3-1-1C 60 /PVC 塗佈壓電晶體對抗人體免疫球蛋白抗體感應訊號

(1)

第3章第三章實驗結果與討論

3-1 碳六十與抗免疫球蛋白間作用研究

3-1-1C 60 /PVC 塗佈壓電晶體對抗人體免疫球蛋白抗體感應訊號

本研究以多頻道液相石英壓電晶體系統感測器為研究工具，將石英晶體接上自組的電子線路界面來收集其振盪頻率訊號。藉頻率訊號的變化觀察反應情形。

三個頻道分別塗佈 C

60

/PVC 的量為 1.95µg、2.46µg 與 2.63µg。

將已塗佈好 C

₆₀

/PVC 的石英晶片置入去離子水的工作槽中，待其頻率穩定，於三個工作槽中分別注入各種人體抗免疫蛋白抗體（或稱二次抗體） anti-IgG 、 anti-IgA 與 anti-IgM 各 100µL ，濃度依序為 3.9×10

^-1

mg/mL、9.1×10

^-3

mg/mL 以及 1.6×10

^-2

mg/mL，觀察頻率變化的情形，研究結果發現當工作槽中有抗人體免疫球蛋白存在時振盪頻率即隨之下降，如圖 3-1 所示。證明抗人體免疫球蛋白抗體已吸附於 C

₆₀

/PVC 塗佈膜上。

3-1-2 C 60 /PVC 塗佈量效應

研究 C

60

/PVC 的塗佈量是否會影響抗人體免疫球蛋白抗體的吸附量。當抗人體免疫球蛋白抗體 anti-IgG、anti-IgA 與 anti-IgM 的吸附濃度分別固定為 39mg/dL、0.91mg/dL、1.6mg/dL 時，逐漸增加 C

60

/PVC 塗佈於石英晶片上的量，此時頻率變化量亦隨之增加，直到塗佈量增加至一特定值時，頻率的變化值趨於平穩，亦即持續增加 C

60

/PVC 塗佈量，頻率變化的感應訊號下降量卻不再大幅度變化。

此研究結果顯示當抗人體免疫球蛋白抗體 anti-IgG、anti-IgA 與 anti-IgM 達最大吸附量時，C

₆₀

/PVC 的塗佈量分別為 3.0 µg、3.77 µg

(2)

與 4.0 µg。如圖 3-2、圖 3-3、與圖 3-4 所示。對 anti-IgG 及 anti-IgA 這兩個頻道而言，持續增加 C

₆₀

/PVC 的塗佈量達 4µg 以上，無法有效提高固定於碳六十上的抗人體免疫球蛋白抗體的量。而 anti-IgM 頻道中，當 C

₆₀

/PVC 的塗佈量為 4 µg 時，雖未達最佳感應效應之塗佈量，

但為考慮系統偵測訊號之穩定性與可靠性，於接下來的研究中，各頻道之 C

₆₀

/PVC 的塗佈量固定於 4µg。

3-1-3 抗人體免疫球蛋白抗體的濃度效應

由 3-1-2 節 C

₆₀

/PVC 塗佈量研究的結果，將各頻道 C

60

/PVC 固定塗佈量固定於 4 µg，探討注入不同濃度抗人體免疫球蛋白抗體

（anti-IgG、anti-IgA 與 anti-IgM）時其頻率的變化情形。隨著注入抗人體免疫球蛋白的濃度增加，頻率變化量也跟著增加。當頻率變化至趨於平緩即代表吸附在石英晶片上的抗人體免疫球蛋白的量已達塗佈物的最大吸附量。

由圖 3-5、圖 3-6 及圖 3-7 可知各種人體抗免疫球蛋白抗體

（anti-IgG、anti-IgA 與 anti-IgM）吸附飽和時的濃度分別為 0.600 mg/mL, 0.014 mg/mL 及 0.030 mg/mL。

而達吸附飽和時，晶片上所吸附的人體抗免疫球蛋白抗體

（anti-IgG、anti-IgA 與 anti-IgM）的量經過換算分別為 1.40 µg, 0.97 μg 及 2.19 μg，晶片上吸附的人體抗免疫球蛋白抗體量的效應如圖 3-8、圖 3-9 及圖 3-10 所示。

(3)

Time / sec

0 1000 2000 3000 4000

Frequency shif t / Hz

-1600 -1400 -1200 -1000 -800 -600 -400 -200 0 200

A : channel 1 anti-IgG B : channel 2 anti-IgA C : channel 3 anti-IgM D : blank (pure water)

圖 3-1 C

₆₀

/PVC 塗佈石英晶體對 anti-IgG(

3 . 9 × 10

⁻¹mg/mL)、

anti-IgA(

9 . 1 × 10

⁻³mg/mL)及 anti-IgM(

1 . 6 × 10

⁻²mg/mL)的頻率感應 Fig.3-1 Frequency response curves of C

60

/PVC coated piezoelectric crystal for anti-human IgG(

3 . 9 × 10

⁻¹mg/mL), anti-human IgA(

9 . 1 × 10

⁻³mg/mL) and anti-human IgM(

1 . 6 × 10

⁻²mg/mL)

A B

C D

(4)

Coating load / µg

0 1 2 3 4

Fre que ncy shi ft / Hz

400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600

圖 3-2 石英壓電晶片之 C

₆₀

/PVC 塗佈量對 anti-IgG 抗體 (

3 . 9 × 10

⁻¹mg/mL)的影響

Fig.3-2 Effect of C

60

/PVC coating load on the frequency shift of PZ sensor for anti-human IgG (

3 . 9 × 10

⁻¹mg/mL)

(5)

Coating load / µg

0 1 2 3 4

Freq ue ncy sh if t / Hz

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

₆₀

/PVC 塗佈量對 anti-IgA 抗體 (

9 . 1 × 10

⁻³mg/mL)的影響

Fig.3-3 Effect of C

60

/PVC coating load on the frequency shift of PZ sensor for anti-human IgA (

9 . 1 × 10

⁻³ mg/mL)

(6)

Coating load / µg

0 1 2 3 4 5

Freq ue ncy sh if t / Hz

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

₆₀

/PVC 塗佈量對 anti-IgM 抗體 (

1 . 6 × 10

⁻²mg/mL)的影響

Fig.3-4 Effect of C

60

/PVC coating load on the frequency shift of PZ sensor for anti-human IgM (

1 . 6 × 10

⁻²mg/mL)

(7)

圖 3-5 C

₆₀

/PVC (4 µg)塗佈壓電晶體感測系統中的 anti-IgG 抗體濃度效應

Fig.3-5 Effect of anti-human IgG concentration on the frequency response of C

60

/PVC (4 µg) coated PZ crystal

Concentration of Anti-IgG / (mg/mL)

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Freq ue nc y s h ift / H z

0

500 1000

1500

2000

2500

3000

(8)

圖 3-6 C

₆₀

/PVC (4 µg)塗佈壓電晶體感測系統中的 anti-IgA 抗體濃度效應

Fig.3-6 Effect of anti-human IgA concentration on the frequency response of C

60 Concentration of Anti-IgA / (mg/mL)

0.000 0.005 0.010 0.015 0.020

Freq ue nc y s h ift / H z

600

800 1000

1200

1400

1600

1800

(9)

圖 3-7 C

₆₀

/PVC (4 µg) 塗佈壓電晶體感測系統中的 anti-IgM 抗體濃度效應

Fig.3-7 Effect of anti-human IgM concentration on the frequency response of C

60 Concentration of Anti-IgM / (mg/mL)

0.00 0.01 0.02 0.03

Fre que ncy sh ift / Hz

500 1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

(10)

圖 3-8 C

₆₀

/PVC (4 µg)塗佈壓電晶體感測系統中晶片上吸附的 anti-IgG 抗體量效應

Fig.3-8 Effect of the quantity of anti-human IgG absorbed on the C

60 Concentration of Anti-IgG / (mg/mL)

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8

Anti-IgG / µg

0

1

2

(11)

圖 3-9 C

₆₀

/PVC (4 µg)塗佈壓電晶體感測系統中晶片上吸附的 anti-IgA 抗體量效應

Fig.3-9 Effect of the quantity of anti-human IgA absorbed on the C

60 Concentration of Anti-IgA / (mg/mL)

0.000 0.005 0.010 0.015 0.020

Anti- IgA / µg

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

(12)

圖 3-10 C

₆₀

/PVC (4 µg)塗佈壓電晶體感測系統中晶片上吸附的 anti-IgM 抗體量效應

Fig.3-10 Effect of the quantity of anti-human IgM absorbed on the C

60 Concentration of Anti-IgM / (mg/mL)

0.00 0.01 0.02 0.03

An ti- IgM / µg

0

1

2

3

(13)

3-1-4抗人體免疫球蛋白抗體的吸附及脫附

本研究藉由碳六十與抗人體免疫球蛋白抗體之間的吸附情形來了解碳六十與抗人體免疫球蛋白抗體之間的作用力。如果是物理性吸附，那麼注入大量的脫附液時，訊號會回至基值；反之，若為一化學性吸附，則訊號不會回到基值。於是本研究使用液相脫附系統來探討此一反應。塗佈 C

₆₀

/PVC 的石英晶片，當抗人體免疫球蛋白抗體注入後，待吸附訊號達平衡穩定，於工作槽中通入脫附液，使吸附在 C

60

/PVC 晶片上的抗人體免疫球蛋白抗體脫附掉。結果顯示頻率訊號均無法回復至起始值，此為不可脫附的現象，故推測碳六十與抗人體免疫球蛋白抗體之間的作用力可能為不可逆的化學性吸附，其結果如圖 3-11 所示。

3-2碳六十/抗人體免疫球蛋白之鑑定

3-2-1 C ₆₀ /anti-human IgG 抗體的鑑定

在 C

₆₀

與 anti-human IgG 的研究中，根據液相脫附系統的結果推測，C

60

與 anti-human IgG 可能為不可脫附的化學性吸附，形成 C

60

/ anti-human IgG。為確認兩者可進行化學反應因此本研究更進一步合成 C

60

/ anti-human IgG，以 FT-IR 光譜做鑑定。

合成的方法為取 0.11 mg 的 C

₆₀

加上 0.44 mg 的 anti-human IgG 與 0.6 mL 的去離子水，置於室溫中攪拌一天，可發現原本因 C

60

不溶於水而呈現分離兩層的溶液，變成混濁的棕褐色，與原先之 C

₆₀

黑色顆粒有所分別，因此推測 C

60

與 anti-human IgG 產生了反應。接著將產物離心、過濾、乾燥等步驟後，再利用 FT-IR 光譜鑑定產物。將產物的譜圖與 C

60

以及 anti-human IgG 的譜圖互相比較，結果顯示產物具有 C

₆₀

在 526、576、1181、1429 cm

^-1

的吸收峰與 anti-human IgG 在 1060、1538、1651、2952 cm

^-1

的吸收峰，如圖 3-12 所示。

(14)

3-2-2C 60 /anti-human IgA 抗體的鑑定

在 C

60

與 anti-human IgA 的研究中，根據液相脫附系統的結果推測，C

₆₀

與 anti-human IgA 為不可脫附的化學性吸附，形成 C

₆₀

/ anti-human IgA。因此本研究更進一步合成 C

60

/ anti-human IgA，以 FT-IR 做鑑定。

60

加上 0.5 mg 的 anti-human IgA 與 0.55 mL 的去離子水，置於室溫中攪拌一天，可發現原本因 C

60

不溶於水而呈現分離兩層的淡黃色溶液，變成混濁的棕褐色，與原先之 C

60 ₆₀

與 anti-human IgA 產生了反應。

接著將產物離心、過濾、乾燥等步驟後，再利用 FT-IR 光譜鑑定產物。

將產物的譜圖與 C

₆₀

以及 anti-human IgA 的譜圖互相比較，結果顯示產物具有 C

60

在 526、575、1182、1429 cm

^-1

的吸收峰與 anti-human IgA 在 667、1536、1648、2326、2360 cm

^-1

的吸收峰，如圖 3-13 所示。

3-2-3C 60 /anti-human IgM 抗體的鑑定

在 C

60

與 anti-human IgM 的研究中，根據液相脫附系統的結果推測，C

₆₀

與 anti-human IgM 為不可脫附的化學性吸附，形成 C

₆₀

/ anti-human IgM。因此本研究更進一步合成 C

60

/ anti-human IgM，以 FT-IR 做鑑定。

60

加上 0.6 mg 的 anti-human IgM 與 0.06 mL 的去離子水，置於室溫中攪拌一天，可發現原本因 C

60

不溶於水而呈現分離兩層的澄清溶液，變成混濁的棕褐色，與原先之 C

60 ₆₀

與 anti-human IgM 產生了反應。接著將產物離心、過濾、乾燥等步驟後，再利用 IR 光譜鑑定產物。將產物的譜圖與 C

₆₀

以及 anti-human IgM 的譜圖互相比較，結果顯示產物具有 C

60

在 526、575、1181、1428 cm-1 的吸收峰與 anti-human IgM 在 1530、1645 cm-1 的吸收峰，如圖 3-14 所示。

(15)

Time / sec

0 1000 2000 3000 4000 5000

Frequency shift / Hz

-1800 -1600 -1400 -1200 -1000 -800 -600 -400 -200 0 200 400

A : channel 1 inject anti-IgG B : channel 2 inject anti-IgA C : channel 3 inject anti-IgM D : blank

圖 3-11 C

₆₀

/PVC 塗佈壓電晶體對 anti-IgG(

3 . 9 × 10

⁻¹mg/mL)、

anti-IgA(

9 . 1 × 10

1 . 6 × 10

⁻²mg/mL)之不可逆感應訊號

Fig.3-11 Irreverisible response curves of anti-IgG(

3 . 9 × 10

⁻¹mg/mL)、

anti-IgA(

9 . 1 × 10

1 . 6 × 10

⁻²mg/mL) with

C

60

/PVC coated PZ crystal

D

C A B

(16)

圖 3-12 (a)C

₆₀

、(b)anti-human IgG 以及(c)C

₆₀

/anti-human IgG 的 IR 光譜圖譜

Fig.3-12 IR spectra of (a) C

60

、 (b) anti-human IgG and (c) C

60

/anti-human IgG

4 0 0 0 . 0 3 0 0 0 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 4 0 0 . 0

6 4 . 4 7 0 7 5 8 0 8 5 9 0 9 5 9 9 . 8

c m - 1

% T

1 4 2 9 . 6 6

1 1 8 0 . 8 6

5 3 0 . 1 4 5 7 6 . 0 7 6 7 5 . 5 9 7 9 4 . 2 5

(a)

(b)

4 0 0 0 . 0 3 6 0 0 3 2 0 0 2 8 0 0 2 4 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0 6 0 0 4 0 0 . 0

4 2 . 6 4 5 5 0 5 5 6 0 6 5 7 0 7 5 8 0 8 5 8 8 . 8

c m - 1

% T

2 9 6 3 . 3 8

3 3 8 5 . 9 1

1 6 5 1 . 3 1 1 5 3 8 . 8 4

1 2 6 3 . 2 6

1 1 0 5 . 7 9 1 0 5 5 . 1 8 9 6 8 . 0 1

8 0 4 . 9 2 2 3 6 0 . 5 6

8 8 9 . 2 7

804.92 889.27

968.01 1055.18 1105.79

1263.26 1538.84

1651.31 2360.56

2963.38

3385.91

(c)

4 0 0 0 . 0 3 6 0 0 3 2 0 0 2 8 0 0 2 4 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0 6 0 0 4 0 0 . 0

5 8 . 6 6 0 6 1 6 2 6 3 6 4 6 5 6 6 6 7 6 8 6 9 7 0 7 1 7 2 7 3 7 4 . 0

c m - 1

% T

2 9 5 2 . 1 1 3 1 9 4 . 3 6

1 6 5 1 . 3 1

1 5 3 8 . 8 4

1 4 2 9 . 1 7 1 2 2 9 . 5 2

1 1 5 6 . 4 1 1 1 8 1 . 7 2

5 2 6 . 5 3 5 7 7 . 1 5

1 0 6 0 . 8 0

526.53 577.1 1060.80

1538.8

1156.41 1181.72 1229.52 1429.17 1651.31

2952.11

3194.36

(17)

圖 3-13 (a)C

₆₀

、(b)anti-human IgA 以及(c)C

₆₀

/anti-human IgA 的 IR 光譜圖譜

Fig.3-13 IR spectra of (a)C

60

、(b)anti-human IgA and (c)C

₆₀

/anti-human IgA

4 0 0 0 . 0 3 0 0 0 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 4 0 0 . 0

6 4 . 4 7 0 7 5 8 0 8 5 9 0 9 5 9 9 . 8

c m - 1

% T

1 4 2 9 . 6 6

1 1 8 0 . 8 6

5 3 0 . 1 4 5 7 6 . 0 7 6 7 5 . 5 9 7 9 4 . 2 5

(a)

(c) (b)

4 0 0 0 . 0 3 6 0 0 3 2 0 0 2 8 0 0 2 4 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0 6 0 0 4 0 0 . 0

5 1 . 1 5 2 5 4 5 6 5 8 6 0 6 2 6 4 6 6 6 8 7 0 7 2 7 4 7 6 7 8 8 0 8 2 . 6

c m - 1

% T

1 5 3 8 . 8 4 1 3 9 5 . 4 3

1 1 5 9 . 2 2

1 0 7 4 . 8 6 9 4 8 . 3 3

8 6 1 . 1 5 6 6 7 . 1 3

5 4 6 . 2 2 5 2 3 . 7 2

1 6 4 8 . 5 0 2 3 6 0 . 5 6

2 3 4 3 . 6 6

523.72 546.22 667.13

861.15 948.33

1074.86 1159.22 1395.43

1538.84

1648.50 2343.66

2360.56

4 0 0 0 . 0 3 6 0 0 3 2 0 0 2 8 0 0 2 4 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0 6 0 0 4 0 0 . 0

6 2 . 5 6 4 6 6 6 8 7 0 7 2 7 4 7 6 7 8 8 0 8 2 8 4 8 6 8 8 9 0 9 2 9 4 9 6 9 8 1 0 0 1 0 1 . 2

c m - 1

% T

2 9 0 8 . 0 3

1 6 4 8 . 8 7

1 5 3 6 . 9 7

1 4 2 9 . 3 1 1 2 1 5 . 7 3

1 1 8 2 . 1 8

1 1 5 4 . 8 9

5 7 5 . 5 1 5 3 4 . 9 6

5 2 6 . 5 3 2 3 6 0 . 5 6

2 3 2 6 . 7 6

6 6 7 . 1 3 7 9 3 . 6 7

526.53 575.51 667.13 793.67

1182.18 1154.89 1215.73

1429.31 1536.97 1648.87 2326.76

2360.56

2908.03

(18)

圖 3-14(a)C

₆₀

、(b)anti-human IgM 以及(c)C

₆₀

/anti-human IgM 的 IR 光譜圖譜

Fig.3-14 IR spectra of (a) C

60

、(b) anti-human IgM and (c) C

60

/anti-human IgM

4 0 0 0 . 0 3 0 0 0 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 4 0 0 . 0

6 4 . 4 7 0 7 5 8 0 8 5 9 0 9 5 9 9 . 8

c m - 1

% T

1 4 2 9 . 6 6

1 1 8 0 . 8 6

5 3 0 . 1 4

5 7 6 . 0 7 6 7 5 . 5 9 7 9 4 . 2 5

(a)

(b)

(c)

4 0 0 0 . 0 3 6 0 0 3 2 0 0 2 8 0 0 2 4 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0 6 0 0 4 0 0 . 0

1 4 . 2 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5 5 0 5 5 5 9 . 4

c m - 1

% T

2 3 4 2 . 3 2

1 6 4 5 . 8 4 1 5 4 1 . 5 7

1 4 5 6 . 7 1 1 4 0 0 . 1 4

1 2 6 1 . 9 0

1 0 9 2 . 3 6 9 8 9 . 7 7

8 6 8 . 4 3 8 0 3 . 1 0

6 6 8 . 2 2

5 3 3 . 5 1

533.51 668.22 803.10 868.43

989.77 1092.36 1261.90 2342.32

1645.84

1400.14 1456.71

1541.57

4 0 0 0 . 0 3 6 0 0 3 2 0 0 2 8 0 0 2 4 0 0 2 0 0 0 1 8 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0 6 0 0 4 0 0 . 0

6 3 . 3 6 6 6 8 7 0 7 2 7 4 7 6 7 8 8 0 8 2 8 4 8 6 8 8 9 0 9 2 9 4 9 6 9 8 1 0 0 1 0 2 . 1

c m - 1

% T

3 2 1 0 . 3 0 2 9 5 5 . 6 9

1 5 3 0 . 3 2 1 4 2 8 . 5 6

1 2 2 1 . 5 1 1 1 8 1 . 9 6

1 1 5 5 . 4 7

6 5 4 . 2 3

6 2 8 . 7 1

5 7 5 . 9 7

5 2 6 . 0 3 1 6 4 5 . 6 9

3210.30 2955.69

1645.69 1530.32 1428.56

1221.51 1155.47

1181.96

575.97 654.23

628.71

526.03

(19)

3-3碳六十/抗免疫球蛋白塗佈壓電晶體感測器

3-3-1 碳六十/抗免疫球蛋白的活性

由於本研究目的是期能運用碳六十 / 抗免疫球蛋白（如 Anti-human IgG）來偵測抗體（如 human IgG），及探討抗人體免疫球蛋白與免疫抗體之間的反應性，因此本實驗將抗人體免疫球蛋白固定於碳六十石英晶片之後，固定化之後的抗人體免疫球蛋白是否保有活性是我們十分關切的問題。

實驗方法為將已固定化之碳六十/抗人體免疫球蛋白（如 C

60

/Anti-human IgG, C

₆₀

/Anti-human IgA, C

₆₀

/Anti-human IgM）壓電晶片置入去離子水的反應槽中，待其頻率穩定後，注入人體免疫抗體，觀察頻率訊號的變化情形。研究結果發現當注入人體免疫抗體（IgG, IgA, IgM）時，頻率的變化量亦隨之增加。由此可知，固定化之碳六十/

抗人體免疫球蛋白石英晶片仍保有活性，可用以偵測人體免疫抗體，

其結果如圖 3-15 所示。

3-3-2 碳六十/抗免疫球蛋白－免疫抗體吸附之可逆性

本研究利用液相脫附系統來探討碳六十/抗人體免疫球蛋白（如 C

60

/Anti-human IgG）－免疫抗體（如 IgG）間的吸附情形與作用力。

結果發現當注入人體免疫抗體的下降頻率趨於平穩後，注入大量的脫附液 Glycine-HCl（pH 2.3），以置換工作槽中的溶液，實驗結果顯示訊號可回復至起始值，如圖 3-16 所示。因此，碳六十/抗人體免疫球蛋白－免疫抗體間的吸附是一種可逆的物理性吸附，所以碳六十/抗人體免疫球蛋白石英晶片於每次使用後可再生，重複使用。

本研究亦進一步討論抗人體免疫球蛋白與免疫抗體間的濃度關係、pH 值效應、溫度效應與干擾物的影響等。

(20)

圖 3-15 固定化之碳六十/抗人體免疫抗體石英晶片對人體免疫抗體的感測訊號

Fig.3-15 Frequency shifts of C

60

/anti-human immunoglobulin coated quartz crystals for human immunoglobulins

Time / sec

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

Fr eque ncy shift / H z

-700 -600 -500 -400 -300 -200 -100 0 100

A : channel 1(C60/anti-IgG PZ) inject IgG B : channel 2(C60/anti-IgA PZ) inject IgA C : channel 3(C60/anti-IgM PZ) inject IgM D : blank

A B C D

(21)

圖 3-16 碳六十/抗人體免疫抗體石英壓電感測器對人體免疫抗體感應之可逆訊號

Fig.3-16 Reversible responses of C

60

/anti-human immunoglobulin coated PZ sensor for human immunoglobulins

Time / sec

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000

Frequency sh ift / Hz

-800 -600 -400 -200 0 200

A : channel 1(C60/anti-IgG PZ) inject IgG B : channel 2(C60/anti-IgA PZ) inject IgA C : channel 3(C60/anti-IgM PZ) inject IgM D : blank

D

C B A

(22)

3-3-3待測抗體濃度效應

本研究於前文中探討了 C

₆₀

/PVC 的最適塗佈量以及抗人體免疫球蛋白的濃度，固定感測系統於最佳條件之下，利用本研究建立的碳六十/抗人體免疫球蛋白石英壓電感測器，偵測不同濃度的抗體溶液，以探討樣品濃度之改變對感應頻率訊號之影響。

研究結果顯示偵測訊號的頻率變化隨著抗體濃度的增加，頻率的變化值跟著增加，三種免疫抗體都可以得到不錯的濃度線性迴歸檢量線，而此多頻道壓電感測器對 IgG，IgA 及 IgM 之靈敏度（m）可由各線性斜率算出，分別為 9.62

×

10

²

Hz /(mg/mL)，1.86

×

10

⁵

Hz /(mg/mL) 及 4.48

×

10

⁵

Hz/(mg/mL)。

3-3-3.1 各頻道對免疫抗體感測之偵測下限

利用感測儀器進行化學分析工作時，偵測結果之有效性及可靠性係根據感測系統對待測樣品的偵測極限（Detection limit，

C

_L）與偵測訊號之再現性（Reproducibility）來決定。本研究採用 IUPAC 的定義來估算偵測下限與再現性。

IUPAC 定義系統之偵測下限（Detection limit，

C

_L）為一分析物的濃度，此濃度可藉由最小偵測訊號經背景空白值校正後

（

X

_L

− X

_B ），再除以分析物濃度線性迴歸之檢量線斜率而求得，而最小偵測訊號之校正值相當於 3 倍之量測 20 次背景空白值產生的標準差（

S

_b），故依據 IUPAC 定義，偵測下限之運算公式推導如下：

(3-1)

(3-2)

( )

m X C

_L

= X

^L

−

^B

b B

L

X kS

X = +

(23)

(3-3) 式中

X

L=最小偵測訊號

X

B =空白訊號平均值

S

b=藉由 20 次量測背景空白值所產生的標準差

C

L=偵測極限，在合理的信度範圍內所能測得的最小分析物濃度 m =分析物的靈敏度（線性迴歸後之檢量線斜率）

k = 信度範圍 (numerical factor chosen in accordance with the confidence level desired)。對一般平均分佈的空白值訊號強度 (

X

_B )而言，使用 k =3 時，即可達到 99.7 ％的信度。

3-3-3.2 人體免疫抗體 IgG 的偵測下限

利用塗佈的 C

60

/anti-human IgG 石英壓電感測器，偵測不同濃度的 IgG 抗體溶液，研究結果顯示在濃度 0.1 mg/mL 至 0.5 mg/mL 間有不錯的線性關係。由圖 3-17 可得知 C

₆₀

/anti-human IgG 石英壓電感測器偵測 IgG 的靈敏度為 9.62

×

10

²

Hz /(mg/mL)，濃度檢量線的 R

²

＝ 0.994，空白訊號的標準偏差(

S

_b)為 3.197，因此由方程式(3-3)計算而得 IgG 抗體的偵測下限(

C

_L)為 9.97

×

10

^-4

mg/mL。

3-3-3.3 人體免疫抗體 IgA 的偵測下限

利用塗佈的 C

₆₀

/anti-human IgA 石英壓電感測器，偵測不同濃度的 IgA 抗體溶液，研究結果顯示在濃度 7.5

×

10

^-3

mg/mL 至 0.0375mg/mL 間有不錯的線性關係。由圖 3-18 可得知 C

60

/anti-human IgA 石英壓電感測器偵測 IgA 的靈敏度為 1.86

×

10

⁵

Hz /(mg/mL)，濃度檢量線的 R

²

＝0.996，空白訊號的標準偏差(

S

_b)為 1.979，因此由方程式(3-3)計算而得 IgA 抗體的偵測下限(

C

_L)為 3.19

×

10

^-5

mg/mL。

m

C

_L

= kS

^b

(24)

Concentratoin of IgG / (mg/mL)

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Fr eq uen cy shi ft / H z

0 1000 2000 3000 4000 5000

3-3-3.4 人體免疫抗體 IgM 的偵測下限

利用塗佈的 C

₆₀

/anti-human IgM 石英壓電感測器，偵測不同濃度的 IgM 抗體溶液，研究結果顯示在濃度 5

×

10

^-3

mg/mL 至 2.5

×

10

^-2

mg/mL 間有不錯的線性關係。由圖 3-19 可得知 C

60

/anti-human IgM 石英壓電感測器偵測 IgM 的靈敏度為 4.48

×

10

⁵

Hz/(mg/mL)，濃度檢量線的 R

²

＝0.980，空白訊號的標準偏差(

S

_b)為 2.563，因此由方程式(3-3)計算而得偵測下限(

C

_L)為 1.72

×

10

^-5

mg/mL。

圖 3-17 C

₆₀

/anti-IgG 抗體石英壓電晶體感測器對 IgG 抗體的濃度標準工作曲線

Fig.3-17 Calibration curve of IgG with C

60

/anti-IgG coated PZ sensor

(25)

圖 3-18 C

₆₀

/anti-IgA 抗體石英壓電晶體感測器對 IgA 抗體的濃度標準工作曲線

Fig.3-18 Calibration curve of IgA with C

60

/anti-IgA coated PZ sensor

Concentration of IgA / (mg/mL)

0.01 0.02 0.03 0.04

Fr eq uen cy shi ft / H z

0 1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

(26)

圖 3-19 C

₆₀

/anti-IgM 抗體石英壓電晶體感測器對 IgM 抗體的濃度標準工作曲線

Fig.3-19 Calibration curve of IgM with C

60

/anti-IgM coated PZ sensor

Concentration of IgM / (mg/mL)

0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025

Fre quen cy sh ift / Hz

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

(27)

3-3-4 多頻道感測對免疫抗體感測之再現性

偵測訊號之再現性 (reproducibility) 可表示分析方法的精確度 (precision)，指的是對一特定分析樣品在多次重複的相同量測中，實驗數據之一致性。可由計算實驗數據的標準偏差(standard deviation，

SD)、變異數(variance)或變異係數(coefficient of variation，CV)來評估分析方法之精確度。本研究採用變異係數來估算此多頻道感測器偵測訊號之再現性。

樣本數據之變異係數相當於是以百分比表示之相對標準偏差 (relative standard deviation，RSD)，其運算公式如下：

(3-4)

相對標準偏差以百分率表示，且變異係數與相對標準偏差之關係可表示為：

(3-5)

本研究藉由相同的量測方法對三種抗體進行連續 5 次量測，所求得之偵測訊號的再現性，以相對標準偏差值來表示，對 IgG，IgA 及 IgM 其 RSD (n=5) 之值分別為 4.16 %，3.37 %及 4.87 %，如圖 3-20、

圖 3-21 及圖 3-22 所示，三者 RSD 皆小於 10 %，顯示此感測系統之偵測數據有良好的一致性，此分析方法之精確度是可信的。

z

x RSD = s × 10

(%) 10

²

RSD x

CV = s × =

(28)

RSD = 4.16 % (n=5)

圖 3-20 C

₆₀

/anti-human IgG 抗體石英壓電感測器對偵測 IgG 抗體的再現性

Fig.3-20 Reproducibility of C

60

/anti-human IgG coated PZ sensor for human IgG

Times

0 1 2 3 4 5 6

Freq uency shift / Hz

0

200

400

600

800

(29)

RSD = 3.37 % (n=5)

圖 3-21 C

₆₀

/anti-human IgA 抗體石英壓電感測器對偵測 IgA 抗體的再現性

60

/anti-human IgA coated PZ sensor for human IgA

Times

0 1 2 3 4 5 6

Fre que ncy sh ift / Hz

0

500 1000

1500

2000

2500

3000

(30)

RSD = 4.87 % (n=5)

圖 3-22 C

₆₀

/anti-human IgM 抗體石英壓電感測器對偵測 IgM 抗體的再現性

60

/anti-human IgM coated PZ sensor for human IgM

Times

0 1 2 3 4 5 6

Fre que ncy sh ift / Hz

0 1000

2000

3000

4000

(31)

3-3-5 碳六十/抗人體免疫球蛋白晶片的儲存活性

由於本研究係利用固定在石英晶片上的 C

₆₀

/anti-human immunoglobulin 來進行感測工作，所以在晶片上的 C

60

/anti-human immunoglobulin 活性能夠保存多久與此感測器的實用性息息相關。

實驗所採用的保存方法是將晶片置於保存瓶中，瓶中有少許的水以保持晶片的濕潤，再將瓶子封好，置於 4

⁰

C 環境中儲存。每一天將晶片取出，進行一次感測反應，反應結束後如上述方式將晶片保存好，以此方式觀察晶片可以保持幾天的活性。研究結果顯示 6 天之內，三個頻道塗佈的碳六十/抗人體免疫球蛋白晶片仍可保有 90％以上的活性，如圖 3-23、圖 3-24 及圖 3-25 所示。

圖 3-23 碳六十/抗人體免疫球蛋白 IgG 的儲存活性 Fig.3-23 The activity of C

60

/anti-human IgG as function of time

Day

0 1 2 3 4 5 6 7

Ac tivity / %

0

20

40

60

80

100

120

(32)

圖 3-24 碳六十/抗人體免疫球蛋白 IgA 的儲存活性 Fig.3-24 The activity of C

60

/anti-human IgA as function of time

Day

0 1 2 3 4 5 6 7

Ac tivity / %

0

20

40

60

80

100

(33)

圖 3-25 碳六十/抗人體免疫球蛋白 IgM 的儲存活性 Fig.3-25 The activity of C

60

/anti-human IgM as function of time

Day

0 1 2 3 4 5 6 7

Ac tivity / %

0

20

40

60

80

100

120

(34)

3-3-6 抗體溶液 pH 值效應對感測的影響

由於環境中 pH 值的變化會影響反應活性，過酸或過鹼的環境容易使抗體的活性發生變化。蛋白質分子上的淨電荷取決於環境中 pH 值的高低，同一分子在不同的 pH 環境下可能帶不同電荷。若環境中的 pH 高於其 pI，此蛋白質帶淨負電，反之帶淨正電，若剛好 pH 值等於 pI 值則淨電荷為零。因此本研究針對 pH 值變因探討在不同的 pH 值環境中對感測的影響。

於固定的溫度下，注入濃度固定的抗體條件下，配製不同 pH 值的溶液來觀察反應的情形。研究結果顯示偵測 IgG、IgA、IgM 抗體的最適 pH 值分別為 pH 6.8、pH 6.1、pH 5.7。其結果如圖 3-26、圖 3-27、圖 3-28 所示。

3-3-7 溫度對感測的影響

對多數抗體蛋白質而言，溫度會影響抗體及抗原間免疫作用，其作用會隨著溫度增加而加快，但是達高溫時可能會造成抗體蛋白質變性，導致活性衰退；而低溫時則抗體蛋白質活性低，反應性亦低。本研究探討溫度對抗人體免疫球蛋白與免疫抗體之間作用的影響。於注入濃度固定的條件下，改變工作槽的溫度（5～50

⁰

C），觀察反應的情形。其結果如圖 3-29、圖 3-30、圖 3-31 所示，結果顯示，對三個頻道而言，最適反應溫度範圍為 25

⁰

C～35

⁰

C。

(35)

圖 3-26 C

₆₀

/anti-human IgG 抗體石英壓電感測器對偵測 IgG 抗體的 pH 值效應

Fig.3-26 pH effect on frequency response of C

60 pH

4 5 6 7 8 9 10

Fre que ncy sh ift / Hz

650

700

750

800

850

900

950 1000

1050

(36)

圖 3-27 C

₆₀

/anti-human IgA 抗體石英壓電感測器對偵測 IgA 抗體的 pH 值效應

60 pH

4 6 8 10

Fre que ncy sh ift / Hz

0

500 1000

1500

2000

2500

3000

3500

(37)

圖 3-28 C

₆₀

/anti-human IgM 抗體石英壓電感測器對偵測 IgM 抗體的 pH 值效應

60 pH

4 6 8 10

Fre que ncy sh ift / Hz

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

(38)

圖 3-29 C

₆₀

/anti-human IgG 抗體石英壓電感測器對偵測 IgG 抗體的溫度效應

Fig.3-29 Temperature effect on frequency response of C

60 Temperature /

⁰

C

0 10 20 30 40 50 60

Frequency shift / Hz

200

300

400

500

600

700

800

900

(39)

圖 3-30 C

₆₀

/anti-human IgA 抗體石英壓電感測器對偵測 IgA 抗體的溫度效應

60 Temperature /

⁰

C

0 10 20 30 40 50 60

Frequ ency shi ft / Hz

600

800 1000

1200

1400

1600

1800

2000

2200

2400

2600

(40)

圖 3-31 C

₆₀

/anti-human IgM 抗體石英壓電感測器對偵測 IgM 抗體的溫度效應

60 Temperature /

⁰

C

0 10 20 30 40 50

Frequ ency shi ft / Hz

0 1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

(41)

3-3-8 生化物質對抗體感測的干擾研究

人體血液中，除了血球、抗體與抗原之外，存在許多重要而微量的生化物質。本研究選定了一些生化物質，依據人體內所含的平均濃度，探討這些生化物質對於已建立的感測系統偵測抗體時是否會造成影響。

這些在人體血液中生化物質常見的有有葡萄糖(glucose)，濃度約為 100 mg/dL；尿酸(uric acid)，濃度約為 8 mg/dL；半胱胺酸(cystein)，

濃度約為 2.4 mg/dL；酪胺酸(tyrosine)，濃度約為 3.62 mg/dL。探討生化物質存在環境對感測抗體的頻率訊號有何影響，其實驗結果如圖 3-32 至圖 3-45 所示。

各頻道在不同生化物質干擾物存在下的偵測感應訊號比較於圖 3-36、圖 3-41、圖 3-46 中。由表 3-1、表 3-2 以及表 3-3 顯示生化物質對各頻道的干擾係數(interfering factor，I)皆很小，對各抗體的選擇係數(selectivity，S)皆達 90 %以上。

(42)

圖 3-32 葡萄糖（100 mg/dL）的存在對 C

₆₀

/anti-human IgG 抗體石英壓電感測器偵測 IgG 抗體時頻率訊號的影響

Fig.3-32 Effect of glucose (100 mg/dL) on frequency responses of C

60

/anti-human IgG PZ sensor for IgG

Time / sec

0 500 1000 1500 2000 2500

Fr equ ency shift / Hz

-800 -600 -400 -200 0 200

IgG + glucose IgG

Glucose

(43)

圖 3-33 尿酸（8 mg/dL）的存在對 C

₆₀

Fig.3-33 Effect of uric acid (8 mg/dL) on frequency responses of C

60 Time / sec

0 500 1000 1500 2000 2500

Frequency shif t / Hz

-700 -600 -500 -400 -300 -200 -100 0 100

IgG + uric acid IgG

Uric acid

(44)

圖 3-34 半胱胺酸（2.4 mg/dL）的存在對 C

₆₀

Fig.3-34 Effect of cystein (2.4 mg/dL) on frequency responses of C

60 Time / sec

0 500 1000 1500 2000 2500

Frequ ency shift / Hz

-800 -600 -400 -200 0 200

IgG+ cystein IgG

Cystein

(45)

圖 3-35 酪胺酸（3.62 mg/dL）的存在對 C

₆₀

Fig.3-35 Effect of tyrosine (3.62 mg/dL) on frequency responses of C

60 Time / sec

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

Frequency shif t / Hz

-800 -600 -400 -200 0 200

IgG + tyrosine IgG

Tyrosine

(46)

圖 3-36 各生化干擾物對 C

₆₀

/anti-human IgG 抗體石英壓電感測器對偵測 IgG 抗體時的感應訊號

Fig.3-36 Frequency responses of IgG with various bio-interfering compounds with the C

60

/anti-human IgG coated PZ sensor

Interfering compound

none glucose uric acid cystein tyrosine

Fre quency shift / Hz

0

200

400

600

800

(47)

表 3-1 生化干擾物對 C

₆₀

/anti-human IgG 抗體石英壓電感測器對偵測 IgG 抗體的影響

Table 3-1 Interference of various bio-interfering compounds on the C

60 Interfering Concentration of Interfering Selectivity compound

interfering compound(mg/dL)

factor , I S(

%

)

Glucose 100 3.08

×

10

^-2

96.92 Uric acid 8 6.17

×

10

^-3

99.38 Cystein 2.4 9.10

×

10

^-2

90.90 Tyrosine 3.62 8.49

×

10

^-2

91.51

I : interfering factor of interfering species = The difference of frequency shift between the presence and absence of interfering compound divided by frequency shift of absence of interfering compound.

S : selectivity of human immunoglobulin = (1.0－I)×100 %

(48)

₆₀

/anti-human IgA 抗體石英壓電感測器偵測 IgA 抗體時頻率訊號的影響

60

/anti-human IgA PZ sensor for IgA

Time / sec

0 500 1000 1500 2000 2500

F requ ency shi ft / Hz

-1400 -1200 -1000 -800 -600 -400 -200 0 200

IgA + glucose IgA

Glucose

(49)

₆₀

60 Time / sec

0 500 1000 1500 2000 2500

F requ ency shi ft / Hz

-1600 -1400 -1200 -1000 -800 -600 -400 -200 0 200

IgA + uric acid IgA

Uric acid

(50)

₆₀

60 Time / sec

0 500 1000 1500 2000 2500

F requ ency shi ft / Hz

-1400 -1200 -1000 -800 -600 -400 -200 0 200

IgA + cystein IgA

Cystein

(51)

₆₀

60 Time / sec

0 500 1000 1500 2000 2500

F requ ency shi ft / Hz

-1400 -1200 -1000 -800 -600 -400 -200 0 200

IgA + tyrosine IgA

Tyrosine

(52)

₆₀

/anti-human IgA 抗體石英壓電感測器對偵測 IgA 抗體時的感應訊號

Fig.3-41 Frequency responses of IgA with various bio-interfering compounds with the C

60

/anti-human IgA coated PZ sensor

Interfering compound

none glucose uric acid cystein tyrosine

Fr eq ue nc y s h ift / Hz

0

200

400

600

800 1000

1200

1400

1600

(53)

₆₀

/anti-human IgA 抗體石英壓電感測器對偵測 IgA 抗體的影響

60 Interfering Concentration of Interfering Selectivity compound

interfering compound(mg/dL)

factor , I S(

%

)

Glucose 100 9.52

×

10

^-2

90.48 Uric acid 8 8.81

×

10

^-2

91.90 Cystein 2.4 1.58

×

10

^-2

98.42 Tyrosine 3.62 3.49

×

10

^-2

96.51

(54)

₆₀

/anti-human IgM 抗體石英壓電感測器偵測 IgM 抗體時頻率訊號的影響

60

/anti-human IgM PZ sensor for IgM

Time / sec

0 500 1000 1500 2000 2500

F requ ency shi ft / Hz

-6000 -5000 -4000 -3000 -2000 -1000 0 1000

IgM + glucose IgM

Glucose

(55)

₆₀

60 Time / sec

0 500 1000 1500 2000 2500

F requ ency shi ft / Hz

-6000 -5000 -4000 -3000 -2000 -1000 0 1000

IgM + uric acid IgM

Uric acid

(56)

₆₀

60 Time / sec

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

F requ ency shi ft / Hz

-6000 -5000 -4000 -3000 -2000 -1000 0 1000

IgM + cystein IgM

Cystein

(57)

₆₀

60 Time / sec

0 500 1000 1500 2000 2500

Fr e q u e n cy s h ift / Hz

-6000 -5000 -4000 -3000 -2000 -1000 0 1000

IgM + tyrosine IgM

Tyrosine

(58)

₆₀

/anti-human IgM 抗體石英壓電感測器對偵測 IgM 抗體時的感應訊號

Fig.3-46 Frequency response of IgM with various bio-interfering compounds with the C

60

/anti-human IgM coated PZ sensor

Interfering compound

none glucose uric acid cystein tyrosine

Fr eq ue nc y s h ift / Hz

0 1000

2000

3000

4000

5000

6000

(59)

₆₀

/anti-human IgM 抗體石英壓電感測器對偵測 IgM 抗體的影響

60 Interfering Concentration of Interfering Selectivity compound

interfering compound(mg/dL)

factor , I S(

%

)

Glucose 100 4.83

×

10

^-2

95.17 Uric acid 8 9.42

×

10

^-2

90.58 Cystein 2.4 7.92

×

10

^-2

92.08 Tyrosine 3.62 9.63

×

10

^-2

90.37

3-1-1C 60 /PVC 塗佈壓電晶體對抗人體免疫球蛋白抗體感應訊 號