以連續式發酵生產PHBV之研究 林家慶、涂瑞澤,張德明
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摘 要
PHB (POLY-HYDROXYBUTYRATE) 與PHBV (POLY-HYDROXYBUTYRATE- CO-HYDROXYVALERATE) 是可被微生 物 完全分解的熱塑性聚合物(THERMOPLASTIC POLYMERS)，其物理性質與聚丙烯 (POLYPROPYLENE) 相仿，可 應用 於目前習用之高分子加工成型程序，適用範圍相當廣泛。PHB與PHBV可由多種微生物來生產，其中R -ALSTONIA EUTROPHA、ALCALIGENES LATUS、AZOTOBACTER VINELANDII、METHYLOTROPHS SP.、PSEUDOMO -NAS SP.等，甚至包括經過基因重組的ESCHERICHIA COLI都是比較具有潛力的菌株。 連續式操作常做為探討培養條件 或營養限制因子對微生物的生長與產物累積之影響。本實驗使用RALS -TONIA EUTROPHA為實驗菌株以連續式發酵(溫 度26 ℃、轉速300 RPM，PH值7.0)，探討不同的稀釋率與 不同濃度的丙酸鈉對菌體生長、PHBV的累積以及碳源基質消耗 的影響。實驗結果得知，在未添加及添加 1G/L的丙酸鈉時，皆無HYDROXYVALERATE (HV)的累積。當未添加丙酸鈉 時，PHB佔總菌體重之比例從35% ~ 41%，以稀釋率D = 0.102 /H時為最高(41%)。添加丙酸鈉濃度1 G/L時，PHB佔總菌 體重之比例為42% ~ 55%，以稀釋率D = 0.1 /H最高(55%)。當添加丙酸鈉濃度5 G/L時，始有HV的累積，至於HV與HB的 平均 莫耳比約為30：70。當添加丙酸鈉濃度7 G/L時，PHBV佔總菌體重的比例約為68%，稀釋率D為0.016 /H， HV：
HB的平均莫耳比約為40：60。添加丙酸鈉濃度15 G/L時，稀釋率僅能維持於0.016 /H， HV：HB的 平均莫耳百分比為60
：40。 連續式饋料丙酸鈉濃度增加時，菌體產物PHBV中HV的MOLE分率也會提高，亦即 HB的MOLE分率降低。當 進 料中丙酸鈉濃度低於5 G/L或未添加丙酸鈉時，稀釋率可達0.15 /H而不至於有WASHOUT的現象發生，由 實驗結果可知
，當稀釋率D在0.1 /H時， PHBV佔菌體重之比例可達最高。若進料中丙酸鈉濃度維持在7 G/L時，則稀釋率最高可 達0.028 /H仍能維持一穩定狀態；至於丙酸鈉濃度為15 G/L時，當稀釋率低至 0.016 /H，穩定狀態仍難以維持。雖然添加 濃度較高的丙酸鈉有助於HV的生成，但當基質中丙酸鈉濃度 太高時，菌體生長反而會受到抑制，以致菌體濃度降低
，PHBV的累積量亦少，反而不符合經濟效益。
關鍵詞 : PHBV、連續式發酵培養、丙酸鈉、稀釋率、RALSTONIA EUTROPHA 目錄
第一章 緒論--P1 第二章 文獻回顧--P3 2.1 分解性塑膠之背景--P3 2.2 分解性塑膠之種類--P5 2.2.1 化學合成聚合物--P5 2.2.2 天然聚合物--P6 2.2.3 微生物合成聚合物--P7 2.3 微生物的代謝作用--P7 2.3.1 一次代謝的生合成--P7 2.3.2 二次代謝的生合 成--P8 2.3.3 微生物生長和產物形成的關係--P10 2.4 分解性塑膠的應用--P10 2.4.1 PHB與PHBV分解性塑膠--P11 2.4.2 PHB(V)的代謝過程--P21 2.5 PHB(V)製法--P27 2.5.1 菌種--P27 2.5.2 基質--P29 2.5.3 生產技術--P32 2.5.4 產品回收--P35 2.5.4.1 溶劑法--P35 2.5.4.2 非溶劑法--P36 2.5.5 PHB(V)測定--P36 2.5.5.1 GC測定法--P37 2.5.5.2 NMR測定法--P38 2.6 發酵槽簡 介--P40 2.6.1 連續式發酵--P40 2.6.2 連續式發酵的特點--P41 2.6.3 連續式發酵的優缺點--P43 2.6.4 連續式發酵的設備和類 型--P44 2.6.5 連續發酵的控制--P48 2.6.5.1 確定進料流率--P48 2.6.5.2 防止其他菌種的污染或菌種退化--P49 第三章 材料與方 法--P50 3.1 實驗材料--P50 3.1.1 菌株--P50 3.1.2 藥品--P50 3.1.3 培養基--P50 3.1.4 儀器設備--P51 3.2 培養條件--P52 3.2.1 活 化--P52 3.2.2 預培養--P53 3.2.3 發酵槽培養--P53 3.3 分析方法--P55 3.3.1 菌體量--P56 3.3.2 葡萄糖消耗量--P56 3.3.3 丙酸鈉 消耗量分析--P57 3.3.4 氮源消耗量分析--P57 3.3.5 PHBV分析--P58 第四章 結果與討論--P61 4.1 於未添加丙酸鈉之下的連續 式發酵--P61 4.1.1 菌體生長與PHBV生產--P61 4.1.2 葡萄糖與氮源之消耗情形--P64 4.2 於添加1 G/L丙酸鈉之下的連續式發 酵--P68 4.2.1 菌體生長與PHBV生產--P69 4.2.2 葡萄糖、丙酸鈉及氮源之消耗情形--P71 4.3 於添加5 G/L丙酸鈉之下的連續 式發酵--P74 4.3.1 菌體生長與PHBV生產--P75 4.3.2 葡萄糖、丙酸鈉及氮源之消耗情形--P79 4.4 於添加7 G/L丙酸鈉之下的 連續式發酵--P82 4.4.1 菌體生長與PHBV生產--P82 4.4.2 葡萄糖、丙酸鈉及氮源之消耗情形--P86 4.5 於添加15 G/L丙酸鈉之 下的連續式發酵--P88 4.5.1 菌體生長與PHBV生產--P88 4.5.2 葡萄糖、丙酸鈉及氮源之消耗情形--P91 4.6 饋料不同濃度丙酸 鈉及改變稀釋率之比較--P93 第五章 結論與未來展望--P95 5.1 結論--P95 5.2 未來展望--P96 參考文獻--P100 附錄--P105 附錄 一 葡萄糖標準曲線--P105 附錄二 丙酸鈉標準曲線--P106 附錄三 菌體濃度與吸光值對照表--P107
參考文獻
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