結果
一 、 噬 菌 體 的 分 離
為了篩選能分解具 ESBL 的克雷伯氏肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）之噬菌 體，我們以本實驗室先前篩選到的具 ESBL 之克雷伯氏肺炎桿菌的一些菌株如 K6、
K55 等，和可以作為噬菌體宿主細胞的 Klebsiella pneumoniae 10693 當作 indicator cell，將中國醫藥學院附設醫院所收集之液體 (如尿液、脊椎液、膽液、痰液、廢 液等等… … )之上清液，利用點測試法（spot test）大量篩選噬菌體。 在 254 個液體 檢體中，我們分離到 12 隻暴裂型噬菌體（lytic bacteriophage），分別命名為 KPP2，
KPP3，KPP4，KPP5，KPP6，KPP7，KPP10，KPP11 ，KPP30，KPP42，KPP50 和 KPP95。
二 、 暴 裂 型 噬 菌 體 的 基 本 性 質
1. 感染宿主的能力：
為了測試這些噬菌體在相同情況下（在菌液相同濃度下，感染相同 MOI 的噬 菌體），感染宿主的能力差別（即測 titer），所以取含 3 ml LB broth 的小空瓶 12 個，
各加入隔夜培養後 OD550約 3-4 的 K. pneumoniae 10693 菌液 100 µl，然後繼續培養 至 OD550約 0.3 後分別加入噬菌體，使每個 MOI 都是 0.1，接著培養至細菌細胞裂 解（lysis），各從中取 1 ml 出來，離心後取其上清液系列稀釋測 titer。各個 titer 之 結果如 Table 2，從表中可以看出這 12 隻暴裂型噬菌體感染宿主的能力差異不大，
其 titer 大約為 1-5 × 109 PFU/ml。
2. 電子顯微鏡下的外形（Morphology）：
接著我們取這些暴裂型噬菌體中的 KPP3, KPP30, KPP42 和 KPP95，以 2 % UA
（Uranyl acetate）負染後照電子顯微鏡，這些噬菌體的外形於電子顯微鏡下（Fig.
1.），可看到具有略長（moderately elongated）之二十面體的頭部（icosahedral head），
接著連接含有一圈圈 tail sheath 的 tail，tail 下接著一個 base plate。 其大小分別為：
KPP3 有一長 101.2 nm，寬 65.8 nm 的 icosahedral head，接著連接含有一圈圈 tail sheath 的 tail (長 89.8 nm，寬 15.2 nm)，tail 下接著一個 base plate。 KPP30 的 icosahedral head 長為 103.8 nm，寬為 73.4 nm，連接著含有一圈圈 tail sheath的 tail (長 101.3 nm，寬 18.9 nm)，tail 下接著一個 base plate。 KPP42 具有一長 91.1 nm，寬 57 nm 的 icosahedral head，接著為長 88.6 nm，寬 17.7 nm 含有一圈圈 tail sheath 的 tail，然後是一個 base plate。 而 KPP95 的 icosahedral head 則長 107 nm，寬 72 nm，
接著連接含有一圈圈 tail sheath 的 tail (長 100 nm，寬 13 nm)，base plate 再接於其 下。由這些電顯圖呈現出的結果，我們發現噬菌體 KPP3, KPP30, KPP42 和 KPP95 的外形類似 T4-type 噬菌體（T4 噬菌體是一被廣泛了解的 E. coli lytic coliphage）。
3. 限制? EcoRV 切割暴裂型噬菌體的 DNA 之結果：
我們抽取各個噬菌體的 DNA 後，取 5 µ l 以 EcoRV 切取隔夜，接著以 1﹪agarose gel 進行電泳分析如 Fig. 2.所示，因為全部都可被限制? EcoRV 切割成大大小小的 DNA 片段，所以這些噬菌體應該都是具有雙股（double-stranded）DNA 的遺傳物 質，而從中也可看出切取的形式（pattern）都非常相似。
4. 暴裂型噬菌體的 genome 大小：
因為這 12 隻暴裂型噬菌體感染宿主的能力差不多（其 titer 都在 109 PFU / ml 左右），而且他們的 DNA 以限制? EcoRV 切取的結果形式（pattern）也很相像，
加上 KPP3, KPP30, KPP42 和 KPP95 其外形大小在電顯下都與 T4 噬菌體相似，所 以我們推論這 12 隻暴裂型噬菌體應該是同一類的噬菌體，而 T4 噬菌體其 genome 大小約為 168 kb，所以我們推論他們的 gemone 大小也與 T4 噬菌體相似，又因為 一般電泳約可決定 20 kb 以下的 DNA 大小，但是 20 kb 以上的 genome 就必須以脈 衝電泳法（PFGE）來決定；脈衝電泳法是一種分離大片段 DNA 分子的電泳方式，
其原理跟一般電泳分析一樣，只是電泳期間會週期性改變電場方向，強迫 DNA 分 子放鬆及拉長來進行數千 kb 的 DNA 片段分離。 所以我們取各個噬菌體液（titer：
約 109 PFU / ml）與 1﹪low melting temperature agarose 混合凝固成 agarose insert，
經 ESP solution 於 50℃去除蛋白質 24 小時並於 0.5 M EDTA 清洗完後，以電壓 200 V，initial time 為 1 秒，final time 為 40 秒，在 14℃下連續跑電泳 16 小時，經 EtBr 染液染色及去離子水退染後，於 UV 光下觀察的結果如 Fig. 3.所示；由圖中我們可
看出這 12 隻暴裂型噬菌體的 gemone 大小都差不多，估計約介於 170-180 kb 之間，
與 T4 噬菌體 genome 大小相近。
5. 總結：
由這 12 隻暴裂型噬菌體的基本性質，如相似的 titer（約 109 PFU/ ml）、相似 的限制? EcoRV 切取之形式（pattern）、相似的 gemone 大小（約 170-180 kb）及部 分噬菌體相似的外形結構，我們推論 KPP2，KPP3，KPP4，KPP5，KPP6，KPP7，
KPP10，KPP11，KPP30，KPP42，KPP50 及 KPP95 應屬同一類噬菌體。於是我們 隨機取 KPP95 進行更深一步的特性研究。
三 、 噬 菌 體 KPP95 之 特 性 研 究
KPP95 如於 400 ml LB broth 中培養，其 titer 可高達每毫升約有 3 × 1010 PFU
（plaque forming units）。 KPP95 噬菌體之外形及 genome 大小如同前面所述。其外 形於電子顯微鏡下（Fig. 1., D and E），可看到與 T4-type 噬菌體有相似的結構與型 態；而 KPP95 genome 大小可利用脈衝電泳法如 Fig. 4.所示，估計約介於 170-180 kb 之間，與 T4 噬菌體 genome 大小相近。
1. K. pneumoniae 10693 之生長與細菌烈解（bacteriolysis）之曲線：
為了了解 KPP95感染其宿主後細菌烈解（bacteriolysis）的情形，於是我們測 試 K. pneumoniae 10693 之生長與細菌烈解（bacteriolysis）之曲線，實驗分兩組，
一組在37℃下於40 ml LB培養液中以起始OD550是0.05時開始培養 K. pneumoniae 10693，並測時間0點和每30分鐘後之OD值，直達到 stationary phase 為止（此時吸 光值不再上升）。同時另一組在上述情況下培養1.5小時後（OD550約0.5）感染適量 噬菌體 KPP95（titer：109-1010 PFU/ml）使MOI達到0.1，繼續每隔30分鐘測試其OD 值並觀察OD值變化的情形，最後將兩組測得數據製成圖表（time-log OD550 之半對 數曲線）如Fig. 5.所示，K. pneumoniae 10693 於 log phase 時每隔半個小時其OD550
的 數 值 就 變 為 原 來 的 兩 倍 ， 顯 示 其 生 長 速 度 為 約 每 30 分 鐘 複 製 一 子 代 ， 與 Escherichia coli 差不多，而於7個小時後，OD550的數值差不多就不再增加，約為5 左右，此時即達 stationary phase。K. pneumoniae 10693在培養1.5小時被噬菌體
KPP95感染後，OD550值緩慢增加，然而於2小時的時間點即可看出其OD550值與沒 有感染KPP95的控制組有些微差異，接著在2.5小時後就不再上升，數值也漸漸往下 掉，與控制組的數值差異也愈大，而且可看到培養液逐漸澄清，而於7小時後OD550
維持在最低值，培養液也已達澄清，所以由噬菌體 KPP95可強烈的造成其宿主細 胞的裂解情形，我們也可證實其為一隻暴裂型噬菌體，但是培養液在8.5小時後 OD550值又漸回升，此現象可能與產生可抵抗噬菌體 KPP95的 K. pneumoniae 突變 株，藉由改變與噬菌體結合的細胞表面接受體有關。
2. 噬菌體 KPP95 的宿主分布：
KPP95 噬菌體宿主分布的決定是以點測試法 (spot test) 來分析 93 個臨床分離 到的菌株（當 Indicator cells，如 Table 1.所列，包括有 25 株 具 ESBL 之 Klebsiella pneumoniae、24 株具 ESBL 之 Enterobacter cloacae、29 株在臨床上抗第三代頭孢 菌素 cefotaxime 的 Serratia marcescens 、13 株 Escherichia coli、1 株在臨床上抗第 三代頭孢菌素 cefotaxime 的 Klebsiella oxytoca 和 1 株具 ESBL 之 Enterobacter agglomerans）對 KPP95 噬菌體之敏感性，若測試之菌株可被噬菌體感染則可見澄 清的溶菌斑；反之，則不會有溶菌斑出現。 KPP95 在 25 株 具 ESBL 之 Klebsiella pneumoniae 中可感染 10 株，比例為 10/25；另外 1 株 Klebsiella oxytoca 和 1 株 Enterobacter agglomerans 也可被 KPP95 感染；然而 Enterobacter cloacae 24 株、
Serratia marcescens 29 株及 Escherichia coli 13 株則都不被 KPP95 感染。
3. 限制? 切割 KPP95 的 DNA 之圖譜：
為了分析限制? 切割 KPP95 的 DNA 之情形，我們抽取其 DNA，每次取 5μl 出來與不同的限制? 於 37℃進行切割反應後做電泳分析，並在 UV 光下觀察並拍 照，結果如 Fig. 6.及 Fig. 7.所示，由此兩張圖中可看出只有 SspI、AseI、DraI、EcoRV 和 NdeI 這五個限制? 可把 KPP95 的 DNA 切割下來，其他的酵素如 EocRI、PstI、
HindIII 及 HincII 等，則都不能將 KPP95 的 DNA 切割下來；而且 KPP95 的 DNA 可被 SspI、 AseI、DraI 和 EcoRV 此四個酵素切成大大小小的片段，相較之下 NdeI 則是切成比較大的 DNA 片段，顯示前四個酵素切位可能廣泛分布在 KPP95 的 genome 裡，而每個 NdeI 的酵素切位則相隔較遠；另外，因為可被這些限制? 切割
下來，所以我們可以證明 KPP95 應該具有雙股（double-stranded）DNA 的遺傳物 質。
4. 噬菌體 KPP95 基因體 DNA 片段的選殖與定序：
為了得到更進一步有關 KPP95 的 DNA 的訊息，我們進行其 genomic DNA 的 選殖（採用 shot-gun cloning 的方法）與定序（sequence）工作。首先我們取經限制
? SspI 切割後的噬菌體 DNA 之大大小小片段，與經 EcoRV 切割過後的 pOK12 質 體於 16℃下進行長達 16 小時以上的黏接反應（ligation），然後送入 E. coli 菌株 DH5 α中進行轉形作用 (transformation) ，以 IPTG 及 X-gal 進行藍白篩選，即挑選白色 菌落，抽取其質體 DNA 並用 PstI and XbaI 切割以確定挑選到的白色菌落是否有接 入噬菌體 DNA 之片段後，我們選了五個轉形株（transformants）分別稱為 pOS 1、
pOS 2、pOS 3、pOS 11 和 pOS 21 並進行定序；定序後的核? 酸序列經適當整理後
（如去掉 vector pOK12 的序列等），得到插入（insert）的 KPP95 之各 DNA 片段，
各片段經 Clone 程式分析得到的限制? 圖譜，及利用 NCBI blastx 程式來與其 database 比對的結果分別列於 Fig. 8., 9., 10., 11., 12., 13., 14.和 Table 3., 4., 5., 6., 7., 8., 9., 10., 11.。
pOS 1 之嵌入片段長 678 bp，由其序列中含有一些限制? 切位如 HincII、AccI、
HpaI 和 NsiI 及 SspI 等，在這些切位中，已如前述，只有 SspI 能將 KPP95 DNA 切 割（Fig. 8.）。 而利用 NCBI blastx 比對結果，發現和一些 T4-type 噬菌體（T4、AR1、
Ox2、RB43、RB49 及 Aeh1）的 Fibritin (gp wac) (Whisker antigen control protein) (Collar protein)呈現約 34%-38% 不等的一致度（identity），顯示選殖於 pOS 1 的 KPP95 DNA 片段含有類似 T4-type 噬菌體其基因 wac 之中段序列（Table 3.）。
pOS 2 全長有 1197 bps，經比對後發現含有類似 T4 噬菌體其 gene 34 與 gene 37 的部分片段，但因為此兩基因並非相鄰，所以推斷 pOS 2 為 gene 34 與 gene 37 的 部分片段相接的結果，或 gene 34 有一小片段和 gene 37 相近，於是我們將其分成 pOS 2-34 與 pOS 2-37 此兩部分；pOS 2-34 全長共 859 bps，限制? 圖譜中含有一些 不能切下 KPP95 之 DNA 的限制? 切位如 HindⅢ和 PstI 等，及能切下 KPP95 之 DNA 的限制? SspI、EcoRV 和 AseI 切位 （Fig. 9.）。 而利用 NCBI blastx 比對結 果和 T4-type 噬菌體如 T4 和 RB49 的 tail fiber protein 有部分相似性，顯示選殖於
pOS 2-34 的 KPP95 DNA 片段含有類似 T4-type 噬菌體其 tail fiber 基因之部分序列
（Table 4.）。 pOS 2-37 全長有 338 bps，限制? 圖譜中含有一些不能切下 KPP95 之 DNA 的限制? 切位如 HincII 和 EcoRI，及能切下 KPP95 之 DNA 的限制? SspI 和 DraI 切位（Fig. 10.）。 比對結果與一些 T4-type 的噬菌體（T4、K3、PPO1、Ac3 及 AR1）的 long tail fiber protein gp37 (Receptor recognizing protein)有 29%-50% 不等 的一致度（identity），顯示選殖於 pOS 2-37 的 KPP95 DNA 片段含有類似 T4-type 噬菌體其 gene 37 之部分序列（Table 5.）。
pOS 3 全長共有 1031 bps，含有一些不能切下 KPP95 之 DNA 的限制? 切位如 HincII、ScaI、HindIII、PstI 和 NsiI 等等，及能切下 KPP95 之 DNA 的限制? 切位 如 SspI、AseI、DraI 和 EcoRV（Fig. 11.）。 而比對結果與 T4-type 的噬菌體 T4 和 RB49 的 Primase-helicase (即 Protein Gp41) 分別有 68%和 53%的一致性，顯示選殖 於 pOS 3 的 KPP95 DNA 片段含有類似 T4-type 噬菌體其 gene 41 之前段序列（Table 6.）。
pOS 11 有 906 bps，含有一些不能切下 KPP95 之 DNA 的限制? 切位如 HincII、
KpnI、ClaI 和 NsiI 等，及能切下 KPP95 之 DNA 的限制? 切位如 SspI 和 DraI（Fig.
12.）。 而比對結果與 T4-type 噬菌體（T4、RB49、KVP40 和 KVP20）的 DNA packaging protein Gp17 (Terminase)呈現 60%-91% 不等的一致度，顯示選殖於 pOS 11 的 KPP95 DNA 片段含有類似 T4-type 噬菌體其 gene 17 全長之中段序列（Table 7.）。
pOS 21 全長共有 3788 bps，含有一些不能切下 KPP95 之 DNA 的限制? 切 位如 HincII、KpnI、ClaI、 NsiI、AccI、HpaI、ScaI、HindIII、PstI、EcoRI、StuI 和 NaeI 等等，及能切下 KPP95 之 DNA 的限制? 切位如 SspI、AseI、DraI、EcoRV 和 NdeI（Fig. 14.）。 而利用 NCBI blastx 比對結果發現選殖於 pOS 21 的 KPP95 DNA 片段含有類似 T4-type 噬菌體其 gene 17 後段序列，gene 18、gene 19 的全部序列以 及 gene 20 的前段序列；其中 gene 17 後段序列經 NCBI blastx 比對與 T4-type 噬菌 體（T4、RB49、KVP40 和 KVP20）的 DNA packaging protein Gp17 (Terminase)有 51%-81% 不等的一致性（Table 8.）。 Gene 18 全長共 1974 個 bps，當中中段 1482 個 bps 是依據先前發表的期刊報告中所使用的引子 FT18-N2 和 FT18-C1 (Francoise Tetart et al., 2001) 進行 PCR 及定序後得到的，gene 18 全部序列經比對後得知與 T4-type 噬菌體（T4、42、RB42、RB49、KVP40 和 nt-1）之 tail sheath protein (Gp18)
有 49%-71%不等的一致性，其中與 T4 有最高的一致性（71%）（Table 9.）。 Gene 19 全長共 489 個 bps，gene 19 全部序列經比對後顯示與 T4-type 噬菌體（T4、T6、42、、
RB49、KVP40 和 nt-1）之 tail tube protein (Gp19)有 57%-69% 不等的一致性，其中 與 42 噬菌體有最高的一致性（69%）（Table 10.）。 Gene 20 前段序列經 NCBI blastx 比對與 T4-type 噬菌體（T4、RB49 和 KVP40）的 portal vertex protein of head (Gp20) 有 39%-64% 不等的一致性（Table 11.）。
由以上各 KPP95 的 DNA 片段（pOS 1、pOS 2-34、pOS 2-37、pOS 3、pOS 11、
pOS 21）的限制? 圖譜結果看出，那些不能將 KPP95 的 DNA 切割下來的限制? 切 位確實存在於 KPP95 的 DNA 序列中；而且由這些 DNA 片段轉譯成的胺基酸序列 之比對結果得知其與 T4-type 噬菌體的基因 17、18、19、20、wac、34、37 和 41 等都具有相似的序列。
5. KPP95 的蛋白質分析：
因為欲分析 KPP95 於 SDS-PAGE 電泳分析下蛋白呈現的情形，所以將大量噬 菌體液利用超高速離心（Ultracentrifugation）、透析（dialysis）及音波振盪（sonicated）
後得到蛋白樣品，接著以 Hoefer（Pharmacia）SE 600 series 裝置將煮沸離心過的蛋 白樣品取其 20µl 之上清液進行 15% SDS-PAGE 之電泳分析，經孔雀藍染液 ( Comassie Blue R250 )染色及褪染後所得結果如 Fig. 15.所示。約有 25 個蛋白片段 在 SDS-PAGE 下可清楚的被看到，而 SDS-PAGE 上最多量的蛋白片段可能是 KPP95 的主要外套蛋白（major coat protein），估計約為 46 kDa。
接著我們欲知此 46 kDa 的蛋白片段是否為 KPP95 的主要外套蛋白（major coat protein），於是將其進行 N-端定序，同上所述取煮沸離心後之上清液 200 µl 載入凝 膠齒溝槽中以 15 % SDS-PAGE 將蛋白質分離後，利用濕式轉漬法將蛋白質由膠體 上轉漬到經由甲醇處理過的 PVDF 轉漬膜上，轉 漬 約 24 小時後， 轉漬膜以 Commassie blue G-250 staining solution 染色，再以含 50% methanol and 10 % glacial acetic acid 的 Destain buffer 清洗直至可看見清楚的蛋白，以去離子水清洗及自然風 乾後，以剪刀剪下欲定序之可能為主要外套蛋白（major coat protein）之片段，然 後 進 行 N- 端 定 序 。 定 序 後 得 到 的 15 個 N- 端 胺 基 酸 序 列 為 AEIGGDHGYDAQNIA，經 NCBI blastp 比對之結果列於 Table 12.中，此可能是
KPP95 之主要外殼蛋白的 15 個 N 端序列與 T4-type 噬菌體（SV14、RB69、AR1 、 T4 和 T6）的 major coat proteins (gp23) 皆有高達 86%-93%的一致性。
6. 噬菌體 KPP95 之 gene23 的 PCR 產物（PCR23）及其比對：
由上述 N-端定序比對的結果，知道可能為 KPP95 的主要外套蛋白與 T4-type 噬菌體其 gene 23 轉譯出來的主要外套蛋白(gp23) 相似，我們欲得到 gene 23 核?
酸序列，於是參考先前發表的期刊報告中所使用的引子 Mzial 和 CAP8 (Francoise Tetart et al., 2001) 來設計 degenerate primer, 進行 PCR及定序，得到中段部位的 gene 23 序列（稱為 PCR 23），共有 789 bps，含有一些不能切下 KPP95 之 DNA 的限制
? 切位如 ClaI、HindIII 和 PstI 等，及能切下 KPP95 之 DNA 的限制? 切位如 DraI 和 EcoRV（Fig. 13.）。 經 NCBI blastx 比對結果顯示與 17 個 T4-type 噬菌體（T4、
T6、RB69、KC69、Tu1a、42、1、SV14、AR1、RB49、RB43、44RR、KVP40、 KVP20、
65、Aeh1 和 nt-1）的 major capsid protein (gp23) 有 53%-83% 不等的一致性（Table 13.）。
7. KPP95 之 gene23、18、19 的比對（alignment）：
我們將 PCR 23 此 DNA 片段經 NCBI blastx比對到的 17 個 T4-type 噬菌體之主 要外套蛋白的胺基酸序列，與 PCR 23 其 DNA 序列轉譯成的胺基酸序列彼此之間 利用 ClustalX 做比對（alignments），結果如 Fig. 18.所示，雖然由圖中可以很清楚 的看出這些噬菌體的主要外套蛋白彼此之間胺基酸序列的重要差異，但是一些區域
（blocks）的胺基酸序列卻是普遍地一致，尤其是從序列 250 到 324 最是顯著。
接著我們又將 KPP95 其整個 PCR 23 所轉譯出來的蛋白序列（即 T4 其 gp23 胺基酸序列的 99-354）與 T4 的 gp23 利用 NCBI blastp 作比較，並分別比較相對於 T4 其 gp23 胺基酸序列之 162-209 殘基區域、N 端和 C 端部分，所得結果如 Fig. 19.
所示，整個 PCR 23 轉譯成的蛋白序列與 T4 的 gp23 比起來只有 17%的變異性，然 而在 T4 的 gp23 近中間序列的 50 個胺基酸區域（序列 162-209），KPP95 卻有 48%
的變異性，兩端（N 端與 C 端）序列與 T4 比起來則各只有 10%的變異性
先前我們由 KPP95 其 genome 的選殖與定序工作得到了 DNA 片段 pOS 21，而 pOS 21 含有類似 T4-type 噬菌體其 gene 17 後段序列，gene 18、gene 19 的全部序列
以及 gene 20 的前段序列。 現在既然我們已取得 KPP95 的 DNA 中類似 T4-type 噬 菌體其 gene 18 的全部序列，則利用同樣的方法，將此 gene 18 序列轉成胺基酸序 列後則與比對到的 T4-type 噬菌體之 gp18 蛋白序列一起作 alignment，所得結果如 Fig. 20.所示，整個看起來很像之前所做的 gene 23 的 alignment 結果，而保留區域 較集中在 gene 18 的前端與尾端部分。
因為也有取得 KPP95 的 DNA 中類似 T4-type 噬菌體其 gene 19 的全部序列，
於是也是利用同樣的方法 ，將此 gene 19 序列轉成胺基酸序列後則與比對到的 T4-type 噬菌體之 gp19 蛋白序列一起作 alignment，所得結果如 Fig. 21.所示可以看 出保留序列呈現比較一致性的分布，不過整體看起來還是和 gene 18 及 gene 23 的 alignment 結果很類似。
8. 選殖的各 KPP95 DNA 片段之 G+C content：
我們利用 frameplot 將 KPP95 之各 DNA 片段的 G+C content 計算出來，分別為 pos1：37.8%； pos2-34：41.8%； pos2-37：39.6%； pos3：37.9%； pos11：41.6%；
pos21：41.2%； PCR23：48.5%，由這些數值似乎可推測噬菌體 KPP95 其整個 genome 的化學組成（chemical composition）應是屬於低 G+C content 的情形，與 T4 噬菌體 整個 genome 的低 G+C content（35.3%）情況相似。
9. 總結：
KPP95 噬菌體之外形於電子顯微鏡下與 T4-type 噬菌體有相似的結構與型態，
genome 大小利用脈衝電泳法估計約介於 170-180 kb 之間，與 T4 噬菌體 genome 大 小（169 kb）相近，而且可能具有與 T4 噬菌體同屬於低 G+C content 的化學組成性 質。 由其 genome 的選殖與定序工作得到的 KPP95 之各 DNA 片段（pOS 1、pOS 2-34、pOS 2-37、pOS 3、pOS 11、pOS 21） 經 NCBI blastx 比對結果發現都與 T4-type 噬菌體之蛋白質有相似的部分，之間的一致性與有些 T4-type 噬菌體還可高達 80%-90%左右；另外，可能為 KPP95 之主要外套蛋白（gp23）的 N-端序列與藉由 PCR 得到其 gene（為 gene 23）序列經 NCBI 比對結果也皆顯示與部分 T4-type 噬 菌體之主要外套蛋白呈現高度一致性，於是我們由上述諸多事實中推論 KPP95 噬 菌體應也屬於 T4-type 噬菌體的一員。
四 、 klebsiella pneumoniae 10693 之 染 色 體 DNA 的 限 制 ? 切 割
我們將 KPP95 的宿主細菌即 klebsiella pneumoniae 10693 之染色體 DNA
（chromosome DNA）抽取出來，然後選取一些不能切割 KPP95 的 DNA 之限制?
如 EocRI、PstI、HindIII 及 HincII 來切割，結果如 Fig. 16.所示，發現這四個限制?
皆可將 klebsiella pneumoniae 10693 的染色體 DNA 切割下來。
五 、 轉 型 株 pOS 1、 pOS 2、 pOS 3 其 質 體 DNA 的 限 制 ? 切 割
我 們 分 別 將 之 前 由 KPP95 其 genome 的 選 殖 所 得 到 的 三 個 轉 型 株
（transformants）pOS 1、pOS 2、pOS 3（宿主是 E. coli DH5a）中的質體 DNA 抽 取出來，接著用 HincII 限制? 進行 pOS 1 切割，用 EocRI 限制? 進行 pOS 2 切割，
而 pOS 3 則用 PstI 限制? 來進行切割，經電泳分析及染色照相後所得結果如 Fig. 17 所示，在凝膠上，pOS 1 經 HincII 切割後可看到被分成一約 0.3 kb，另一約 2.1 kb 的兩個片段，pOS 2 經 EocRI 切割後可被分成一約 0.9 kb 和另一約 2.5 kb 的兩個片 段，而 pOS 3 經 PstI 切割後則可被分成一約 1 kb 和另一約 2.1 kb 的兩個片段。
