貳、研究材料與方法 一、研究樣品
74 名原發性 VUR 患童及其家族血液樣品係由台北榮民總醫院小兒部 林清淵醫師提供，血液樣品的採集均本人或家屬同意。依 VUR 患者病程 是否進入末期腎病(end stage renal disease)為依據，將患者區分為二組：(1) 病程已進行為末期腎病者(血漿肌酸酐值＞10 mg/dl)，需仰賴血液透析維持 生命，共16 名；(2) 經藥物治療後病情穩定，尚未發展成末期腎病者，共 58 名。另蒐集 117 名正常人之血液樣品，作為控制組以供對照。
二、基因組DNA (genomic DNA)的萃取
將 4 ~6 ml 的全血置於 15 ml 離心管中，加入 RBC lysis buffer (0.32 M sucrose - 10 mM Tris pH7.5 - 5 mM MgCl2 - 1 % Triton X-100)至 15 ml，翻轉 數次使之混合均勻。靜置於冰上5~10 分鐘後，以 2,000 rpm 離心 5 分鐘以 沉澱細胞核。丟棄上層液，再以1 ml RBC lysis buffer 劇烈震盪清洗核沈澱 中的血紅素。此步驟重覆數次後，再加入0.5 ml 含 50 µg/ml proteinase K 的SDS lysis buffer (10 mM Tris pH 7.5 - 5 mM EDTA - 0.5 % SDS)，於 37℃
隔 夜 或 作 用 數 天 。 待 proteinase K 反 應 完 成 後 ， 加 入 等 體 積 的 phenol/chloroform 萃取兩次，13,000 rpm 離心 5 分鐘，取上層液，再以等 體積的chloroform 萃取一次，13,000 rpm 離心 2 分鐘。取上清液加入 0.05 倍體積的5 M NaCl 及 2 倍體積的無水酒精，13,000 rpm 離心 5 分鐘以沉 澱DNA。再以 70 %酒精洗去 DNA 沉澱物中的鹽類，風乾後溶於適量 TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0 - 1 mM EDTA pH 8.0)或 ddH2O 中。再以 OD260吸 光值測定DNA 濃度，稀釋成 50 ng/µl 後，以 0.8 %洋菜(agarose)膠體電泳 檢查，置於 4℃冰箱備用。
三、AGT、ACE 與 AT1R 基因 5′端上游區啟動子多型性的檢視
(一) 聚合酶鏈反應(PCR)
以 PCR 放大 4 名末期腎病患者、4 名非末期腎病患者之 AGT、ACE 與AT1R 基因 5′端上游區啟動子序列，反應所使用之引子對、放大區域、
片段長度、煉合溫度及所需之 MgCl2濃度列於表一。取 100 ng 的基因組 DNA，置於一 25 µl 的反應中，反應溶液中包含 50 ng 的引子對、適當濃 度之MgCl2、200 µM dNTP 及 0.5 U 熱穩定性 DNA 聚合酵素(Promega)。
PCR 反應以熱循環儀(OmniGene, HYBAID)進行，反應條件為 94℃ 6 分鐘 使DNA 雙股裂解，再以循環式的裂解溫度 94℃ 30 秒、煉合溫度 56 ~ 60
℃ 30 秒及延長溫度 72℃ 30 秒作用 45 個循環，最後以 72℃作用 10 分鐘。
反應完畢後進行1.0 % ~ 1.4 %洋菜膠體電泳分析 PCR 產物，以確定片段 大小的正確性。
(二) 自洋菜膠中純化 DNA 片段
PCR 放大之各啟動子片段，經含 EtBr (0.25 µg/ml)的 1.2 %洋菜膠體電 泳分離後，於紫外光下切下該片段，置於1.5 ml 離心管中，進行膠體純化 (Gel extraction kit, Viogene)。其方法為：加入 GEX buffer (50 ~ 300 mg 膠 體/500 µl)，置於 60℃乾浴器中 10 分鐘，使膠體溶解。然後將溶解後的膠 體移至純化的管柱中，以13,000 rpm 離心 1 分鐘。棄去離心後的液體，加 入500 µl wash I buffer，並以 13,000 rpm 離心 1 分鐘。棄去離心後的液體，
再加入700 µl wash II buffer，以 13,000 rpm 離心 1 分鐘。棄去離心後的液 體，再以13,000 rpm 離心 1 分鐘後，將管柱移至另一 1.5 ml 離心管中，加 入30 µl 的 ddH2O，於室溫下靜置 5 ~ 10 分鐘，再以 13,000 rpm 離心 1 分 鐘，即完成純化的工作。最後取2 µl 純化後的 DNA，以 1.2 %洋菜膠體進 行電泳檢查。
(三) DNA 定序
經純化後確認無誤之啟動子片段，即以雷射螢光 DNA 自動定序儀(377
DNA Sequencer，ABI，明欣生物科技公司；MegaBACE Analyzer，Molecular Dynamics，Division of Amersham Pharmacia Biotech，國立台灣師範大學遺 傳多樣性實驗室)進行定序分析。
(四) 序列比對與多型性檢視
自 GenBank 取得 AGT、ACE 與 AT1R 基因 5′端上游區啟動子序列 (Accession Number：AGT－AF424741，ACE－AF229986 及 X94359，AT1R
－AF245699 及 U07144)，利用序列分析比對軟體 DNASIS (HITACH)，比 對已發表的網路序列與8 名原發性 VUR 病患的定序序列，以檢視 AGT、
ACE 與 AT1R 基因 5′端上游區啟動子的多型性。
四、AGT、ACE、AT1R 與 TGF-β1 基因的多型性分析
包括原發性 VUR 病患中的 16 名末期腎病患者、58 名非末期腎病患 者，與117 名正常人，以 PCR-RFLP 或 SSCP 檢測 AGT、ACE、AT1R 與 TGF-β1 基因的多型性，並進行族群遺傳分析。
(一) 聚合酶鏈反應(PCR)
以 PCR 放大包含特定多型性的片段，各反應所使用之引子對、片段 長度、煉合溫度及所需之MgCl2濃度列於表二、三、四、五。若該多型性 未改變任何限制酶的切點，則設計誤配引子(mismatch primer)引入適當限 制酶切點，以利進行RFLP 分析。
(二) 限制酶片段長度多型性(RFLP)分析
包含特定多型性之PCR 放大片段，以適當限制酶進行切割(表二、三、
四、五)。在一 10 µl 的切割反應中，包含 2 µl PCR 產物(約含 50 ~ 200 ng DNA)、1 ~ 2 U 限制酶(New England Biolabs)、1 µl 10X 緩衝液、0.1 µl 10 mg/ml BSA (必要時添加)，其餘體積以 ddH2O 補足。混合均勻後，置於 37
℃或60℃作用 2 小時至隔夜，再以 1.6 % ~ 2.2 %洋菜膠體電泳分析切割片
段，以判定該樣品之多型性基因型。
(三) 單股核酸構形多型性(SSCP)分析
包含 AGT 基因 C-532T 多型性之 PCR 放大片段，先以限制酶 NlaIII 進行切割反應成適當大小片段後，再進行SSCP 分析。
使用Pharmacia Biotech 公司出品的 GeneGel Excel 12.5/24 kit 及 Silver staining kit，配合 GenePhor 電泳槽(Pharmaia)及 EP31000 電源供應器進行 本實驗。取3 µl 的切割反應，加入等體積之 95 % formamide 染液，混合後 於 95℃下處理 5 分鐘，解開雙股 DNA，然後迅速置於冰上，以防止單股 DNA 復性。快速離心後吸取 5 µl 至 GeneGel Excel 12.5/24 膠片(Pharmaia)，
於8℃下的 Genephor 電泳槽，以 600 V、25 mA、15 W 進行電泳 1.5 小時。
電泳結束後，取出膠體置於50 ml 固定液(0.6 % w/v benzene sulphonic acid - 19.2 %酒精)，緩慢均勻搖晃 30 分鐘或靜置隔夜後，棄去固定液，倒 入50 ml 銀染色液(0.2 % silver nitrate - 0.7 % benzene sulphonic acid)，均勻 搖晃30 分鐘。再棄去銀染色液，倒入 50 ml 水，均勻搖晃 1 分鐘。將膠體 轉移至含50 ml 的呈色液(2.5 % sodium carbonate - 0.037 % formaldehyde - 0.002 % sodium thiosulphate)，均勻搖晃至 band 出現，最多 6 分鐘即棄去 呈色液。再倒入50 ml 保存液(1 % acetic acid - 5 % sodium acetate - 10 % glycerol)以終止反應，均勻搖晃 30 分鐘或靜置隔夜，取出膠體置於架上晾 乾後，蓋上塑膠膜，即可判讀C-532T 多型性之基因型。
(四) 統計分析
以Popgene 軟體[101]分析 VUR 病患與正常人族群樣品之多型性的對 偶基因頻率，並以chi-square (χ2)檢測各多型性遺傳情形是否符合哈溫平 衡、兩樣品群間的多型性對偶基因頻率是否具有顯著性差異。另依據基因 計算方法[102]，將同一基因之多型性兩兩配對進行單套型分析，再以χ2 檢測是否具有顯著性差異，以檢驗多型性間的連鎖不平衡情形。
五、多型性啟動子片段的選殖(cloning)
根據多型性分析的結果，我們分別選殖了 AGT 基因 5 種、ACE 與 AT1R 基因各 2 種不同單套型的多型性啟動子片段，以構築報導基因之重組質 體。其中AGT 基因選殖片段區域為-567 ~ +116，共 683 bp，包含 C-532T、
G-217A 、 G-152A 、 A-20C 、 G-6A 等 多 型 性 ， 多 型 性 單 套 型 分 別 為 C-G-A-C-A、C-G-G-C-A、C-G-G-A-G、T-A-G-A-A 與 C-G-G-A-A 等五種；
ACE 基因選殖片段區域為-1207 ~ +4，共 1210 bp，包含 A-240T、T-93C 等多型性，多型性單套型分別為A-T 與 T-C 二種[103]；AT1R 基因選殖片 段區域為-1332 ~ +45，共 1377 bp，包含 A-1138T、T-810A、T-713G、
C-521T 、 A-214C/G-213C 、 A-153G 等 多 型 性 ， 多 型 性 單 套 型 分 別 為 A-T-T-C-AG-A 與 T-A-G-T-CC-G 二種[103]。
(一) 聚合酶鏈反應(PCR)與 DNA 片段純化
以PCR 放大各基因之特定單套型的多型性啟動子片段(表一)，所得之 放大產物經DNA 片段純化、檢查後，即可進行接合反應。
(二) 接合反應(ligation)
在一 10 µl 接合反應中，取 1 µl (50 ng) pGEM-T Easy 載體(Promega)，
加入適量上述純化的DNA 片段(載體與插入片段之分子數比約為 1：5)、1 µl T4 DNA ligase (3 U)及 1 µl 10 X buffer (300 mM Tris-HCl pH 7.8 - 100 mM MgCl2 - 100 mM DTT - 10 mM ATP)，混合均勻後置於 16℃隔夜。隔 日再將作用完成的反應置於 70℃乾浴器中作用 10 分鐘，終止 T4 DNA ligase 的作用，並迅速置於冰上。
(三) 轉形勝任細胞(competent cell)之製備
接種大腸桿菌 TOP-10F' (Invitrogen)菌落到 1 ml Luria Bertani (簡稱 LB) 培養基中(10 g/l trypton - 5 g/l yeast extract - 10 g/l NaCl)，於 37℃、200 rpm
震盪培養。隔夜後倒入50 ml LB 中繼續培養約 3 ~ 4 小時(OD600 = 0.5)。置 於冰上10 分鐘後，以 4℃、3,000 rpm 離心 5 分鐘以沉澱細胞。棄去上清 液後再加入12.5 ml 預冷過濾之 0.1 M CaCl2以懸浮細胞。冰浴10 分鐘，
以4℃、3,000 rpm 再離心 5 分鐘。倒去上清液，加入 4 ml 含 16 % glycerol 的0.1 M CaCl2以懸浮細胞，可敲打管壁以利細胞懸浮，即完成可用之轉 形勝任細胞。分裝成每管 100 µl 後，測定其轉形效率達 1×107 菌落/µg pGEM4 DNA 以上，即可置於-70℃保存備用，可保存一年。
(四) 細菌的轉形作用(transformation)
將上述製備完成保存於-70℃的轉形勝任細胞於冰上解凍，在 100 µl 的細胞中加入5 µl 前述已完成接合反應的重組質體 DNA，均勻混合後置 於冰上30 分鐘；然後置於 42℃水浴中熱休克(heat shock) 45 秒。冰浴 2 分 鐘後，加入900 µl 的 LB 培養液，於 37℃水浴槽培養 1 小時，再加入 100 µl 的 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal ， 20 mg/ml in dimethylformamide)及 100 µl 的 isopropylthio-β-D- galactoside (IPTG，200 mg/ml)，混合均勻，各吸取 200 µl 至每盤含 50 µg/ml 青黴素(ampecilin)之 LB 培養基中，最後以滅過菌的玻棒將菌液均勻塗抹，並將培養皿正放於 37℃培養箱中 1 小時，以防止菌液倒流，然後再將培養皿倒置培養 16 ~ 20 小時。
(五) 質體 DNA 的小量製備與 DNA 定序
以牙籤挑選出前述轉形作用生長出的白色單一菌落，劃在含青黴素之 培養基中保留菌種，同時並置於含青黴素的1 ml 培養液中，於 37℃、200 rpm 震盪培養。隔夜後以 14,000 rpm 離心 1 分鐘，除去上清液。以鹼性溶 菌法分解細菌，抽取質體之DNA。其方法為：加入 70 µl solution I (50 mM glucose - 25 mM Tris-HCl pH 8.0 - 10 mM EDTA pH 8.0)，劇烈震盪以懸浮 菌液；再加入140 µl 新鮮配製的 solution II (0.2 N NaOH - 1 % SDS)，溫和
翻轉小管數十次之後，加入105 µl solution III (3 M potassium acetate)，再 溫和翻轉小管數十次，以14,000 rpm 離心 5 分鐘沈澱細胞碎片。取含有核 酸的上清液，加入 0.8 倍體積的異丙醇(2-propanol)，溫和的混合後，以 14,000 rpm 離心 5 分鐘，即可看到白色的核酸沉澱物。去除上清液，以 70
%的酒精清洗多餘的鹽類。風乾後，將沈澱物溶於 50 µl 含 10 µg/ml RNase 的ddH2O 中，37℃水浴 10 分鐘幫助核酸溶解，最後取 2 µl 進行 0.7 %洋 菜膠體電泳分析。挑選出有插入片段的質體，以限制酶 EcoRI 檢查其插入 片段的正確性，再送DNA 定序分析。
(六) 質體 DNA 的大量製備及純化
經定序分析確認該單套型多型性啟動子片段序列的正確性後，即將插 入片段正確的質體的菌落培養於含青黴素的1 ml 培養液中，37℃、250 rpm 震盪培養2 小時以上，倒入 65 ml 含青黴素的培養液，繼續培養 20 小時。
之後利用Viogene Ultrapure Plasmid Midiprep System (Midiprep-V100)進行 質體DNA 的大量製備及純化。方法為：將 65 ml 的菌液均分裝於兩個 50 ml 的有蓋離心管中，以8,000 rpm 離心 5 分鐘，棄除上清液後每管加入 2 ml 的buffer VP1 並劇烈震以盪懸浮細菌，將兩管打散的菌液合併為一管，加 入4 ml 的 buffer VP2，溫和的翻轉離心管數十次，再加入 4 ml 的 buffer VP3，翻轉離心管數十次後於冰上作用 5 分鐘。之後利用 12,000 rpm 離心 20 分鐘，離心時將 Midiprep-V100 column 置於 50 ml 新的離心管中，加入 5 ml 的 buffer VP4，經重力作用讓溶液通過管柱後棄去濾液。之後將前述 離心後的上清液倒入Midiprep-V100 column 中，經重力作用讓菌液通過管 柱後棄除濾液，再以12 ml 的 buffer VP5 清洗管柱，亦利用重力作用讓菌 液通過管柱後棄除濾液。之後將管柱移至另一個新的離心管中，加入5 ml 的 buffer VP6，利用重力讓溶液通過管柱將 DNA 沖洗出，即得含有質體 DNA 的沖洗液。再加入 3.75 ml 的異丙醇溫和的混合後，以 12,000 rpm 離
心 10 分鐘，即可看到白色的 DNA 沉澱物。去除上清液，加入 400 µl 的 ddH2O 溶解 DNA，並加入 20 µl 的 5 M NaCl 及 2 ~ 3 倍體積之 100 %酒精，
混合後轉移至1.5 ml 微量離心管，以 14,000 rpm 離心 10 分鐘以沉澱質體 DNA，再以 70 %酒精清洗鹽類。風乾後將 DNA 溶於 400 µl 的 ddH2O 中，
以OD260吸光值測定 DNA 濃度，即完成質體 DNA 的大量製備。
六、多型性啟動子重組質體的構築及確認
我們擬以 pGL3 luciferase 報導基因系統(Promega)作為基因轉錄活性 的檢測工具，但因報導基因載體pGL3 basic 並不包含適當的限制酶選殖點 (cloning site)，供我們將多型性啟動子片段直接置入，故我們利用本實驗室 先前已構築之pcDNA3-GLA (α-galactosidase)重組質體，引入限制酶 EcoRI 的選殖點，以利多型性啟動子重組質體的構築。
(一) pGL3 basic 載體的 EcoRI 選殖點引入
pGL3 basic 載體以限制酶 XhoI 和 HindIII 進行切割，得到 4,818 bp 的 線狀載體片段；另 pcDNA3-GLA 重組質體亦以限制酶 XhoI 和 HindIII 進 行切割，得到約 1,400 bp 的 GLA cDNA 片段(包含限制酶 EcoRI 的選殖 點)。二片段經純化、檢查後，依適量比例進行接合反應。經轉形作用、質 體DNA 的小量製備與限制酶 XhoI 和 EcoRI 的切割檢查確認，即可得到含 EcoRI 選殖點的 pGL3-GLA 重組質體。
(二) pGL3 basic 多型性啟動子重組質體的構築與確認
pGL3-GLA 重組質體與含多型性啟動子片段的 pGEM-T Easy 重組質 體，以限制酶 EcoRI 進行切割，可分別得到 4,818 bp 的 pGL3 載體片段與 適當大小的多型性啟動子片段。二片段經純化、檢查後，依適量比例進行 接合反應。經轉形作用、質體DNA 的小量製備與適當限制酶的切割檢查，
確認置入片段的方向與多型性，即完成多型性啟動子重組質體的構築。
七、多型性啟動子重組質體的轉錄活性分析
構築完成之各基因的多型性啟動子重組質體，轉移至 293 細胞株進行 體外的基因表現，藉由測定報導基因之表現量，以檢測啟動子多型性對於 基因轉錄活性的影響。
(一) 293 細胞株的培養
培養 293 細胞(食品工業發展研究所菌種中心)於 37℃含 5 % CO2且溼 度良好的培養箱中。培養液為含 10 %胎牛血清(fetal bovine serum)、100 U/ml 青黴素(penicillin)與 100 U/ml 鏈黴素(streptomycin)之 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM，GIBCO ＃12100-038)培養液。每隔 3-4 天以 1:10 稀釋作繼代培養。冰凍保存細胞時，將八分滿的細胞以 trypsin 處理收集，加入培養液，以800 rpm 離心 5 分鐘，棄去上清液，加入 1 ml 含5 % DMSO 的培養液，於冰上 2 小時，-20℃ 2 小時及-70℃隔夜後，保 存於液態氮中。
(二) 多型性啟動子重組質體的轉移(transfection)
以 electroporation 方法進行重組質體的轉移實驗，使用 BIO RAD 公司 出產之Gene Pulser II Electroporation System 進行實驗。培養 293 細胞於 10 cm 培養盤上，待細胞生長至 8 分滿時，以 trypsin 處理使細胞懸浮，再 加入適量培養液終止trypsin 作用，以 800 rpm 離心 5 分鐘，同時計算細胞 總數。之後以PBS 清洗細胞二次，並調整細胞數目為 4 × 106 / 800 µl。再 取 800 µl 細胞加入 10 µg 質體 DNA (包含 8 µg pGL3 重組質體與 2 µg phRL-TK 載體作為內在控制組)，置於 0.4 mm cuvette 中，以 1.20 kV、25 µF 進行 electroporation。電擊完畢之細胞立即加入含培養液之 10 cm 培養盤 中，於37℃培養 48 ~ 72 小時。
(三) 轉移之重組質體的轉錄活性分析
以Dual-Luciferase Reporter Assay System 與 TD-20/20 Luminometer 冷光測定儀(Promega)進行重組質體的轉錄活性分析。轉移完畢的細胞先用 PBS 清洗一次，以 trypsin 處理使細胞懸浮，加入適量培養液終止 trypsin 作用，以1,200 rpm 離心 3 分鐘，棄去上清液。再以 PBS 清洗二次，同樣 以1,200 rpm 離心 3 分鐘，棄去上清液。之後加入 0.5 ml 1X Passive Lysis Buffer，以液態氮冰凍、解凍二次以打破細胞，再以 14,000 rpm 離心 30 秒 沈澱細胞碎片。另準備一luminometer tube，加入 100 µl Luciferase Assay Reagent II，再加入 20 µl 上清液，略微混勻後，以冷光測定儀測定 pGL3 重組質體之 firefly luciferase 的活性。接著加入 100 µl Stop and Glo Reagent，略微混勻後，再以冷光測定儀測定內在控制組 phRL-TK 載體之 Renilla luciferase 的活性，計算 firefly Luciferase 與 Renilla Luciferase 活性 的比值。
(四) 統計分析
各次實驗所得之 firefly Luciferase 與 Renilla Luciferase 的活性比值先進 行校正，方法為以特定重組質體的活性比值作為 1，計算其他重組質體的 相對活性(relative activity)。接著求出三次實驗各重組質體的相對活性平均 值與標準誤差值，並利用unpaired t test 檢驗兩重組質體間的相對活性差異 及其顯著性，以檢視特定多型性對於啟動子轉錄活性的影響。
