3-2-1 基質輔助雷射脫附游離質譜

第三章第三章

第三章第三章 儀器儀器儀器儀器、、、藥、藥藥品與實驗方法藥品與實驗方法品與實驗方法 品與實驗方法

3-1 自組式

圖 3-1 為本實驗室自組的基質輔助雷射脫附游離-飛行時間質譜 儀裝置圖。光源波長為 Nd：YAG laser 的第三倍頻波(third harmonic generation; THG)355 nm。取一小部分分光作為 trigger 的來源，剩餘 的光線藉由 pinhole 的調整，取直徑約 2～3 mm 的雷射光線經由稜鏡 與反射鏡的引導，最後再經由焦距 20 cm 的透鏡導入 MALDI-TOFMS 的離化區，直接聚焦在 MALDI sample plate 上的分析物與基質的結 晶，產生脫附與離化的效果。本實驗施加的電場為：加速電場 (acceleration voltage)14 kV 與聚焦電場(ion extraction grid voltage)6 kV。離化後的離子經加速電場與聚焦電場作用後，會飛行過 flight tube，並且撞擊在 MCP(microchannel plate)上產生訊號，訊號經由示 波器顯示後再經由電腦做紀錄。實驗進行時可藉由 CCD camera 觀測 入射雷射打在 plate 上的情況。

beam-splitter

Flight tube

lens CCD camera

pinhole 6” diffusion-pump

4” turbo-pump to computer

sample rod

mirror

Oscilloscope trigger

computer prism

P.D.

Nd:YAG laser THG: 355 nm

(200 mJ)

MCP

beam-splitter

Flight tube

lens CCD camera

pinhole 6” diffusion-pump

4” turbo-pump to computer

sample rod

mirror

Oscilloscope Oscilloscope trigger

computer computer prism

P.D.

P.D.

Nd:YAG laser THG: 355 nm

(200 mJ)

Nd:YAG laser THG: 355 nm

(200 mJ)

MCP

圖 3-1 基質輔助雷射脫附游離-飛行時間質譜儀裝置圖 (The experimental apparatus used for MALDI-TOF/MS)

3-2 資料處理

3-2-1 基質輔助雷射脫附游離質譜

實驗所得到的資料，是由示波器擷取而來，為一文字文件，其 X 軸為飛行時間，Y 軸為訊號強度，故需將飛行時間轉換成質量後才會 得到質量與訊號強度的函數圖。由於質量與飛行時間的平方成正比，

所以可以將已知物(例如：CHCA 的主要斷裂譜峰)的質荷比與飛行時 間的平方作一校正曲線 y = ax²+b，y 為質荷比，x 為飛行時間，利用 此公式可將飛行時間轉換成質量，即可得到質量與訊號強度的關係 圖。下表即為常用基質 CHCA 的主要斷裂譜峰與各代表的 Ion form[54]。

表 3-1 CHCA 的主要斷裂譜峰 (Main fragments of CHCA)

9.395 9.957 10.197 10.718 13.327 14.216 15.117

下表為飛行時間轉換成質量的 Excel 表格，將從示波器所擷取的 資料匯入到 F 欄與 G 欄，分別代表飛行時間與訊號強度。E 欄為 m/z=at²+b 的公式，當資料匯入完成，即會得到相對應的質量。

b z at

m= ²+

m/z t

b z at

m=at²+b z

m= ²+

m/z t

表 3-2 飛行時間---荷質比單位換算表

(Sheet for flight times transform to m/z)

3-2-2 氣相層析質譜

由質譜儀所得到的資料統一由中央處理器判讀。氣相層析質譜儀 得到的資料包含層析圖以及質譜圖，因此中央處理器有兩大特色：1.

具處理同時多項工作的功能，可同時監控層析圖以及對質譜的分析。

2.具質譜資料庫查詢的功能，可以依照其質譜斷裂情形推測最有可能 分子及相對可信度。

另外質譜儀偵測離子的紀錄方式有兩種：1.全離子掃瞄法(Total Ion Current Monitoring, TIC)，此種方式是將所有的離子訊號全部紀錄 下來所得到的層析圖。2.選擇性離子偵測法(Select Ion Monitoring, SIM)，此種方式是利用四極柱特定電壓抓取特定荷質比的離子的偵測 方式，有利於純化層析圖以及增加靈敏度。

3-3

名 稱 製造廠商 型 號 示意圖或規格

Nd:YAG laser Spectra-Physics Model: GCR-170

飛行管

（flight tube）

Modified Wilet-McLaren

design(R.M.

Jordan Co., Grass Valley, Ca)

--- Flight distance: 1.1 m Mass resolution: ~300

4-inch turbo pump VARIAN Turbo-V 300HT Series: 9699038

6-inch diffusion

pump VARIAN

VHS-6 diffusion pump P/N: L6193301

Turbo pump

controller VARIAN Model: 9699424

Gauge controller VARIAN Model: SENTORR S/N: LIM00604

Vaccum valve VARIAN P/N: VGA160IM S/N: LVA10506

Vaccum valve VARIAN P/N: L6280603 S/N: LVA90828

Rotary pump ALCATEL M0del: 2015 SD

Diffusion pump 冷卻水循環器

Thermo Neslab/USA

Type: Merlin Series Model: M-75 S/N: 102247014

Oscillator

示波器 Lecroy Model: 9350A

500MHz

High voltage power supply 高壓電源供應器

GAMMA High Voltage Research

Inc., USA

Model: RR30-2R

Centrifugal

evaporator EYELA Model: CVE-1000

2750 rpm

氣相層析儀

Hewlett-Packard Agilent Technologies

Avondale GC 6890

質譜儀

Hewlett-Packard Agilent Technologies

HP 5973

GC column

Hewlett-Packard Agilent Technologies

HP-5MS cross-linked 5% PH Me siloxane

UV/VIS Spectrometer

System y

Hewlett-Packard Agilent Technologies

HP 8453

pH meter RADIOMETER

COPENHAGEN PHM201 玻璃電極

Minishaker IKA Type: MS1 S1

電子天平 ELECTRONIC

BALANCE ER-120A 0.1 mg~120 g

微量吸量管 Eppendorf ---

100~1000 µL 10~100 µL

1~10 µL

加熱攪拌器 CIMARECTM SP46925 18×18 cm

超音波震盪器 BRANSONIC B2200R-4

110 V 50/60 Hz 1.8 AMPS 高速離心機 --- Serial no: 026702 Max: 6000 rpm

1.5 mL

過濾器 MILLIPORE CAT.NO.

SLHN025NK

0.45μm

3-4

類 類類 類 別 別 別 別

藥藥

藥藥 名名名名 化學式及來源化學式及來源化學式及來源化學式及來源 結構式結構式結構式結構式

Methylphosphonic acid (MPA)

CH5O3P Radian International

P O H₃C OH

OH

Ethyl methylphosphonic acid (EMPA)

C₃H₉O₃P Radian International

P OH H₃C O

OCH₂CH₃

Isopropyl methylphosphonic acid

(IMPA)

C₄H₁₁O₃P Radian International

P OH H₃C O

O

CH CH₃

CH₃

Isobutyl methylphosphonic acid (i-BuMPA)

C₅H₁₃O₃P ( 憲兵司令部刑事

鑑定中心 柳如宗中校提供)

P OH H₃C O

O

H₂ C CH

CH₃

CH₃

Cyclohexyl methylphosphonic acid

(CHMPA)

C7H15O3P Radian International

P OH H₃C O

O 分

分 分 分 析 析 析 析 物 物 物 物

Pinacolyl methylphosphonic acid

(PMPA)

C₇H₁₇O₃P Radian International

P O H₃C O

OH

HC C(CH₃)₃

CH₃

衍 衍 衍 衍 生 生 生 生 試 試 試 試 劑 劑 劑 劑

N-(tert-butyldimethylsilyl)- 2,2,2-trifluoro-N-methylac

etamide (MTBSTFA)

C₉H₁₈F₃NOSi Acros

CH₃ Si C

CH₃ N CH₃

CH₃

H₃C C

CH₃ O

C F

F F

α-Cyano-4- hydroxycinnamic acid

(CHCA)

C10H7NO3

Sigma-Aldrich

O HO

OH N

2,6-Dihydroxy acetophenone (2,6-DHAP)

C₈H₈O₃ Fluka

HO

OH O

基基 基基 質質 質質

2,4,6-Trihydroxy acetophenone (2,4,6-THAP)

C₈H₈O₄ Fluka

HO OH

OH O

Acetonitrile (ACN) CH₃CN Acros

Methanol CH₃OH

Acros Ethanol (99.8%) C2H5OH Acros Ethyl acetate CH3COOC2H5

（Acros）

Tetrahydrofuran (THF) CH₃NO Acros

Hexane C₆H₁₄

Acros 溶

溶 溶 溶 劑 劑 劑劑

Methylene chloride CH2Cl2

Acros 試試

試試 藥藥

藥藥 Trifluoroacetic acid C2HF3O2

Sigma-Aldrich

3-5

衍生流程：先用 Acetonitrile 清洗試管，待試管乾燥後，加入 25µL 的神經戰劑降解產物，利用氮氣吹乾後，再加入 25µL 的衍生試劑 MTBSTFA，將試管加蓋旋緊後，置於加熱板上加熱，在維持約 80 ℃ 的溫度下，持續加熱 20 分鐘，所得之衍生物(如圖 3-3 所示)即可供 GC/MS 分析。

加入ACN

乾燥 樣品25µL N₂吹乾

衍生試劑25µL 加蓋旋緊

加熱至約80℃

20分鐘 加入ACN

乾燥 樣品25µL N₂吹乾

衍生試劑25µL 加蓋旋緊

加熱至約80℃

20分鐘

圖 3-2 衍生流程示意圖

(Derivative flow schematic drawing)

P O

H2n+1 Cn OH OH

CH₃ Si C

CH3

CH₃

CH3

H₃C

CH₃ Si C

CH3

CH₃

CH3

H₃C

P O H_2n+1Cn O

O

Si CH₃ H₃C

C CH₃ H₃C

CH₃

Si CH₃

CH₃ C CH₃

CH₃ CH₃

P OH H₃C

O

OCnH2n+1

CH3

Si C

CH3

CH3

CH3

H3C

CH3

Si C

CH3

CH3

CH3

H3C

a.

b.

P O H₃C

O O

Si CH₃ H₃C

C CH₃ H₃C

CH₃

CnH2n+1

P O

H2n+1 Cn OH OH P O

H2n+1 Cn OH OH

CH₃ Si C

CH3

CH₃

CH3

H₃C

CH₃ Si C

CH3

CH₃

CH3

H₃C

P O H_2n+1Cn O

O

Si CH₃ H₃C

C CH₃ H₃C

CH₃

Si CH₃

CH₃ C CH₃

CH₃ CH₃ P

O H_2n+1Cn O

O

Si CH₃ H₃C

C CH₃ H₃C

CH₃

Si CH₃

CH₃ C CH₃

CH₃ CH₃

P OH H₃C

O

OCnH2n+1

P OH H₃C

O

OCnH2n+1

CH3

Si C

CH3

CH3

CH3

H3C

CH3

Si C

CH3

CH3

CH3

H3C

a.

b.

P O H₃C

O O

Si CH₃ H₃C

C CH₃ H₃C

CH₃

CnH2n+1

P O H₃C

O O

Si CH₃ H₃C

C CH₃ H₃C

CH₃

CnH2n+1

圖 3-3 圖 a 為烷膦酸類的二矽烷衍生物結構

(TBDMS derivative structure of alkyl phosphonic acids) 圖 b 為烷磷酸烷酯類衍生物結構

(TBDMS derivative structure of alkyl methylphosphonic acids)