第二章 淺談 prion 的發展歷史

第二章 淺談 prion 的發展歷史

本章將就 prion protein 在人類及動物中的致病發展歷史及其結構 上的變化做一簡單的介紹，以了解其研究背景。

2.1、克魯症（kuru）

1950 年，巴布亞新幾內亞東部高地的南富雷村落裡，出現了一 種名為「克魯」的疾病[6] 。 「克魯」 ，依照富雷族的語言，意思是「因 為寒冷或恐懼所產生的顫抖」 ，這個症狀專門發生在婦女及小孩子身 上，男性成年人並沒有這類的症狀，所以當地人認為，這個疾病是 由巫術所造成的。當感染到此疾病時，患者會無法控制的發抖、步 伐蹣跚、說話不清楚，最後開始全身癱瘓，且死亡率達 100%。

之後， Gajdusek 及其他研究者開始著手研究這種地方性的怪異且 致命的疾病，並根據他們所看到染病的富雷人的症狀--判斷出克魯症 是一種新形式的腦感染性疾病，並發現患者的小腦的神經細胞以及 大腦下面的部分，有明顯退化的現象[7,8]。由於當地的衛生環境惡 劣，所以一開始，他們假設克魯症是一種因為感染而形成的一種疾 病，但若是經由傳染，也就是外來組織的蛋白質入侵人類身體時，

身體應該會產生發炎的現象，而身體的淋巴、免疫系統會產生

抗體來毀滅外來者，以求自 保。而發炎會造成發燒，腦脊 椎淋巴液的細胞數會增加，使 液體充滿了脊椎，造成腦部及 身體其他部分的改變。但是當 他們為患者的腦部解剖時，卻 沒有一個克魯症患者有發炎的 現象，且在研究兒童患者的頭 部時，他們看到一種腦部損傷 情形--澱粉樣蛋白斑

（amyloid） ，一種非常微小的蛋 白質結球。過去只有在罹患阿 茲海默症（Alzheimer`s disease）

的人腦中才看的到，這是典型 的腦部老化才有的症狀[10] 。於 是，Gajdusek 便從患者的生活

習慣中觀察，得知他們有食用死去的親人的習俗，而他們食用的親人 的屍體也是因為患有克魯症而死亡的。這是發現 prion 的第一類接觸。

圖 2-1 克魯症患者喪失行為能力[9]

圖 2-2 澱粉樣蛋白斑[10]

2.2、庫賈式症（CJD）

庫賈式症（Creutzfeldt- Jakob Disease）是在 1913 年由 Creutzfeldt 發現的病症，他們發現一個病患會無時無刻的發抖，臉部肌肉顫動，

於是根據這些症狀，推斷應該是腦部的某部分神經受損。所以當患者 死亡之後，Creutzfeldt 解剖屍體並檢查腦部，他發現腦部雖然沒有發 炎，卻被不知名物質殺死了數以百萬計的腦細胞，造成嚴重的受損。

而腦中空出來的位置，則被神經膠細胞（glia）進駐。而在 1921 年 Jakob 也發現他的病人有相同的症狀，因此這種嶄新而危險的腦部疾病被取 名為 CJD[10,11]。

不過，由於解剖及分 析技術的不成熟，

Creutzfeldt及Jakob忽略 這個疾病最獨特且重要 的一項症狀--腦內的洞 狀組織，而沒將其紀錄下 來。這個看似海綿的洞狀

組織，後來稱為海綿狀改變（spongiform change）的組織，是為判斷 CJD最重要的一項特徵。後來，在研究克魯症時，比較其與CJD之間 的差異。發現克魯症的分佈集中，只出現在富雷村及新幾內亞其他部

圖2-3 星形神經細胞症出現的暗色星星

落的婦女及小孩身上；而CJD則平均分佈在全球，年齡層分佈廣。克 魯症主要侵襲小腦，使小腦產生海綿狀改變的小洞，得病的患者無法 說話，失去協調呼吸、喉頭、上顎、舌頭和嘴唇等肌肉的能力；而 CJD除了小腦受到破壞使患者失去行動能力外，它同時也破壞了主控 思考的大腦，所以CJD患者早期會顯露喪失心智功能的症狀，而克魯 症患者到臨死前都還能夠保持清醒，但到底是什麼原因造成克魯症和 CJD，一直到1950年代末，還沒有人知道原因。[9,10,11]

2.3、羊搔癢症（scrapie）

羊搔癢症，這個疾病最早的紀錄是在1730年英國的東安格利亞

（East Anglia） ，這個病症最大的特徵就是綿羊會感覺身體發癢，使牠 磨蹭牆壁、樹幹、籬笆等地方以求得解脫。此外，病羊還會走路不穩、

顫抖、瞎眼、摔倒、最後導致死亡。沒有人知道羊如何得到此病，但 是在中歐流行已久，所以許多牧羊人相信羊搔癢症是一種遺傳性疾 病，所以並不會傳染給人，也就沒有禁止人們食用已得病的羊肉

直到1930年左右，法國獸醫證實了羊搔癢症是傳染病。他們從患

有羊搔癢症的綿羊中取下腦部組織，攪勻以後，注射入健康的綿羊體

內。經過一段很長的潛伏期之後，大約有30%的健康羊隻開始顯露出

病徵，最後死亡。接著再 以山羊為試驗對象，證明 山羊會100%的受到這疾病 的感染，而每一隻被注射 的山羊最後都因羊搔癢症 而死[14]。

羊搔癢症的病原體非 常的頑強，當取下綿羊腦 組織後加入甲醛液，將兩

者混合攪拌均勻之後，再注射入綿羊體內，原本預期甲醛液能夠殺死 病原體，但是接受甲醛液注射的羊群依舊會因羊搔癢症死亡，證明了 病原體是非常不容易被消除的。

Hadlow在英國研究羊搔癢症，其中最關鍵的病理特徵，就是腦 細胞中的小洞。這些被列為羊搔癢症最大特徵的海綿組織不僅出現在 小腦，在大腦外層，也就是人類思考用的腦皮質中也有增生的現象。

此外，他發現以前在研究羊搔癢症時常被人忽略的星狀神經膠細胞，

也有不正常的繁殖，且為數眾多[8,9,11]。

經由Hadlow的比對[8,9,10]，他發現羊搔癢症跟克魯症的病理竟 非常相似（圖2-5，2-6），且兩種疾病都未分解出任何微生病原體，

圖2-4 患羊搔癢症的羊，背上的毛被磨

損[10]

以至於這兩種疾病的傳播途徑為何，在當時並沒有人知道。但在經由 實驗，證實羊搔癢症可以跨越品種，從綿羊傳播到山羊，再從山羊傳 播到綿羊身上。所以Hadlow認為如果可以使克魯症的病原體成功地 移植到人猿或猴子上，說不定便可從裡頭找到共同的病原體，進而研 究該病症了。

在此時，Gajdusek同時也進行了一項與Hadlow的想法相似的實 驗：長時間的人猿活體實驗。他將克魯症患者的腦萃取液直接接種到 人猿的腦部，經過了兩年多的時間之後，人猿開始出現類似克魯症的 症狀，且發展迅速。最後解剖出來的結果，人猿的病理與人類克魯症 是無法分辨的，更加證實了除了羊搔癢症外，克魯症也是一種傳染性 疾病而非遺傳性疾病。[7,9,11]

圖2-5 羊搔癢症綿羊腦部切片[10] 圖2-6 克魯症患者腦部切片[10]

此外，Gajdusek同時也將CJD患者 的腦萃取液注射到人猿腦中。最後，人 猿也是產生CJD相關的病理現象，雖然 能夠證實這三種疾病有共同的特徵，都 具有傳染性，不過，依舊未找出這三種 疾病的病原體為何[11]。而之後，

Prusiner也將這一類的腦部海綿狀病 變，稱為可傳播海綿狀腦疾病（TSE，

transmissible spongiform encephalopathies）[15]。

2.4、貂瘟

Hadlow在美國的一個養殖水貂農場研究水貂的中央神經系統病 變。牠們的行為怪異，會無意義地在籠子裡打轉，後臀、後腿、尾巴 會以一種怪異的姿勢翹起，經過解剖之後，病理竟與羊搔癢症相同，

在當時，一般認為羊隻因為吃胎盤或是與有病的羊隻混在一起放牧才 會得到羊搔癢症，但從來沒有聽過水貂會得到羊搔癢症。於是Hadlow 便研究過去發生的貂病，他發現1947年及1961年曾發生過類似的流行 性貂病。而他也將這個貂腦組織注射到一些沒有病的水貂身上，七個

圖2-7 患CJD的人猿下巴無法閉

合[9]

月後，這些貂也開始出現上述的行為[16]。

這種貂的疾病，後來便稱為傳染性貂腦病（TME，transmissible mink encephalopathy）。野生的水貂似乎沒有TME的問題，只有被飼 養的水貂才會感染到這種腦類疾病，所以有可能是水貂的食物出了問 題。貂是肉食動物，養貂的人一般用生肉、屠宰包裝廠的動物內臟、

魚、肝和穀物餵食。所以羊搔癢症可能是TME感染最有可能的病源。

但第一次爆發TME是在1947年的威斯康辛州，比在美國的密西根州內 發生的羊搔癢症還要早，所以可能不是羊搔癢症將腦病傳染給水貂

但在研究TME的獸醫發現，有一些得了所謂倒牛症（downer）的 牛隻被拿去餵食水貂，而使得吃了倒牛症的貂得了TME而死。倒牛症 是指牛隻緊張易怒，變得有攻擊性、腳步不穩、協調性變差、最後無 法站立而倒下病死的症狀。然而，牛隻中並沒有任何與羊搔癢症類似 的疾病。這是病原體跨物種傳染的第一次發現[9,17]。

2.5、狂牛病

狂牛病，其實指的就是牛隻腦部海綿化（BSE，bovine spongiform encephalopathy）的疾病，最早於1986年的英國所發現[18,19] 。起初，

得病的牛會變得具有攻擊性、容易緊張，身體的協調性也變得很差，

一跑動就會摔倒，數週之後便倒地死亡。而這些牛隻的腦部組織也有 海綿質破壞及星形神經細胞症的現象。而且狂牛病傳染的範圍更由英 國，擴張到英格蘭。經由調查發現，所有得到狂牛病的牛隻都是乳牛，

而且這些乳牛都沒有與患有羊搔癢症的羊一起放牧，所以排除了其他 可能的共同傳染源後，就只剩一個潛在因素：食物污染。而乳牛的食 物當中，有一種飼料符合了食物污染的條件：一種肉與骨綜合的粉狀 蛋白質補充品。

為了增加乳產量，乳牛需要食用高蛋白質的食物，所以牧場老闆 便利用報廢牲口骨肉磨粉、煮熟、曬乾的替代品做成乳牛所食用的飼 料，來增加牛乳的產量。這些死掉的動物包括罹患各種未經診治的疾 病而死亡的牛羊[9,19]。

1994到1997年間，英國死於CJD的患者多達數十位，但是由於CJD

是屬於偶發現象，發生的機率是百萬分之一，同時發生在英國的機率

其實是相當的低的，所以這些病例格外得到英國人的注意。之後，英

國又發生了許多BSE的案例，並發現這些病例中，腦部病變的範圍與

CJD相比，更類似於狂牛病。經由調查研究發現，這些病患在死亡之

前，都是熱愛食用牛肉加工食品。而這些疑似因食用狂牛病牛肉加工

食品所引起的新型CJD則稱為 vCJD（new-varient CJD）[9,19]。

2.6、GSS、FFI及醫源性庫賈氏症

CJD有時候也會在家族中流傳，相較於全球得病機率百萬分之一 的偶發性病例，這些家族成員的得病機率為千分之一。例如格斯特曼 症候群（Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome，又稱GSS）就是一 種較為罕見的CJD的變形，致死的速度較為緩慢，確實是一種家族性 疾病[20]。而且在90年代，陸續發現二十種不同的遺傳性疾病和GSS 症的家族性病變形式[21]，其中比較著名的便是由基因組（genome）

突變所產生的FFI（fatal familial insomnia）疾病。這類疾病的家族成 員得病之後會無法入睡，最後產生幻覺，陷入長期昏迷，終至死亡

此外，醫生在醫療時，無意中引發之疾病被稱為「醫源性

（iatrogenic）」疾病，在1974年，一位接受眼睛手術的病人因為接受 了因CJD患者所捐贈的眼角膜，在手術後的一年半左右，開始產生了 CJD的症狀，證明了經由移植，也會傳染CJD[8,9]。

此外，一位治療癲癇症手術的患者，在手術的過程中，由於接觸

過治療CJD患者所使用過的電極棒而感染到CJD，而當初，這個醫療

用的電極棒也是經由加熱、甲醛液、紫外線等殺菌方式，但患者還是

一樣受到感染，證明了CJD是一種幾乎殺不死的病原體。但CJD的病

原體究竟是病毒，還是其他的致命的物質，當時並不清楚[8,9]。

此外，還有一些疾病也是與上述的澱粉樣及海綿狀病變及是相關 的：帕金森氏病（Parkinson’s disease）、肌萎縮性側索硬化症

（Amyotrophic lateral sclerosis） 、紅斑性狼蒼（Lupus erythematosus）、

真性糖尿病（True diabetes）、多發性硬化症（Multiple sclerosis）、類 風溼性關節炎（Rheumatoid arthritis）和某些腫瘤性疾病等都可能是 由prion感染所引起的。[20]

2.7、病原體的研究

由於 Watson 和 Crick 在1953年提出的去氧核糖核酸（DNA）

的報告，證明了DNA製造RNA（核糖核酸），RNA製造蛋白質。他假 設蛋白質的製造過程永遠是單向性的--

轉譯

蛋白質

轉錄

⎯ → ⎯ ⎯ ⎯ → ⎯

⎯ RNA DNA

也就是說，蛋白質不會製造蛋白質，蛋白質不會製造RNA，蛋白質

也不會製造DNA。在培養被羊搔癢症傳染的組織時，組織中並無法

讓它長出任何細菌（至少在非電子的顯微鏡下看不到東西） ，於是假

設病原體是一種「濾過性病毒」(virus)[11,12]。經由電子顯微鏡的觀

察發現，濾過性病毒這個東西是一些外表包著蛋白質的 DNA 或

RNA 鏈條的小細菌。如果說羊搔癢症的病原體是濾過性病毒，那當 感染到羊搔癢症時，應當會使綿羊的身體產生發炎、發燒等反應，但 在發病之前，得病的羊群並沒有上述症狀產生，讓人不禁懷疑病原體 是否為濾過性病毒的可能性，所以當時稱羊搔癢症的病原體為類病毒

（viroid）或慢病毒（slow virus）。

而在1966年， Alper、Haig、Clarke三位研究學者發現，經由直 線加速器（linear accelerator）的量測，理應可以計算出羊搔癢症的病 原體大小[21]。但他們的實驗結果發現，羊搔癢症的病原體內若有核 酸基因組合的話，那這個病原體的基因組合應該會比最小的濾過性病 毒的基因還要小上一千倍。

另外，Prusiner利用被感染的倉鼠（Hamster）腦組織經蛋白酶消 化，並用硫酸銨（Ammonium sulfate）沉澱萃取病原體，再經由瓊脂 凝膠電泳後純化的製品進行實驗，結果顯示病原體製品經過多種核酸 酶類處理後，其感染力並不會降低，這也證明了病原體不含核酸[20] 。

Alper也利用紫外線照射濾過性病毒及羊搔癢症的混合溶液

症的病原體卻完全不受影響。因此，他們便下了一個非常驚人的結

論： 「由於羊搔癢症的病原體可以在寄生動物中繁殖，我們必須假設

它的結構必定有核酸。然而，即使將它曝露於大量的紫外線之下，使

其吸收核酸特別敏感的波長，都不會使它失去活動力，顯示這種病原 體可能在本身沒有核酸的情況下，增加數量」 。沒有核酸而能複製的 可傳染性病原體，這在生物界中是極為獨特的現象。

此外，研究更發現，若使用能夠對核酸產生傷害的酵素來浸泡羊 搔癢症的腦部，並不能減少病原體的感染性；而利用焦炭酸二乙酯

（Diethyl pyrocarbonate，DEPC）處理病原體，使病原體變性之後，

再用蛋白質復性劑（Renature agent）作用，病原體的感染性又恢復，

這也證明了病原體具有蛋白質成分。因此，Gajdusek猜測，羊搔癢症 可能不具核酸，也有可能是核酸藏在特別的蛋白質保護膜內，不受紫 外線的侵襲[20]。

而在電子顯微鏡的發明及幫助之下， Merz 發現了羊搔癢症更細 微的結構[22,23] 。她在比較正常的羊的腦部及患羊搔癢症病的羊的腦 部時發現，在羊搔癢症的標本裡，經由剛果紅（Congo Red）染色後，

發現了一種棒狀物，看似一段段扭曲的短線頭或是纖維形狀的物質

（圖2-8，2-9），且數量隨病情的嚴重程度而增加。此外，她更猜想，

此棒狀物與在克魯病死者的大腦中所發現的澱粉樣蛋白是相同的東 西，亦是羊搔癢症的致病因子，也為往後的研究開創了另一個新的研 究方向。

Prusiner因為在實驗中，發現能破壞核酸的化學藥品，對羊搔癢

症毫無作用，反而是能破壞蛋白質的化學藥品和處理方式，可以減少 或預防感染而有了以下的結論--「羊搔癢症的致病因子不含核酸」

[11]。因此，Prusiner在 Science 雜誌提出，用「prion」來稱呼羊搔癢

症的病原體，取代了「類病毒致病因子」的名詞[1]。

雖然prion已被觀察是為纖維狀物或是棒狀物，但是在計算其形狀 時，還是採用了有效利用幾何形狀的最大形狀--球形，並推算出顆粒 直徑為4-6 nm。在這種情況下，假設蛋白殼體最厚為1 nm，核心應該 是14.1 nm

，那麼其所包含的核苷酸不可能超過12個。根據三聯密碼

（triplet code）法則，根本不可能編碼出250個氨基酸組成的PrP。所 以Prusiner認為prion是一種體積極小，具傳染性的蛋白質，而主張prion 有可能是少量核酸外圍包有緊密的蛋白質外殼或是完全不含核酸的 傳染性蛋白質[20]。

之後，Prusiner在1984年又進一步證實prion是一種結構不均一的 醣蛋白[24]。他利用蔗糖梯度離心（sucrose gradient centrifugation）和 聚丙烯醯胺凝膠電泳法（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）

純化分離，獲得高純度的PrP,進而研究這種蛋白的超微結構。更在已

感染羊搔癢症的倉鼠大腦中，萃取出一種與感染有關的蛋白質，且組

織受感染程度愈嚴重，所取得的蛋白質愈多。在電子顯微鏡下看到這

些提煉出來的PrP具有桿狀顆粒的外型，因此稱為桿狀prion（也就是

Merz所發現的纖維形狀的物質），而每根桿狀物含有約一千個PrP分 子。經由剛果紅染色之後觀察，證實了這些具傳染性、導致退化的神 經性疾病中發現的凝聚團狀之典型的澱粉樣纖維，就是prion所組成的

與Prusiner合作的Weissmann，解開了PrP的化學密碼[26] ，他利用 這種蛋白質的基因排列順序在基因庫裡找到對應的DNA排列順序，

發現PrP的基因存在於感染羊搔癢症的敘利亞倉鼠(SHa)細胞中，但也 存在於正常倉鼠和正常人的細胞之中。

SHaPrP是由254個胺基酸所組成的，在PrP的COOH端有GPI所依 附著。PrP

原本是利用GPI依附在細胞的表面，由於GPI與細胞之間 分裂，會使得PrP

脫離細胞表面。此外，還有一組雙硫鍵位在COOH 端的Cys-179及Cys-214處結合，這組雙硫鍵具有穩定PrP

的作用

圖2-8 在電子顯微鏡下所見的纖維 狀物質[23]。

圖2-9 由圖中可知纖維狀物質中

也會有澱粉樣斑點存在[23]。

[11,12]。

經由蔗糖梯度離心、柱層分析（column chromatography）和離子 輻射法（ionization radiation）推算出PrP

及PrP

的分子量皆只有 33~35 kD（kilo-Dalton） ，且兩者的一級結構皆相同，證實了正常與患 病兩種形式的PrP有約209個完全相同的基因密碼（見圖2-10）

。

在研究PrP

及PrP

的差異性時，有一個重要的關鍵，就是正常 的PrP

很容易就被PK水解，但致命的PrP

則無法被消化，且 PrP

在 PK作用下切割序列，可產生分子量只有27-30 kD的PrP 27~30（見圖 2-10）。PrP 27~30大約在序列90~231的位置，是為蛋白酶抵抗性蛋白

（Protease-resistant protein），是為PrP

的核心[12]。當大量的PrP

結 合成特定的形狀，因此才會有桿狀澱粉樣的蛋白。

在早期，由於並沒有儀器能夠精確的測量PrP的結構，只能利用 化學分子模擬（molecular modeling）的方法[27,28]，預測出PrP

是為 含有四個α-helix（H1：109~122。H2：129~140。H3：178~191。H4：

202~218。）（圖1-1及圖2-11）的結構，而 PrP

的結構則是由兩對

平行的β-sheet及兩個α-helix所組成（圖1-2）。 經由Fourier transform

infrared(FTIR)及circular dichroism(CD)光譜測量prion的結構，PrP

的

結構中含有約40%的α-helix及3%的β-sheet，而PrP

則含有約30%的

α-helix及45%的β-sheet。且PrP

中NH

端的H1及H2，就是形成PrP

中

β-sheet的主要成份，所以在PrP

中，NH

端處上的四個殘基

（Asn-108，Met-112，Met-129，Ala-133），被視為和PrP

互相結合 的關鍵處[12,29,30]。

之後，經由nuclear magnetic resonsnce（NMR）測量出在基因轉 殖鼠中的基因重組（recombinant）PrP（rPrP）包含了胺基酸序列 90~231，相當於SHaPrP 27-30[31] 。其結構含有3個α-helix（helix A~C）

及2個短小的β-sheet（S1及S2）（圖2-11，2-12），結構與PrP

類似。

既然先前預測出PrP

的NH

端H1及H2是為形成β-sheet的主要部

圖2-10 經由敘利亞倉鼠(SHa)腦部所萃取出來的蛋白質的PrP序列簡

圖[12]。

分，那COOH端的H3及H4為何不會形成β-sheet？除了H3上的Cys-179 及H4上Cys-214的雙硫鍵有穩定結構的作用外，在COOH端（殘基 215~230處），PrP

與protein X結合（圖2-13），再與PrP

交互作用，

這也是H3及H4在轉變的過程中沒有產生變化的原因。protein X的作 用是在PrP

結構當中，具有伴隨及穩定蛋白質摺疊的功能[31,32]。

經過證實，大腦會製造正常的PrP

，但是正常的PrP

有時會變 成致命的PrP

的形式。在病患腦中正常的PrP

為什麼會變成致命的 PrP

？Prusiner等人研判，正常的PrP

可能會因為基因突變、環境影 響、偶發的情況下，亦或其他的因素而轉變成具有β平板結構的致命 性PrP

（見圖2-14（A）~（D））[31,32,33]。

而致命的PrP

是如何在人腦中產生堆疊的？Prusiner相信具傳染 性的BSE，其感染方式是以一類似結晶的方式所進行的。羊搔癢症原 纖維就是這種PrP

結晶所形成的長條狀集合物絞扭在一起

[22,23,24,34]（圖2-15），而克魯病澱粉樣蛋白斑則是堆積在患者腦部

的原纖維，集結成較大的團塊。當PrP

侵入神經細胞膜製造PrP的位

置時，就取代PrP

的晶核的地位，並開始影響周圍PrP

的結構，進

而產生更多異常的PrP

。同時，細胞依然繼續生產PrP，因此當PrP

持續的影響、改變PrP

時，PrP

便在腦中不斷累積，造成妨礙或毒

害某些神經細胞的功能，使細胞遭到破壞直到細胞死亡為止。之後身

體便會清除死亡的神經細胞，造成BSE典型的空洞[12]。

2.8、PrP在內質網上的結構

早期，原本判定若是prion所引起的神經性疾病，就是由於PrP

在 腦部中堆疊所引起的[35]。但是經由研究指出，並非所有的神經性疾 病都含有大量的PrP

，部分遺傳性的PrP突變在缺乏PrP

的情況之 下，也會造成神經性衰退的疾病[36,37,38,39] 。例如在2.6所提到的GSS 家族性疾病，及一些基因突變所引起的prion疾病，在這些疾病的腦部 的萃取物中檢測出，除了含有極少量PrP

外，其中大部分卻是被一 種稱為

PrP的蛋白質所佔據[40]，這些蛋白質是構形上變異的PrP，

並被預測為引起傳染及遺傳性prion疾病中關鍵的PrP結構。這些

PrP 原本是出現在內質網膜上，並利用其COOH端的GPI附著並橫跨在內 質網（endoplasmic reticulum，ER）的兩側，等到

PrP大量的在內質 網累積之後，再退出內質網並進入細胞中，造成致命的結果。

此外，也有許多的實驗證實了

PrP有可能是導致神經病變的主

要原因[40,41]。Hegde及其他的研究學者利用基因轉殖工程，使實驗

的基因轉殖鼠會產生PrP，並使PrP在穿透膜周圍或內部的胺基酸產生

突變，其中這些突變的PrP較容易形成

PrP。在實驗中，這些老鼠所

產生的

PrP超過一個定量時，便會發展出像罹患羊瘙癢症特徵的自

發性神經疾病，但是在這些老鼠當中，並沒有發現PrP

的存在。若 將老鼠的

PrP減少，且令其不會產生

PrP，則並不會導致老鼠的 死亡。而

PrP的量越多，則老鼠發病的時間就越短[41]。

另外，當這些老鼠被接種了患羊瘙癢症的腦萃取液時，他們發現，

當注射定量的腦萃取液到兩組不同的老鼠上時（其中一組的PrP形成

Ctm

PrP的比例較高，另一組較低），皆會產生prion疾病的症狀，但體 內含較少

PrP的老鼠，經測量得知其體內雖然產生較多的PrP

，但 需要產生prion疾病的時間卻比較久；而體內含有較多

PrP的老鼠，

其體內雖然只有測量到少量的PrP

，但是發病的時間卻比較快（且 死亡的時間比沒有接腫患羊瘙癢症的腦萃取液的老鼠要快的多）

[41]，這也說明了^Ctm

PrP可能是造成神經病變的主要原因。

同時，他們也將患羊瘙癢症的腦萃取液注射到帶有正常PrP序列

（沒有突變基因）的基因轉殖鼠身上，並記錄這些老鼠體內的

PrP 的變化量。在感染的過程當中，也會發現

PrP會大量的累積[41]。

綜合了以上的實驗結果，更可以解釋

PrP可能是prion直接造成家族 性及感染性的神經退化性疾病，而PrP

則是扮演著間接增加

PrP的 角色。

在內質網，發現除了與PrP相同序列但結構不同的

PrP存在以

外，還有另外兩種不同構形的PrP也存在於內質網處[40,42]。

內質網是參與合成蛋白質的地方，是為雙層磷脂結構，PrP在此 作最後的蛋白質合成，因此PrP是一種膜蛋白。膜蛋白有兩種型式：

周邊型（peripheral）及嵌入型（integral或transmembrane） （圖2-16）。

雖然PrP是醣蛋白，且其他的醣蛋白在內質網合成時，通常都只具有 單一方向的形狀。不過經由觀測時，卻發現PrP同時具有周邊型及嵌 入型這兩種不同的形狀[40] 。其中，周邊型的PrP完全移位到內質網的 內腔處(lumen)（圖2-17） ，稱之為分泌（secretory）形式的PrP (又稱為

sec

PrP)，這一形式的PrP與PrP

類似。另一種形式的PrP則橫跨內質網 膜的兩側，其中一部份的分子曝露在細胞液中（cytosol）（圖2-17）。

而橫跨的PrP形式又分成兩種，一種是COOH端在內腔中，而在NH

端 在細胞液中的PrP，稱之為

PrP。另一種則是NH

端在內腔中，而 COOH端在細胞液中的PrP，稱之為

PrP。不管是

PrP還是

PrP，

它們橫跨於膜的兩側時，兩者在膜中都擁有相同的疏水性殘基（殘基 111-134，又稱為TM1）[40,42]（圖2-17）。且在細胞液中加入PK，也 可以用來判斷在內質網處的PrP是何種構形 [40](圖2-18)。TM1的結構 為α-helix的結構。

在研究中，Prusiner利用含有各種基因突變的基因轉殖鼠來測試

任何可能的神經性疾病時發現，當大量的

PrP存在於內質網時，若

PrP中第117個殘基發生突變（A117V，alanine to valine）之後，會造

成神經退化性疾病（如GSS）[40]，且其結構穩定。而且利用清潔劑 將內質網膜去除，再加入PK進行水解的作用之後，發現

PrP及PrP

一樣，都具有抵抗PK的特定結構[40]（圖2-19），這也說明了

PrP對 神經性退化疾病而言，扮演著重要的角色。而導致GSS疾病的胺基酸 A117V正好位在TM1之中，因此，我們便利用這個突變的胺基酸在內 質網膜內的性質，來進行我們的電腦模擬。

2.9、半定量測定法

在實驗的測量當中，為了快速的得到實驗結果，普西納設計出一 套評估羊搔癢症感染較快的方法：他採用潛伏期僅老鼠一半的基因轉 殖鼠，而且當注射羊搔癢症病原體到基因轉殖鼠的腦部當中，且只要 出現疾病的症狀就列入統計，不必等到老鼠死亡，這種方法在病毒學 當中又叫作半定量測定法。

在病毒學的研究當中，在單位體積中測定感染性病毒的量，稱之

為滴定（titration）。檢測病毒可靠的方法為檢測其感染性，病毒懸浮

液的滴定通常以單位體積中的感染單位數來表示，能夠產生一個反應

的最小病毒量稱為一個感染單位（infectious unit）。測定病毒感染性

基本上分為定量測定和半定量測定。由於普西納的研究是以半定量測

定分析。所以，底下我們只介紹半定量測定的研究方法[20]。

半定量測定法，是一種系列終點稀釋（serial end-point dilution）

測定法，不記錄接種物中感染病毒的數量，而是根據有無病變等來判 定的一種定性測定法，這種方法雖不及定量測定法準確，但可縮短潛 伏期時間，進而得到大量的數據。其實驗方法如下（非普西納實驗方 法，但測定的方式相同）：

1、將 5 支消毒試管排列於試管架上並置於冰中，每管加入 1.8ml 稀釋液，用注射器安裝滅菌滴管，吸取病毒懸浮液 0.2ml，加入第一 管內，棄去此滴管，另取一個滴管，將第一管內液體混合均勻，並從 中吸取 0.2ml 加入第二管，使成為

病毒稀釋液，按此法同樣稀釋 成

、

、

等不同病毒稀釋度。

2

、將各種稀釋度的病毒接種到實驗的生物體上，每稀釋度接種

隻，以「病毒學概論」書中的範例為基準，試驗時用

至

稀 釋度的病毒，接種後按病毒增殖的情況，觀察記錄動物死亡或病變情 況並依表

計算各稀釋度死亡百分率。

假定一動物注射

稀釋度的病毒液仍能生存，則在注射

、

等較高的稀釋度時，也應當生存。所以累積總計欄內，各組應生

存的動物總數是由注射較低稀釋度而生存的動物，向注射較高稀釋度

而生存的動物數累加而得。相反的若一動物死於

稀釋度，則亦應

會死於注射

、

等較濃的病毒液。所以總計死亡動物數時，是

由較高稀釋度致死的數目向低稀釋度致死的數目累加而得。由表可知 此病毒所致半數動物死亡的稀釋度介於

與

之間而較接近

，計算方法如下：

的死亡百分數 距離比例 低於

的死亡百分數 高於

的死亡百分數

高於 ==

−

−

% 50

% 50

% 50

% 50

）

（或 0 . 4 36

. 58 0 21 13

71 50

71 = =

−

−

0 . 3 10

%

50 死亡率的最低稀釋度的 對數值 = Log −

= − 高於

4 . 0 1 4 . 0 4

.

0 ） × 稀釋比例的對數值 = × （ − ） = − 距離比例（

4 . 3 50

50效價= LD 終點值的對數值=10⁻ LD

4 .

10

即為此病毒半數致死量，因此病毒的 10

稀釋度，可使一定數 量的動物有 50%死亡。終點（end point）法獲得的病毒效價，其中普 西納所使用到的名詞：

半數致死量

50

=

LD

（lethal dose）

半數感染量

50

=

ID

（infectious dose）

表 2-1 半數致死量測定結果（此表非普西納實驗之數據，僅供了解半 數致死量測定方法使用）。[20]

圖2-11 由化學分子模擬所預測的SHa的PrP

結構（H1~H4）及NMR

所測量出來的SHaPrP結構（S1~C）。X軸：不同於人類胺基酸序列的

其他生物，在每個位置上的差異數目 [31]。

圖2-12 SHa rPrP（90-231）由NMR所測量出來的結構，其中粉紅色 代表α-helix A（殘基144-157），B（172-193），C（200-227）；黃色，

代表雙硫鍵，存在於Cys-179及Cys-214；綠色，代表S1（殘基 129-134）；藍色，代表S2（159-165），S1及S2類似於β-sheet；灰色 代表loop；紅色，表示結構中的疏水部位[31]。

圖2-13 Protein X與PrP

互相結合的NMR結構圖，其中protein X與殘

基Q168、Q172 Q219、T215的side chain結合[31]。

圖2-14 PrP

複製的結合圖[3]。

（A）一個未突變（wild type）的 PrP

，經由與protein X相結合後，

使 PrP

結構轉變成 PrP

的中間產物，再與外來的（exogenous）

PrP

接觸形成 PrP

。等到 PrP

轉變成 PrP

之後，protein X會與

PrP

脫離，產生再作用的protein X及內生的（endogenous）PrP

。

圖2-14（B） 伴隨著內生的PrP

的產生，protein X再次與PrP

互相

結合，轉換成PrP

結構並與內生的PrP

接觸之後，PrP

再度形成

PrP

。而先前所形成的兩個PrP

，皆能成為模板而與PrP

作用，使

得PrP

的數目呈現指數成長。[3]

圖2-14（C） 由於遺傳性的疾病，或是自發性的疾病的產生，使得體 內的細胞造成突變，而且突變的PrP

會與protein X結合，且與另一組 同為突變的PrP

與protein X相遇，進而形成突變的PrP

，並使這個 因突變而產生的PrP

當作感染的模板，對其他未突變的PrP

作用。

一旦這個情況產生，PrP

便會不斷的改變其他PrP

的結構（如圖B

所示）。[3]

圖2-14（D）在自發性的疾病當中，很少會有此種情況發生--兩個正

常的PrP

各自與protein X結合之後，再交互作用，導致結構重新轉

變成PrP

的形式。且一旦這極少的情況發生，PrP

便會不斷的產

生。 （如圖B所示）[3]

圖 2-16 膜蛋白又分成周圍性蛋白（peripheral）及嵌入性蛋白（integral 或 transmembrane）兩種，此為簡單的示意圖[44]。

圖2-15 PrP

與PrP

交互作用，堆疊成纖維狀組織的示意圖，其中圓

形表示PrP

圖2-17 membrane PrP的三種形式，在穿透膜的部分，其序列為111-134

（TM1），是此PrP的疏水部分[42]。

圖2-18 為了分辨在內質網上PrP的形態，Prusiner在膜外的細胞液中加

入PK，水解PrP在膜外的部分，再測量剩餘的PrP分子量大小，便可

分辨出PrP的形態是為何種PrP結構[40]。

圖2-19 此為各型式的PrP經由PK進行蛋白質水解的示意圖。在利用特

殊的消化劑將內質網膜去除之後，再加入PK進行水解，由圖中可以

發現只有

PrP及PrP

不會被水解，這證明了其內部結構均含有特定

的結構可以抵抗PK，造成在致病時的主要因子[40]。