國⽴立台灣⼤大學⽣生命科學院⽣生化科技學系 碩⼠士論⽂文
Department of Biochemical Science and Technology College of Life Science
National Taiwan University Master Thesis
⼩小孢⼦子靈芝免疫調節蛋⽩白質中三個⾊色胺酸對其功能之 影響
Effects of the Three Tryptophan residues on the Functions of an Immunomodulatory Protein from
Ganoderma microsporum, GMI 洪凱琳
Kai-Lin Hong
指導教授：⿈黃慶璨 博⼠士 Advisor: Ching-Tsan Huang, Ph.D.
中華民國 106 年 7 ⽉月
July 2017
謝誌
不知不覺碩班兩年就過去了，這⼤大概是我⼈人⽣生中最崩潰的兩年，但也因此學 會了堅強，更重要的是發現原來我是真的喜歡做研究，認清了⾃自⼰己未來想⾛走的路，
即便這條路的開始很崎嶇。︒｡
⾸首先，還是最感謝⿈黃慶璨⽼老師，每當我跌跌撞撞，覺得⼈人⽣生很難時，您的⼀一 番話總是⼜又在我⼼心裡燃起⼩小⼩小的希望，覺得世界還是會因為每個⼈人的⼀一點努⼒力⽽而 不⼀一樣的，不知道為何總覺得⽼老師有⼀一種⿎鼓舞⼈人的魔⼒力，希望在未來也能像⽼老師
⼀一樣，為這個世界注⼊入希望。︒｡再來要感謝吳亘承⽼老師，感謝吳⽼老師親⾃自教我做細 胞實驗，花很多時間跟我討論實驗的細節，⽐比起⽼老師覺得您更像學⾧長，實驗室因 為您的加⼊入，有了不⼀一樣的氛圍，雖然可能還沒達到您的預期，但相信會越來越 上軌道的。︒｡還有楊啓伸⽼老師也在這⼀一路上給了我很多的建議跟⿎鼓勵，最記得碩⼀一 時，⽼老師在我最無助的時候給了我⼀一個⼤大⼤大的擁抱，那也⽀支持著我到現在，由衷 地感謝您。︒｡
再來是 Lab106 的⼤大家，從實驗室的學姊哩哩、︑､宛伶、︑､巧青、︑､俞君、︑､昱伶，
感謝你們在實驗上的指導，每次都會⼀一直去煩你們問問題，在剛進實驗室什麼都 不懂的時候，因為有你們實驗室才可以順利的運作下去。︒｡還有我的同學孟羲、︑､景 翔、︑､哲銘，常常來實驗室串⾨門⼦子也算是半個 Lab106 ⼈人的愷兒，感覺同屆是最容 易有摩擦的，雖然我有時候講話有點直、︑､有點⽩白⽬目，如果有得罪的還請多多包涵，
的學弟妹映希、︑､浩安、︑､尚儒、︑､冠陞、︑､麒倫，還有後⾯面進來的⼀一堆學弟們，你們的 加⼊入讓實驗室帶來了不少歡樂，每個⼈人的個⼈人特⾊色都超鮮明的，未來實驗室就靠 你們了。︒｡
最後是我的家⼈人們，感謝你們的⽀支持才有今天的我，雖然這兩年常常回台中
⼀一下公⾞車看到你們，眼淚就⽴立⾺馬飆出來，不好意思讓你們擔⼼心了，但看⼤大家雖然 四散在台灣的北中南，但都很努⼒力的活著，往後我也會更加認真努⼒力的，也感謝 你們讓我知道，不論怎樣家永遠在那，就算天塌下來你們還是會在那等著我。︒｡
凱琳謹誌 106 年 7 ⽉月
摘要
靈芝為中國著名的藥⽤用真菌，含有許多對⼈人體有益的成分，如多醣體、︑､三萜
類及真菌免疫調節蛋⽩白質 (Fungal Immunomodulatory Proteins, FIPs)。︒｡本實驗室⾃自
⼩小孢⼦子靈芝 (Ganoderma microsporum) 選殖出真菌免疫調節蛋⽩白質基因 GMI，
並以嗜甲醇酵母菌 Pichia pastoris 表達系統⽣生產。︒｡GMI 已證實具刺激⼈人類 T 細胞
株分泌 IL-2、︑､降低發炎因⼦子分泌、︑､抑制腫瘤轉移及誘發腫瘤細胞凋亡等效果。︒｡
GMI 雖具多種功效，卻可能因彼此的交互作⽤用，難以⽤用於藥物發展。︒｡因此探討
GMI 與細胞表⾯面受體結合的機制及與蛋⽩白質結合相關的胺基酸是極為重要的。︒｡
過去研究發現 FIPs 會使⼭山⽺羊⾎血球凝集，⽣生理活性與已知的凝集素 (Lectins) 相
似，兩者皆為分⼦子量⼩小卻能對不同細胞造成不同作⽤用的蛋⽩白質。︒｡本研究擬探討
GMI 作⽤用機制是否與凝集素相似，同樣藉由與細胞表⾯面受體的醣分⼦子結合，⽽而
影響其下游⽣生理活性。︒｡⽬目前結果顯⽰示加特定醣分⼦子，GMI 活化 Jurkat 細胞分泌
IL-2的功能會受影響，但抑制肺癌細胞 A549 ⽣生⾧長的功能卻不受影響；以澱粉酶
競爭細胞表⾯面醣分⼦子，可得到相似的結果。︒｡由此推測 GMI 是藉由與醣分⼦子的結
合⽽而產⽣生免疫活化的功能。︒｡此外，芳⾹香族的胺基酸在蛋⽩白質與醣結合能⼒力扮演著
重要的⾓角⾊色，其中⼜又以⾊色胺酸最為重要。︒｡因此將 GMI 上三個⾊色胺酸置換成丙胺
酸或⽢甘胺酸。︒｡其中唯有將三個⾊色胺酸同時⾄至換掉時才會影響抗癌功能，但 GMI-
W25G、︑､GMI-W110A、︑､GMI-W12A/W25G/W110A 會影響免疫活化功效。︒｡總⽽而⾔言
之，在本研究中發現 GMI 活化 Jurkat 細胞分泌 IL-2 的功能與醣分⼦子結合有關，
⽽而其序列上第 25 及 110 個胺基酸似乎扮演關鍵的⾓角⾊色。︒｡
關鍵字：真菌免疫調節蛋⽩白質、︑､⼩小孢⼦子靈芝、︑､GMI、︑､細胞免疫、︑､抗腫瘤
Abstract
Ganoderma is a traditional Asian medicine, which contains many bioactive
compounds, such as triterpenoids, polysaccharides, and fungal immunomodulatory proteins (FIPs). GMI is a FIPs found in Ganoderma microsporum, and successfully produced by pichia pastoris, a heterologous protein expression system. It was proved that recombine GMI was able to stimulate Jurkat T cell secreting IL-2, reduced inflammation, and killed cancer cell. GMI was multifunction, but it is difficult to become a drug because of the interactions of those functions. As a result, the detail mechanism of how GMI interacts with the cell surface receptors and which amino acid play a critical role in those functions are important. In the previous studies, FIPs would cause hemagglutination, and the bio-activity were similar to lectins. Both of them were small proteins with different functions to different cells. In this study, we would like to investigate whether the functions of GMI was related to the binding ability to the glycosylation of cell surface receptors just like lectins. From the result, the immunomodulatory function of GMI would inhibit by adding specific carbohydrates and α-amylase; however, the anti-cancer activity of GMI would not affect. Besides, the aromatic amino acids, especially tryptophan, played a critical role in protein-glycan interactions. Thus, trying to replace the 3 tryptophans of GMI into alanine or glycine to see whether these three amino acids are critical to the functions of GMI. The result showed that only the replacement of three tryptophans in the same tine would affect the anti-cancer activity, and the replacement of the 25th or 110th amino acid would affect the immunomodulatory functions of GMI. Overall, the immunomodulatory functions
of GMI seemed relative to its carbohydrate binding ability, and the 25th and 110th amino acid of GMI, tryptophan, somehow played an important role in it.
Keywords: Fungal immunomodulatory proteins (FIPs), Ganoderma microsporum, GMI, immunomodulatory functions, anti-cancer activity
⽬目錄
摘要 ... III Abstract ... V
⽬目錄 ... VII
表⽬目錄 ... XII
圖⽬目錄 ... XIII
第⼀一章前⾔言 ... 1
⼀一、︑､靈芝 ... 1
⼆二、︑､靈芝⽣生理活性成分 ... 2
1. 靈芝多醣體 ... 2
2. 三萜類 ... 2
3. 核酸類 ... 3
4. 真菌免疫調節蛋⽩白質 ... 3
三、︑､⼩小孢⼦子靈芝免疫調節蛋⽩白質 ... 4
1. 蛋⽩白質結構 ... 4
2. 免疫調節活性 ... 5
四、︑､凝集素 (Lectins) ... 6
1. 動物中的凝集素 ... 6
2. 植物中的凝集素 ... 7
3. 凝集素的應⽤用 ... 7
五、︑､Alanine scanning ... 8
六、︑､Pichia pastoris 表達系統 ... 8
七、︑､研究動機 ... 9
1. ⽬目的 ... 9
2. 策略 ... 10
3. 欲達成⽬目標 ... 11
第⼆二章、︑､材料⽅方法 ... 16
⼀一、︑､ 細菌與真菌實驗 ... 16
1. 培養基與藥品 ... 16
2. 菌株與培養條件 ... 18
3. 質體建構與轉形株 ... 19
4. 嗜甲醇酵母菌電穿孔轉形法 ... 21
5. 轉形株篩選 ... 22
⼆二、︑､蛋⽩白質表現與分析 ... 22
1. 蛋⽩白質表現 ... 22
2. 蛋⽩白質純化與濃縮 ... 23
3. 蛋⽩白質定量 ... 24
4. 聚丙烯醯胺膠體電泳 ... 24
5. 西⽅方墨點法 ... 25
三、︑､細胞培養與分析 ... 27
1. 試劑與培養基 ... 27
2. 細胞株及培養條件 ... 27
3. 抗腫瘤活性測試 ... 28
4. 細胞免疫活性測試 ... 29
⼆二、︑､ 統計分析 ... 31
第三章、︑､實驗結果 ... 35
⼀一、︑､ 嗜甲醇酵母菌表現系統表現免疫調節蛋⽩白質 ... 35
1. 突變質體構築 ... 35
2. 表現菌株篩選 ... 35
⼆二、︑､ 抗腫瘤活性測試 ... 37
1. 醣結合競爭測試 (Sugar binding Competition assay) ... 37
2. 澱粉酶影響 GMI 抗腫瘤活性 ... 37
3. 突變型 GMI 抗腫瘤活性 ... 38
三、︑､ 細胞免疫活性測試 ... 38
1. 醣結合競爭測試 (Sugar binding Competition assay) ... 38
2. 澱粉酶影響 GMI 免疫調節作⽤用 ... 39
3. 突變型 GMI 免疫調節作⽤用測定 ... 39
第四章、︑､討論 ... 70
⼀一、︑､ Alanine scanning ... 70
⼆二、︑､ 抗腫瘤活性測試 ... 70
三、︑､ 細胞免疫活性測試 ... 71
第五章、︑､總結 ... 73
第六章、︑､未來展望 ... 74
⼀一、︑､ Alanine scanning ... 74
⼆二、︑､ 抗腫瘤活性測試 ... 74
三、︑､ 細胞免疫活性測試 ... 74
第七章、︑､參考⽂文獻 ... 76
表⽬目錄
表 ⼀一、︑､建構表現載體與定序之引⼦子序列... 32
圖⽬目錄
圖⼀一、︑､已發表之真菌類免疫調節蛋⽩白質氨基酸序列⽐比對 (Aligned by Bioedit) . 12
圖⼆二、︑､LZ-8 同源雙體之三級結構 ... 13
圖三、︑､GMI 結晶四聚體結構 ... 14
圖四、︑､本研究架構圖... 15
圖五、︑､點突變表現質體上⽬目標基因定序結果... 40
圖六、︑､表現質體 pPICZα-GMI-L6C mutant 質體構築圖 ... 41
圖七、︑､pPICZα-GMI-W12A 定序結果 ... 42
圖⼋八、︑､以不同濃度 Zeocin 篩選 GMI-W12A 表現菌株 ... 43
圖九、︑､GMI-W12A 表現菌株濃度由左⾃自右染⾊色體 DNA 之聚合酶連鎖反應分析 ... 44
圖⼗十、︑､Alanine scanning 突變型蛋⽩白質電泳分析 ... 45
圖⼗十⼀一、︑､Alanine scanning 突變型蛋⽩白質西⽅方墨點法 ... 46
圖⼗十⼆二、︑､GMI-W12A 胞外上清液蛋⽩白質電泳與西⽅方墨點法 ... 47
圖⼗十三、︑､GMI-W110A 胞外上清液蛋⽩白質表現蛋⽩白質電泳與西⽅方墨點法 ... 48
圖⼗十四、︑､GMI-W25A 胞外上清液蛋⽩白質電泳與西⽅方墨點法 ... 49
圖⼗十五、︑､GMI-W25A 胞內蛋⽩白質蛋⽩白質電泳與西⽅方墨點法 ... 50
圖⼗十七、︑､ GMI-W12A/W25G/W110A 胞外上清液蛋⽩白質表現蛋⽩白質電泳與西⽅方
墨點法... 52
圖⼗十⼋八、︑､GMI-W12A 純化結果 ... 53
圖⼗十九、︑､GMI-W25G 純化結果 ... 54
圖⼆二⼗十、︑､GMI-W110A 純化結果 ... 55
圖⼆二⼗十⼀一、︑､GMI-W12A/W25G/W110A 純化結果 ... 56
圖⼆二⼗十⼆二、︑､醣分⼦子對 GMI 抗腫瘤活性測試 ... 57
圖⼆二⼗十三、︑､澱粉酶影響 GMI 抗腫瘤活性 ... 59
圖⼆二⼗十四、︑､不同濃度 GMI-W12A 抗腫瘤活性測試 ... 60
圖⼆二⼗十五、︑､不同濃度 GMI- W25G 抗腫瘤活性測試 ... 61
圖⼆二⼗十六、︑､GMI-W110A 抗腫瘤活性測試 ... 62
圖⼆二⼗十七、︑､不同濃度 GMI-W12A/W25G/W110A 抗腫瘤活性測試 ... 63
圖⼆二⼗十⼋八、︑､醣分⼦子對 GMI 免疫活性測試 ... 64
圖⼆二⼗十九、︑､澱粉酶對 GMI 免疫活性測試 ... 66
圖三⼗十、︑､突變型 GMI 之免疫活性測試 ... 67
圖三⼗十⼀一、︑､醣分⼦子免疫活性測試... 69
第⼀一章前⾔言
⼀一、︑､靈芝
靈芝⾃自古以來被認為是滋補強壯、︑､扶正固本的珍貴藥材。︒｡中國古代依靈芝的 質地將之分為「⽯石芝、︑､⽊木芝、︑､⾁肉芝、︑､菌芝、︑､草芝」，或依外部型態分為「青芝、︑､
⾚赤芝、︑､⿈黃芝、︑､⽩白芝、︑､⿊黑芝、︑､紫芝」(1)。︒｡直到 1979 年由 Alexopoulus 建⽴立了真菌分 類系統後，靈芝被歸於真菌界 (Myceteae) 、︑､無鞭⽑毛菌⾨門 (Amastigomycota) 、︑､擔
⼦子菌綱 (Basidiomycetes)、︑､無蕈褶⽬目 (Aphyllophorales) 、︑､多孔菌科 (Polyporaceae) 中的靈芝屬 (Ganoderma)(2)。︒｡靈芝屬⽬目前經鑑定發表的約有兩百多種，其中台灣 常⾒見野⽣生靈芝共 8 種，分別為樹⾆舌靈芝 (G. applanatum) 、︑､台灣靈芝 (G.
formosanum) 、︑､拱狀靈芝 (G. fornicatum) 、︑､靈芝 (G.lucidum) 、︑､新⽇日本靈芝 (G.neo-japonicum) 、︑､熱帶靈芝 (G. tropicum)、︑､松杉靈芝 (G.tsugae) 、︑､⼩小孢⼦子靈芝 (G. microsporum)(1)。︒｡
靈芝的藥理活性早在東漢末年的《神農本草經》中已被記載：「養命以應天，
無毒，多服久服不傷⼈人，輕⾝身益氣，不⽼老延年」。︒｡此外，明朝李時珍的《本草綱
⽬目》則對青芝、︑､⾚赤芝、︑､⿈黃芝、︑､⽩白芝、︑､⿊黑芝、︑､紫芝，六種芝的釋名、︑､集解、︑､正誤、︑､
修治、︑､氣味、︑､主治、︑､附⽅方等詳加註解(1)。︒｡1970 年代開始，學者們陸續使⽤用西⽅方 藥理學及臨床研究等⽅方法，重新定義靈芝的藥理活性及擴⼤大其應⽤用及療效。︒｡⽬目前 的研究顯⽰示靈芝對中樞神經系統、︑､⼼心臟、︑､⾎血管、︑､呼吸系統、︑､肝臟、︑､調節⾎血糖、︑､降
⾎血壓、︑､抗癌、︑､抗過敏、︑､抗衰⽼老等皆有顯著的功效，且毒性極低，極具有開發的價 值(1, 3)。︒｡
近 年 來 ， 靈 芝 的 ⽣生 理 活 性 成 分 也 陸 續 被 發 現 ， 如 靈 芝 多 醣 體 (Polysaccharides) 、︑､三萜類 (Triterpenes) 、︑､核酸類及真菌免疫調節蛋⽩白質 (Fungal immunomodulatory proteins, FIPs)。︒｡
⼆二、︑､靈芝⽣生理活性成分
1. 靈芝多醣體
多醣體由多個單醣分⼦子脫⽔水形成糖苷鍵聚合⽽而成，成直鏈或⽀支鏈。︒｡多醣體為 靈芝細胞壁的成分之⼀一。︒｡靈芝多醣體與⼀一般澱粉相⽐比，多醣體由𝛽 1 → 3 所鍵 結，⽽而⾮非澱粉的𝛼 1 → 4 ，因此無法被消化系統中的澱粉酶所⽔水解。︒｡1970 年代 開始靈芝多醣體被廣泛地研究，已知具有抗癌、︑､調節⾎血糖、︑､增強免疫⼒力等功效。︒｡
然⽽而靈芝多醣體多經由將靈芝以熱或鹼性溶液萃取⽽而得，分⼦子量很⼤大且結構複雜，
故其完整結構⽬目前仍不清楚(4)。︒｡
2. 三萜類
三萜類為學者在研究靈芝苦味來源時發現(5, 6)。︒｡⽬目前從靈芝⼦子實體、︑､菌絲及 孢⼦子分離出的三萜類化合物超過⼀一百五⼗十種，有些苦味很強，有些淡⽽而無味。︒｡三 萜類主要由三個萜烯 (Terpene) 所組成，或被認為由六個異戊⼆二烯 (Isoprene) 所 構成。︒｡有關靈芝化學成份分析中以三萜類發表最多，其中也證實三萜類有抗癌、︑､
抗過敏、︑､促進肝功能、︑､抗氧化，甚⾄至是抗 HIV 等功能(7, 8)。︒｡然⽽而，三萜類化合 物穩定性較差，在靈芝中的含量會因栽種條件、︑､採收時期、︑､成熟程度⽽而有極⼤大差 異，萃取和濃縮過程也須避免⾼高溫及⾼高氧，避免破壞三萜類原有的結構，使其失 去活性。︒｡
3. 核酸類
靈芝核酸類化合物也被認為是⼀一種⽣生理活性成分，其分⼦子量較⼩小，包含了腺 嘌呤、︑､腺嘌呤核苷、︑､尿嘧啶、︑､尿嘧啶核苷和靈芝嘌呤等。︒｡也被證實有治療肌⾁肉萎 縮、︑､誘導⼲干擾素⽣生成、︑､鎮靜⽌止痛等功效(9)。︒｡
4. 真菌免疫調節蛋⽩白質
1989年 Kino 等⼈人⾃自 G. lucidum 菌絲體體分離⼀一個分⼦子量為 13 kDa 的蛋⽩白 質，命名為 LZ-8(10, 11)，並證實此蛋⽩白質具有免疫調節和促進細胞有絲分裂的 作⽤用(12)。︒｡
LZ-8的發現使靈芝研究進⼊入另⼀一個新⾯面向，隨後也⾃自其他種靈芝及⾷食⽤用真 菌中分離或釣取出類似的蛋⽩白質或其基因，例如：拱狀靈芝 (G. fornicatum) 中 的 FIP-gfo-1、︑､FIP-gfo-2；⼩小孢⼦子靈芝 (G. microsporum) 中的 FIP-gmi；草菇
(Volvariella volvacea) 中的 FIP-vvo；⾦金針菇 (Flammulina velutipes) 中的 FIP-fve 等(13-15)，其基因及胺基酸序列與 LZ-8 有⾼高度的相似性 （圖⼀一）。︒｡
此類蛋⽩白質分⼦子量約 13 kDa，⼤大約由 110 左右個胺基酸組成，結構上為 N 端⼀一個𝛼-helix 接續⼋八個𝛽-sheets，會藉由其 N 端區域形成同源雙體，Ｃ端區域則 由七個𝛽-sheets 組成⼀一個 Fibronectin type III domain (FNIII domain) (圖⼆二) ，此外 FIPs 的整體結構與免疫球蛋⽩白質重鏈的可變區 (Immunoglobulin heavy chain, IgVH) 有⾼高度的相似性(16)。︒｡
不同來源的真菌免疫調節蛋⽩白質在功效部分也不盡相同，⽬目前已知的功能有 免疫調節、︑､促進 T 淋巴球增⽣生、︑､促進淋巴球分泌細胞激素 (Cytokine)、︑､促進⼈人類
周邊⾎血液淋巴球 (Human peripheral blood leukocytes, hPBLs) 增⽣生及有絲分裂、︑､
抑制腫瘤⽣生⾧長、︑､抗過敏等功效(17)。︒｡
此外，真菌免疫調節蛋⽩白質可藉由異源蛋⽩白質表達系統取得，在過去已藉由 細菌、︑､真菌等表現系統成功地表現出有功效之蛋⽩白質，綜合以上幾點，真菌免疫 調節蛋⽩白質極具發展成藥物或保健⾷食品的潛⼒力。︒｡
三、︑､⼩小孢⼦子靈芝免疫調節蛋⽩白質
⼩小孢⼦子靈芝免疫調節蛋⽩白質 (GMI) 是本實驗室在 2005 年⾃自⼩小孢⼦子靈芝 (G.
microsporum) 中調取出的基因，並透過異源蛋⽩白質表現平台嗜甲醇酵母菌 Pichia
pastoris成功⽣生產之，重組 GMI 由 111 個胺基酸所組成，並經由 MALDI-TOF 判 定其分⼦子量為 15863.79 Da，其數值與理論分⼦子量相近，因此推斷此重組蛋⽩白質 無醣基化修飾(15)。︒｡
1. 蛋⽩白質結構
以 Pichia pastoris ⽣生產之重組蛋⽩白質 GMI 的蛋⽩白質結構，於 2008 年與臺灣
⼤大學⽣生化科技學系楊啓伸⽼老師實驗室及中研院王惠鈞研究員合作，利⽤用 X-ray 晶 體繞射法解出 (圖三)，其結構為⼀一同源四聚體，藉由 N 端區域的分⼦子間氫鍵及 疏⽔水性作⽤用⼒力形成雙體，雙體間⼜又靠疏⽔水性及氫鍵的⽅方式組成同源四聚體(18)。︒｡
在過去真菌免疫調節蛋⽩白質研究中發現雙體化的結構在此類蛋⽩白質的⽣生理活性 扮演著重要的⾓角⾊色，若將 LZ-8 N 端的 13 個胺基酸剔除，或將第五個胺基酸 leucine、︑､
第七個胺基酸 phenylalanine 及第⼗十個胺基酸 leucine 剔除，皆會使 LZ-8 無法形 成同源雙體，進⽽而喪失了免疫調節活性(19)。︒｡因此本實驗室過去針對此，將 GMI
的第六個胺基酸由 leucine 突變為 cysteine，並稱之為 GMI-L6C，發現雙硫鍵
(disulfide bond) 的形成可穩定 GMI 雙體化結構，並提升其促進⼈人類淋巴癌 T 細 胞株 Jurkat 分泌 IL-2 的刺激效果。︒｡由此亦証明雙體化結構對免疫調節功效的重 要性(20)。︒｡
2. 免疫調節活性
由 P. pastoris 異源表達的重組蛋⽩白質 GMI，在過去發現可以促進⽼老⿏鼠巨噬細 胞株 (Mice macrophages, J774A.1) 分泌 IL-6 及 TNF-α、︑､刺激 BALB/c ⽼老⿏鼠⾻骨髓 樹突細胞 (BALB/c mice bone marrow dendritic cells) 分泌 IL-12p40、︑､促進⼈人類淋 巴癌 T 細胞株 Jurkat 分泌 IL-2。︒｡除了促進免疫功能外，還能抑制 LPS 造成⼩小⿏鼠 巨 噬 細 胞 株 分 泌 促 發 炎 細 胞 激 素 (Mouse macrophage-like cell lines RAW264.7)(20)。︒｡
3. 抗腫瘤活性
在癌症治療⽅方⾯面，發現 GMI 處理過後的⼈人類⾮非⼩小细胞肺癌细胞 (Non-small
cell lung cancer cell lines, A549) 會因為⾃自噬作⽤用 (Autophagy) ⽽而死亡，此現象可 能和癌細胞表⾯面⼤大量表現的⼈人類表⽪皮⽣生⾧長因⼦子受體 (EGFR) 有關，有研究顯⽰示
GMI會與 A549 表⾯面的 EGFR 結合，並造成 EGPR 被胞吞 (Endocytosis) 後並降 解。︒｡在過去也有研究當細胞受到藥物或外界壓⼒力時，EGFR 亦會被胞吞並降解，
此外也會造成細胞⾃自噬作⽤用，因此推測 GMI 在毒殺癌細胞可能是透過此途徑。︒｡
此外 GMI 還影響 A549 的移動及侵略能⼒力，透過抑制促發炎細胞激素 TNF-𝛼活
四、︑､凝集素 (Lectins)
凝集素是⼀一種會與醣結合的蛋⽩白質，對醣類有⾼高度的專⼀一性。︒｡Lectin ⼀一字是 來⾃自於拉丁⽂文中的 legere，代表選擇的意思。︒｡最早關於凝集素的描述來⾃自 1888 年
Peter Hermann Stillmark發表的博⼠士論⽂文中，其中⾃自蓖⿇麻 (Ricinus communis) 的 種⼦子中分離出的凝集素，並命名為蓖⿇麻毒素（Ricin）。︒｡後續發現凝集素不只存在 於植物中，⽽而是廣泛存在於⾃自然界中。︒｡⽽而⼤大部份的凝集素以多倍體存在，多不具 酵素活性，可與游離於溶液中的醣類、︑､或與醣蛋⽩白質和醣脂上的醣分⼦子結合，會 造成細胞凝集或參與醣結合作⽤用 (Glycoconjugate)(24)。︒｡
1. 動物中的凝集素
在動物中的凝集素具有許多功能，像是調節細胞貼附 (Cell adhesion) 、︑､幫助 醣蛋⽩白質的⽣生成、︑､或調節⾎血液中蛋⽩白質含量。︒｡像是有些哺乳類肝臟細胞內的凝集 素會專⼀一性的辨認半乳糖，這些凝集素能幫助清除⾎血液循環中特定的醣蛋⽩白質 (25)。︒｡
凝集素也可能是⼀一種受器，例如可專⼀一性的辨識含有⽢甘露糖-6-磷酸
(Mannose-6-phosphate) 的蛋⽩白質，並將之送⾄至溶⼩小體中 (Lysosome) 分解。︒｡此外，
凝集素在免疫系統中也扮演著重要的⾓角⾊色，像是 MBL (Mannose-binding lectin) 在先天免液系統 (Innate immune system) 中，扮演了第⼀一道防線，會幫助抵抗外 來微⽣生物的⼊入侵。︒｡除了 MBL 外還有許多凝集素會辨認⼊入侵物，並啟動發炎反應 或藉由其他⽅方式清除掉外來物(26)。︒｡
2. 植物中的凝集素
相較於動物的凝集素，凝集素在植物中的功能較不明確。︒｡⼀一個較明確的功能 為幫助根瘤菌與植物體結合。︒｡此外，在種⼦子中的凝集素含量很⾼高，推測在種⼦子發 芽時扮演著重要的⾓角⾊色。︒｡⼜又有些植物的凝集素可與外來⼊入侵者的醣蛋⽩白結合，似
⼀一種免疫系統。︒｡最後植物中的凝集素除可與醣分⼦子結合外，也被發現可以藉由疏
⽔水性作⽤用⼒力與其他⾮非醣類的配體 (Ligand) 結合，像是 adenine、︑､auxins、︑､ cytokinin、︑､
indole acetic acid 或 ⽔水 溶 性 的 porphyrins ， 推 測 可 能 原 因 為 植 物 激 素 (phytohormones) 與這些物質結構相似(27, 28)。︒｡
3. 凝集素的應⽤用
科學家在發現了各種凝集素後，即開始探討凝集素除其本⾝身的⽣生理意義外，
是否有其他應⽤用。︒｡像⾖豆科植物中的 Phytohaemagglutinin (PHA) 被⽤用於研究蛋⽩白 質如何與醣分⼦子結合。︒｡在純化上，Concanavalin A (ConA) 常⽤用於純化醣蛋⽩白。︒｡⼜又 可因⾎血球上帶有不同的醣分⼦子，⽤用於鑑別不同⾎血型。︒｡此外，在對⼈人體疾病治療及 預防上，也⼜又許多的研究，像是凝集素可⽤用來診斷癌症、︑､調節細胞免疫系統、︑､毒 殺癌細胞、︑､或可⽤用於藥物載體幫助藥物標定⾄至⽬目標細胞。︒｡此外亦有許凝集素被發 現可以⽤用於治療其他疾病像是愛滋病、︑､⾵風濕性⼼心臟病、︑､糖尿病等。︒｡因此，凝集素 可能會是除了抗體外，下⼀一個具有潛⼒力成為蛋⽩白質藥物的新標的(29, 30)。︒｡
五、︑､Alanine scanning
此⽅方法利⽤用 alanine 去取代⽬目標蛋⽩白質中想探討之胺基酸，看置換前後對蛋
⽩白質本⾝身或其功能之影響，進⽽而決定突變位置的胺基酸於蛋⽩白質重要性為何。︒｡選 擇 alanine 的原因為其結構較⼩小、︑､化學鈍性⾼高、︑､胺基酸側鏈為⼀一個甲基、︑､將特定 胺基酸置換成 alanine 後，較不會影響蛋⽩白質原先的結構，⽽而能確定置換後，對 蛋⽩白質的影響確實爲胺基酸組成的改變所造成，⽽而⾮非蛋⽩白質結構。︒｡此⽅方法可透過 建構⼀一個⼤大的 PCR Library，以快速且全⾯面性的⾓角度瞭解蛋⽩白質結構。︒｡此外，可 透過⽣生物資訊學藉由熱⼒力學參數預測關鍵胺基酸位置。︒｡在分⼦子⽣生物學中 alanine scanning為⼀一常⽤用於探討蛋⽩白質中胺基酸對其功能或穩定性等影響之⽅方法(31)。︒｡
六、︑､Pichia pastoris 表達系統
P. pastoris為⼀一嗜甲醇酵母菌，並為⼯工業⽣生產常⽤用的異源蛋⽩白質表現
系統。︒｡作為⼀一異源蛋⽩白質表現系統 P. pastoris 具有許多優點，例如：⽣生⾧長速率 快、︑､培養基較便宜且簡單、︑､為真核⽣生物具較完整的轉譯後修飾、︑､且可利⽤用訊息 胜肽將蛋⽩白質分泌⾄至胞外等。︒｡此外，P. pastoris 具有 Aox1 及 Aox2 兩個酒精氧 化酶，幫助其使⽤用甲醇為唯⼀一碳源，此兩酵素的啟動⼦子皆受嚴謹調控，會因甲 醇誘導⽽而⼤大量表現，⼜又會受到其他碳源如葡萄糖、︑､⽢甘油及⼄乙醇等抑制。︒｡其中⼜又 以 Aox1 為主要代謝甲醇的酵素，因 AOX1 啟動⼦子表現量⽐比 AOX2 啟動⼦子的⾼高
⼗十倍以上，在甲醇誘導時 AOX1 mRNA 可達總 mRNA 的 5%，蛋⽩白質可達總可 溶蛋⽩白質的 30%。︒｡因此在異源表達時常利⽤用 AOX1 啟動⼦子來⽣生產異源蛋⽩白質 (32)。︒｡
七、︑､研究動機
1. ⽬目的
真菌免疫調節蛋⽩白質在過去研究他中，被證實具有多項對⼈人體有益的功效，
像是促進免疫系統、︑､抑制發炎反應、︑､抗腫瘤等，且相較於其靈芝⽣生理活性成分多 糖體或三萜類等，真菌免疫調節蛋⽩白質可以利⽤用異源蛋⽩白質表達系統⼤大量表現及 純化出⾼高純度的重組蛋⽩白質，不須經由菌絲或⼦子實體中分離純化，或化學合成等 過程，較為繁鎖且成分較不單⼀一的⽅方法取得，因此有更⾼高的潛⼒力成為臨床⽤用藥(12, 17)。︒｡
然⽽而在真菌免疫調節蛋⽩白質的研究上，雖然已知其具不同的功效，但到底此 類蛋⽩白質確切與細胞作⽤用的活性區、︑､對不同細胞作⽤用之受器、︑､或到底為何能有其
⽣生理活性的原因，皆為未知。︒｡因此這類蛋⽩白質在作為醫療保健⾷食品為很好的標的 物，但如想發展藥物，可因其功能間彼此交互作⽤用，造成不必要的影響。︒｡因此了 解此類蛋⽩白質是藉由胺基酸序列中的哪些部份與細胞進⾏行反應，⼜又參與在各功效 間的關鍵胺基酸是否相同，是值得被研究的議題。︒｡
在過去也有⼈人試著去探討 FIPs 上的胺基酸與其功能間的關係，有將不同來 源的 FIPs 藉由 DNA shuffling 的⽅方法(33)，將其基因打散後重組；或利⽤用⽣生物資 訊學的⼯工具，像是蛋⽩白質—蛋⽩白質對接 (Protein-protein docking)，藉由模擬及預 測其物理及⽣生化特性，再針對預測結果去改變 FIPs 上的胺基酸。︒｡想由這些⽅方式 去幫助我們了解 FIPs 中重要的胺基酸為何，並藉此強化其功效(34)。︒｡
⽽而本實驗室過去也藉由⽐比較不同來源的 FIPs 結構，發現其中在第六個跟第 七個𝛽摺疊 (𝛽-sheet) 中間的 loop 結構變異最⼤大，因此針對 GMI 此區塊進⾏行胺 基酸置換，發現似乎第 96 個胺基酸與刺激 Jurkat 細胞免疫調節功能有關(35)。︒｡此 外，也有前⼈人藉由合成 GMI 部分⽚片段胜肽去探討其功能，發現合成 N 端𝛼螺旋 (𝛼-helix) 即具有抗腫瘤的功效(36)。︒｡
然⽽而上述成果雖提出某部分胺基酸，對特定功能是有影響的，但仍未對到底
為何這些胺基酸是重要，提出合理的解釋。︒｡
2. 策略
2.1 Alanine scanning
在過去研究中，如果想要全⾯面性的了解⼀一蛋⽩白質中每個胺基酸的重要性，
Alanine scanning是⼀一個常⾒見的⽅方法(31)，因此想藉由此⽅方法去了解 GMI 上各胺 基酸之重要性。︒｡然⽽而此類蛋⽩白質 N 端前⼗十五個胺基酸在過去研究發現與之雙體 化有關(19)，所以選擇不去改變之，針對 GMI 第⼗十六個胺基酸開始，分別將每五 個胺基置換成五個丙胺酸 (Alanine)，總共會得到⼗十九種突變型蛋⽩白質。︒｡並純化 進⾏行功能性測試，期望能找到會影響原先功能的組別。︒｡
2.2 醣結合胺基酸點突變
然⽽而在過去研究中，真菌免疫調節蛋⽩白質會造成⼭山⽺羊⾎血球凝集、︑､在刺激免疫 細胞也會造成細胞凝集的現象(13)。︒｡此外，在不同物種所找到的凝集素有諸多功 能 也 與 真 菌 免 疫 調 節 蛋 ⽩白 相 似 。︒｡ ⽽而 過 去 在 FIP-fve 中 被 指 出 具 有 與
Thermoactinomyces vulgaris 的 R-47 α-amylase I 上的 carbohydrate binding module family 34 相似的結構，也發現 FIP-fve 刺激⼈人類周邊單核球細胞 (Human Peripheral Mononuclear Cells) 分泌 Interferon-𝛾 (INF-𝛾) 似乎確實與醣結合能⼒力 相關(37)。︒｡因此，在本研究中想知道是否 GMI 亦為⼀一凝集素，其⽣生理活性是靠著 與細胞表⾯面的醣分⼦子結合。︒｡⽽而在過去研究中，確認蛋⽩白質是否為凝集素，最簡單
⽅方法為，在其與細胞作⽤用時加⼊入不同的醣分⼦子，去看是否會抑制細胞凝集，或其 蛋⽩白質的效果，並藉由此⽅方式找到對應之醣分⼦子基質。︒｡此外，在過去研究中也發 現在能與醣結合的蛋⽩白質中，通常芳⾹香族的胺基酸扮演著重要的⾓角⾊色，其中⼜又以
⾊色胺酸 (Tryptophan) 最為重要(38-40)。︒｡因此，除了想知道 GMI 是否是⼀一種凝集 素外，也將探討 GMI 上的三個⾊色胺酸的重要性。︒｡
3. 欲達成⽬目標
本論⽂文的研究架構 (圖四)，欲達成具體⽬目標為：
1. 測試不同醣分⼦子是否會影響 GMI 對免疫調節活性及抗腫瘤功能。︒｡
2. 利⽤用澱粉酶處理細胞表⾯面醣分⼦子，看是否會影響 GMI 對免疫調節活性及抗腫 瘤功能。︒｡
3. 建構並表現純化各組帶特定位點突變之 GMI 蛋⽩白質。︒｡
4. 測試突變蛋⽩白質的免疫調節活性及抗腫瘤功能。︒｡
圖⼀一、︑､已發表之真菌類免疫調節蛋⽩白質氨基酸序列⽐比對 (Aligned by Bioedit) Figure 1. Alignment of amino acid sequence of published fungal
immunomodulatory proteins (Aligned by Bioedit)
圖⼆二、︑､LZ-8 同源雙體之三級結構
Figure 2. Overall structure of LZ-8 homodimer
圖三、︑､GMI 結晶四聚體結構
Figure 3. Overall structure of GMI tetramer
圖四、︑､本研究架構圖
Figure 4. Schematic framework of this study
第⼆二章、︑､材料⽅方法
⼀一、︑､細菌與真菌實驗
1. 培養基與藥品
Low salt LB broth：2 g Lennox L Broth (Alpha Biosciences) 配置成 100 mL 溶液，
⾼高溫滅菌 121oC ，20 分鐘後，室溫保存。︒｡
Low salt LB agar:於 Low salt LB broth 添加 1.5% agar (Cyrusbioscience)，⾼高溫 滅菌 121oC，20 分鐘後，降溫約 50oC ，倒於 9 cm petri dish，凝固後 4oC保存。︒｡
LB broth：2.5 g Luria-Bertani (Acumedia) 配置成 100 mL 溶液，⾼高溫滅菌 121oC， 20 分鐘後，室溫保存。︒｡
LB agar：於 LB broth 添加 1.5% agar，⾼高溫滅菌 121oC，20 分鐘後，降溫 約 50oC時倒於 9 cm petri dish，凝固後 4oC保存。︒｡
10x Dextrose stock solution (20%, w/v)：20 g Dextrose (D-Glucose anhydrous, Biotech) 配置成 100 mL 溶液，⾼高溫滅菌 121oC，室溫保存。︒｡
YPD broth：1 g Yeast extract (YE, Biotech) 及 2 g Peptone-A (From meat) (Biotech) 溶於 90 mL 蒸餾⽔水，⾼高溫滅菌 121oC，20 分鐘，冷卻後加⼊入 10 mL 之 10X Dextrose stock solution，室溫保存。︒｡
YPD agar：於 YPD broth 中添加 1.5% agar，⾼高溫滅菌 121oC，20 分鐘後，降溫 約 50oC倒於 9 cm petri dish，待凝後於 4oC保存。︒｡
Zeocin stock solution (Invivogen, R250-01)：100 mg/mL，-20oC避光保存。︒｡
Kanamycin stock solution (50 mg/mL)：500 mg Kanamycin sulfate (USP) 配置成 10 mL⽔水溶液，以 0.22 µm 濾膜過濾滅菌後保存於 4oC。︒｡
10x Glycerol stock solution (10%, w/v)： 10 g Glycerol (Glycerol anhydrous, J.T.Baker) 配置成 100 mL ⽔水溶液，⾼高溫滅菌 121oC，20 分鐘，室溫保存。︒｡
10x 磷酸鉀緩衝液 (Potassium phosphate buffer, 1 M, pH 6.0)：11.81 g KH2PO4
及 2.30 g K2HPO4 配置成 100 mL ⽔水溶液，調整 pH 6.0 ± 0.1，⾼高溫滅菌 121oC， 20分鐘。︒｡
500x biotin stock solution (0.02%, w/v)：20 mg D-biotin (Sigma) 溶於 100 mL 蒸 餾⽔水，以 0.22 µm 濾膜，過濾滅菌後保存於 4oC。︒｡
甲醇 (100%, v/v)：甲醇 (CH3OH, J.T. Baker) 以 0.22 µm 濾膜，過濾滅菌後保存 於 4oC。︒｡
BMGY 培養基：10 g yeast extract (YE, Biotech) 及 20 g peptone-A (from meat) (Biotech) 溶於 700 mL 蒸餾⽔水，⾼高溫滅菌後，加⼊入 100 mL 10x YNB、︑､100 mL 10x 磷酸鉀緩衝液、︑､2 mL 500x biotin、︑､100 mL 10x glycerol stock solution。︒｡
BMMY培養基：10 g yeast extract (YE, Biotech) 及 20 g peptone-A (from meat) (Biotech) 溶於 800 mL 蒸餾⽔水，⾼高溫滅菌後加⼊入 100 mL 10x YNB、︑､100 mL 10x 磷酸鉀緩衝液、︑､2 mL 500x biotin、︑､於使⽤用前添加適當濃度之 100%甲醇。︒｡
2. 菌株與培養條件
2.1細菌
本研究所使⽤用於質體建構與保存之宿主為⼤大腸桿菌 Escherichia coli EPI300 (Epicentre Technologies Corp, USA)。︒｡菌株於 Low salt LB broth 或 LB broth 中於 37oC、︑､150 rpm 震盪培養，或於 37oC固態培養於 Low salt LB agar 或 LB agar 上。︒｡
2.2真菌
本研究所使⽤用之重組蛋⽩白質表達系統為 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) 之嗜 甲醇酵母菌 Pichia pastoris KM71H (MutS, aox1::ARG4, arg4)。︒｡菌株於 YPD broth 中於 30oC、︑､250 rpm 震盪培養，或於 37oC固態培養於 YPD agar 上。︒｡
2.3菌株保存
為避免轉形株於繼代 (Subculture) 過程中，因插⼊入的外源基因不穩定被剔除，
或隨機產⽣生突變，因此將菌株養⾄至對數⽣生⾧長中期 (Mid-log phase) 後，細菌加⼊入 終濃度 15%之⽢甘油，真菌加⼊入終濃度 25％⽢甘油，並置於-80oC保存。︒｡
3. 質體建構與轉形株
3.1 Alanine scanning
本研究利⽤用重疊延伸 PCR 技術 (Overlap PCR) 將⽬目標基因 GMI-L6C ⾃自第⼗十 六個胺基酸開始，每五個胺基酸置換成五個丙氨酸 (Alanine)，共建構得⼗十九個 表現載體。︒｡利⽤用引⼦子對 EcoRI-GMI-F、︑､GMI-XYA-R 及 GMI-XY-F、︑､GMI-SalI-R 分別於前⼈人建構之質體中(41)，擴增出⽬目標基因前半段及後半段 (XY 代表突變 胺基酸的位點，假設將 GMI-L6C 上第 16 到 20 個胺基酸突變為五個丙氨酸，則
XY=1620，引⼦子詳情⾒見表 ⼀一)，再將擴增出來之前後半段產物作為模板，以引⼦子 對 EcoRI-GMI-F、︑､GMI-SalI-R 將突變的⽬目標基因擴增出來，並以限制酶 EcoRI 與
SalI 插⼊入以相同限制酶處理之 pPICZαA (Invitrogen)，完成特定突變為點之酵母 菌表現載體，並以 5’AOX 引⼦子進⾏行定序。︒｡
3.2 pPICZα-GMI-W12A
本研究利⽤用重疊延伸 PCR 技術 (Overlap PCR)，利⽤用引⼦子對 EcoRI-GMI-F、︑､
GMI-W12A-R及 GMI-W12A-F、︑､GMI-SalI-R 分別於前⼈人建構之質體中(41)，擴增 出⽬目標基因前半段及後半段，再以此前後半段產物作為模板，以引⼦子對 EcoRI- GMI-F、︑､GMI-SalI-R 將帶有點突變的⽬目標基因擴增出來，並以限制酶 EcoRI 與 SalI 插⼊入以相同限制酶處理之 pPICZαA (Invitrogen)，完成特定突變為點之酵母 菌表現載體，並以 5’AOX 引⼦子進⾏行定序。︒｡
3.3 pPICZα-GMI-W25A
本研究利⽤用重疊延伸 PCR 技術 (Overlap PCR)，利⽤用引⼦子對 EcoRI-GMI-F、︑､
GMI-W25A-R及 GMI-W25A-F、︑､GMI-SalI-R 分別於前⼈人建構之質體中(41)，擴增 出⽬目標基因前半段及後半段，再以此前後半段產物作為模板，以引⼦子對 EcoRI- GMI-F、︑､GMI-SalI-R 將帶有點突變的⽬目標基因擴增出來，並以限制酶 EcoRI 與 SalI 插⼊入以相同限制酶處理之 pPICZαA (Invitrogen)，完成特定突變為點之酵母 菌表現載體，並以 5’AOX 引⼦子進⾏行定序。︒｡
3.4 pPICZα-GMI-W110A
利⽤用引⼦子對 EcoRI-GMI-F、︑､GMI-W110A-R 於前⼈人建構之質體中(41)，擴增出 帶有單點突變的⽬目標基因，並以限制酶 EcoRI 與 SalI 插⼊入以相同限制酶處理之
pPICZαA (Invitrogen)，完成特定突變為點之酵母菌表現載體，並以 5’AOX 引⼦子 進⾏行定序。︒｡
3.5 pPICZα-GMI-W25G
本研究利⽤用重疊延伸 PCR 技術 (Overlap PCR)，利⽤用引⼦子對 EcoRI-GMI-F、︑､
GMI-W25G-R及 GMI-W25G-F、︑､GMI-SalI-R 分別於前⼈人建構之質體中(41)，擴增 出⽬目標基因前半段及後半段，再以此前後半段產物作為模板，以引⼦子對 EcoRI- GMI-F、︑､GMI-SalI-R 將帶有點突變的⽬目標基因擴增出來，並以限制酶 EcoRI 與 SalI 插⼊入以相同限制酶處理之 pPICZαA (Invitrogen)，完成特定突變位點之酵母 菌表現載體，並以 5’AOX 引⼦子進⾏行定序。︒｡
3.6 pPICZα-GMI-W12A/W25G/W110A
本研究利⽤用重疊延伸 PCR 技術 (Overlap PCR)，利⽤用引⼦子對 EcoRI-GMI-F、︑､
GMI-W12A-R及 GMI-W12A-F、︑､GMI-SalI-R 分別於質體 pPICZα-GMI-W25G 中，
擴增出⽬目標基因前半段及後半段，再以此前後半段產物作為模板，以引⼦子對
EcoRI-GMI-F、︑､GMI-W110A-R 將帶有點突變的⽬目標基因擴增出來，並以限制酶
EcoRI 與 SalI 插⼊入以相同限制酶處理之 pPICZαA (Invitrogen)，完成特定突變為 點之酵母菌表現載體，並以 5’AOX 引⼦子進⾏行定序。︒｡
4. 嗜甲醇酵母菌電穿孔轉形法
4.1 P. pastoris勝任細胞製備
將單⼀一菌落之 P. pastoris 接⾄至 3 mL YPD broth 中，培養 20 ⼩小時，⾄至 OD600
約 15，取 1 mL 菌液接⾄至 100 mL YPD broth 中，使 OD600介於 0.1-0.2 之間，培 養約七⼩小時，使 OD600介於 1-2 之間，以 3000 g、︑､4 oC離⼼心 5 分鐘，去上清加⼊入 50 mL Pre-treat buffer (100 mM LiOAc, 10 mM DTT, 0.6 M sorbitol, 10 mM Tris- HCl, pH7.5)，於 30 oC靜置 30 分鐘。︒｡1500 g、︑､4 oC離⼼心 10 分鐘後，以 2 mL 1 M sorbitol清洗三次，以 1 M sorbitol 回溶菌體⾄至 500 µL，並分裝每管 80µL 冰上備
⽤用。︒｡
4.2電穿孔轉形
將表現載體以限制酶 SacI 切成線狀後，經純化並測濃度，取 1 µg 線狀質體 與事前準備好的勝任細胞，加⼊入 0.2 mm Gap cuvette (No.620 BTX, San Diego, USA)
(BTX, San Diego, CA, USA)，以 1.5 kV、︑､25 µF、︑､200 Ω 進⾏行電穿孔轉形，後以 1 mL 1M sorbitol稀釋菌體，並於 30 oC下靜置 60 分鐘，取 250 µL 菌液塗⾄至 YPDSZ agar (1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Dextrose, 1 M Sorbitol, 1.5% Agar, 100 µg/mL Zeocin) 上，30oC靜置培養 2~3 天。︒｡
5. 轉形株篩選
5.1 抗性篩選
將電穿孔後，在篩選培養基⾧長起來的菌落，挑選約 100 個菌落，分別點⾄至含 有 100、︑､300、︑､500 µg/mL Zeocin 的篩選培養基上，初步藉由抗性基因的強弱，來 判斷轉形株所帶有⽬目標基因拷⾙貝數的多寡，並挑選抗性強的作為後續蛋⽩白質表現 的菌株。︒｡
5.2轉形株染⾊色體簡易分析
以⽛牙籤挑取合適⼤大⼩小轉形株之單⼀一菌落，點⾄至 0.02 N NaOH 中，以 95 oC、︑､
10 分鐘破菌後做為模板，以專⼀一性引⼦子進⾏行聚合酶鏈鎖反應，並以電泳確認轉 形株是否帶有⽬目標基因。︒｡
⼆二、︑､蛋⽩白質表現與分析
1. 蛋⽩白質表現
將嗜甲醇酵母菌轉形株接種⾄至 100 µg/ml zeocin 的 YPD broth 中，250 rpm、︑､
30oC 震盪培養 24 ⼩小時，再接種⾄至 100 mL BMGY，以 250 rpm、︑､30oC 震盪培養 24 ⼩小時，後以 3000 g、︑､10 分鐘離⼼心置換濃縮⾄至 20 mL BMMY 中，並每⽇日以 1%
甲醇誘導⽬目標蛋⽩白質表現，五天後以 3000 g、︑､10 分鐘離⼼心收取上清液，保存於- 80oC備⽤用。︒｡
2. 蛋⽩白質純化與濃縮
2.1 試劑儀器
濃縮離⼼心管：Amicon® Ultra Centrifugal Filter-3 kDa
Ni-NTA樹脂：GE Healthcare Ni SepharoseTM High Performance。︒｡
Phosphate buffer：20 Mm PB, 500 mM NaCl, pH 7.4，室溫保存。︒｡
300 mM Imidazole phosphate buffer: 20 Mm PB, 500 mM NaCl, 300 mM Imidazole, pH 7.4，避光保存。︒｡
2.2 實驗⽅方法
將收取之胞外上清液以 0.45 µm 濾膜過濾後，以 3 kDa 濾膜的濃縮離⼼心管以
3000 g、︑､4oC 濃縮離⼼心，並將溶液置換成含有 10 mM Imidazole 的 PBS buffer，再 以 0.22 µm 濾膜過濾後，通⼊入 Ni-NTA 管柱，收取流出管柱的溶液。︒｡待管柱上 層液相流乾後以⼗十倍膠體體積之 10 mM Imidazole buffer 流洗，並收取流洗液。︒｡
逐步提⾼高 Imidazole 濃度，50 mM ⾄至 300 mM Imidazole buffer 梯度流洗五倍膠 體體積，收取流洗出的蛋⽩白質，後以 15% SDS-PAGE 確認蛋⽩白質⽚片段⼤大⼩小，挑 選含有⽬目標蛋⽩白質之流洗液，以濃縮管濃縮⾄至體積⼩小於 1 mL，並置換成適當緩
衝溶液，以 0.22 µm 濾膜過濾除菌後，保存於 -20oC 冷凍庫 待後續細胞實驗使
⽤用。︒｡
3. 蛋⽩白質定量
本研究中使⽤用 Bradford ⽅方法來定量蛋⽩白質，將 50 µL 經不同倍率稀釋的樣品 或已知濃度的 BSA (bovine serum albumin, BSA, Sigma-Aldrich) 作為標準品 (標 準品濃度為 0.2 mg/mL-2 mg/mL)，加⼊入 96 孔盤後加⼊入 200 µL 稀釋五倍的
Bradford 5x Dye Reagent (Bio-Rad)，於 37oC 反應 5 分鐘，以測定 595 nm 吸 光值，並以標準品做出標準曲線後，選擇迴歸係數 R2 >0.99 的回歸線，推算樣 品蛋⽩白質濃度。︒｡
4. 聚丙烯醯胺膠體電泳 4.1 試劑儀器
15% SDS-PAGE running gel：1.1 mL ddH2O, 2.5 mL 30% (29 : 1)
Acrylamide/Bisacrylamide (Bio-Rad), 1.3 mL 1.5 M Tris (pH 8.8), 0.05 mL 10%
SDS, 0.05 mL 10% Ammonium persulfate (APS), 0.002 mL TEMED (Bio-Rad) , 補
⽔水⾄至 5 mL。︒｡
5% SDS-PAGE stacking gel：1.4 mL ddH2O, 0.33 mL 30% Acrylamide, 0.25 mL 1.5 M Tris (pH 6.8), 0.02 mL 10% SDS，10% APS, 0.002 mL TEMED，補⽔水⾄至 2 mL，。︒｡
4X protein loading dye：40% Glycerol, 240 mM Tris/HCl pH 6.8, 8% SDS, 0.04%
Bromophenol blue，蒸餾⽔水配置，-20oC保存。︒｡
垂直式電泳槽：Mini-PROTEAN Tetra Cell, Life Science Education, Bio-Rad, USA
10x電泳緩衝液 (TGS)：250 mM Tris-base, 1.92 M Glycine, 1% SDS，蒸餾⽔水配 置，調整⾄至 pH 8.3，以 0.22 µm 濾膜過濾，室溫保存。︒｡
CBR染⾊色液 ：0.5 g Coomassie Brilliant Blue R-250 溶於 250 mL 之 100% 甲 醇，加⼊入 45 mL 100% 醋酸，配成 50 mL ⽔水溶液，以 0.22 µm 濾膜過濾，室溫 保存。︒｡
脫⾊色液：10 mL 冰醋酸，20 mL 100%甲醇，配成 100 mL ⽔水溶液，室溫保存。︒｡
4.2 實驗⽅方法
將蛋⽩白質樣品三⽐比⼀一與 4x loading dye，95oC、︑､⼗十分鐘煮沸後，注⼊入 5%
SDS-PAGE中，以 70 伏特電壓膠集蛋⽩白質樣品，待樣品跑到下層 15% SDS- PAGE running gel後，將電壓調⾄至 100 伏特，直到 loading dye 跑出膠體，將膠
⽚片拆下後，以 CBR 染⾊色液在 50 rpm 染 30 分鐘，再以脫⾊色液將膠⽚片背景退⾄至 透明。︒｡
5. 西⽅方墨點法
5.1 試劑儀器
Transfer buffer: 25 mM Tris-base, 192 mM Glycine, 10% Methanol, dH2O配置, pH 8.3，0.22 µm 濾膜過濾，常溫保存。︒｡
Gelatin-Net: 0.25% Gelatin, 0.15 M NaCl, 5 mM EDTA.Na, 50 mM Tris-Base, 0.05%
Tween-20，dH2O配置，4oC保存。︒｡
10x Phophate buffer (PBS): 0.1 M NaH2PO4, 1.3 M NaCl, pH 7.0，0.22 µm 濾膜過
PBST: 將 1x PBS 加⼊入 0.05% Tween-20，常溫保存。︒｡
呈⾊色試劑：Western LightningTM Plus-ECL
5.2 實驗⽅方法
將跑完的 SDS-PAGE 浸泡 Transfer buffer 5 分鐘，並將 0.45 µm PVDF 轉印 膜 (Polyvinylidendifuorid; PVDF, PerkinElmer, USA) 浸泡於 100% 甲醇 10 分 鐘。︒｡正極到負極以兩張浸潤 Transfer buffer 之濾紙、︑､PVDF 膜、︑､電泳膠⽚片、︑､兩張 浸潤濾紙的順序，放⼊入濕式電泳轉印槽 (Bio-Rad)，以 400 mA、︑､兩⼩小時的條件將 蛋⽩白質由膠體轉印到膜上。︒｡後將 PVDF 膜以 Gelatin-Net 於室溫下、︑､轉速 50 rpm 震盪作⽤用 1 ⼩小時，減少⾮非專⼀一性結合，以 Gelatin-Net 稀釋 5000 倍之⼀一次抗體
(Monoclonal anti-His, rabbit) 於 4oC 反應隔夜。︒｡以 PBST 清洗 PVDF 膜 3 次，每 次 10 分鐘。︒｡以 Gelatin-Net 稀釋 5000 倍帶有 HRP 之⼆二次抗體 (anti-rabbit IgG, goat) 於室溫下、︑､50 rpm 、︑､1 ⼩小時。︒｡以 PBST 清洗 PVDF 膜 3 次，每次 10 分鐘。︒｡
加⼊入呈⾊色劑，以偵測冷光訊號。︒｡
三、︑､細胞培養與分析
1. 試劑與培養基
胎⽜牛⾎血清：Fetal Bovine Serum (FBS, Gibco 10438026)
DMEM 培養液：Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM (1x) + GlutaMAXTM, Gibco 10569-010)，使⽤用前須⽽而外添加 10% FBS，4oC 保存，使⽤用前於 37oC ⽔水 浴槽回溫。︒｡
RPMI 1640 培養液: RPMI Medium 1640 (1x) (Gibco A10491-01)，使⽤用前須⽽而外 添加 10% FBS，，4oC 保存，使⽤用前於 37oC ⽔水 浴槽回溫。︒｡
胰蛋⽩白酶：0.25% Trypsin-EDTA (1x) (Gibco 25220-056)。︒｡
PBS：Dulbecco’s phosphate buffer saline (DPBS, Gibco 14190-144)，室溫保存。︒｡
2. 細胞株及培養條件
2.1⼈人類肺腺癌細胞株 A549
細胞株：⼈人類肺腺癌細胞株 A549 由台灣⼤大學⽣生化科技學系陳進庭⽼老師，原購⾃自
ATCC (Rockville, MD) 於 37oC、︑､5% CO2靜置培養於含有 10% FBS 的 DMEM 中，約 2-3 天繼代⼀一次，繼代時吸除舊的培養液，以 DPBS 清洗⼀一次，加⼊入 Trypsin 於 37oC 作⽤用⼗十分鐘，加⼊入新的培養液終⽌止 Trypsin 作⽤用，並分取適量細胞⾄至新 的培養液中，完成繼代。︒｡
實驗⽅方法：於實驗前⼀一晚，吸除舊的培養液，以 DPBS 清洗⼀一次，加⼊入 Trypsin 於 37oC 作⽤用⼗十分鐘，加⼊入新的培養液終⽌止 Trypsin 作⽤用，並將細胞稀釋 3×104
cells/mL，於 24 孔盤中種⼊入 100 µL 之細胞液，使最終細胞濃度為 3x103 cells/mL， 待細胞貼附後，吸除培養基，加⼊入不同濃度的重組蛋⽩白質及醣分⼦子，於 37oC、︑､
5% CO2靜置作⽤用 48 ⼩小時，進⾏行細胞存活分析。︒｡
2.2⼈人類淋巴癌 T 細胞株 Jurkat
細胞株：⼈人類淋巴癌 T 細胞株 Jurka 由台灣⽣生化科技學系張麗冠⽼老師提供，原 購⾃自 ATCC (Rockville, MD)，於 37oC、︑､5% CO2 靜置培養於含有 10% FBS 的 RPMI Medium 1640中，約四天繼代⼀一次。︒｡
實驗⽅方法：於實驗前⼀一天將細胞株重新培養⾄至含有 10% FBS 的 RPMI1640 培 養基，並維持細胞密度為 2×105 cells/mL以上。︒｡以 300 g、︑､5 min 將細胞離⼼心，去 上清後，重新懸浮⾄至 2×106 cells/mL，於 24 孔盤中種⼊入 500 µL 之細胞液，再加
⼊入不同濃度的重組蛋⽩白質及醣分⼦子、︑､正控制組 PMA(Phytohemagglutinin)/PHA
(phytohemagglutinin) 或負控制組之培養基，使最終細胞濃度為 1x106 cells/mL， 總體積為 1 mL。︒｡於 5% CO2 、︑､ 37oC 靜置培養六⼩小時，1000 g 離⼼心 2 分鐘收集 上清液進⾏行後續 IL-2 分泌濃度測定。︒｡
3. 抗腫瘤活性測試
利⽤用細胞存活分析 (MTT assay) 測試⽬目標蛋⽩白質毒殺癌細胞的功能，3-(4，
5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromide (MTT) 為粒線體中琥
珀酸脫氫酶 (Succinate dehydrogenase, SDH) 的受質，因此 MTT 經活細胞中的
SDH及細胞⾊色素 c (Cytochrome c, cyt c) 作⽤用後會產⽣生紫⾊色甲䐶 (formazan)，以 此為判斷細胞的存活。︒｡在重組蛋⽩白質作⽤用 48 ⼩小時，將 96 孔盤中上清液吸除，加
⼊入 100 𝜇L 0.5 mg/mL MTT，於 37oC培養箱反應 2 ⼩小時，隨後吸除上清液，加⼊入
100 µL DMSO，兩⼩小時使 formazan 溶解後，以 ELISA reader 測量波⾧長 570 nm 吸 光值，並以未經重組蛋⽩白質處理之負控制組作為 100%存活率，計算出細胞的相 對存活率。︒｡
4. 細胞免疫活性測試
細胞免疫活性測試採⽤用測量細胞受刺激後分泌的細胞激素含量，本研究中以三明 治酵素連結免疫分析法 (Sandwich Enzyme-linked immunosorbent assay)測量之。︒｡
藥品與試劑:
細胞激素含量分析套組：Human IL-2 ELISA kit (R&D system, Inc., Minneapolis, MN, USA)
PBS：137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4，以 ddH2O 配置，調整⾄至 pH 7.2–7.4，以 0.22 µm 濾膜過濾，常溫保存。︒｡
Wash buffer：0.05% Tween-20 溶於 PBS，pH 7.2 – 7.4，常溫保存。︒｡
Block buffer：1% BSA 溶於 PBS，保存於 4oC，分裝使⽤用，使⽤用前先回溫。︒｡
Reagent diluent：0.1% BSA, 0.05% Tween-20 溶於 20 mM Tris base，150 mM NaCl 溶液中，調整⾄至 pH 7.2–7.4，0.22 µm 濾膜過濾，4oC 保存，分裝使⽤用，使⽤用前先 回溫。︒｡
Capture antibody：720 µg/mL Mouse anti-human IL-2，溶於 PBS，分裝保存於- 20oC。︒｡使⽤用時以 PBS 稀釋成 4 µg/mL。︒｡
Detection antibody：90 µg/mL Biotinylated goat anti-human IL-2 溶於 Reagent diluent，分裝保存於 -20oC。︒｡使⽤用時以 Reagent diluent 稀釋成 500 ng/mL。︒｡
Standard：60 ng/mL Recombinant human IL-2 溶於 ddH2O，分裝保存於-20oC。︒｡使
⽤用時以 Reagent diluent 稀釋成 1000 ng/mL，兩倍序列稀釋⾄至 25 ng/mL 作為標準 品。︒｡
Streptavidin-HRP： Streptavidin 連接 Horseradish-peroxidase (HRP)，4oC 保 存，
使⽤用時以 Reagent diluent 稀釋。︒｡
實驗⽅方法:於 96 孔盤中加⼊入 100 µL/well 4 µg/mL 之 Capture antibody，室溫反應
18⼩小時。︒｡隔⽇日以 PBST 清洗三次，加⼊入 300 µL Block buffer 室溫反應⼀一⼩小時。︒｡
PBST清洗三次後，再加⼊入 100 µL 不同濃度之 IL-2 標準品 (最⾼高濃度為 1000 ng/mL) 及待測樣品，室溫反應兩⼩小時。︒｡以 PBST 清洗三次，接著加⼊入 100 µL 500 ng/mL Detection antibody，室溫反應兩⼩小時。︒｡以 PBST 清洗三次，再加⼊入 100 µL 以 Reagent diluent 稀釋 250 倍 Streptavidin-HRP，避光室溫反應 20 分鐘。︒｡以 PBST 清洗三次後 加⼊入 100 µL TMB 呈⾊色液，室溫避光呈⾊色，以 ELISA 光度計
每 5 分鐘測定⼀一次波⾧長 650 nm 吸光值，直⾄至反應完成。︒｡最後以標準品做出標準 曲線後，選擇迴歸係數 R2 >0.99 的回歸線，推算樣品濃度。︒｡
⼆二、︑､統計分析
以 Student T test 對各重複試驗組進⾏行單尾⾮非成偶檢定，分析 IL-2 及存活 率偵測結果各組間是否具顯著差異，定 P < 0.05 為具顯著差異。︒｡
表 ⼀一、︑､建構表現載體與定序之引⼦子序列
Table 1. The primer used for plasmids construction and sequencing
名稱 序列(5'端到 3'端)
⽤用於建構表現載體的引⼦子
EcoRI-GMI-F AGCTGAATTCATGTCCGACACTGCCT
GMI-SalI-R ＡGAGTCGACGTTCCACTGGGCAA
GMI-W12A-F CTTCACGCTCGCCGCTAACGTGAAGCAGC GMI-W12A-R GCTGCTTCACGTTAGCGGCGAGCGTGAAG GMI-W25A-F CTACACTCCAAACGCTGGCCGCGGGCGTC GMI-W25A-R GACGCCCGCGGCCAGCGTTTGGAGTGTAG GMI-W25G-F TACACTCCAAACGGAGGCCGCGGGCGTCC GMI-W25G-R GGACGCCCGCGGCCTCCGTTTGGAGTGTA GMI-W110A-F CATTGTTGCCCAGGCTAACGTCGACCATC GMI-W110A-R GATGGTCGACGTTAGCCTGGGCAACAATG GMI-1620A-F GCTGCTGCTGCTGCTTACACTCCAAACTGG GMI-1620A-R AGCAGCAGCAGCAGCCTTCACATTCCAGGC GMI-2125A-F GCAGCAGCAGCAGCAGGCCGCGGGCGTCCC GMI-2125A-R TGCTGCTGCTGCTGCGTCGAACGCGAGCTG GMI-2630A-F GCAGCAGCAGCAGCAAGCAGCTTTATCGAC GMI-2630A-R TGCTGCTGCTGCTGCCCAGTTTGGAGTGTA GMI-3135A-F GCTGCTGCTGCTGCTACCGTCACCTTCCCG GMI-3135A-R AGCAGCAGCAGCAGCGGGACGCCCGCGGCC GMI-3640A-F GCAGCAGCAGCAGCAACGGTCCTGACTGAC GMI-3640A-R TGCTGCTGCTGCTGCGTCGATAAAGCTGCT GMI-4145A-F GCAGCAGCAGCAGCAAAGGCGTACACGTAC GMI-4145A-R TGCTGCTGCTGCTGCCGGGAAGGTGACGGT GMI-4650A-F GCTGCTGCTGCTGCTCGCGTCGTCGTTTCC GMI-4650A-R AGCAGCAGCAGCAGCGTCAGTCAGGACCGT GMI-5155A-F GCTGCTGCTGCTGCTGGAAAGGACCTCGGC
GMI-5155A-R AGCAGCAGCAGCAGCGTACGTGTACGCCTT GMI-5660A-F CTGCTGCTGCTGCTGTGCGCCCCTCATACG GMI-5660A-R CAGCAGCAGCAGCAGCGGAAACGACGACGC GMI-6165A-F GCTGCTGCTGCTGCTGCGGTCGAGAGCGAC GMI-6165A-R AGCAGCAGCAGCAGCGCCGAGGTCCTTTCC GMI-6670A-F GCGGCAGCAGCAGCAGGCTCGCAGAAAATC GMI-6670A-R TGCTGCTGCTGCCGCGTATGAGGGGCGCAC GMI-7175A-F GCTGCTGCTGCTGCTAACTTCCTCGAATAC GMI-7175A-R AGCAGCAGCAGCAGCGTCGCTCTCGACCGC GMI-7680A-F GCAGCAGCAGCAGCAAACTCCGGCTACGGC GMI-7680A-R TGCTGCTGCTGCTGCGATTTTCTGCGAGCC GMI-8185A-F GCTGCTGCTGCTGCTATCGCGGACACGAAC GMI-8185A-R AGCAGCAGCAGCAGCGTATTCGAGGAAGTT GMI-8690A-F GCTGCTGCTGCTGCTACGATCCAAGTGTAC GMI-8690A-R AGCAGCAGCAGCAGCGCCGTAGCCGGAGTT GMI-9195A-F GCTGCTGCTGCTGCTGTCATTGACCCCGAC GMI-9195A-R AGCAGCAGCAGCAGCGTTCGTGTCCGCGAT GMI-96100A-F GCAGCAGCAGCAGCAACCGGCAACAATTTC GMI-96100A-R TGCTGCTGCTGCTGCGTACACTTGGATCGT GMI-101105A-F GCTGCTGCTGCTGCTATTGTTGCCCAGTGGAAC GMI-101105A-R AGCAGCAGCAGCAGCGTCGGGGTCAATGAC GMI-106111A-F TGCTGCTGCTGCTGCTGCGAAATTGTTGCCGGT GMI-106111A-R GCAGCAGCAGCAGCAGCAGTCGACCATCATCAT AatII-5’STE13-F AAAGACGTCTGGGGGCCTCCAGGACTTG
5’STE13-BamHI-R GGGGGATCCGCTGTTTGAATCTGGAACG
BamHI-HIS4-F GGGGGATCCTAAATCAGAATTGGTTAAT
HIS4-AvrII-R GAACCTAGGATTAATTCGCCTTAGACAT AvrII-3’STE13-F AAACCTAGGTACTGGGAACCACGAGACA 3’STE13-XhoI-R AAAACTCGAGCTCTCATTAGGCCCACCTA
⽤用於定序的引⼦子
M13F CAGTATCGACAAAGGACACACT
5' AOX1 GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3' AOX1 GCAAATGGCATTCTGACATCC
HIS4-Internal-1 ATTGTCGACAATGTTCGTTAAGAATG HIS4-Internal-2 CTGAGACCGCAAAGTTGGTAGATG
第三章、︑､實驗結果
⼀一、︑､嗜甲醇酵母菌表現系統表現免疫調節蛋⽩白質
1. 突變質體構築
以 EcoRI 與 SalI 切位將擴增出來的帶有特定位點突變之 GMI 基因，接合到
pPICzαA 質體中，並經定序無誤共得 23 個以 AOX1 啟動⼦子啟動並帶有 α-factor 與 6xHis-tag 之⽬目標基因表現載體，質體圖譜以其中⼀一組建構 pPICzα-GMI-W12A 為例 (圖六)，定序結果詳⾒見 (圖五、︑､圖七)。︒｡
2. 表現菌株篩選
將表現載體以限制酶 SacI 切成線狀後，以電穿孔轉形法將之電⼊入表現宿主 P.
pastoris KM71H勝任細胞中，並培養於篩選培養基 YPDSZ 上，待 2-3 天菌落⾧長
成，以不同抗⽣生素濃度的 YPDZ agar 篩選出抗性較佳的轉形株，以其中⼀一組建構
pPICzα-GMI-W12A為例 (圖⼋八) ，並挑選 2-5 之轉形株，以搖瓶誘導 5 天，每⽇日 添加 1%甲醇並取樣，之後以 SDS-PAGE 及西⽅方墨點法分析，選出蛋⽩白質表現兩 較⾼高的，並進⾏行菌落聚合酶鏈鎖反應 (Colony PCR) 確認基因確實有被嵌⼊入宿主 基因中，以其中⼀一組建構 pPICzα-GMI-W12A 為例 (圖九)，皆能在相對位置看到
⽬目標基因⽚片段。︒｡
3. 蛋⽩白質表現、︑､純化與分析
3.1 Alanine scanning
在 Alanine scanning 的部分，針對 GMI 第⼗十六個胺基酸開始，分別將每五個 胺基置換成五個丙胺酸 (Alanine)，總共有⼗十九種，以搖瓶誘導 5 天，每⽇日添加 1%甲醇並取上清液後，跑 15% SDS-PAGE 結果顯⽰示，以突變組 GMI-2125A 及 GMI-8185A 兩組為例 (圖⼗十)，在預期⽬目標⼤大⼩小位置皆無訊號，且下⽅方有兩個降 解的訊號產⽣生，且在西⽅方墨點法結果中，以突變組 GMI-2125A 及 GMI-8185A 兩 組為例 (圖⼗十⼀一)，此兩個訊號皆會被 anti-His 的抗體所辨認到。︒｡
3.2突變型 GMI
突變型 GMI 中有 GMI-W12A、︑､GMI-W25A、︑､GMI-W25G、︑､GMI-W110A、︑､
GMI-W12A/W25G/W110A 四個組合，以搖瓶誘導 5 天，每⽇日添加 1%甲醇並取 上清液後，由 15% SDS-PAGE 結果顯⽰示，GMI-W12A 及 GMI-W110A 皆可在預 測⽬目標蛋⽩白質⼤大⼩小的位置 (約 13.58 kDa) 看到相似⼤大⼩小的⽬目標條帶，⽽而在西⽅方 墨點法結果中，GMI-W12A (圖⼗十⼆二)、︑､GMI-W25G (圖⼗十六)、︑､GMI-W110A (圖⼗十 三) 及 GMI-W12A/W25G/W110A (圖⼗十七)在⽬目標位置可被 anti-His 抗體所辨認。︒｡
但 GMI-W25A 則無法在 15% SDS-PAGE 或西⽅方墨點法結果中看到任何訊號 (圖
⼗十四)，但從胞內蛋⽩白質的西⽅方墨點法結果中 (圖⼗十五)，可發現預期⽬目標蛋⽩白質
⼤大⼩小 (約 13.58 kDa) 的位置有相應的訊號出現，此外在約 26 kDa 處亦可發現會 被 anti-His 的抗體辨認之訊號，推測為雙體化之⽬目標蛋⽩白質。︒｡
將 P. pastoris 所表現之 GMI-W12A (圖⼗十⼋八) 、︑､GMI-W25G (圖⼗十九)、︑､GMI-
W110A (圖⼆二⼗十)、︑､GMI-W12A/W25G/W110A (圖⼆二⼗十⼀一) 蛋⽩白質，使⽤用 Ni-NTA 管柱純化，蛋⽩白質約在 Imidazole 濃度為 150 mM 時，會被流洗出來，利⽤用 Bradford
⽅方法量測出含有⽬目標蛋⽩白質的劃分 ，後將含有⽬目標蛋⽩白質之劃分跑 15% SDS-
PAGE，可發現經純化後的蛋⽩白質，與胞外上清液 (XT) 相⽐比，純度確實提升，
另外在處理樣品時試著不額外添加 β-mercaptoethanol (βME)，避免雙硫鍵因還原
⽽而打斷，由此確定⽬目標蛋⽩白質確實可以靠雙硫鍵形成同源雙體。︒｡此外，在終產量 的部分 GMI-W12A、︑､GMI-W110A 每毫升的胞外上清液約可以純出 0.2 mg 的⽬目 標蛋⽩白質，⽽而 GMI-W25G、︑､W12A/W25G/W110A 則約 0.1 µμg。︒｡
⼆二、︑､抗腫瘤活性測試
1. 醣結合競爭測試 (Sugar binding Competition assay)
在本研究中，分別使⽤用了 Maltose、︑､Fructose、︑､Glucose、︑､N-acetylneuraminic acid、︑､
Starch五種醣分⼦子，想看會不會影響 GMI 毒殺⾮非⼩小細胞肺癌 A549 的功能，由結 果 (圖⼆二⼗十⼆二) 中發現六種醣類皆不影響毒殺效果。︒｡此外，單獨加⼊入醣分⼦子並不 會抑制細胞⽣生⾧長，以此作為負控制組 (圖⼆二⼗十⼆二)。︒｡
2. 澱粉酶影響 GMI 抗腫瘤活性
想利⽤用澱粉酶與 GMI 競爭細胞表⾯面的醣基化，看是否會影響 GMI 抗腫瘤活 性，間接証明 GMI 確實是與細胞表⾯面受體的醣分⼦子結合，⽽而造成其下游之反應，
