180-200 base pair 或其倍數的 DNA 片段，因而在瓊膠電泳分析上呈現階梯 形之特殊圖形，但細胞壞死則無此特徵且在瓊膠電泳的分析上會呈現 smear 的情形，所以一般實驗室經常使用此特性來區分細胞的死亡是經由 凋亡或壞死。 首先我們將 3T3 各以 1.5×106/ml 細胞培養 10 cm 的 culture dish 中， 每盤加入 10ml 培養液，持續培養兩天，加入 50μM 的 TCHQ 作用不同時 間點（4，8，10，12hr）後，將細胞收集（包含已懸浮之受損細胞及尚黏貼在培養皿底部之細胞），進行 DNA 萃取純化及分析，結果發現在 50μM TCHQ，8 小時的作用下，以電泳瓊膠分析即可觀察到 DNA 的階梯式片段 ---典型的細胞凋亡特徵，而之後隨著時間的增加（10，12hr）亦可清楚的 觀察到此現象。此外再分別加入不同劑量之 TCHQ（10，25，50，100μM） 作用 10 小時，發現若時間增加，則在 TCHQ 25μM 的劑量作用下也可觀 察到細胞凋亡的現象。由此結果可知，TCHQ 對小鼠纖維母細胞所造成的 毒性反應，細胞凋亡是其中一項主因。 第三節、 TCHQ造成 3T3 細胞內氧化性壓力增加 由過去的研究指出 TCHQ 會自發性的產生活性氧物種（ reactive oxygen species，ROS）包括超氧自由基（ superoxide，O2 ˙－ ）及活性氧中間產物－ tetrachlorosemiquinone（TCSQ）及 tetrachlorobenozquinone（TCBQ）這些 ROS 的產量若超過細胞本身的抗氧化能力時，就會產生氧化性壓力 （oxidative stress）；而由先前的實驗已知 TCHQ 會造成 3T3 細胞凋亡，因 此為進一步證實，是否 TCHQ 所造成的細胞凋亡是來自於 TCHQ 氧化過程 中所產生這些 ROS 而導致細胞氧化性壓力增加所造成的。於是我們先以 DCFH-DA 添加至 3T3 細胞培養液中，培養作用一小時，再分別添加不同 濃度之 TCHQ（10，25，50，100μM）作用 30 分鐘後，再用流氏細胞儀 進行分析；將對照組圖形的最高點訂在座標軸 101處為標準，當細胞內氧 化性壓力有增加的情形，則圖形會向右偏移，反之，若圖形向左偏移則表 示細胞內氧化性壓力減少；其結果如圖三所示，隨著 TCHQ 劑量的增加， 圖形越往右邊偏移，顯示 3T3 細胞內氧化性壓力有增加的趨勢；把 TCHQ 100μM 劑量作用下氧化性壓力改變的細胞數量定為 100﹪，可發現在 TCHQ 10μM 的作用下，氧化性壓力相較於對照組已增加了 5 倍，而在 TCHQ 50μM 的作用下相較於對照組已增加了 10 倍之多，這顯示，在
隨著劑量的增加氧化性壓力亦有增加的趨勢。 第四節、抗氧化劑抵抗 TCHQ 對 3T3 細胞造成的細胞毒性 由以上的實驗結果可知 TCHQ 會導致細胞凋亡以及會造成細胞內氧 化性壓力增加，而細胞的氧化性壓力的增加，通常來自於細胞中 ROS 的攻 擊所導致，所以便假設如果抗氧化劑的加入，可以降低 TCHQ 對 3T3 細胞 的細胞毒性，就可以間接證實 TCHQ 所造成的細胞毒性是來自於 TCHQ 氧化過程中所產生的 ROS。所以我們選用了幾種在過去文獻中曾被探討具 有抗氧化及清除 ROS 功能的抗氧化劑（附表一），利用 MTT assay 去觀察 抗氧化劑對 TCHQ 細胞毒性的抑制情形。結果如圖四所示，在只有加入 TCHQ 50μM，2 小時的作用下，細胞存活率不到百分之二十，若加入抗 氧化劑與 TCHQ 一起作用 2 小時，則細胞的存活率明顯提高，在抗氧化劑 2.5mM 的作用下以 penicillame 抑制 TCHQ 細胞毒性的效果最好，細胞的 存活率可達百分之八十五；若抗氧化劑的劑量降為 1mM 其效果則以 captopril 為佳；隨著抗氧化劑劑量下降，抑制 TCHQ 細胞毒性的能力亦有 下降的趨勢，不過即使抗氧化劑的劑量降到 0.1mM 仍然可以維持細胞存活 率達百分之四十左右。結果顯示抗氧化劑可以抑制 TCHQ 所造成的細胞死 亡，證實了 TCHQ 所造成的細胞毒性應來自於 TCHQ 氧化過程中所產生的 ROS 所致。除此之外我們亦發現，這些具有抑制 TCHQ 細胞毒性的抗氧化 劑其結構中皆具有 thiol- group，其是否與清除 ROS 的能力有關，將在之後 的文章中做進一步的探討。 第五節、抗氧化劑抵抗 TCHQ 對 3T3 細胞造成的基因毒性 由之前的實驗結果可知 TCHQ 在氧化過程中會產生 ROS，而 ROS 會 攻擊細胞內的巨分子，如 DNA、蛋白質、脂質等，造成氧化性損傷（ oxidative damage），所以便想進一步觀察是否低劑量的 TCHQ 會經由產生 ROS 攻擊
3T3 細胞的 DNA，導致基因毒性。此結果的判斷方式是基於 DNA 斷裂的 片段，在電場中受陽極拉扯會造成拖尾的現象，用 EtBr 染色，再依其尾巴 的面積大小來決定 DNA 受損的程度，若 DNA 受損的越嚴重，則尾巴的面 積、長度會增加，反之，若細胞越完整則細胞本體的部分會越明亮，尾巴 越不明顯。由圖五可知，在 TCHQ 4μM，2 小時的作用下（C 圖）就會對 3T3 細胞的 DNA 造成些許的損傷，但並不明顯，若劑量提高至 10μM（D 圖）可觀察到，DNA 拖尾的情形已非常明顯，顯示 TCHQ 在 10μM，2 小時的作用下已經可以對 3T3 細胞造成明顯的基因毒性。 而為了更進一步的證實，低劑量的 TCHQ 是否藉由產生 ROS 來導致 基因毒性，因此把之前具有抑制 TCHQ 細胞毒性的抗氧化劑與 TCHQ 一起 作用，觀察是否可以抑制低劑量 TCHQ 所造成的基因毒性。 圖六結果顯示在 2.5mM 及 1mM 的 penicillamine 加入下，可有效的 抑制 TCHQ 所造成的基因毒性，而隨著 penicillamine 劑量的下降，抑制的 效果也隨之下降。圖七結果顯示，在 DMSA 2.5mM 的作用下，其抑制 TCHQ 基因毒性的效果並不明顯，反而在 DMSA 1mM 處，可以看見最明顯的抑 制效果，0.5mM 與 0.1mM 也可見抑制 TCHQ 基因毒性的能力，但並不如 1mM 來得顯著。圖八結果顯示，在 Captopril 2.5mM、1mM、0.5mM、0.1mM 四種劑量的作用下皆可觀察到，具有抑制 TCHQ 基因毒性的現象。圖九， 把 Lipoic acid 與其還原態 dihydrolipoic acid（DHLA）一起比較觀察其抑制 TCHQ 基因毒性的能力，結果與之前的細胞毒性實驗的結果相似，在 Lipoic acid 與 DHLA 分別與 TCHQ 一同作用之下，只有在 DHLA 0.5mM 及 0.1mM 可見具有抑制基因毒性的效果，2.5mM 的效果並不明顯；而 Lipoic acid 則 無觀察到抑制基因毒性的能力。圖十二、改用 Bcl-2 over-expression 的 3T3 細胞株，觀察 TCHQ 誘發基因毒性產生的情形，發現與 wild-type 3T3 細胞 不同的地方，TCHQ 要在比較高的劑量（20μM）作用下，才會對此細胞 產生較嚴重的基因毒性。
第六節、TCHQ 造成 3T3 細胞 mitochondria 膜電位不穩定
許多生理上的死亡訊息會啟動細胞凋亡，一般認為細胞凋亡主要經由 兩個途徑：caspase pathway 和 organelle dysfunction，經由後者這個 pathway 最明顯的特徵是 mitochondrial dysfunction；而 mitochondrial dysfunction 包 含幾種變化，例如： mitochondria 膜電位不穩定、位於 mitochondria 膜上的 permeability transition pore 打開、釋放出 cytichrome c 等變化。所以我們可 以藉由觀察 mitochondria 膜電位的穩定程度，進一步證實外來的死亡訊息 所造成的細胞凋亡是經由何種路徑產生。
由以上的實驗結果可知 TCHQ 會在氧化過程中產生 ROS 攻擊細胞 DNA 使細胞受損，且 TCHQ 會造成 3T3 細胞凋亡。因此想進一步證實 TCHQ 造成 3T3 細胞凋亡的訊息，是否經由 mitochondria dependent pathway 來進行的。實驗結果如圖十所示，其判斷的方式乃是將對照組訂在座標軸 中點，當 mitochondria 膜電位有不穩定的情形，則向左偏移；觀察的結果 發現，隨著 TCHQ 的劑量上升，mitochondria 的膜電位有越不穩定的趨勢， 這顯示 TCHQ 所造成的細胞凋亡機制應是經由 mitochondria dependent pathway 來進行的。 第七節、Bcl-2 蛋白在 TCHQ 造成細胞凋亡過程中的重要性 如之前所提到的，mitochondria 整體狀態的穩定與否，決定著細胞生 存或死亡的命運，而在維持 mitochondria 整體的穩定性上，Bcl-2 蛋白扮演 著極重要的角色。Bcl-2 蛋白被視為具有 anti-apoptosis 的功能(53)，因為 Bcl-2 不僅可以降低因 Mitochondria dysfunction 所產生的 ROS，還可以維 持 Mitochondria 的膜電位穩定，所以在細胞凋亡的過程中， Bcl-2 蛋白佔有 重要的角色。
為了瞭解在 TCHQ 造成細胞凋亡過程中是否會影響 Bcl-2 蛋白的表 現，因此我們用西方墨點法定性分析 Bcl-2 蛋白在不同時間點的變化情形。
圖十一（B）為 coomassie blue 定量蛋白濃度的結果，可知每一條 lane 其 總蛋白的濃度是相同的。西方墨點法分析 Bcl-2 蛋白的結果如圖十一（A） 所示，以 TCHQ 50μM 添加於培養中的 3T3 細胞，分別收集 0 小時、4 小 時、8 小時、10 小時、12 小時之細胞，進行，Bcl-2 蛋白在 4 小時的表現 量最明顯，之後隨著時間的增加有逐漸下降的趨勢；由之前電泳瓊膠分析 3T3 細胞凋亡的實驗結果已知在 TCHQ 50μM，8 小時的作用下，會有明 顯細胞凋亡的情形；綜合這兩個結果，我們推測 3T3 細胞對 TCHQ 50μM 的毒性反應在 4 小時的時候，可能會產生內生性的抗氧化反應（Bcl-2 蛋 白表現量上升），然而其產生的 Bcl-2 蛋白不足以抵抗 TCHQ 對 3T3 細胞 所造成的氧化性傷害，所以細胞凋亡的過程繼續進行，所以我們仍然可以 在 TCHQ 50μM，8 小時的作用下，觀察到 3T3 細胞凋亡的情形。 因此我們選用一個大量表現 Bcl-2 蛋白的 3T3 細胞株，觀察如果在 相同條件 TCHQ 的作用之下，細胞 是否會進行細胞凋亡；結果如圖十一（ D） 所示，利用西方墨點法確認此 Bcl-2 蛋白大量表現的 3T3 細胞株在一般狀 態之下其 Bcl-2 蛋白表現量確實比正常 3T3 細胞株高出許多；由圖十一（ C） 電泳瓊膠分析的結果可發現，在 TCHQ 50μM，8 小時的作用下，此 Bcl-2 蛋白大量表現的細胞株並沒有出現細胞凋亡的現象，此結果顯示 Bcl-2 蛋 白在 TCHQ 造成 3T3 細胞進行細胞凋亡的過程中扮演著重要的角色。 第八節、3T3 細胞內與細胞凋亡有關基因的表現 除了 Bcl-2 蛋白外，亦有許多蛋白的表現在調控細胞凋亡的過程中扮 演著重要的角色。p53 蛋白是一個與細胞週期及細胞凋亡有關的蛋白，當 細胞的 DNA 受到損傷，p53 蛋白便逐漸累積，造成細胞週期暫停，讓細胞 內的修復機制去修補此傷害，若傷害無法修復，則細胞會進行細胞凋亡； 結果如圖十三所示，在 TCHQ 50μM 不同時間的作用下，發現隨著時間的 增加，p53 蛋白的表現量有增加的趨勢。另一個與細胞凋亡有關的蛋白為
Bax，屬於 Bcl-2 family proteins，是一個 proapoptotic protein，平常位於 cytosol，若有死亡訊息傳入，則為轉移至 Mitochondria 膜上，影響 cytochrome
c 的釋出，進一步造成細胞凋亡；但在我們的結果中，並沒有發現於 TCHQ
造成 3T3 細胞凋亡的過程中，Bax 蛋白的表現量有明顯的變化情形。如之 前所敘述，cytochrome c 是一個 apoptotic protein，平常位於 Mitochondria 內，若 Mitochondria 受到 ROS 的攻擊或者其他死亡的訊息傳入，則會改變 其膜電位及通透性，釋放出 cytochrome c，進一步的活化下游細胞凋亡的 訊息傳遞，如圖十三所示，隨著 TCHQ 作用時間的增加，cytochrome c 的 表現亦有增加的趨勢。 綜合之前的實驗結果，我們已知 TCHQ 會造成 Mitochondria 膜電位 不穩定，影響 Bcl-2 蛋白的表現量，而這會導致 cytochrome c 從 Mitochondria 釋出至細胞質中，活化下游的細胞凋亡訊息---caspase 9 及 caspase 3，之後 再繼續影響其後的訊息傳遞，最後造成細胞凋亡。caspase activity 實驗結 果如圖十四（A）所示，當 3T3 細胞暴露到 TCHQ 50μM，4 小時後其 caspase 9 的活性隨著時間的增加而有上昇的趨勢，其後 caspase 3 的活性隨著 caspase 9 活性上升而有上昇的趨勢，在 8 小時後可觀察到 caspase 3 的活性 有顯著增加，此兩者的活性皆持續至 24 小時以上。另一方面，Bcl-2 大量 表現的 NIH/3T3 細胞株，於相同條件之 TCHQ 作用下觀察 casapse activity， 研究發現其 caspase 9 及 casapse 3 的活性並沒有上昇的趨勢，此結果顯示 Bcl-2 蛋白會藉著影響下游蛋白的活性，進一步影響 TCHQ 造成的細胞凋 亡，再一次證明 Bcl-2 蛋白在 TCHQ 造成細胞凋亡的過程中有著決定性的 角色。除此之外，caspase 1、caspase 2、caspase 6、caspase 8 其活性並沒 有明顯上昇的趨勢圖十四（B）。
第七章 討論
第一節、TCHQ 對 NIH/3T3 細胞之細胞凋亡機轉 在人類癌症的發生，其中有大部分，與 ROS 導致的 DNA 受損有關， 環境中有許多 carcinogen 是藉著產生 ROS，而誘發腫瘤的形成(54)。齧齒 類動物及人類肝臟酵素代謝的研究中發現 PCP 會被 cytochrome P450 代謝 成 TCHQ，而 TCHQ 會進一步自發性的產生超氧自由基（O2 -）及活性中 間產物 tetrachlorosemiquinone（TCSQ）及 tetrachlorobenzoqninone（TCBQ） 其中超氧自由基與 TCSQ 帶有不成對的電子，屬於活性氧物種（ROS）。 而 TCBQ 會經由體內 NADPH 酵素作用，再度形成 TCHQ；最近 TCSQ 亦 被報導，在 TCHQ 所造成的基因毒性中，其重要性遠高於氫氧自由基 (12)。 而如之前敘述，ROS 會攻擊細胞內的巨分子，如 DNA、蛋白質、脂質時， 就會造成氧化性損傷。所以 PCP 可能會經由 TCHQ 的代謝進而對 DNA 造 成損傷。再 由過去的研究可知 PCP 在多數的細菌致突變測試結果顯示並不 會造成基因突變及 DNA 損害(6)，但是 TCHQ 卻不然。因此，推測由 PCP 代謝產生的 TCHQ 應具有細胞毒性和基因毒性，而此結果可能是由 ROS 所造成的結果。 於 NIH/3T3 細胞中，以 TCHQ 50μM 8小時的作用下，由電泳瓊膠 的分析結果可見明顯的 DNA ladder 產生，而隨著時間的增加（10 小時）， 在較低劑量（25μM）TCHQ 的作用之下，於電泳瓊膠中亦可觀察到 DNA ladder 的現象，並沒有 smear 的情形，顯示在 TCHQ 所造成的細胞毒性反 應，大部分以細胞凋亡為主。這結果與之前的研究，於人類肝癌細胞及人 類 T 細胞中所發現在 TCHQ 的作用下，會導致細胞凋亡的結果相符(55) (56)。 在以流式細胞儀偵測細胞氧化性壓力的實驗中，發現在 TCHQ ，30 分鐘的作用下，會產生高於 control 組 5 倍以上的 ROS，在 25μM、50μM 與 100μM 的劑量下，ROS 的產生就比 control 組高出 10 倍以上； 而由 comet assay 的實驗中可觀察到在 10μM 的 TCHQ 作用下，就足以對 NIH/3T3 細胞造成明顯的基因毒性（圖五），證實低劑量的 TCHQ 就可以 產生造成細胞基因毒性的 ROS。
ROS 除了會造成 DNA 損傷之外，還會影響 Mitochondria 膜電位的穩 定、增加 Mitochondria 的通透性使 cytochrome c 釋出進行下游細胞凋亡的 訊息傳遞(22)。從本研究中可以明顯觀察到，在 TCHQ 的加入下，隨著劑 量的增加，Mitochondria 膜電位有越不穩定的趨勢（圖十）。細胞進行細胞 凋亡一般會經由兩種路徑，一則是 透過活化 procaspase 8，直接影響下游的 細胞凋亡訊息，此路徑稱為 Mitochondria-independent pathway。另外一條 路徑則與 Mitochondria 有關，若細胞凋亡是經由此路徑，則可觀察到 cytochrome c 蛋白從 Mitochondria 中釋放至細胞質中，caspase 9 會被 cytochrome c 所活化，之後再活化下游的 caspase 3。經由 western blot 及 caspase activity 的實驗中，可發現 cytochrome c 蛋白的表現量增加，caspase 9、caspase 3 的活性上升，說明經由 TCHQ 所誘發的細胞凋亡機轉是為 Mitochondria-dependent pathway。
第二節、抗氧化劑抵禦 TCHQ 所造成細胞毒性及基因毒性
在本實驗中選擇了五種抗氧化劑（附表一），皆具有抵抗 TCHQ 所產生 的細胞毒性及基因毒性的功能，證實 TCHQ 會藉由產生 ROS 對細胞產生 毒性。其中 Captopril、Penicillamine 及 DMSA 具有 metal chelator 的功能； 如前述，在 TCHQ 自發性氧化過程中會產生超氧自由基，在超氧自由基轉 變成過氧化氫的過程中，若同時存在銅離子或鐵離子時，就會更進一步導 致氫氧自由基的形成，因此推測 Captopril、Penicillamine 及 DMSA 具有抵 抗 TCHQ 毒性的能力，其中有部分原因可能是來自於清除了細胞中的銅離 子及鐵離子，氫氧自由基的產量降低，減少了細胞內氧化性壓力所致。由
過去的研究中發現，TCSQ 自由基為 TCHQ 毒性的主要來源之一(16, 57)， 因此推測 Captopril、Penicillamine 及 DMSA 具有抵抗 TCHQ 毒性的能力， 有另一部份是來自於這些抗氧化劑皆具有 thiol group。 在抗氧化劑抑制 TCHQ 細胞毒性的實驗中發現，於 2.5mM 劑量下 的抗氧化劑，以 penicillamine 的抑制效果最好；於 1mM 的劑量下，則以 Captopril 為最佳，而 DHLA 則反而在 0.5mM 的劑量下，才可觀察到較佳 的抑制效果，而 lipoic acid 則無論在何種劑量下，皆觀察不到抑制 TCHQ 細胞毒性的效果。綜合以上所觀察到的現象，推論：在過去的文獻中， penicillamine 一般比較常被用來做為 metal chelator，Captopril 大部分用來 治療因腎臟病併發引起的心臟疾病，在本研究中發現具有抑制 TCHQ 細胞 毒性的功能，可能是由於此兩種抗氧化劑具有 thiol group 的結構，可以清 除 TCHQ 所產生的 ROS 所致。在過去的文獻中曾指出，Lipoic acid 和其 還原態 DHLA 皆具有抗氧化的作用，尤其是 DHLA 可以有效的清除超氧 自由基及氫氧自由基(58) DHLA 在高濃度時（2.5mm 及 1mM）無法抑制 TCHQ 的毒性，可能是因為 DHLA 在高濃度時會導致 3T3 細胞產生細胞凋 亡的現象（附圖二），所以在較低濃度之下，才可顯現其抗氧化的效 果。 Lipoic acid 一直以來就都被用來當作抗氧化劑使用，除了因為 Lipoic acid 具有螯合銅離子及鐵離子的功能外，它還具有清除 ROS 的能力，在許多研 究中指出 Lipoic acid 之所以具有清除 ROS 的能力，主要是來自於其還原 態 DHLA 的作用；過去曾有研究指出， Lipoic acid 加入細胞培養液中 2 小 時後，可偵測到 DHLA 的生成(45)。因此在本實驗中 Lipoic acid 與 TCHQ 一起作用 2 小時的條件下，沒有發現抑制 TCHQ 細胞毒性的能力，推測是 因為 Lipoic acid 來不及還原成 DHLA，所以不具有抗氧化的能力 。
在以 comet assay 偵測 TCHQ 的基因毒性實驗中發現：在 TCHQ 10μ
M 的作用下，即可明顯造成 3T3 細胞 DNA 損傷的現象（圖五）在相同的 條件下，加入五種抗氧化劑觀察其抑制 TCHQ 的基因毒性實驗中發現：
penicillamine 在 2.5mM 及 1mM，2 小時的作用下，可以明顯的抑制 TCHQ 所產生的基因毒性，隨著 penicillamine 劑量的降低，抑制的效果也隨之 下降；DMSA 在 2.5mM 的劑量下，沒有顯著抑制 TCHQ 基因毒性的情形，反 而在 1mM 才可見明顯的抑制效果；Captopril 在此四種劑量之下，皆具有 明顯抑制 TCHQ 所造成基因毒性；比較 DHLA 與 Lipoic acid 的抑制效果發 現與細胞毒性實驗中有相似的結果，Lipoic acid 不具有抑制 TCHQ 基因毒 性的能力，DHLA 只有在 0.5mM 及 0.1mM 才可觀察到抑制 TCHQ 基因毒性的 情形。綜合以上觀察的現象，推論：在低劑量（10μM）TCHQ 作用下， 已經可以產生足以造成細胞基因傷害的 ROS。DMSA 在過去的研究中指 出，它除了具有 metal chelator 的功能，亦可以在動物實驗中發現，每 天攝取 1 mmol/kg 的 DMSA，在大鼠身上可觀察到具降低因鉛暴露誘發之氧 化性壓力的能力(51)；然而，在其他的研究指出，在 medium 當中加入 10mM 的 DMSA，會促進 gentamicin 形成自由基的能力(52)；因此推測，在本實 驗中 2.5mM 的 DMSA 不具抑制 TCHQ 的基因毒性，可能因為劑量太高所致。 抗氧化劑之所以具有抗氧化的能力，通常是因為其可以提供氧化劑電 子，因此在不同的條件之下抗氧化劑是有可能轉變成氧化劑的；DHLA 亦具 有這樣的特性；DHLA 暴露在空氣之中，會自動氧化，而在鐵三價離子的存 在之下，會增加此反應速率 (59)。本實驗中，發現 DHLA 在 1mM 劑量下不 具抑制 TCHQ 基因毒性的能力，推測可能是因為在高劑量的 DHLA 作用下， 其本身的抗氧化能力不足以平衡其氧化的過程中所產生的 ROS 所致。而在 較低的劑量之下（0.5mM、0.1mM）DHLA 才能提供足夠的電子，清除 TCHQ 所產生的 ROS，降低 TCHQ 所造成的基因毒性。
Antioxidants
TCHQ
ROS generation
DNA damage
Mitochondria membrane
potential change
Cytochrome c release
Caspase 9 activation
Caspase 3 activation
Apoptosis
REFEREANCES
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圖一、顯微鏡下觀察 3T3 細胞形態。（ A）正常情況下細胞的形態。（ B） 加入 TCHQ 50μM 細胞培養液中處理 8 小時候，3T3 細胞的形態。
圖二、以瓊膠電泳法分析 3T3 細胞 DNA 階梯式斷片化。左半部，3T3 細胞 經 50μM 的 TCHQ 處理 4、8、10、12 小時候所得結果，指出 4 小時尚未有 細胞凋亡的特徵，時間延長至 8 小時以上，則可見明顯 DNA 階梯狀斷片化。 右半部，3T3 細胞經 10、25、50、100μM 的 TCHQ 作用 10 小時，在 25μM 的劑量下，就可觀察到此現象。
圖三、以 DCFH-DA 染色進行流式細胞儀分析，偵測細胞內活性氧物種（ ROS） 生成情形。分別以不同濃度 TCHQ 作用 30 分鐘觀察。(A)control（B）10 μM（C）25μM（D）50μM（E）100μM。結果發現隨著劑量的增加，曲線 有越往右移的趨勢。
圖四、以 MTT assay 分析細胞存活率。在 100μM 的 TCHQ 作用兩小時的情 況下，細胞的存活率平均只剩百分之二十左右。分別加入 2.5mM、1mM、 0.5mM、0.1mM 的抗氧化劑一起作用兩小時，除了 lipoic acid 之外，其他 抗氧化劑皆可明顯的增加 3T3 細胞的存活率。
圖五、comet assay 可偵測 DNA 受損的情形，為測量基因毒性極為靈敏的 工具。分別以不同劑量 TCHQ 作用 3T3 cell 兩小時(A)control (B)TCHQ 4μM (C)TCHQ 6μM (D)TCHQ 10μM。在 10μM 的 TCHQ作用下，可造成 DNA 明顯受損。定義對照組細胞尾巴的面積為 1，實驗組相對於控制組面 積之比值即為相對之 DNA 損傷的程度。
圖六、以 comet assay 偵測 penicillamine 抑制 TCHQ 基因毒性的程度。 (A) control (B)TCHQ 10μM (C)penicillamine 2.5mM (D) penicillamine 1mM (E) penicillamine 0.5mM (F) penicillamine 0.1mM。
圖八、以 comet assay 偵測 Captopril 抑制 TCHQ 基因毒性的程度。 （A）control (B)TCHQ 10μM (C)Captopril 2.5mM (D) Captopril 1mM (E) Captopril 0.5mM (F) Captopril 0.1mM。
圖九、以 comet assay 比較 Lipoic acid 與 DHLA 抑制 TCHQ 基因毒性的程 度。（ A）control (B)TCHQ 10μM (C)DHLA 1mM (D) DHLA 0.5mM
(E) DHLA 0.1mM (F) Lipoic acid 1mM。(G) Lipoic acid 0.5mM (H) Lipoic acid 0.1mM
圖十、以 DiOC6染色，利用流式細胞儀偵測 Mitochondria 膜電位變化的情
形。3T3 細胞分別以不同濃度的 TCHQ 作用二小時。（ A）control（B）10 μM（C）25μM（D）50μM（E）100μM。
